CN108802157A - 一种总胆汁酸检测试剂、试纸及检测方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种总胆汁酸检测试剂、试纸及检测方法与应用，所述总胆汁酸检测试纸包括绝缘基片，位于绝缘基片上的电极系统，所述电极系统包括三条导电电极，分别为工作电极、参比电极和短路电极，其中的短路电极与工作电极或参比电极相接；一局部覆盖于电极系统上的绝缘隔离层，使得在未覆盖绝缘隔离层所裸露出的电极系统区域，形成一容纳样品溶液空间的电化学电极反应区；一位于电化学电极反应区的酶反应膜，所述酶反应膜包括至少一种电子介体、至少一种总胆汁酸吸附剂。本发明通过总胆汁酸吸附剂，可使样品中的总胆汁酸快速被吸附浓缩，从而使总胆汁酸试纸检测总胆汁酸含量的灵敏度大大提高，因而提高了检测的准确度及可靠性。

Description

一种总胆汁酸检测试剂、试纸及检测方法与应用

技术领域

本发明涉及一种胆汁酸电化学生物传感器检测方法，以及在快速检测中的应用，尤其是一种总胆汁酸检测试剂、试纸及检测方法与应用。

背景技术

总胆汁酸是胆汁中的主要成分，是胆固醇经肝组织代谢的最终产物，当肠肝循环被破坏，则总胆汁酸不能重复利用。血清总胆汁酸测定可以反映肝细胞的合成代谢、摄取和排泌状态；总胆汁酸的生成和代谢与肝脏关系十分密切，肝细胞发生病变，血清总胆汁酸会跟随变化。

总胆汁酸（Total Bile Acids，简称TBA）是一种敏感的肝功能试验，肝细胞仅有轻微坏死时，即可升高，其变化早于丙氨酸转氨基酶（Alanine transaminase，简称ALT）和胆红素，甚至可早于肝组织学活检所见。TBA升高主要见于急慢性肝炎、肝硬化、阻塞性黄疸、原发性肝癌、急性肝内胆汁淤积、原发性胆汁性肝硬化和肝外梗阻性黄疸等。

餐后2hTBA测定可较空腹时更敏感，用餐后胆囊收缩，大量胆汁排入肠中，再经肝肠循环回到肝脏，肝细胞轻度损害时，总胆汁酸清除率即可下降，餐后2h血中总胆汁酸仍维持高水平，从而可观察肝细胞微小变化，对早期肝病的诊断极有价值。

目前，检验总胆汁酸的主要方法有：高效液相色谱法、化学发光法、光化学比色法。在这些方法中，高效液相色谱法和化学发光法检测过程繁琐，获得分析结果所需时间较长；光化学比色法取血量大，并且需要专用的生化分析仪，价格昂贵。未见能家用或床旁使用的快速检测总胆汁酸方法及产品报道。

相关研究表明，血清与尿液中总胆汁酸浓度具有显著正相关，相关系数达到0.9964，血清中总胆汁酸处于正常参考值范围（0-10μmol/L）时,排泄入尿液中的总胆汁酸浓度不超过20μmol/L，随着血清中总胆汁酸浓度的增加，尿液中总胆汁酸浓度也增加，即尿液中的总胆汁酸浓度是随着血清中总胆汁酸浓度的增加而增加。由于尿液中总胆汁酸浓度与血液中总胆汁酸浓度具有非常强的相关性，因此，检测尿液中的总胆汁酸浓度即可以知道血液中的总胆汁酸浓度，尿液总胆汁酸浓度可以用作实时监测肝胆疾病的指标。尿液检测属于无创检测，可以避免使用者取样疼痛。

检测总胆汁酸，需要一种测试灵敏度高、结果准确、抗干扰能力强、成本低、操作简单的方法。

发明内容

本发明解决目前总胆汁酸检测方法的技术不足，提供一种总胆汁酸检测试剂、试纸及检测方法与应用，本发明使用直接电化学生物传感器原理检测总胆汁酸方法，可以在样品中总胆汁酸含量很低的情况下，提高总胆汁酸测试灵敏度，实现准确、快速、简单、低成本检测总胆汁酸。

实现本发明目的的技术方案是：

一种总胆汁酸检测试剂，包括酶反应液，所述酶反应液包括如下重量百分比的组分：

3α-羟基类固醇脱氢酶1.0%-2.2%；

铁氰化钾3.0%-20.0%；

羧甲基纤维素1.0%-6.0%；

AD+，氧化态的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸 0.5%-3.0%；

pH值为7.0的磷酸钾缓冲液65%-80%；

医药级蒙脱石钙1.0%-10.0%。

一种总胆汁酸检测试纸，包括

一绝缘基片；

一位于绝缘基片上的电极系统，所述电极系统包括三条导电电极，分别为工作电极、参比电极和短路电极，其中的短路电极与工作电极或参比电极相接；

一局部覆盖于电极系统上的绝缘隔离层，使得在未覆盖绝缘隔离层所裸露出的电极系统区域，形成一容纳样品溶液空间的电化学电极反应区；

一位于电化学电极反应区的酶反应膜，所述酶反应膜包括至少一种电子介体、至少一种总胆汁酸吸附剂、还包括缓冲液、粘合剂及表面活性剂；

在所述的绝缘隔离层的上方设有一粘合隔片，所述粘合隔片上开设有相互连通的采样口和虹吸导样槽，其中采样口设置于远离绝缘基片上电极传导部的一端，虹吸导样槽的开设位置与绝缘隔离层上电化学电极反应区的位置相对应。

所述绝缘隔离层的电化学电极反应区设有反应窗口，反应窗口的跨度为同时覆盖工作电极和参比电极；所述酶反应膜与反应窗口相对应。

所述酶反应膜包括

酶，为3α-羟基类固醇脱氢酶；

电子介体，为铁氰化钾、二茂铁及其衍生物、钌的络合物或苯醌类化合物中的一种或几种；

缓冲液，为磷酸缓冲液、MES缓冲液、柠檬酸缓冲液中的一种；

总胆汁酸吸附剂，为蒙脱石。

所述总胆汁酸吸附剂干重含量为1%-10%。

所述总胆汁酸吸附剂直径为0.5μm -7μm。

所述酶反应膜中的总胆汁酸检测试剂包括如下重量百分比的组分：

3α-羟基类固醇脱氢酶1.0%-2.2%；

铁氰化钾3.0%-20.0%；

羧甲基纤维素1.0%-3.0%；

AD+，氧化态的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸 0.5%-3.0%；

pH值为7.0的磷酸钾缓冲液65%-80%；

医药级蒙脱石钙或医药级蒙脱石钠1%-10%。

上述的总胆汁酸检测试纸在制备总胆汁酸检测试纸中的应用。

上述的总胆汁酸检测试剂在制备总胆汁酸检测试纸中的应用。

利用上述的总胆汁酸检测试纸进行总胆汁酸检测的方法，包括如下步骤：

一、制作线性曲线图：

收集比重为1.018的新鲜尿液，配制尿液胆汁酸浓度为0，10, 25, 50,100,200,300μmol/L的尿样；

将总胆汁酸检测试纸置于配套的多参数分析仪中并在工作电极和参比电极两端施加300mV工作电压；

取尿样10-100µL加到总胆汁酸检测试纸的采样口，尿液通过虹吸导样槽自动吸取2µL样品，进入电化学电极反应区与酶反应膜中的总胆汁酸检测试剂反应形成电流，在多参数分析仪上可检测出与总胆汁酸浓度相对应的电流值；

以总胆汁酸的浓度为横坐标，电流值为纵坐标，绘制出总胆汁酸浓度与电流值的线性关系图；

二、测量被测样品的总胆汁酸浓度值：

将总胆汁酸检测试纸置于多参数分析仪中并在总胆汁酸检测试纸的工作电极和参比电极两端施加300mV工作电压；

取被测样品尿样10-100µL加到总胆汁酸检测试纸的采样口，尿液通过虹吸导样槽自动吸取2µL样品，在多参数分析仪上检测出与取被测样品总胆汁酸浓度相对应的电流值；

该电流值对应的总胆汁酸浓度可直接从上述线性关系图上得出，从而得到被测样品的总胆汁酸浓度值。

用这种方法定标后，将得到的总胆汁酸浓度与电流的线性关系的线性曲线输入到配套多参数分析仪的存储设备中；被检测样品的总胆汁酸浓度可以直接从配套多参数分析仪中读出。

本发明电化学生物传感器检测总胆汁酸原理如下：

其中，NAD⁺：烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，氧化态，氧化型辅酶Ⅰ

NADH：烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，还原态，还原型辅酶Ⅰ

本发明所采用的总胆汁酸试纸，是一种利用电子介体及酶反应系统分析液体中总胆汁酸浓度的电流型电化学生物传感器。该生物传感器（即总胆汁酸试纸）具有较高的灵敏度及较宽的线性范围，因此能快速的检测生物液体比如尿液中总胆汁酸浓度值。它对总胆汁酸的高敏感性使总胆汁酸分析可以应用较低的工作电压，避免一些干扰物质造成错误的分析结果。

同时，本发明的总胆汁酸试纸在酶反应膜中加入了总胆汁酸吸附剂蒙脱石。蒙脱石对葡萄糖、尿酸、胆固醇等无吸附作用，但蒙脱石能大量快速吸附总胆汁酸，使样品中的总胆汁酸快速浓缩到酶试剂层里的酶及其它生化试剂附近，一方面提高了反应速度，另一方面使酶及介体附近的总胆汁酸浓度迅速增大，从而使总胆汁酸测试灵敏度得以提高，因此用本发明的总胆汁酸试纸定量分析总胆汁酸浓度，即使血液中总胆汁酸浓度很低，也能快速、准确获得检测结果。

本发明提高总胆汁酸测量准确度和实现快速检测的方法在于，样品经虹吸导样槽进入反应区与反应膜中的试剂反应形成电流，在电化学生物传感器检测系统上可快速检测出总胆汁酸浓度。

反应膜中包括总胆汁酸吸附剂、缓冲液、表面活性剂、电子介体或电子介体及酶，总胆汁酸吸附剂能将样品中的微量总胆汁酸吸附浓缩，在电极表面形成高浓度的总胆汁酸与反应膜中的酶反应从而提高测试准确度。

由于临床样品中总胆汁酸浓度只有10μmol/L -500μmol/L，传统电化学生物传感器方法无法达到如此高灵敏度。因此，目前未见用于家庭及个人检测使用的快速床边检测总胆汁酸方法及检测试纸报道。为了解决检测灵敏度问题，本发明人经过深入研究完成此专利发明。与现有技术相比，本发明所述的总胆汁酸检测方法，由于酶反应膜中含有总胆汁酸吸附剂，从而大大提高了电化学生化传感器检测总胆汁酸的灵敏度，从而实现电化学生物传感器检测临床样品中的总胆汁酸含量。电化学生化传感器检测总胆汁酸，保持快速检测优点的同时，也使大规模生产及低检测成本得以实现。该总胆汁酸试纸与多参数分析仪（现有技术）配套使用，可实时以数字定量显示总胆汁酸测试结果。

附图说明

此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本发明的一部分，并不构成对本发明的限定。在附图中：

图1为本发明实施例中总胆汁酸试纸的结构分解图；

图2 为本发明实施例中总胆汁酸试纸酶膜中含有总胆汁酸吸附剂时测试尿液总胆汁酸浓度-电流曲线和比较例中总胆汁酸试纸酶膜中不含有总胆汁酸吸附剂时测试尿液总胆汁酸浓度-电流曲线比较图；

图3为本发明实施例中总胆汁酸试纸酶膜中含有总胆汁酸吸附剂时测试血液总胆汁酸浓度-电流曲线图。

图中，1.绝缘基片 2.电极系统 2-1.工作电极 2-2.参比电极 2-3.短路电极 3.绝缘隔离层 4.反应窗口 5.酶反应膜 6.虹吸导样槽 7.采样口 8.粘合隔片。

具体实施方式

参照图1所示，一种总胆汁酸检测试纸，包括

一绝缘基片1；

一位于绝缘基片1上的电极系统2，所述电极系统2包括三条导电电极，分别为工作电极2-1、参比电极2-2和短路电极2-3，其中的短路电极2-3与工作电极2-1或参比电极2-2相接；

一局部覆盖于电极系统2上的绝缘隔离层3，使得在未覆盖绝缘隔离层3所裸露出的电极系统2区域，形成一容纳样品溶液空间的电化学电极反应区；

一位于电化学电极反应区的酶反应膜5，所述酶反应膜5包括至少一种电子介体、至少一种总胆汁酸吸附剂、还包括缓冲液、粘合剂及表面活性剂；

在所述的绝缘隔离层3的上方设有一粘合隔片8，所述粘合隔片8上开设有相互连通的采样口7和虹吸导样槽6，其中采样口7设置于远离绝缘基片1上电极传导部的一端，虹吸导样槽6的开设位置与绝缘隔离层3上电化学电极反应区的位置相对应。

所述绝缘隔离层3的电化学电极反应区设有反应窗口4，反应窗口4的跨度为同时覆盖工作电极2-1和参比电极2-2；所述酶反应膜5与反应窗口4相对应。

所述酶反应膜5包括

酶，为3α-羟基类固醇脱氢酶；

电子介体，为铁氰化钾、二茂铁及其衍生物、钌的络合物或苯醌类化合物中的一种或几种；

缓冲液，为磷酸缓冲液、MES缓冲液、柠檬酸缓冲液中的一种；

总胆汁酸吸附剂，为蒙脱石。

所述总胆汁酸吸附剂干重含量为1%-10%。

所述总胆汁酸吸附剂直径为0.5μm -7μm。

所述酶反应膜中的总胆汁酸检测试剂包括如下重量百分比的组分：

3α-羟基类固醇脱氢酶1.0%-2.2%；

铁氰化钾3.0%-20.0%；

羧甲基纤维素1.0%-3.0%；

AD+，氧化态的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸 0.5%-3.0%；

pH值为7.0的磷酸钾缓冲液65%-80%；

医药级蒙脱石钙或医药级蒙脱石钠1%-10%。

本文中所说的绝缘基片1，系指具有平直的表面及电绝缘特性的薄层片。较佳地，该绝缘基片1选自下列所组成的群：聚氯乙烯(PVC)片、玻璃纤维片(FR-4)、聚酯、电木片、PET片、PC片、PP片、PE片、PA片、PS片、玻璃片及陶瓷片(CEM-I)。根据本发明的一较佳实施，该绝缘基片为PC或PET片。

本文中所说的电极系统2，系指包括至少有二条分离且互不相接触的电极，分别形成工作电极2-1和参比电极2-2。根据本发明的一较佳实施，电极系统2系以电绝缘层局部覆盖，使裸露于电绝缘隔离层一端，分别形成工作电极2-1和参比电极2-2与电化学电极反应区相连，而另一端则形成工作电极2-1和参比电极2-2的接头，可与检测样品在电化学反应时产生电效应的检测装置相连。较佳地，该电极系统的材料可选用适合网版印刷的导电性浆状材质，包括但不限于碳胶、金胶、银胶、碳银混合胶、挥发性石墨或铜胶或其组合（例如以网印先印银胶后再印碳胶），或其它任何适合网版印刷的导电性浆状材料。

本文中所说的电绝缘隔离层3，系指以具有电绝缘性质的材质所形成的薄层。较佳地，该电绝缘隔离层3的材料可选用适合网版印刷的电绝缘性浆状材质或电绝缘性胶带，例如热干燥型或紫外光干燥型的绝缘漆，或PVC或PET材质的绝缘胶带。较佳地，该电绝缘层具有厚度为0.1至0.25毫米。

根据本发明的一较佳实施，该电绝缘隔离层3局部覆盖于基片上的电极系统2，使得在未覆盖电绝缘层所裸露出的电极系统区域，形成一容纳样品溶液空间的电化学电极反应区及排气孔。

本文中所说的酶反应膜，系指位于上述电化学电极反应区，含有与被测物质反应的生物试剂。酶反应膜中包括与被测物质反应的酶和一种电子传递介体，同时还含有缓冲液、粘合剂及表面活性剂的调配物薄层。或者酶反应膜中包括与被测物质反应的电子传递介体，同时还含有缓冲液、粘合剂及表面活性剂的调配物薄层。较佳地，该调配物可以涂覆或滴加的方式加至该反应层后，于60℃下干燥。

本文中所说的酶，系指可与样品中的待测标的物产生氧化还原反应的酶。检测总胆汁酸浓度所选用的酶为3α-羟基类固醇脱氢酶。

本文中所说的电子介体，系指可与经前述氧化还原酶作用所产生的物质反应后，本身可由氧化状态还原成还原状态得物质。当电子介体变成还原状态时，可藉由施加一外加电压于电极试纸上，促使电子介体由还原状态逆反应回复为氧化状态，此时化学反应的电位、电阻或电流变化，可由电极系统的工作电极与参比电极传导至电极系统另一端的接头。当此接头与一讯号接收装置连接时，可将前述化学反应的电位、电阻或电流变化接收，并藉由一显示装置将讯号转换成检测标的物的浓度。电子介体为铁氰化钾、二茂铁及其衍生物、钌的络合物或苯醌类化合物。根据本发明的一较佳具体实施例，该电子介体可为铁氰化钾。较佳地，该电子介体的含量为3%（m/m）至20%（m/m）。

本文中所说的缓冲液、粘合剂及表面活性剂，系指可助于氧化还原酶及电子介体干燥后附着于绝缘基片上的物质，或可保护氧化还原的物质。所述缓冲液为磷酸缓冲液、MES缓冲液、柠檬酸缓冲液中的一种；所述粘合剂采用淀粉、糊精、明胶、羟乙基纤维素、羧甲基纤维素、海藻酸钠中的一种或几种；所述表面活性剂为TritonX-100、TW-20。将酶反应膜固定到电极上的方法可以是吸附法、交联法、溶胶-凝胶法、粘合剂法等。吸附法固定酶只需要将酶液直接滴加在电极表面上，酶的疏水基团与疏水的电极表面经范德华力而吸附；交联法固定酶可以在酶液中加入戊二醛等交联试剂。溶胶-凝胶法固定酶可以将酶融入二氧化硅水溶胶、二氧化钛水溶胶、明胶等试剂中，在电极表面干燥后形成凝胶。粘合剂法固定酶可以将酶与粘合剂及其他辅料配成可印刷的酶浆，丝网印刷在电极表面上。电子传递介体、缓冲液及表面活性剂可以与酶混合一起滴加或丝网印刷到电极表面。

本文中所说的总胆汁酸吸附剂，由高分子化合物形成，在电化学上是惰性的高分子化合物。这样的高分子化合物优选是不溶于水的，作为这样的高分子化合物的具体例，可列举含有蒙脱石。具体的说，最优选的是医药级蒙脱石钙、医药级蒙脱石钠。

本发明的总胆汁酸试纸中，前述的总胆汁酸吸附剂蒙脱石，可以具有0.5μm -7μm的直径，优选1μm -3μm。

本发明所述的总胆汁酸试纸中，前述的总胆汁酸吸附剂蒙脱石，在酶反应膜中干重的含量为1%-10%。当总胆汁酸吸附剂蒙脱石在酶反应膜中干重含量低于1%时，起不到快速吸附浓缩作用；当浓度超过10%，难以均匀混合到酶浆液中，无法保证总胆汁酸试纸的重复性。优选总胆汁酸吸附剂蒙脱石干重含量为2%-7%。

本发明的一个较优实例的总胆汁酸试纸的结构分解图显示在图1。本发明的总胆汁酸试纸包括绝缘基片1，绝缘基片1上设置有三条条状导电电极2，分别为工作电极2-1、参比电极2-2和短路电极2-3，其中的短路电极2-3与工作电极2-1或参比电极2-2相接，在导电电极2的上部分设置有绝缘隔离层3，该绝缘隔离层3的一端与绝缘基片1平齐，另一端在条状导电电极2的传导部与所述绝缘隔离层3的平齐端之间，以使导电电极2前端的电极传导部裸露在外；所述绝缘隔离层3上开设有反应窗口4，该反应窗口的跨度为同时覆盖工作电极2-1、参比电极2-2。短路电极2-3用于感测到又被测样品存在而启动测量仪器；所有电极可以采用丝网印刷技术或溅射技术制备。

在反应窗口4内粘贴有酶反应膜5；酶反应膜5含有与被测物质反应的生物试剂包括与被测物质反应的酶和一种电子传递介体，同时还含有缓冲液、粘合剂及表面活性剂；酶与总胆汁酸反应而得到电子并转移给电子传递媒体，电子传递媒体在电极表面发生氧化而产生电流，仪器检测所产生的电流并换算出总胆汁酸的浓度。

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例和附图，对本发明实施例做进一步详细说明。在此，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，但并不作为对本发明的限定。任何熟悉此项技术的人士可轻易做到的修饰及改变均包含于本案所附申请专利权利要求的范围内。

实施例1：

本实施例提供一总胆汁酸试纸的制备实例，从而说明本发明的总胆汁酸试纸及制备方法。

首先，采用丝网印刷技术在0.25mm厚PET塑料基片上制作工作电极、参比电极和短路电极，工作电极、参比电极和短路电极，采用由Acheson公司购买的导电碳墨制作。通过丝网印刷将导电油墨在PET塑料基片上铺上分散均匀的油墨薄层后，放到80℃烘箱中烘干60min。

其次，采用丝网印刷技术在印好电极系统的基片上印刷绝缘漆作为电绝缘隔离层，绝缘漆由Acheson公司购买。通过丝网印刷将绝缘漆在PET塑料基片上铺上分散均匀的油墨薄层后，放到紫外烘干机一分钟烘干。

接着，在电极表面固定酶反应膜用于尿液总胆汁酸的检测。所取酶反应液的各组分及其重量百分比见表 1：

表 1

材料	重量（w/v）
		3α-羟基类固醇脱氢酶	1.5%
铁氰化钾	7.5%
		羧甲基纤维素	4%
NAD+，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（氧化态）	2%
		磷酸钾缓冲液(pH=7.0)	80%
医药级蒙脱石钙	5%

取4µL酶反应液滴加到电极表面，50℃烘干20 min，备用。

固定酶膜后，用粘合隔片将表面封装片、PET基片粘合，粘合隔片上设有开槽，对应于电极反应区域，及暴露电极上有酶反应试剂的一端，以及参比电极和短路电极。PET基片、粘合隔片和表面封装片组成虹吸导样槽及采样口。

比较例1：

本比较例制备总胆汁酸试纸，除了酶反应液中不添加医药级蒙脱石钙，以磷酸钾缓冲液替代，其它与实施例1相同。

实施例2：

本实施例举例说明总胆汁酸浓度与电流线性关系，以及使用实施例1制备的总胆汁酸试纸构建定标曲线方法。

收集比重为1.018的新鲜尿液，配制尿液总胆汁酸浓度为0，10, 25, 50,100,200,300μmol/L的尿样，将实施例1制备的总胆汁酸检测试纸，置于配套分析仪中并在工作电极和参比电极两端施加300mV工作电压；用吸管取尿样10-100µL，加到采样口，尿液通过虹吸导样槽自动吸取约2µL样品,进入电化学电极反应区与酶反应膜中的总胆汁酸检测试剂反应形成电流，在电化学生物传感器检测系统上可快速检测出与总胆汁酸浓度相对应电流，总胆汁酸浓度与电流的线性关系见图2。定标后，将得到的总胆汁酸浓度与电流的线性关系的线性曲线输入到配套分析仪的存储设备中，被检测样品的总胆汁酸浓度可以直接从配套分析仪中读出。

比较例2：

本比较例举例说明总胆汁酸浓度与电流线性关系，以及使用比较例1制备的总胆汁酸试纸构建定标曲线方法。构建定标曲线的方法，除了使用的定标试纸是比较例1制备的总胆汁酸试纸外，其它与实施例2相同。总胆汁酸浓度与电流的线性关系见图2。

从图2可以看出，用实施例1制作的总胆汁酸试纸定标所得曲线的斜率比用比较例1制作的总胆汁酸试纸定标所得曲线的斜率大很多，也就是说实施例1制作得到的试纸测试总胆汁酸灵敏度大大提高了。而比较例制作的总胆汁酸试纸无法区分高低浓度总胆汁酸样品。

实施例3：

本实施例制备总胆汁酸试纸，除了酶液中不添加医药级蒙脱石钙，以医药级蒙脱石钠替代，且医药级蒙脱石钠添加量为2.5%，其它与实施例1相同。

采集新鲜静脉血液，调整红细胞压积比为40%，配制总胆汁酸浓度分别为10µmol/L,25mol/L, 50µmol/L、100µmol/L, 200µmol/L血样。将本实施例制备的总胆汁酸试纸，置于配套智能分析仪中并在工作电极和参比电极两端施加300mV工作电压；取血液，加到采样口，血液通过虹吸导样槽自动吸取约2µL样品,进入反应区与酶反应膜中试剂反应形成电流，在电化学生物传感器检测系统上可快速检测出与总胆汁酸浓度相对应电流，记录仪器显示结果。总胆汁酸浓度与电流的线性关系见图3。

从图3可以看出，用实施例3制作的总胆汁酸试纸定标所得曲线的斜率较大，有较高的灵敏度，能较好的区分高低浓度总胆汁酸样品。

由以上可知，本发明的总胆汁酸试纸在酶液中加入了总胆汁酸吸附剂，大大的提高了检测灵敏度，从而本发明的检测总胆汁酸试纸能快速、简便的检测总胆汁酸含量，灵敏度高、准确、可靠，且试纸的制作方法简单，适合大批量生产。

以上举例仅为举例性，并非限制性。任何未脱离本发明的精神与范畴，而对其进行的等效修改和变更，包含但不限定将本发明实施例中所述原件以软体或硬体或韧体或其任何组合，均应包含于本发明的权利范围内。

Claims (10)

1.一种总胆汁酸检测试剂，其特征在于，包括酶反应液，所述酶反应液包括如下重量百分比的组分：

3α-羟基类固醇脱氢酶1.0%-2.2%；

铁氰化钾3.0%-20.0%；

羧甲基纤维素1.0%-6.0%；

AD+，氧化态的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸 0.5%-3.0%；

pH值为7.0的磷酸钾缓冲液65%-80%；

医药级蒙脱石钙1.0%-10.0%。

2.一种总胆汁酸检测试纸，其特征在于，包括

一绝缘基片；

一位于绝缘基片上的电极系统，所述电极系统包括三条导电电极，分别为工作电极、参比电极和短路电极，其中的短路电极与工作电极或参比电极相接；

一局部覆盖于电极系统上的绝缘隔离层，使得在未覆盖绝缘隔离层所裸露出的电极系统区域，形成一容纳样品溶液空间的电化学电极反应区；

一位于电化学电极反应区的酶反应膜，所述酶反应膜包括至少一种电子介体、至少一种总胆汁酸吸附剂、还包括缓冲液、粘合剂及表面活性剂；

在所述的绝缘隔离层的上方设有一粘合隔片，所述粘合隔片上开设有相互连通的采样口和虹吸导样槽，其中采样口设置于远离绝缘基片上电极传导部的一端，虹吸导样槽的开设位置与绝缘隔离层上电化学电极反应区的位置相对应。

3.根据权利要求2所述的总胆汁酸检测试纸，其特征在于，所述绝缘隔离层的电化学电极反应区设有反应窗口，反应窗口的跨度为同时覆盖工作电极和参比电极；所述酶反应膜与反应窗口相对应。

4.根据权利要求2所述的总胆汁酸检测试纸，其特征在于，所述酶反应膜包括

酶，为3α-羟基类固醇脱氢酶；

电子介体，为铁氰化钾、二茂铁及其衍生物、钌的络合物或苯醌类化合物中的一种或几种；

缓冲液，为磷酸缓冲液、MES缓冲液、柠檬酸缓冲液中的一种；

总胆汁酸吸附剂，为蒙脱石。

5.根据权利要求2或4所述的总胆汁酸检测试纸，其特征在于，所述总胆汁酸吸附剂干重含量为1%-10%。

6.根据权利要求2或4所述的总胆汁酸检测试纸，其特征在于，所述总胆汁酸吸附剂直径为0.5μm -7μm。

7.根据权利要求2或4所述的总胆汁酸检测试纸，其特征在于，所述酶反应膜中的总胆汁酸检测试剂包括如下重量百分比的组分：

3α-羟基类固醇脱氢酶1.0%-2.2%；

铁氰化钾3.0%-20.0%；

羧甲基纤维素1.0%-3.0%；

AD+，氧化态的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸 0.5%-3.0%；

pH值为7.0的磷酸钾缓冲液65%-80%；

医药级蒙脱石钙或医药级蒙脱石钠1%-10%。

8.权利要求2-7任一项所述的总胆汁酸检测试纸在制备总胆汁酸检测试纸中的应用。

9.权利要求1所述的总胆汁酸检测试剂在制备总胆汁酸检测试纸中的应用。

10.利用权利要求2-7任一项所述的总胆汁酸检测试纸进行总胆汁酸检测的方法，其特征在于，包括如下步骤：

一、制作线性曲线图：

收集比重为1.018的新鲜尿液，配制尿液胆汁酸浓度为0，10, 25, 50,100,200,300μmol/L的尿样；

将总胆汁酸检测试纸置于配套的多参数分析仪中并在工作电极和参比电极两端施加300mV工作电压；

取尿样10-100µL加到总胆汁酸检测试纸的采样口，尿液通过虹吸导样槽自动吸取2µL样品，在多参数分析仪上可检测出与总胆汁酸浓度相对应的电流值；

以总胆汁酸的浓度为横坐标，电流值为纵坐标，绘制出总胆汁酸浓度与电流值的线性关系图；

二、测量被测样品的总胆汁酸浓度值：

将总胆汁酸检测试纸置于多参数分析仪中并在总胆汁酸检测试纸的工作电极和参比电极两端施加300mV工作电压；

取被测样品尿样10-100µL加到总胆汁酸检测试纸的采样口，尿液通过虹吸导样槽自动吸取2µL样品，在多参数分析仪上检测出与取被测样品总胆汁酸浓度相对应的电流值；

该电流值对应的总胆汁酸浓度可直接从上述线性关系图上得出，从而得到被测样品的总胆汁酸浓度值。