CN101943673A - 电化学生物传感器及其制备方法以及细胞积压校正的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种电化学生物传感器，该传感器至少包括盖板，双面胶片和底板，所述双面胶片设置在盖板和底板之间并将两者粘合起来，所述底板上设置有第一工作电极、第二工作电极和参比电极，所述第一工作电极上固定有与被测物质反应的生物试剂，所述第二工作电极上固定有不溶解的电化学反应物质。本发明能同时分别测定物质含量和细胞压积，并用细胞压积测定值对物质含量测定值进行校正，以保证物质含量测定结果不受细胞压积的影响。

Description

电化学生物传感器及其制备方法以及细胞积压校正的方法

技术领域

本发明涉及一种生物测量技术领域，尤其涉及一种电化学生物传感器及其制备方法以及测试准确性的校正方法。

背景技术

电化学生物传感器的工作原理是，物质在外加电压的电极表面发生电子得失，得失电子沿电极传导产生电流，电流与物质浓度成正比，而通过测量电流的强度可以测量物质的浓度。其中，物质首先要传递到电极表面才能发生反应，物质的传递速度取决于溶液传质系数。血液中溶质传质系数主要受细胞压积(红细胞比例)的影响，细胞压积越高，传质系数越小，反之亦然。以血糖测试为例，细胞压积每增加1％，快速血糖仪的测试值就有可能降低1％(The effect of hematocrit is significant，with a bias of-1％per％Hct。Edmond Magner，Analyst，2001，126：861)。正常人全血细胞压积范围为35％～55％，由此引起的血糖测试误差达到20％，因此对细胞压积的影响进行校正是提高血糖仪测试准确性的主要途径。

一种消除细胞压积影响的方法是在电极表面加血清分离膜(Douglas，etal.US6818180B2)，血液经血清分离膜分离红细胞后得到的单纯血清再与电极表面的酶发生反应。这种方法可以彻底消除细胞压积的影响，但电极结构复杂，不仅需要测试条上固载血清分离膜，还需要构建血清引流渠，也需要较多的血液才能产生足够检测量的血清。

欧洲专利说明书EP1394545A1公开了一种采用交流阻抗来测定细胞压积的方法，并依此对血糖测定值进行校正。不同细胞压积的血液样品具有不同的溶质扩散传质系数，溶质扩散系数的的差异导致交流阻抗谱相位移的变化。PCT专利说明书WO2005/003748A1也采用类似的交流相位移法测定细胞压积并对血糖测定值进行校正，测定分为5个步骤：1)施加第一个交流信号于血液样品；2)测定第一个信号的相角响应；3)施加第二个交流信号于血液样品；4)测定第二个信号的相角响应；5)、由两次相角响应差值计算细胞压积值。但是，交流方法测定细胞压积对仪器的电路和电源的要求较高，需要复杂的电子线路和控制原件，无疑会增加仪器成本。

中国专利说明书CN1815236A介绍了在血糖测定体系中增加测定流速的电极来测定细胞压积。在血糖测试电极的后端增加一流速测定电极，根据血液从血糖工作电极流动到测速电极的时间来计算细胞压积，并由此对血糖值进行校正。细胞压积影响血液的流动速度，细胞压积越高，血液流动速度越慢。然而，血液流动速度除与细胞压积有关以外，还受采血量的影响，特别是对于末梢血测定。当末梢血采血量不足时，血液可能只流到血糖工作电极，需要再次挤压采血部分以增加血量，增加的血量继续进样才能达到测速电极，这会导致错误的流速时间测定结果。

PCT国际专利说明书WO2008/040982A1提出了，在血糖测定体系中增加一微电极阵列来测定细胞压积。掩膜光刻技术产生的微电极阵列与血糖测试的参比电极共同组成细胞压积测定体系。血糖工作电极表面所发生的反应为平面扩散控制的反应，产生瞬态电流；微电极阵列电极表面所发生的反应为球形扩散控制的反应，产生稳态响应电流。由两种响应电流的时间变化规律可以求出溶质在血液样品中的扩散系数及细胞压积，并对血糖测定值进行校正。血糖工作电极由丝网印刷技术制备，微电极阵列由掩膜光刻技术制备，测试条的制备工艺复杂；两种电极响应的都是葡萄糖氧化酶的反应产物，难免会相互干扰。

发明内容

本发明实施例提供一种电化学生物传感器，该传感器至少包括盖板，双面胶片和底板，双面胶片设置在盖板和底板之间并将两者粘合起来，底板上设置有第一工作电极、第二工作电极和参比电极，第一工作电极上固定有与被测物质反应的生物试剂，第二工作电极上固定有不溶解的电化学反应物质。

本发明实施例还提供一种电化学生物传感器的制备方法，该方法包括：形成用于血糖测定的第一工作电极、用于细胞压积测定的第二工作电极、用于与第一工作电极或第二工作电极组成电化学测试系统的参比电极；在第一工作电极上固定与被测物质反应的试剂；在第二工作电极上固定不溶解的电化学反应物质；以及用双面胶片粘合盖板和底板，形成虹吸进样通道。

本发明实施例再提供一种利用上述电化学生物传感器对被测物测定值进行细胞压积校正的方法，该方法包括：用第二工作电极上测定的细胞压积值对第一工作电极上的被测物测定值进行校正；被测样品细胞压积偏高时，给予被测物测定值正补偿；被测样品细胞压积偏低时，给予被测物测定值负补偿。

本发明实施例在同一血液体系中实现血糖和细胞压积的分别测定，并根据细胞压积的测定值对血糖测定值进行校正。测定细胞压积时采用的是不溶解于血液中的电化学反应物质，如银、铜、铁、氧化铜、三氧化二铁等金属及其化合物的纳米或微米颗粒，这些颗粒被粘结剂固定在细胞压积测定电极上，对血糖测定没有影响。不溶解的电化学反应物质还可以直接是磁控溅射的金、银、铜等电极导轨。血糖测试采用的是固定在血糖测试电极表面的葡萄糖氧化酶或葡萄糖脱氢酶及电子传递媒体，固定的酶不会向细胞压积测试电极扩散，因此对细胞压积测定没有影响。

附图说明

此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本申请的一部分，并不构成对本发明的限定。在附图中：

图1为本发明实施例中血糖测定试条的结构示意图。

图2为本发明实施例中血糖测定试条制备方法的流程图。

图3为本发明实施例的细胞压积测定结果示意图。

图4为本发明实施例的细胞压积测定值对血糖测定值的校正结果示意图。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例和附图，对本发明实施例做进一步详细说明。在此，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，但并不作为对本发明的限定。

实施例一

本实施例提供一种电化学生物传感器。如图1所示，以血糖测定试条为例说明本发明的电化学生物传感器。

该血糖测定试条包括盖板110，双面胶片120和底板130，双面胶片120设置在盖板110和底板130之间并将两者粘合起来。

盖板110由亲水材料制成，如亲水塑料，其上设置有用于排气的小孔111。

底板130上设置有用于血糖测定的第一工作电极131、用于细胞压积测定的第二工作电极133、用于与第一工作电极或第二工作电极组成电化学测试系统的参比电极135。其中，底板130由PET、PP、PVC等塑料制成。其中，血糖测定和细胞压积测定可以共用一个参比电极，也可以采用两个参比电极供两种测定独自使用。所有电极的排列顺序没有特殊要求。此外，还可以包括触发电极136，用于感测到有被测样品存在而启动测量仪器。

第一工作电极131表面固定有血糖检测试剂132。血糖检测试剂132至少包括一种与葡萄糖反应的酶和一种电子传递媒体。酶与葡萄糖反应而得到电子并转移给电子传递媒体，电子传递媒体在电极表面发生氧化而产生电流，仪器检测所产生的电流并换算出葡萄糖的浓度。与葡萄糖反应的酶可以是葡萄糖氧化酶，也可以是葡萄糖脱氢酶。电子传递媒体可以是铁氰化钾、二茂铁及其衍生物、钌的络合物、苯醌类化合物等。

第二工作电极133表面固定用于细胞压积测定的反应试剂134。该反应试剂134为不溶解的电化学反应物质。该物质在外加电压下发生电化学氧化或还原而产生电流，所产生的电流在仪器、工作电极导轨、参比电极导轨和血氧样品组成的导电回路中传递，其中在血液样品中的导电是靠电解质离子定向迁移来完成的。电解质离子来自于外加缓冲试剂或血液自身的盐分。电解质离子在血液样品中的迁移速度与血液细胞压积有关，细胞压积越高、离子迁移速度越慢，响应电流就越小，从而实现细胞压积的检测。不溶解的电化学反应物质是指电化学反应前不溶解于或微溶解于缓冲液、血液等以水为溶剂的液体中的物质，但不限制它们在有机溶剂中的溶解性，也不限制它们电化学反应后在水溶液或血液中溶解性。这些物质可以是银、铜、铁、氯化银、氧化铜、三氧化二铁等金属及其化合物的纳米或微米颗粒，也可以是苯胺衍生物、苯酚衍生物、苯醌衍生物等有机类化合物。

双面胶片120的一侧设有开槽121，对应于电极反应区域，即暴露第一工作电极131和第二工作电极132上有试剂的一端，以及参考电极135和触发电极136。此外，通过该开槽121，双面胶片120与盖板110和底板130一起形成虹吸进样通道。

本实施例中与葡萄糖反应的酶也可换成与胆固醇、β-3-羟丁酸、尿酸、乳酸等物质反应的酶，从而用于血液中这些物质的检测。

实施例二

本实施例提供一种电化学生物传感器的制备方法。如图2所示，以制备血糖测定试条为例说明本发明的电化学生物传感器的制备方法。该方法包括：

步骤S210：在底板上形成用于血糖测定的第一工作电极、用于细胞压积测定的第二工作电极、用于与第一工作电极或第二工作电极组成电化学测试系统的参比电极。

所有电极可以采用丝网印刷技术或磁控溅射技术进行制备。采用丝网印刷技术制备时，印刷材料为导电碳油墨、导电银油墨或其他任何一种导电油墨；采用磁控溅射技术制备时，溅射材料可以是金、钯、镍等金属。

步骤S220：在第一工作电极上固定血糖检测试剂；

血糖检测试剂至少包括一种与葡萄糖反应的酶和一种电子传递媒体。与葡萄糖反应的酶可以是葡萄糖氧化酶，也可以是葡萄糖脱氢酶。与葡萄糖反应的酶也可换成与胆固醇、β-3-羟丁酸、尿酸、乳酸等物质反应的酶，从而用于血液中这些物质的检测。电子传递媒体可以是铁氰化钾、二茂铁及其衍生物、钌的络合物、苯醌类化合物等。固定的方法可以是吸附法、交联法、溶胶-凝胶法、粘合剂法等。吸附法固定酶只需要将酶液直接滴加在第一工作电极表面上，酶的疏水基团与疏水的电极表面经范德华力而吸附。交联法固定酶可以在酶液中加入戊二醛等交联试剂。溶胶-凝胶法固定酶可以将酶溶入二氧化硅水溶胶、二氧化钛水溶胶、明胶等试剂中，在第一工作电极表面干燥后形成凝胶。粘合剂法固定酶可以将酶与粘合剂及其他辅料配成可印刷的浆料，丝网印刷在电极表面。电子传递媒体可以与酶一起滴加或印刷在第一工作电极的表面上。

步骤S230：在第二工作电极上固定用于细胞压积测定的反应试剂；

不溶解的电化学反应物质是指电化学反应前不溶解于或微溶解于缓冲液、血液等以水为溶剂的液体中的物质，但不限制它们在有机溶剂中的溶解性，也不限制它们电化学反应后在水溶液或血液中溶解性。这些物质可以是银、铜、铁、氯化银、氧化铜、三氧化二铁等金属及其化合物的纳米或微米颗粒，也可以是苯胺衍生物、苯酚衍生物、苯醌衍生物等有机类化合物。固定方法具体为，将不溶解电化学反应物质的颗粒与粘合剂、有机溶剂及其他辅助试剂配制成可印刷的油墨，丝网印刷在第二工作电极表面，或者将它们溶解在有机溶剂中直接滴加在电极表面。不溶解的电化学反应物质还可以直接是磁控溅射的金、银、铜等电极导轨。

步骤S240：用双面胶片粘合盖板和底板，形成虹吸进样通道。

在双面胶片上开设开槽121，对应于电极反应区域，即暴露第一工作电极和第二工作电极上有试剂的一端，以及参考电极和触发电极。盖板由亲水材料制成，如亲水塑料，其上设置有用于排气的小孔。

实施例三

本实施例提供一血糖测定试条的制备实例，从而说明本发明的电化学生物传感器及其制备方法，以及利用该电化学生物传感器对被测物测定值进行细胞压积校正的方法。

采用丝网印刷技术在0.25mm厚PET塑料底板上制作触发电极、第一工作电极、参比电极和第二工作电极。触发电极、第一工作电极和第二工作电极采用从Acheson(日本)公司购买的导电碳油墨制作。参比电极采用从Acheson(日本)公司购买的银/氯化银油墨制作。

在第一工作电极表面固定反应试剂1用于葡萄糖的检测。滴加2μL含1000U/ml葡萄糖氧化酶、2.5％戊二醛、1％羧基二茂铁试剂于工作电极1表面，50℃烘干。

在第二工作电极表面固定反应试剂2用于细胞压积的测定。取100ml松油醇，加入2g羟乙基纤维素，加热至80℃使羟乙基纤维素完全溶解，加入1g亚微米级金粉末，充分搅拌后印刷在工作电极2表面，烘干待用。

固定反应试剂1和反应试剂2后，用双面胶片将亲水盖片和PET底板粘合，双面胶片上设有开槽，对应于电极反应区域，即暴露第一工作电极和第二工作电极上有试剂的一端，以及参考电极和触发电极。PET底板、双面胶片和盖片组成虹吸进样通道。

将以上方法构建的传感器试条与检测仪器联接。加样后，检测仪器分别向工作电极1与参比电极组成的测定系统、工作电极2与参比电极组成的测定系统施加工作电压，两个系统独自进行检测。用第二工作电极上测定的细胞压积值对第一工作电极上的被测物测定值进行校正；当被测样品细胞压积偏高时，给予被测物测定值正补偿；当被测样品细胞压积偏低时，给予被测物测定值负补偿。

图3是细胞压积测定结果示意图。如图3所示，当血液的细胞压积为20％～70％时，响应电流与细胞压积有良好的线性关系，R2＝0.9936。

图4是细胞压积测定值对血糖测定值的校正结果示意图。如图4所示，细胞压积校正前，细胞压积低时血糖测定值高于YSI标定值，细胞压积高时血糖测定值低于YSI标定值。为此，仪器对细胞压积偏低样品的血糖值给予负补偿，对细胞压积偏高样品的血糖值给予正补偿。细胞压积校正后，血糖测定值在各细胞压积范围均与YIS标定值良好吻合。

以上所述的具体实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (14)

1.一种电化学生物传感器，该传感器至少包括盖板，双面胶片和底板，所述双面胶片设置在盖板和底板之间并将两者粘合起来，其特征在于：

所述底板上设置有第一工作电极、第二工作电极和参比电极，所述第一工作电极上固定有与被测物质反应的生物试剂，所述第二工作电极上固定有不溶解的电化学反应物质。

2.根据权利要求1所述的电化学生物传感器，其特征在于：所述与被测物质反应的生物试剂包括与被测物质反应的酶和一种电子传递媒体。

3.根据权利要求2所述的电化学生物传感器，其特征在于：所述与被测物质反应的酶为与葡萄糖、胆固醇、β-3-羟丁酸、尿酸或乳酸反应的酶；所述电子传递媒体为铁氰化钾、二茂铁及其衍生物、钌的络合物或苯醌类化合物。

4.根据权利要求1所述的电化学生物传感器，其特征在于：所述不溶解的电化学反应物质是银、铜、铁、氯化银、氧化铜、三氧化二铁或其化合物的纳米或微米颗粒，或者是苯胺衍生物、苯酚衍生物或苯醌衍生物。

5.根据权利要求1所述的电化学生物传感器，其特征在于：所述双面胶片的一侧设有开槽，暴露所述第一工作电极和第二工作电极上有试剂的一端，以及参考电极，且在与所述盖板和底板130之间形成虹吸进样通道。

6.根据权利要求1所述的电化学生物传感器，其特征在于：所述底板上设置有触发电极，用于启动测量仪器。

7.一种电化学生物传感器的制备方法，其特征在于，该方法包括：

形成用于血糖测定的第一工作电极、用于细胞压积测定的第二工作电极、用于与第一工作电极或第二工作电极组成电化学测试系统的参比电极；

在第一工作电极上固定与被测物质反应的试剂；

在第二工作电极上固定不溶解的电化学反应物质；以及用双面胶片粘合盖板和底板，形成虹吸进样通道。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：通过丝网印刷技术或磁控溅射技术在底板上形成所述电极。

9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：通过吸附法、交联法、溶胶-凝胶法或粘合剂法将与被测物质反应的试剂固定到所述第一工作电极上。

10.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：通过丝网印刷或滴定干燥方法将不溶解的电化学反应物质固定到所述第二工作电极上。

11.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：所述与被测物质反应的试剂包括与被测物质反应的酶和一种电子传递媒体。

12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于：所述与被测物质反应的酶为与葡萄糖、胆固醇、β-3-羟丁酸、尿酸或乳酸反应的酶；所述电子传递媒体为铁氰化钾、二茂铁及其衍生物、钌的络合物或苯醌类化合物。

13.根据权利要求10所述的方法，其特征在于：所述不溶解的电化学反应物质是银、铜、铁、氯化银、氧化铜、三氧化二铁或其化合物的纳米或微米颗粒，或者是苯胺衍生物、苯酚衍生物或苯醌衍生物。

14.一种利用如权利要求1所述的电化学生物传感器对被测物测定值进行细胞压积校正的方法，其特征在于，该方法包括：

用第二工作电极上测定的细胞压积值对第一工作电极上的被测物测定值进行校正；被测样品细胞压积偏高时，给予被测物测定值正补偿；被测样品细胞压积偏低时，给予被测物测定值负补偿。

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