CN108107209B

CN108107209B - 一种检测分泌型报告蛋白含量的优化方法及其所用生物材料

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Publication number: CN108107209B
Application number: CN201710845521.0A
Authority: CN
Inventors: 刘长振; 李晶哲; 郭志兰
Original assignee: EXPERIMENTAL RESEARCH CENTER CHINA ACADEMY OF CHINESE MEDICAL SCIENCES
Current assignee: EXPERIMENTAL RESEARCH CENTER CHINA ACADEMY OF CHINESE MEDICAL SCIENCES
Priority date: 2017-09-19
Filing date: 2017-09-19
Publication date: 2020-07-24
Anticipated expiration: 2037-09-19
Also published as: CN108107209A

Abstract

本发明公开了一种检测分泌型报告蛋白含量的优化方法及其所用生物材料。该方法包括：1)提供DNA分子，该DNA分子表达由分泌型报告蛋白和标签蛋白连接而成的融合蛋白；2)将该DNA分子导入生物细胞，得到含有所述DNA分子的重组生物细胞，用培养基培养该重组生物细胞，使所述融合蛋白表达，用结合针对所述标签蛋白的抗体的免疫磁珠从培养基中收集融合蛋白，得到融合蛋白‑免疫磁珠复合物；3)将该融合蛋白‑免疫磁珠复合物在含有所述分泌型报告蛋白的底物的液体中检测所述分泌型报告蛋白的信号，根据所述信号确定所述分泌型报告蛋白的含量。本发明降低了检测的噪声背景并增加了灵敏性和准确性；增强了检测的应用性和重复性。

Description

一种检测分泌型报告蛋白含量的优化方法及其所用生物材料

技术领域

本发明涉及生物领域中一种检测分泌型报告蛋白含量的优化方法及其所用生物材料。

背景技术

生物发光成像是目前在基础生物医学研究中非常受重视且广泛应用的一种技术。在体内或体外实验中，生物发光是化学能转化为可见光。该反应基于荧光素酶在氧的存在下，使荧光素底物发生生化转化，产生发射光。在过去的十年中，生物发光成像已成为非侵入性监测的生物学方法，例如用于基因表达、蛋白质-蛋白质相互作用、T细胞和干细胞转运、肿瘤发生和治疗应答等方面，并进一步用于药物研发所需的高通量筛选实验的数据读出。

分泌型Nanoluc(secNluc)(GenBank:AFI79293.1)是一个新设计的分泌荧光素酶，具有结构稳定，半衰期长的优点。其发光强度高，辉光型动力学表现优秀，因此将成为生物发光成像研究中最有价值的工具之一。这种工程化的荧光素酶是单体的，并且在活细胞内和培养基中，可以在几天的半衰期内保持较高的酶稳定性。它利用腔肠素或furimazine，一种腔肠素模拟为底物，产生辉光型发光。secNluc的发光信号更明亮，大约是已广泛应用于生物医学研究的萤火虫荧光素酶和海肾萤光素酶的150倍。这些优点使secNluc成为生物发光成像的一个吸引人的工具。目前secNluc已经被用来产生各种各样的转基因生物和细胞，用于体内和体外研究。

与细胞内荧光素酶相比，分泌型荧光素酶在许多应用中是有特殊优点，例如非侵入性的定量评估、实时监测和药物高通量筛选。因此，分泌型的secNluc在这些研究领域中将成为有力的研究工具。尽管secNluc具有稳定性高，半衰期长和信号发射强度高的特点，但是报告系统应用该酶时有一些制约。例如，如同其它分泌型荧光素酶一样，secNluc分泌导致不可避免的与一些干扰成分的交融，如血清和残留的实验试剂、细胞培养时所用的培养基或在生物样品，如血液或尿液中存在；信号强度在低密度的细胞实验检测中可能不够强大。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何将分泌报告蛋白与周围的干扰因素分离开，降低检测中的信噪比，增加了检测的灵敏性和准确性，同时将分泌报告蛋白置于优化的反应体系，增强其辉光型动力学表现，并且实现对分泌报告蛋白的富集，增强了检测的灵敏度。

为了解决以上技术问题，本发明提供了一种检测分泌型报告蛋白含量的优化方法。

本发明所提供的检测分泌型报告蛋白含量的方法，包括：

1)制备DNA分子，所述DNA分子表达由分泌型报告蛋白和标签蛋白连接而成的融合蛋白；

2)将所述DNA分子导入生物细胞，得到含有所述DNA分子的重组生物细胞，用培养基培养所述重组生物细胞，使所述融合蛋白表达，用结合针对所述标签蛋白的抗体的免疫磁珠从所述培养基中收集(富集)融合蛋白，得到融合蛋白-免疫磁珠复合物；

3)将所述融合蛋白-免疫磁珠复合物在含有所述分泌型报告蛋白的底物的液体中检测所述分泌型报告蛋白的信号，根据所述信号确定所述分泌型报告蛋白的含量。

上述方法中，所述DNA分子可为载体或表达盒。所述DNA分子可只表达由所述分泌型报告蛋白和所述标签蛋白连接而成的融合蛋白，还可表达其它蛋白质，如当所述DNA分子为表达载体时，还可表达筛选标记蛋白。

上述方法中，所述生物细胞可为离体的细胞。

上述方法中，所述分泌型报告蛋白可为分泌型荧光素酶。

上述方法中，所述分泌型荧光素酶可为如下P1)或P2)：

P1)、氨基酸序列是序列表中序列2的第1-199位的蛋白质；

P2)、氨基酸序列与序列表中序列2的第1-199位具有90％以上的同一性且具有分泌型荧光素酶活性的蛋白质。

上述方法中，具有90％以上的同一性可为具有至少91％、92％、95％、96％、98％、99％或100％的同一性。

上述方法中，所述标签蛋白(protein-tag)是指利用DNA体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和/或纯化。所述标签蛋白可为Flag标签蛋白。

Flag标签蛋白为编码8个氨基酸的亲水性多肽，其氨基酸序列为DYKDDDDK。

上述方法中，所述融合蛋白的氨基酸序列可为序列表中序列2。

上述方法中，所述液体由溶质和溶剂组成，所述溶质为所述分泌型报告蛋白的底物，所述溶剂为PBST缓冲液；所述PBST缓冲液由溶质和溶剂组成，所述溶质为TritonX-100，所述溶剂为磷酸盐缓冲液(PBS)。

上述方法中，所述PBST缓冲液的pH值为7.0-8.5，如7.5，Triton X-100在所述PBST缓冲液的体积百分浓度为0.01％-0.1％。

上述方法中，所述磷酸盐缓冲液由溶质和溶剂组成，所述溶质为2mmol/L磷酸二氢钾，10mmol/L磷酸氢二钠，137mmol/L氯化钠，2.7mmol/L氯化钾；所述溶剂为水。

为了解决以上技术问题，本发明还提供了检测分泌型报告蛋白含量的成套系统(试剂盒或成套试剂)

本发明所提供的检测分泌型报告蛋白含量的成套系统，包括a、b和c；

所述a为所述DNA分子，

所述b为所述分泌型报告蛋白的底物，

所述c为所述结合针对所述标签蛋白的抗体的免疫磁珠。

上述检测分泌型报告蛋白含量的成套系统还可包括所述PBST缓冲液。

上述检测分泌型报告蛋白含量的成套系统可只由所述a、所述b、所述c和所述PBST缓冲液组成。

所述融合蛋白或与所述融合蛋白相关的生物材料也属于本发明的保护范围，所述生物材料可为下述B1)至B15)中的任一种：

B1)编码所述融合蛋白的核酸分子；

B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；

B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体；

B4)含有B2)所述表达盒的重组载体；

B5)含有B1)所述核酸分子的重组微生物；

B6)含有B2)所述表达盒的重组微生物；

B7)含有B3)所述重组载体的重组微生物；

B8)含有B4)所述重组载体的重组微生物；

B9)含有B1)所述核酸分子的转基因动物细胞系；

B10)含有B2)所述表达盒的转基因动物细胞系；

B11)含有B3)所述重组载体的转基因动物细胞系；

B12)含有B4)所述重组载体的转基因动物细胞系；

B13)含有B1)所述核酸分子的转基因植物细胞系；

B14)含有B2)所述表达盒的转基因植物细胞系；

B15)含有B3)所述重组载体的转基因植物细胞系；

B16)含有B4)所述重组载体的转基因植物细胞系。

上述生物材料中，编码所述融合蛋白的核酸分子具体可为编码序列是序列表中序列1的第14-655位的DNA分子。

上述生物材料中，B9)至B16)可包括繁殖材料也可不包括繁殖材料。

上述生物材料中，B9)至B12)所述的转基因动物细胞系可为将表达所述融合蛋白的DNA分子导入哺乳动物细胞系(如GP2-293细胞)得到的重组细胞。

所述方法、所述成套系统、所述融合蛋白或所述生物材料的下述1)-7)中的任一种应用也属于本发明的保护范围：

1)在检测基因表达中的应用；

2)在检测蛋白质-蛋白质相互作用中的应用；

3)在检测T细胞转运中的应用；

4)在检测干细胞转运中的应用；

5)、在制备检测肿瘤发生的产品(试剂或试剂盒)中的应用；

6)、在制备检测肿瘤治疗应答的产品(试剂或试剂盒)中的应用；

7)、在制备筛选目标物(如药物)的产品(试剂或试剂盒)中的应用。

本发明使分泌型荧光素酶(secNluc)融合标签蛋白构建出融合蛋白，从而将secNluc从培养基中分离，摆脱血清或残余试剂干扰，降低检测中的信噪比，增加了检测的灵敏性和准确性，同时可以富集分泌型荧光素酶从而大力增加信号强度，可以检测低至20个细胞/孔细胞实验中的荧光信号，并且为荧光素酶提供最优反应环境，提高动力学曲线稳定性。本发明有助于secNluc等分泌荧光素酶在生物医学研究中，特别是在需要高灵敏度、低噪声和高重现性的实验中的应用。

附图说明

图1为pQCXIP-secNluc-FLAG的结构示意图。

图2为pQCXIP-secNluc-FLAG的BglⅡ和AgeⅠ识别位点间的序列。

图3为M2anti-FLAG magnetic beads(Sigma)本身没有背景信号。

图4为2.5μl磁珠M2anti-FLAG magnetic beads分别加入到100μl培养基中的实验组的secNluc的回收率。

图5为10μl和2.5μl磁珠M2anti-FLAG magnetic beads分别加入到2ml培养基中的实验组的secNluc的回收率。

图6为10μl和2.5μl磁珠M2anti-FLAG magnetic beads分别加入到5ml培养基中的实验组的secNluc的回收率。

图7为细胞培养液的检测限。

图8为细胞接种密度的检测限。

图9为本发明检测分泌型报告蛋白含量的方法消除残余试剂甘草酸对secNluc-FLAG的荧光素酶活性影响。

图10为各个体系在无TNF-α刺激下的secNluc-FLAG的荧光素酶活性。

图11为各个体系在TNF-α刺激下的secNluc-FLAG的荧光素酶活性。

图12为各个体系在TNF-α刺激下的secNluc-FLAG的荧光素酶信号的比率。

图13为pH值、FBS和残余试剂对secNluc催化的生物发光反应的影响。(A)secNluc的纯化制备及鉴定。(B)不同pH值的DMEM和RPMI1640培养基对secNluc催化的生物发光反应的影响。(C)血清对secNluc催化的生物发光反应的影响。(D)栀子苷、川芎嗪、甘草酸、葛根素对secNluc催化发光反应的影响。纵坐标值表示RLU不同中药单体组比对照组的值。**,P<0.01，***,P<0.001。

图14为不同缓冲液对secNluc催化发光反应稳定性的影响。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的PBST的pH为7.5，溶质为Triton X-100，溶剂为磷酸盐缓冲液(PBS)，Triton X-100在PBST缓冲液的体积百分浓度为0.03％。

PBS由溶质和溶剂组成，溶质为2mmol/L磷酸二氢钾、10mmol/L磷酸氢二钠、137mmol/L氯化钠、2.7mmol/L氯化钾，溶剂为水。

实施例1、检测分泌型报告蛋白含量的方法

1、制备表达由分泌型报告蛋白和标签蛋白连接而成的融合蛋白的DNA分子pQCXIP-secNluc-FLAG

将pQCXIP-NF-κB-NLuc(郭志兰,车路阳,李晶哲,等.NF-κB荧光素酶报告基因系统的构建及验证.生物工程学报,2016,32(10):1465–1473)的BglⅡ和AgeⅠ识别位点间的序列替换为图2所示的序列，并将pQCXIP-NF-κB-NLuc的AgeⅠ和EcoRⅠ识别位点间的序列替换为序列表中序列1的序列，保持pQCXIP-NF-κB-NLuc的其它核苷酸序列不变，得到表达由分泌型报告蛋白和标签蛋白连接而成的融合蛋白secNluc-Flag的DNA分子pQCXIP-secNluc-FLAG(图1)。

pQCXIP-secNluc-FLAG含有NF-κB的顺式作用元件、TATAlike启动子、secNluc-Flag的编码序列(序列表中序列1的第14-655位)。secNluc-Flag的氨基酸序列是序列表中序列2，序列表中序列2的第1-199位是分泌型报告蛋白secNluc的氨基酸序列，序列表中序列2的第204-211位是标签蛋白Flag的氨基酸序列。

pQCXIP-secNluc-FLAG的BglⅡ和AgeⅠ识别位点间的序列如图2所示，由NF-κB的顺式作用元件(图1中以“NF-κB”表示)和TATAlike启动子(图1中以“TATA box”表示)，图1中的secNluc表示secNluc的编码序列，Flag-Taq表示Flag标签蛋白。

2、由分泌型报告蛋白和标签蛋白连接而成的融合蛋白secNluc-Flag的制备

根据说明书操作，使用Lipofectamine 2000(Life Technologies)将pQCXIP-secNluc-FLAG转入GP2-293细胞，得到重组细胞GP2-293/pQCXIP-secNluc-FLAG，在加湿，5％CO₂，37℃培养，培养基分别为下述四种培养基：DMEM培养基、RPMI1640培养基、含10％(v/v)灭活胎牛血清的DMEM(以下简称D10培养基)和含10％(v/v)灭活胎牛血清的RPMI1640(以下简称R10培养基)。分别培养24小时后，培养液中含有融合蛋白secNluc-Flag。将M2anti-FLAG magnetic beads(Sigma)按如下方式加入到培养液中(2.5μl磁珠分别加入到100μl、2ml、5ml培养液中，10μl磁珠分别加入到2ml、5ml培养液中)，室温振荡混合10min。磁力架吸附磁珠，得到融合蛋白-免疫磁珠复合物，即secNluc-Flag-免疫磁珠复合物。

3、磁珠纯化对secNluc-Flag的荧光信号的影响

步骤2的融合蛋白-免疫磁珠复合物以PBST洗涤2次后以100μl PBST重悬，得到融合蛋白-免疫磁珠复合物重悬液。在96孔板内直接加入100μl融合蛋白-免疫磁珠复合物重悬液及腔肠素至腔肠素浓度为3μmol/L使用Biotek Synergy 2多功能酶标仪(Biotek，美国)在96孔板中测定生物发光，给出相对荧光单位(RLU)。作为实验组。

同时设PBST对照，将融合蛋白-免疫磁珠复合物重悬液替换为等体积的PBST作为对照。

同时设磁珠对照，将100μl融合蛋白-免疫磁珠复合物重悬液替换为90μl PBST和10μl M2anti-FLAG magnetic beads(Sigma)作为磁珠对照。

结果表明，PBST对照和磁珠对照的发光信号没有差别，说明M2anti-FLAGmagnetic beads(Sigma)本身没有背景信号(图3)。

结果表明，100μl培养基中，2.5μl磁珠M2anti-FLAG magnetic beads(Sigma)几乎回收了所有的secNluc-FLAG蛋白(图4)。在2ml、5ml培养基中，10μl磁珠M2anti-FLAGmagnetic beads(Sigma)可回收约90％和80％secNluc-FLAG，2.5μl磁珠M2anti-FLAGmagnetic beads(Sigma)可以回收约65％和50％secNluc-FLAG蛋白(图5和图6)。值得注意的是，四种介质的回收率没有明显差异(图4)。

4、本发明的检测分泌型报告蛋白含量的方法提高了检测的灵敏度

4.1、根据说明书操作，使用Lipofectamine 2000(Life Technologies)将pQCXIP-secNluc-FLAG转入GP2-293细胞，得到重组细胞GP2-293/pQCXIP-secNluc-FLAG，在加湿，5％CO₂，37℃培养，培养基分别为D10培养基和R10培养基。分别培养24小时后，每种培养基中的培养液各分为两组，用D10培养基得到的培养液分为D10组和融合蛋白-免疫磁珠复合物D10纯化组，用R10培养基得到的培养液分为R10组和融合蛋白-免疫磁珠复合物R10纯化组。D10组和R10组分别取1ml培养液，D10组用D10培养基、R10组用R10培养基分别进行0、2、4、8、16、32、64、128、256、512和1024倍梯度稀释，得到梯度稀释液，上述梯度稀释液各取100μl，加入96孔板内，再加入腔肠素至其浓度为3μmol/L使用Biotek Synergy2多功能酶标仪(Biotek，美国)在96孔板中测定生物发光，给出相对荧光单位(RLU)。

融合蛋白-免疫磁珠复合物D10纯化组用D10培养基、融合蛋白-免疫磁珠复合物R10纯化组用R10培养基分别进行0、2、4、8、16、32、64、128、256、512和1024倍梯度稀释，得到梯度稀释液，上述梯度稀释液各取100μl，分别加入2.5μl磁珠M2anti-FLAG magneticbeads(Sigma)，室温振荡混合10min。磁力架吸附磁珠，得到融合蛋白-免疫磁珠复合物。融合蛋白-免疫磁珠复合物以PBST洗涤2次后以100μlPBST重悬，得到融合蛋白-免疫磁珠复合物重悬液。在96孔板内直接加入100μl融合蛋白-免疫磁珠复合物重悬液及腔肠素至腔肠素浓度为3μmol/L使用Biotek Synergy 2多功能酶标仪(Biotek，美国)在96孔板中测定生物发光，给出相对荧光单位(RLU)。

结果如图7所示，D10组(图7中以“D10”表示)和R10组(图7中以“R10”表示)的secNluc-FLAG的检测限均是稀释至16倍，融合蛋白-免疫磁珠复合物D10纯化组(图7中以“D10with beads purification”表示)和融合蛋白-免疫磁珠复合物R10纯化组(图7中以“R10with beads purification”表示)的secNluc-FLAG的检测限均是稀释至1024倍，说明本发明的检测分泌型报告蛋白含量的方法的灵敏度是不纯化直接检测方法的64倍。

4.2、将重组细胞GP2-293/pQCXIP-secNluc-FLAG，按照如下细胞接种密度梯度接种于24孔板中：2×10⁵个/孔、2×10⁴个/孔、2×10³个/孔、2×10²个/孔、2×10¹个/孔，在加湿，5％CO₂，37℃培养，培养基为含10％(v/v)灭活胎牛血清的DMEM(D10)。培养24小时后，每种细胞接种密度的培养液分为两组：D10组和融合蛋白-免疫磁珠复合物D10纯化组。D10组直接取100μl培养液，加入96孔板内，再加入腔肠素至其浓度为3μmol/L使用BiotekSynergy 2多功能酶标仪(Biotek，美国)在96孔板中测定生物发光，给出相对荧光单位(RLU)。融合蛋白-免疫磁珠复合物D10纯化组，取100μl培养液，加入2.5μl磁珠M2anti-FLAGmagnetic beads(Sigma)，室温振荡混合10min。磁力架吸附磁珠，得到融合蛋白-免疫磁珠复合物。融合蛋白-免疫磁珠复合物以PBST洗涤2次后以100μl PBST重悬，得到融合蛋白-免疫磁珠复合物重悬液。在96孔板内直接加入100μl融合蛋白-免疫磁珠复合物重悬液及腔肠素至其浓度为3μmol/L使用Biotek Synergy 2多功能酶标仪(Biotek，美国)在96孔板中测定生物发光，给出相对荧光单位(RLU)。

结果如图8所示，D10组(图8中以“D10”表示)的secNluc-FLAG的检测限是2×10³个/孔，融合蛋白-免疫磁珠复合物D10纯化组(图8中以“D10with beads purification”表示)的secNluc-FLAG的检测限是2×10¹个/孔，说明本发明的检测分泌型报告蛋白含量的方法的灵敏度是不纯化直接检测方法的100倍。

可见，采用本发明的检测分泌型报告蛋白含量的方法的灵敏度是不纯化直接检测方法的64-100倍。

5、本发明的检测分泌型报告蛋白含量的方法不受残余试剂的影响

本实验中用甘草酸模拟残余试剂。

将重组细胞GP2-293/pQCXIP-secNluc-FLAG，在加湿，5％CO₂，37℃培养，培养基为D10培养基。培养24小时后，培养液分为两组：D10组和融合蛋白-免疫磁珠复合物D10纯化组。D10组直接取100μl培养液，加入96孔板内，加入甘草酸溶液(溶剂为DMSO)至甘草酸的浓度分别为12.5、25、50和100μg/ml，得到分别含有不同浓度的甘草酸的培养液，以加入等体积的DMSO作为对照组(control)，再加入腔肠素至其浓度为3μmol/L，使用Biotek Synergy2多功能酶标仪(Biotek，美国)在96孔板中测定生物发光，给出相对荧光单位(RLU)。

融合蛋白-免疫磁珠复合物D10纯化组，分别向100μl上述不同浓度的甘草酸的培养液中加入2.5μl磁珠M2anti-FLAG magnetic beads(Sigma)，室温振荡混合10min。磁力架吸附磁珠，得到融合蛋白-免疫磁珠复合物。融合蛋白-免疫磁珠复合物以PBST洗涤2次后以100μl PBST重悬，再加入腔肠素至其浓度为3μmol/L，使用Biotek Synergy 2多功能酶标仪(Biotek，美国)在96孔板中测定生物发光，给出相对荧光单位(RLU)。

结果如图9所示，D10组(图9中以“D10”表示)的secNluc检测信号受残余试剂甘草酸的影响很大，融合蛋白-免疫磁珠复合物D10纯化组(图9中以“D10with beadspurification”表示)的secNluc-FLAG检测信号不受残余试剂甘草酸的影响。

实施例2、本发明的检测分泌型报告蛋白含量的方法测试TNF-α刺激下的NF-κB激活情况

本实施例以已知的NF-κB活化因子TNF-α为例阐明本发明的检测分泌型报告蛋白含量的方法在筛选药物中的应用。具体方法如下：

根据说明书操作，使用Lipofectamine 2000(Life Technologies)将实施例1的pQCXIP-secNluc-FLAG转入Hela细胞，得到重组细胞Hela/pQCXIP-secNluc-FLAG，在5％CO₂，37℃湿润环境中培养，培养基为含10％(v/v)灭活胎牛血清的DMEM(D10)。细胞计数，分别以0、125、250、500、1000、2000、4000和8000个/孔的接种密度接种培养于24孔板中。50ng/ml的TNF-α用于NF-κB信号通路的测试。每孔加或不加TNF-α，加TNF-α的孔中TNF-α的含量为50ng/ml，不加TNF-α的孔中TNF-α的含量为0ng/ml。12h后，经与未经TNF-α刺激的10μl、50μl和100μl细胞培养液分别与90μl、50μl和0μl的PBST混合后按照上述方法测定生物发光情况。将10μl细胞培养液与90μl PBST混合的体系命名为10％Medium，将50μl细胞培养液与50μl PBST混合的体系命名为50％Medium，将100μl细胞培养液与0μlPBST混合的体系命名为Medium。同时，设置如下磁珠纯化组(Beads Purification)：取100μl经与未经TNF-α刺激的细胞培养液，分别加入2.5μl磁珠M2anti-FLAG magnetic beads(Sigma)，室温振荡混合10min。磁力架吸附磁珠，得到融合蛋白-免疫磁珠复合物。融合蛋白-免疫磁珠复合物以PBST洗涤2次后以100μl PBST重悬。检测生物发光情况。

结果表明在培养基中，当接种细胞数量较少时RLU保持600单位(无TNF-α刺激，细胞少于4000个/孔和有TNF-α刺激，细胞少于500个/孔)(图10和图11)。在没有进行磁珠纯化的各个实验中，当接种细胞少于4000个/孔时，对TNF-α刺激反应信号的呈低增长倍数，表明检测的TNF-α刺激应答性低(图12)。然而在磁珠纯化组，即使接种细胞最少为125个/孔时，对TNF-α刺激信号呈高增长倍数，表明检测的TNF-α刺激应答性高(图12)。此外，虽然用PBST稀释(50％Medium和10％Medium)可以降低背景信号(图10和11)，这两组与培养基组相比，当接种量少于8000个/孔时在TNF-α刺激后信号增长倍数没有增加，表明单用PBST稀释而未用磁珠纯化的方式对TNF-α刺激应答性依然很低(图12)。

本发明的发明人在做出本发明之前，分析了pH值、血清和残余试剂对secNluc催化发光反应的影响，发现这些因素可以降低生物发光反应信号，导致结果不准确，具体实验方法和实验结果如下：

1、secNluc的制备

将pQCXIP-NF-κB-NLuc(郭志兰,车路阳,李晶哲,等.NF-κB荧光素酶报告基因系统的构建及验证.生物工程学报,2016,32(10):1465–1473)的BglⅡ和AgeⅠ识别位点间的序列替换为图2所示的序列，并将pQCXIP-NF-κB-NLuc的AgeⅠ和EcoRⅠ识别位点间的序列替换为secNluc基因，保持pQCXIP-NF-κB-NLuc的其它核苷酸序列不变，得到表达分泌型报告蛋白secNluc的重组载体pQCXIP-secNluc。其中，secNluc基因的核苷酸序列是将序列表中序列1的第611-652位核苷酸去除，保持序列1的其它核苷酸不变得到的序列。secNluc基因的核苷酸序列与序列表中序列1的区别仅在于缺失序列表中序列1的第611-652位核苷酸。

pQCXIP-secNluc表达氨基酸序列是序列表中序列2第1-199位的secNluc。

根据说明书操作，使用Lipofectamine 2000(Life Technologies)将pQCXIP-secNluc转入GP2-293细胞，得到重组细胞GP2-293/pQCXIP-secNluc，在加湿，5％CO₂，37℃培养48小时，培养基为无血清的DMEM。培养液经过超滤浓缩后使用磷酸盐缓冲液(PBS，pH＝7.4)透析，然后分子排阻色谱(Superdex 75,GE Healthcare)。蛋白质从13ml左右的峰开始收集并且经12％SDS-PAGE分析，从SDS-PAGE分析结果表明，收集蛋白分子量约22kD，这是相符的secNluc理论分子量(图13中A)。纯化的secNluc的荧光素酶活性在以下实验中得到证实。

2、pH、胎牛血清和残余试剂对secNluc的影响

pH、FBS和残留试剂，这是在测试细胞周围介质中对secnluc催化的生物发光反应普遍存在的干扰因素，下面研究这三个因素的影响。

DMEM和RPMI1640的pH在5.0-9.0范围内以0.5为间隔调整，构成pH系列梯度。将secNluc和底物腔肠素分别加入到调整pH后的培养基中，最终体积为100μl，得到反应体系。反应体系中secNluc的浓度为20ng/ml，底物腔肠素的浓度为3μmol/L。使用Biotek Synergy2多功能酶标仪(Biotek，美国)在96孔板中测定生物发光。检测血清的影响，将secNluc和底物腔肠素加入到PBS(pH＝7.4)中，100μl/孔。secNluc浓度在0–500pg/ml范围内调整，腔肠素终浓度3μmol/L，PBS分别含有0-10％的胎牛血清(v/v)。生物发光检测同上述。在残留物质影响检测中选取了四种中药单体提取物：栀子苷、川芎嗪、甘草酸、葛根素，以DMSO溶解为5mg/ml母液(100×)。检测时100μl/孔PBS(pH＝7.4)含有secNluc浓度为20ng/ml，腔肠素浓度为3μmol/L以及药物单体母液1μl。纯DMSO为对照组。检测方法同上所述。

结果表明，pH对生物发光的产生显著影响(图13中B)。在pH 7-8.5时，光的强度变化不大，在pH 7.5时光输出最强。然而，当介质pH低于7或超过8.5时，光强度迅速下降。图13中C的结果表明，FBS甚至可能在没有secNluc时存在产生一定程度的发光信号。这一背景信号随血清浓度的升高而升高，并在secNluc较弱时屏蔽其催化反应产生的生物发光信号(13中C)。此外，中药单体例如栀子苷、川芎嗪、甘草酸和葛根素被用来模仿残余试剂。结果表明，虽然栀子苷对secnluc催化的生物发光反应无影响，但是川芎嗪、甘草酸、葛根素确实有影响(13中D)。特别是50μg/ml甘草酸能抑制生物发光信号至40％。结果表明，培养基中的干扰因素，如pH、FBS和残留的试剂，有可能在secnluc催化的生物发光反应有显著影响，因而可能制约secNluc报告系统的应用。

3、secNluc催化生物发光的最佳缓冲体系

接下来关注的是secNluc催化的生物发光反应的最佳缓冲液。这种最佳缓冲液应满足pH值稳定的要求，并有助于产生稳定的辉光型发光动力学，这对报告系统的精确性和可靠性非常重要。

secNluc和底物腔肠素分别加入到pH值为7.5的6种不同的缓冲液中：DMEM培养基、RPMI1640培养基、含10％(v/v)灭活胎牛血清的DMEM(D10培养基)、含10％(v/v)灭活胎牛血清的RPMI1640(R10培养基)、磷酸盐缓冲液(PBS)和含0.03％(v/v)Triton X-100的PBS(PBST)，得到反应体系。反应体系中secNluc的浓度为5ng/ml，底物腔肠素的浓度为3μmol/L。检测方法同上所述。

结果表明，DMEM培养基、RPMI1640培养基、D10培养基和R10培养基的发光信号迅速衰减(图14)。相对光单位(RLU)在60s内，DMEM和RPMI 1640组的下降到初始值的一半；D10组和R10组下降到初始值的65％，120s后上述4组信号几乎完全消失。然而在PBS组和PBST组，生物发光信号的衰减率比前四组明显放缓(图14)。在PBST和PBS两种缓冲液中，PBST提供了最好的环境，150s时RLU值减少低于15％，并且提供稳定pH值，有助于稳定发光型发光动力学的要求。因此，PBST为secNluc催化的生物发光反应的最佳缓冲液。

<110> 中国中医科学院医学实验中心

<120> 一种检测分泌型报告蛋白含量的优化方法及其所用生物材料

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 661

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<221> CDS

<222> (14)..(655)

<400> 1

accggtcgcc accatgaact ccttctccac aagcgccttc ggtccagttg ccttctccct 60

gggcctgctc ctggtgttgc ctgctgcctt ccctgcccca gtcttcacac tcgaagattt 120

cgttggggac tggcgacaga cagccggcta caacctggac caagtccttg aacagggagg 180

tgtgtccagt ttgtttcaga atctcggggt gtccgtaact ccgatccaaa ggattgtcct 240

gagcggtgaa aatgggctga agatcgacat ccatgtcatc atcccgtatg aaggtctgag 300

cggcgaccaa atgggccaga tcgaaaaaat ttttaaggtg gtgtaccctg tggatgatca 360

tcactttaag gtgatcctgc actatggcac actggtaatc gacggggtta cgccgaacat 420

gatcgactat ttcggacggc cgtatgaagg catcgccgtg ttcgacggca aaaagatcac 480

tgtaacaggg accctgtgga acggcaacaa aattatcgac gagcgcctga tcaaccccga 540

cggctccctg ctgttccgag taaccatcaa cggagtgacc ggctggcggc tgtgcgaacg 600

cattctggcg acgcgtgccg gtgattacaa ggatgacgat gataaggccg gttaagaatt 660

c 661

<210> 2

<211> 213

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Asn Ser Phe Ser Thr Ser Ala Phe Gly Pro Val Ala Phe Ser Leu

1 5 10 15

Gly Leu Leu Leu Val Leu Pro Ala Ala Phe Pro Ala Pro Val Phe Thr

20 25 30

Leu Glu Asp Phe Val Gly Asp Trp Arg Gln Thr Ala Gly Tyr Asn Leu

35 40 45

Asp Gln Val Leu Glu Gln Gly Gly Val Ser Ser Leu Phe Gln Asn Leu

50 55 60

Gly Val Ser Val Thr Pro Ile Gln Arg Ile Val Leu Ser Gly Glu Asn

65 70 75 80

Gly Leu Lys Ile Asp Ile His Val Ile Ile Pro Tyr Glu Gly Leu Ser

85 90 95

Gly Asp Gln Met Gly Gln Ile Glu Lys Ile Phe Lys Val Val Tyr Pro

100 105 110

Val Asp Asp His His Phe Lys Val Ile Leu His Tyr Gly Thr Leu Val

115 120 125

Ile Asp Gly Val Thr Pro Asn Met Ile Asp Tyr Phe Gly Arg Pro Tyr

130 135 140

Glu Gly Ile Ala Val Phe Asp Gly Lys Lys Ile Thr Val Thr Gly Thr

145 150 155 160

Leu Trp Asn Gly Asn Lys Ile Ile Asp Glu Arg Leu Ile Asn Pro Asp

165 170 175

Gly Ser Leu Leu Phe Arg Val Thr Ile Asn Gly Val Thr Gly Trp Arg

180 185 190

Leu Cys Glu Arg Ile Leu Ala Thr Arg Ala Gly Asp Tyr Lys Asp Asp

195 200 205

Asp Asp Lys Ala Gly

210

Claims

1.检测分泌型报告蛋白含量的方法，包括：

1）提供DNA分子，所述DNA分子表达由分泌型报告蛋白和标签蛋白连接而成的融合蛋白；

2）将所述DNA分子导入生物细胞，得到含有所述DNA分子的重组生物细胞，用培养基培养所述重组生物细胞，使所述融合蛋白表达，用结合针对所述标签蛋白的抗体的免疫磁珠从所述培养基中收集融合蛋白，得到融合蛋白-免疫磁珠复合物；

3）将所述融合蛋白-免疫磁珠复合物在含有所述分泌型报告蛋白的底物的液体中检测所述分泌型报告蛋白的信号，根据所述信号确定所述分泌型报告蛋白的含量；所述分泌型报告蛋白为分泌型荧光素酶；

所述标签蛋白为Flag标签蛋白；

所述底物为腔肠素；

所述液体由溶质和溶剂组成，所述溶质为所述分泌型报告蛋白的底物，所述溶剂为PBST缓冲液；所述PBST缓冲液由溶质和溶剂组成，所述溶质为Triton X-100，所述溶剂为磷酸盐缓冲液；所述PBST缓冲液的pH值为7.0-8.5，Triton X-100在所述PBST缓冲液的体积百分浓度为0.01%-0.1%；

所述分泌型荧光素酶为氨基酸序列是序列表中序列2的第1-199位的蛋白质。

2.检测分泌型报告蛋白含量的成套系统，包括权利要求1的方法中所述的DNA分子、底物、结合针对所述标签蛋白的抗体的免疫磁珠和PBST缓冲液。

3.权利要求1所述的方法或权利要求2所述的成套系统的下述1）-7）中的任一种应用：

1）在检测基因表达中的应用；

2）在检测蛋白质-蛋白质相互作用中的应用；

3）在检测T细胞转运中的应用；

4）在检测干细胞转运中的应用；

5）、在制备检测肿瘤发生的产品中的应用；

6）、在制备检测肿瘤治疗应答的产品中的应用；

7）、在制备筛选目标物的产品中的应用。