CN111044585A - 一种双试纸条左旋多巴检测系统及其方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种双试纸条左旋多巴检测系统及其方法。该系统包含试纸条I、试纸条II和检测仪。试纸条包含工作电极和参比电极，其中试纸条I工作电极上固定有牛血清白蛋白，试纸条II工作电极上固定有酪氨酸酶。在使用时，待测样本被注入到两试纸条的工作区，插入检测仪的试纸条插口，与内部的印刷电路板相接，检测电流I1与I2，计算差分电流，即为左旋多巴的响应电流，通过浓度换算公式计算得到左旋多巴的浓度并在显示屏上输出，实现左旋多巴的定量检测，并具有检测限低、抗干扰、操作简单、工艺简化的特点。

Description

一种双试纸条左旋多巴检测系统及其方法
技术领域
本发明涉及电化学分析技术领域，具体涉及一种用于定量检测左旋多巴的电化学系统及方法。
背景技术
左旋多巴(L-DOPA)是酪氨酸经酪氨酸羟化酶的作用下羟化产生的一种氧化产物，在酪氨酸酶作用下会转化为多巴醌，左旋多巴是治疗帕金森病的重要药物。左旋多巴被服用后，会在脑中经多巴脱羧酶脱羧作用转化为多巴胺，从而起到替代治疗的效用，左旋多巴从而被广泛用于帕金森病的治疗。但在临床实践中，左旋多巴的剂量控制仍然困扰着医务工作者，因剂量问题导致的疗效不佳或副作用等问题层出不穷。因此，定量检测人体样本中的左旋多巴含量能够有效保证患者的健康生命安全。
近些年，大量的左旋多巴检测方法被提出，包括化学发光法、高效液相层析法、电化学方法和光谱法等。其中，电化学方法凭借其高稳定性、设备简单和探测速度快等优点引起了广泛的关注，目前已有多篇文献报道了相关的检测方法，包括基于计时电流法的一次性试纸条(Brunetti B,Valdés-Ramírez,Gabriela,Litvan I,et al.ElectrochemistryCommunications,2014,48:28-31.)、基于方波伏安法的介入式微针阵列(Goud K Y,MoonlaC,Mishra R K,et al.ACS sensors,2019,4(8):2196-2204.)和连续动态监测的可穿戴汗液条带(Tai L C,Liaw T S,Lin Y,et al.Nano letters,2019,19(9):6346-6351.)等等。然而，体液中左旋多巴的含量极低，仅为μM级甚至亚μM级的浓度，同时还存在含量远高于它的其他干扰物质，因此，要准确地检测体液中的左旋多巴含量仍然具有很大挑战。
目前，丝网印刷试纸条法已经广泛应用于糖尿病患者血糖浓度监测，具有样本量小(指尖血)、微创、使用方便、操作简单、适合家用等优势。但是正常血糖浓度在4-6mM，而左旋多巴浓度在μM级别，相差1000倍，因此简单采用现有血糖试纸改进来检测左旋多巴的浓度还存在很大困难。
发明内容
本发明针对现有技术存在的上述不足与困难，提供了一种定量检测体液中的左旋多巴的双试纸条差分检测法。该方法用于检测左旋多巴具有较低的检测限，能够较好地避免体液中其他物质的干扰。
本发明解决其技术问题所采取的技术方案如下所述：
一种双试纸条左旋多巴检测系统，该系统设有两片试纸条和检测仪；两片试纸条的结构相同，均包含两个电极，分别为工作电极和参比电极；其中，第一片试纸条的工作电极上还固定有牛血清白蛋白，第二片试纸条的工作电极上固定有酪氨酸酶；所述检测仪包含两个试纸条插口和印刷电路板，每片试纸条用于分别插入一个试纸条插口中，且每片试纸条上的工作电极和参比电极均能在插入状态下连接到印刷电路板，构成用于左旋多巴检测的双电极体系；所述检测仪在外加电势下，通过第一片试纸条获得待测样本中的左旋多巴在恒电势下直接催化所产生的检测电流以及与酪氨酸酶等量的牛血清白蛋白所产生的基础电流，通过第二片试纸条获得待测样品中的左旋多巴被酪氨酸酶反应后检测得到的基础电流。
作为优选，所述工作电极为普鲁士蓝修饰的碳电极，所述的参比电极为银/氯化银电极。
作为优选，所述的工作电极上修饰有碳纳米管、石墨烯或金属纳米颗粒，以提高检测的灵敏度。
作为优选，所述的试纸条还包含对电极，与工作电极和参比电极构成三电极体系。
作为优选，所述的印刷电路板包含前端输入电路、单片机、锂电池及外围电路，所述的前端输入电路与两个试纸条插口相连，所述单片机与前端输入电路相连，所述锂电池及外围电路用于供电；所述的印刷电路板还可以连接用于显示检测信息的显示屏。
进一步的，所述的前端输入电路包含两组相连的互阻抗放大器和模数转换元件，两个互阻抗放大器分别与两个试纸条插口一一对应相连。
进一步的，所述的前端输入电路仅包含一组顺次相连的可编程模拟开关、互阻抗放大器和模数转换元件，所述的可编程模拟开关与两个试纸条插口分别相连。
作为优选，所述的试纸条采用丝网印刷技术制造，从下到上依次是基底层、电极层、绝缘层、双面胶层和外层，其中电极层包括工作电极和参比电极；所述绝缘层和双面胶层在两个电极的检测区域开始有凹型缺口，双面胶层具有一定厚度，进而在基底层和外层之间形成一个供待测样品注入所述检测区域的注液微腔。
本发明的另一目的在于提供一种采用上述任一项方案所述检测系统的双试纸条左旋多巴检测方法，其具体方法为：
将待测样品滴加于第一片试纸条和第二片试纸条的检测区域，然后将两片试纸条分别插入两个试纸条插口中，使每片试纸条上的工作电极和参比电极各自与检测仪内的印刷电路板构成双电极体系；
待第二片试纸条上的酪氨酸酶将待测样品中的左旋多巴完全催化生成多巴醌后，对两片试纸条的双电极体系施加相同的恒电势，在第一片试纸条内直接催化样本中的左旋多巴，产生电流I1；而第二片试纸条上检测得到基础电流I2，计算两者的差分电流，根据差分电流与左旋多巴浓度间的换算公式计算得到待检测的左旋多巴浓度。
作为优选，所述的浓度换算公式是差分电流与待测样品中左旋多巴浓度之间的线性拟合公式。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：检测限较低，能较好地避免体液中其他物质的干扰，用于检测的试纸条制作方法简易、成本低廉，与检测仪结合很好地实现了手持式检测，在用药安全和临床监测等领域有较好的前景。
附图说明
图1是本发明的整体结构示意图；
图2是本发明的试纸条示意图与爆炸图；
图3是本发明的第一种检测仪电路原理图；
图4是本发明的第二种检测仪电路原理图；
图5是试纸条I和试纸条II在相同浓度的L-DOPA样品中检测得到的电流随时间变化的曲线。
图6是试纸条在左旋多巴加标的PBS溶液中检测的电流值与其浓度之间的线性关系图。
图中附图标记为：塑料外壳1、显示屏2、试纸条插口3、试纸条4、注液微腔4.1、基底层4.2、工作电极4.3、参比电极4.4、绝缘层4.5、双面胶层4.6、外层4.7。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的实例作详细说明，本实例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述实例。
如图1所示，在本发明的一较佳实施例中提供了一种双试纸条左旋多巴检测系统，在该系统中设有检测仪和两个试纸条4，分别记为第一片试纸条4(下文称为试纸条I)和第二片试纸条4(下文称为试纸条II)。检测仪包含塑料外壳1、显示屏2、两个试纸条插口3和封装在内部的印刷电路板。如图2所示，本发明中用于左旋多巴检测的两片试纸条4的结构相同，均包含两个电极，分别为工作电极4.3和参比电极4.4。本实施例中，试纸条4采用丝网印刷技术制造，从下到上依次是基底层4.2由、工作电极4.3和参比电极4.4组成的电极层、绝缘层4.5、双面胶层4.6和外层4.7，其中绝缘层4.5和双面胶层4.6在两个电极的检测区域开始有凹型缺口，双面胶层4.6具有一定厚度，进而在基底层4.2和外层4.7之间形成一个供待测样品注入所述检测区域的注液微腔4.1，而工作电极4.3和参比电极4.4的电极工作区位于该注液微腔4.1的底部。外层4.7上在注液微腔4.1顶部开设一个注液孔，使用时待测样品通过该注液孔注入该注液微腔4.1中，外层4.7为透明材质，可直接观察到样品是否注入。
检测过程需要使用两个试纸条4，虽然两片试纸条4的结构相同，但是其电极上固定的酶/蛋白质是不同的，其中试纸条I的工作电极4.3上固定有牛血清白蛋白BSA，试纸条II的工作电极4.3上固定有酪氨酸酶。
检测仪的塑料外壳1上同时设有两个试纸条插口3，内部设有印刷电路板，同时表面设有按键和显示屏2。两片试纸条4可以各自插入对应的试纸条插口3中，且每片试纸条4上的工作电极4.3和参比电极4.4均能在插入状态下连接到印刷电路板的电极触点，构成用于左旋多巴检测的双电极体系。检测仪在外加电势下，通过试纸条I获得待测样本中的左旋多巴直接由恒电势催化所产生的检测电流(还包括与酪氨酸酶浓度一致的牛血清白蛋白产生的基础电流)，通过试纸条II获得待测样品中的左旋多巴被酪氨酸酶反应后检测得到的基础电流。
在使用时，取微量样品注入到试纸条I和试纸条II的注液微腔4.1内，两片试纸条4分别插入到两个不同的试纸条插口3内，每条试纸条4的工作电极4.3和参比电极4.4均与印刷电路板上的供信号输入的金属触点导通，由此构成左旋多巴检测的双电极体系，等待30s后开始检测。如图5所示，在外加恒电势下，试纸条I直接催化样本中的L-DOPA，产生电流I1；而试纸条II上的酪氨酸酶在等待时间内催化L-DOPA生成多巴醌，多巴醌无法在电极上发生反应，因此检测到的电流I2为去除L-DOPA后的基础电流(包含电极充电电流和各种干扰物质)。通过单片机的控制单元处理得到差分电流△I＝I1-I2，即为L-DOPA的响应电流，利用浓度换算公式计算得到样品中的L-DOPA浓度，并在显示屏2上显示。
在本发明中，两个试纸条的电极获得样品中的浓度电信号，而印刷电路板的作用在于接收电极所采集的浓度电信号，并对信号进行处理和输出显示。一般而言，印刷电路板包含前端输入电路、单片机、锂电池及外围电路，前端输入电路与两个试纸条插口3相连，单片机与前端输入电路相连，锂电池及外围电路用于供电；印刷电路板还连接用于显示检测信息的显示屏2。在本发明中，印刷电路板的具体形式以及电路结构，基本可按照图3或图4的两种电路原理图来设计：第一种电路原理图的前端输入电路包含两组相连的互阻抗放大器与模数转换元件，两个互阻抗放大器分别与两个试纸条插口3一一对应相连，电信号分两路输入到单片机内；第二种电路原理图则包含一组顺次相连的可编程模拟开关、互阻抗放大器和模数转换元件，可编程模拟开关与两个试纸条插口3分别相连，两路电信号都连接到可编程模拟开关上，分步采集。两者皆可实现检测仪所需的功能，其余功能可根据需要进行设计，也可以采用现有的市售产品，并非本发明的关键。一般而言，印刷电路板上需要设置上述的前端输入电路、单片机、锂电池及外围电路。电极所采集的电信号通过前端输入电路传输至单片机内，然后处理后输出到显示屏2上。
在双电极体系中，工作电极4.3可以采用任意现有技术中的电化学电极实现。但在本实施例中，提供了如图2所示的一种丝网印刷技术制造的普鲁士蓝(PB)修饰碳电极，兼具较低的成本与较好的催化性能的优势，同时工作电极4.3也可以进一步修饰碳纳米管、石墨烯或金属纳米颗粒以提高检测的灵敏度。检测过程需要使用的两个试纸条的工作电极4.3上分别提前固定了相同浓度、相同体积的BSA和酪氨酸酶，酶固定方法可以采用任意现有技术实现。但在本实施例中，试纸条仅满足一次性使用需求即可，因此采用简单的干燥法。
同样的，参比电极4.4可以采用任意现有技术中的银/氯化银电极实现。但在本实施例中，其为一种丝网印刷技术制造的银/氯化银电极。
当然，如有必要，还可以在试纸条4的基底层4.2上通过丝网印刷技术制造对电极，对电极也通过试纸条插口3连接到印刷电路板，由此构成三电极体系，以提高L-DOPA检测的稳定性。
另外，本发明的一个实施例中，用于数据处理的浓度换算公式由图6的拟合直线得到，其为试纸条4在左旋多巴加标的PBS溶液中检测的电流值与其浓度之间的线性关系。将含有不同浓度L-DOPA的PBS溶液注入到试纸条4的工作区，在外加恒电势下检测响应电流，拟合直线得到的灵敏度即为待测样品的L-DOPA浓度与其响应电流之间的换算关系。本发明采用双试纸条法去除检测电流中的干扰电流和基础电流后，获得的差分电流△I就是L-DOPA的响应电流，其与灵敏度的乘积即为检测的L-DOPA浓度，从而实现左旋多巴的定量检测。
以上所述的实施例只是本发明的一种较佳的方案，然而并非用以限制本发明。有关技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，还可以做出各种变化和变型。因此凡采取等同替换或等效变换的方式所获得的技术方案，均落在本发明的保护范围内。

Claims (10)

1.一种双试纸条左旋多巴检测系统，其特征在于，设有两片试纸条(4)和检测仪；两片试纸条(4)的结构相同，均包含两个电极，分别为工作电极(4.3)和参比电极(4.4)；其中，第一片试纸条(4)的工作电极(4.3)上还固定有牛血清白蛋白，第二片试纸条(4)的工作电极(4.3)上固定有酪氨酸酶；所述检测仪包含两个试纸条插口(3)和印刷电路板，每片试纸条(4)用于分别插入一个试纸条插口(3)中，且每片试纸条(4)上的工作电极(4.3)和参比电极(4.4)均能在插入状态下连接到印刷电路板，构成用于左旋多巴检测的双电极体系；所述检测仪在外加电势下，通过第一片试纸条(4)获得待测样本中的左旋多巴在恒电势下直接催化所产生的检测电流以及与酪氨酸酶等量的牛血清白蛋白所产生的基础电流，通过第二片试纸条(4)获得待测样品中的左旋多巴被酪氨酸酶反应后检测得到的基础电流。
2.如权利要求1所述的双试纸条左旋多巴检测系统，其特征在于，所述工作电极(4.3)为普鲁士蓝修饰的碳电极，所述的参比电极(4.4)为银/氯化银电极。
3.如权利要求1所述的双试纸条左旋多巴检测系统，其特征在于，所述的工作电极(4.3)上修饰有碳纳米管、石墨烯或金属纳米颗粒，以提高检测的灵敏度。
4.如权利要求1所述的双试纸条左旋多巴检测系统，其特征在于，所述的试纸条(4)还包含对电极，与工作电极(4.3)和参比电极(4.4)构成三电极体系。
5.如权利要求1所述的双试纸条左旋多巴检测系统，其特征在于，所述的印刷电路板包含前端输入电路、单片机、锂电池及外围电路，所述的前端输入电路与两个试纸条插口(3)相连，所述单片机与前端输入电路相连，所述锂电池及外围电路用于供电；所述的印刷电路板还可以连接用于显示检测信息的显示屏(2)。
6.如权利要求5所述的双试纸条左旋多巴检测系统，其特征在于，所述的前端输入电路包含两组相连的互阻抗放大器和模数转换元件，两个互阻抗放大器分别与两个试纸条插口(3)一一对应相连。
7.如权利要求5所述的双试纸条左旋多巴检测系统，其特征在于，所述的前端输入电路仅包含一组顺次相连的可编程模拟开关、互阻抗放大器和模数转换元件，所述的可编程模拟开关与两个试纸条插口(3)分别相连。
8.如权利要求1所述的双试纸条左旋多巴检测系统，其特征在于，所述的试纸条(4)采用丝网印刷技术制造，从下到上依次是基底层(4.2)、电极层、绝缘层(4.5)、双面胶层(4.6)和外层(4.7)，其中电极层包括工作电极(4.3)和参比电极(4.4)；所述绝缘层(4.5)和双面胶层(4.6)在两个电极的检测区域开始有凹型缺口，双面胶层(4.6)具有一定厚度，进而在基底层(4.2)和外层(4.7)之间形成一个供待测样品注入所述检测区域的注液微腔(4.1)。
9.一种采用如权利要求1～7中任一项所述的检测系统的双试纸条左旋多巴检测方法，其特征在于，步骤如下：
将待测样品滴加于第一片试纸条(4)和第二片试纸条(4)的检测区域，然后将两片试纸条(4)分别插入两个试纸条插口(3)中，使每片试纸条(4)上的工作电极(4.3)和参比电极(4.4)各自与检测仪内的印刷电路板构成双电极体系；
待第二片试纸条(4)上的酪氨酸酶将待测样品中的左旋多巴完全催化生成多巴醌后，对两片试纸条(4)的双电极体系施加相同的恒电势，在第一片试纸条(4)中直接催化样本中的左旋多巴，产生电流I1；而第二片试纸条(4)上检测得到基础电流I2，计算两者的差分电流，根据差分电流与左旋多巴浓度间的换算公式计算得到待检测的左旋多巴浓度。
10.如权利要求9所述的双试纸条左旋多巴检测方法，其特征在于，所述的浓度换算公式是差分电流与待测样品中左旋多巴浓度之间的线性拟合公式。
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