CN113337571B - 一种快速、超高灵敏度的TNFα生物活性检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种快速、超高灵敏度的TNFα生物活性检测方法。所述方法包括将待测TNFα与SM‑164和Z‑VAD‑FMK混合(称为TSZ)、以特定的细胞作为测试细胞(诱导其凋亡)，在TSZ检测前进行特定的细胞无血清培养处理，利用TSZ诱导特定几种细胞短时间内产生程序性坏死，进一步可结合多种细胞毒性/活性检测方法，实现超高灵敏度地检测TNFα的生物学活性。

Description

一种快速、超高灵敏度的TNFα生物活性检测方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，更具体地，本发明涉及一种快速、超高灵敏度的TNFα生物活性检测方法。
背景技术
肿瘤坏死因子α(Tumor Necrosis Factor alpha，TNFα)是一种主要由巨噬细胞和其它一些类型细胞如CD4+淋巴细胞、NK细胞等产生的促炎细胞因子。TNFα生物学作用有杀伤肿瘤、促进炎症反应、抗病毒、发热反应与免疫调节等。TNFα在其他多种细胞中也有较低的表达，如成纤维细胞、平滑肌细胞和肿瘤细胞。适量的TNFα可以调节机体免疫功能，对维持机体内部的稳定状态及抵御各种致病因子具有重要意义，然而，TNFα的异常分泌可作为机体炎症、损伤及休克的重要炎症介质。研究表明TNFα不仅对肿瘤细胞具有细胞毒性，还可以诱导产生多种的白细胞介素和干扰素，这些细胞因子的网络活性可以相互协同，形成一系列连锁放大反应，从而加重炎症反应，最终导致机体的大范围损伤，比如感染性休克、多器官损伤、DIC等危重症的发生。TNFα还具有对骨组织的吸收作用而造成对骨的破坏，目前已知的与TNFα相关联的疾病包括：艾滋病、贫血、肿瘤、出血性休克、器官移植的排斥反应、结核病、白血病、糖尿病、类风湿性关节炎等。近些年来，TNFα也是单克隆抗体和蛋白酶抑制剂等相关领域极具重要意义的靶点分子。
在利用基因重组技术体外大量表达制备TNFα已成主流的今日，研究人员越发需要一种快速、高效、高灵敏度的检测TNFα生物活性的方法。以往基于ELISA方法检测TNFα蛋白水平只能反映出蛋白的含量或者蛋白与抗体结合水平，无法真实反映出TNFα在细胞内发挥作用的机制。
传统常见的方法为利用重组TNFα对一些细胞的直接的体外杀伤细胞毒性检测来评价其生物学活性。该方法的主要原理是利用TNFα直接对细胞生长的抑制作用以及TNFα诱导细胞凋亡或坏死的作用，后续使用细胞活性检测方法来检测TNFα的生物学活性。通常此类方法的检测灵敏度范围为90～11250pg/ml。
目前还缺乏一种检测灵敏度更高的技术方法来检测TNFα的生物活性。高灵敏度的TNFα生物活性检测方法，一方面可以用于微量的重组表达的TNFα的生物活性检测，另一方面也可以用于体内或体外微量样品中极微量TNFα生物活性的检测。特别是在轻微炎症时TNFα分泌量比较少的情况下，血液和组织样品中极微量的TNFα的检测还存在困难，对于微量细胞炎症反应是分泌的TNFα的生物活性检测也存在困难。
使用TNFα联合SM-164和Z-VAD-FMK组合药物(简称TSZ)诱导细胞产生程序性坏死是一种研究细胞程序性坏死的方法，同时通过检测细胞坏死时细胞外乳酸脱氢酶LDH的水平来反映细胞毒性也是比较常用的方法。但是，现有技术中，TSZ针对不同细胞产生细胞毒性时，细胞对TNFα的浓度敏感度是不同的，大多数细胞均需要TSZ中很高水平的TNFα存在时才能产生一定程度的细胞毒性，而且此时细胞程序性坏死的程度很低，该情况下用于检测TNFα的生物学活性的灵敏度会很低。
因此，本领域中还需要进一步研究能有效提高检测TNFα生物学活性的灵敏度的检测方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种快速、超高灵敏度的TNFα生物活性检测方法。
在本发明的第一方面，提供一种高灵敏度测定TNFα生物活性的方法，所述方法包括：(1)提供测试细胞，所述测试细胞包括选自：NRK-52E、HT-29、L-929细胞；对测试细胞进行完全生长培养基(含血清)培养，之后去除血清、继续培养3～10小时；(2)将待测TNFα与SM-164和Z-VAD-FMK混合；(3)以(2)与(1)的细胞混合，诱导(1)的细胞程序性坏死；测定细胞坏死程度，进而确定TNFα生物活性。
在一个优选例中，(1)中，所述的完全生长培养基包括：基础培养基以及血清；较佳地还包括抗生素(如但不限于：青链霉素)；较佳地，所述基础培养基包括：DMEM，McCOY's5A，EMEM。
在另一优选例中，(1)中，所述完全生长培养基中，含有5～20％(v/v)的血清。
在另一优选例中，(1)中，去除血清后，继续培养4～9小时，较佳地4.5～8小时(如5、6、7小时)。
在另一优选例中，所述的去除血清是在细胞贴壁后，通过换液的方法更换为不含血清的培养基。
在另一优选例中，所述完全生长培养基中，含有8％、10％、12％、15％(v/v)的血清。
在另一优选例中，(2)中，按照质量体积比，SM-164和Z-VAD-FMK的混合比例为1:(200～1000)；较佳地为1:(300～800)。
在另一优选例中，所述按照质量体积比，SM-164和Z-VAD-FMK的混合比例为1:400，1:450，1:500，1:550，1:600，1:700，1:900。
在另一优选例中，所述测定细胞坏死程度的方法包括选自：细胞毒性检测法，细胞活力检测法。
在另一优选例中，所述细胞毒性检测法包括：细胞外乳酸脱氢酶(LDH)检测法，MTT法。
在另一优选例中，所述细胞活力检测法包括：WST-1(WST-1细胞增殖和细胞毒性检测)、CCK8(Cell Counting Kit-8检测)、CTL(CellTiter-Lumi发光法细胞活力检测)、CTLPlus(CellTiter-Lumi Plus发光法细胞活力检测)、Calcein AM(钙黄绿素细胞活力检测)。
在另一优选例中，所述的方法检测TNFα生物活性的检测限为1pg/ml。
在另一优选例中，所述的方法中，所述的待测TNFα为溶液，包括细胞上清液。
在另一优选例中，所述的待测TNFα可设置为不同稀释度的TNFα溶液。
在另一优选例中，所述的方法为不是以疾病诊断为直接目的(非诊断性)的方法。
在本发明的另一方面，提供一种用于高灵敏度测定TNFα生物活性的试剂盒，其中包括：(a)测试细胞，所述测试细胞包括选自：NRK-52E、HT-29、L-929细胞，或其组合；(b)完全生长培养基(含血清)；(c)无血清的基础培养基；(d)SM-164和Z-VAD-FMK。
在另一优选例中，所述的试剂盒中还包括选自下组的试剂或产品：TNFα生物活性确定的标准品，阴性对照品，细胞毒性检测试剂，细胞活力检测试剂或使用说明书；较佳地，所述细胞毒性检测试剂包括：细胞外乳酸脱氢酶(LDH)检测试剂，MTT检测试剂；较佳地，所述细胞活力检测法包括：WST-1检测试剂、CCK8检测试剂、CTL检测试剂、CTL Plus检测试剂、Calcein AM检测试剂。
在另一优选例中，所述的完全生长培养基包括：基础培养基以及血清；较佳地还包括抗生素(如但不限于：青链霉素)；较佳地，所述基础培养基包括：DMEM，McCOY's 5A，EMEM；较佳地，所述完全生长培养基中，含有5～20％(v/v)的血清。
在另一优选例中，按照质量体积比，SM-164和Z-VAD-FMK的混合比例为1:(200～1000)；较佳地为1:(300～800)。
本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
附图说明
图1、使用TSZ组合药物对常见的多种细胞诱导程序性坏死的效果测试，检测方法为乳酸脱氢酶细胞毒性检测(LDH法)。其中A～D依次对应Hela、A549、BGC-823、MCF-7。
图2、NRK-52E、HT-29、L-929细胞在使用TSZ诱导前经无血清处理6h，以OD490测定值作图，确定细胞程序性坏死的效果，检测方法为乳酸脱氢酶细胞毒性检测(LDH法)。其中A～C依次对应L-929、HT-29、NRK-52E。
图3、TNFα浓度为横坐标(选用以10为底的log对数坐标轴)，酶标仪读数为纵坐标作折线图。其中A～C依次对应L-929、HT-29、NRK-52E，检测方法为乳酸脱氢酶细胞毒性检测(LDH法)。
图4、诱导细胞程序性坏死后进行CCK8(A)或CellTiter-Lumi(CTL，B)的检测结果。其中A～B依次对应OD450测定结果，RLU测定结果。
图5、基于诱导细胞程序性坏死并且后续进行LDH释放的检测，检测方法为乳酸脱氢酶细胞毒性检测(LDH法)。其中A～C依次对应L-929、HT-29、NRK-52E。
图6、使用本发明的方法检测TNFα生物学活性的稳定性测试，检测方法为乳酸脱氢酶细胞毒性检测(LDH法)。其中A～C依次对应L-929、HT-29、NRK-52E。
图7、细胞培养液上清中TNFα活性的检测；其中，Vehicle组：未使用LPS处理RAW264.7细胞，取其稀释后的上清配成的TSZ试剂诱导细胞后检测细胞外LDH水平；LPS组：使用1μg/ml LPS处理RAW 264.7细胞24h，取其稀释后的上清配成的TSZ试剂诱导细胞后检测细胞外LDH水平。其中A～C依次对应L-929、HT-29、NRK-52E。
具体实施方式
本发明人致力于提高TNFα生物活性检测的灵敏度，经过反复研究，揭示了一种高灵敏度TNFα生物活性的检测方法。所述方法包括将待测TNFα与SM-164和Z-VAD-FMK混合(称为TSZ)、以特定的细胞作为测试细胞(诱导其凋亡)，在TSZ检测前进行特定的细胞无血清培养处理，利用TSZ诱导特定几种细胞短时间内产生程序性坏死，进一步可结合多种细胞毒性/活性检测方法，实现超高灵敏度地检测TNFα的生物学活性。
因此，本发明提供了一种高灵敏度测定TNFα生物活性的方法，包括：(1)提供测试细胞，所述测试细胞包括选自：NRK-52E、HT-29、L-929细胞；对测试细胞进行完全生长培养基(含血清)培养，之后去除血清、继续培养3～10小时；(2)将待测TNFα与SM-164和Z-VAD-FMK混合；(3)以(2)与(1)的细胞混合，诱导(1)的细胞程序性坏死；测定细胞坏死程度，进而确定TNFα生物活性。
如本发明所用，所述的“待测TNFα”为所需确定生物活性的TNFα，包括人TNFα(hTNFα)，其可以是存在于溶液(包括不同梯度稀释后的溶液)中的，或是细胞上清液。
如本发明所用，所述的“测试细胞”为适于利用本发明的方法进行处理、并能高效的被TSZ试剂诱导凋亡的细胞，包括选自：NRK-52E、HT-29、L-929细胞。
本发明的方法利用TNFα(如人TNFα)联合SM-164和Z-VAD-FMK组合药物诱导细胞产生程序性坏死的原理，通过细胞活性检测试剂CCK-8、CTL或用于细胞毒性检测的乳酸脱氢酶检测试剂盒等检测细胞中乳酸脱氢酶的释放，来检测细胞程序性坏死的程度；进一步地，根据细胞程序性坏死的程度，来计算TNFα的生物活性。本发明利用TNFα在组合试剂中活性被显著放大来进行高灵敏度的TNFα生物活性检测，具有检测灵敏度极高，检测便捷等优点。
TNF-α是一种主要由巨噬细胞和其它一些类型细胞如CD4+淋巴细胞、NK细胞等产生的促炎细胞因子，不仅具有选择性杀伤某些肿瘤细胞的功能，而且有多种免疫调节作用。生理条件下具有生物学活性的人TNF-α(hTNF-α)是一个紧密的三聚体，其活性位点位于两个相邻亚基之间的V型结构域，hTNF-α有两种不同的受体TNFR1和TNFR2，分别介导不同的生物学活性。在对hTNF-α结构与功能研究的基础上，人们对其N末端、C末端和受体结合位点进行基因改造，研制了一系列衍生物，以提高hTNF-α的抗肿瘤活性，降低毒副反应。
本发明的方法，除了可被应用于检测天然的TNF-α，也可被应用于检测保留其生物活性的TNF-α的变异形式(变体)、衍生物或经修饰的产物。所述TNF-α的变异形式包括(但并不限于)：若干个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个，还更佳如1-8个、1-5个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。任何与所述的TNF-α(比如同源性为80％或更高；更优选地同源性为90％或更高，如同源性95％，98％或99％)的、且具有TNF-α相同生物活性的蛋白也包括在本发明内。
来源于人以外其它物种的与人TNF-α序列同源性较高、或在同样或相近的调控通路中发挥同样或相近作用的多肽也包括在本发明中。在TNF-α两端添加其它蛋白或标签等形成的生物分子、只要其保留有TNF-α的生物活性，则也是本发明的方法的适用对象。
SM-164是Smac(Second mitochondria-derived activator of caspase)的二价模拟物，可渗透细胞，对cIAP-1、cIAP-2和XIAP的抑制常数Ki分别为0.31nM、1.1nM和0.56nM。SM-164是一种抗癌剂，可以诱导肿瘤细胞中cIAP-1/2的降解、拮抗XIAP、诱导TNFα依赖性的凋亡，从而发挥其抗肿瘤作用。
Z-VAD-FMK(carbobenzoxy-valyl-alanyl-aspartyl-[O-methyl]-fluoromethylketone)是一种可穿透细胞膜的泛Caspase抑制剂，可与caspase的催化活性部位发生不可逆结合，抑制细胞凋亡。
本发明的优选方式中，先将SM-164与Z-VAD-FMK制成混合液，再将待测TNFα添加于该混合液中，获得称为TSZ的混合液。
本发明人在研究中发现，大多数细胞经TSZ短时间诱导(3-4h)完全不会产生坏死，甚至诱导24h、48h也无明显的细胞坏死现象。而NRK-52E细胞(肾小管导管上皮细胞)、HT-29细胞(结肠癌细胞)、L-929细胞(成纤维细胞)相对而言能够发生显著的细胞坏死现象，比之其它类型的细胞，其效果相对理想。
更特别地，本发明人在研究中意外地发现，将利用所述TSZ处理测试细胞(包括选自：NRK-52E、HT-29、L-929细胞)前，对于测试细胞进行无血清培养处理，可以极为显著地提高后续检测TNF-α的灵敏度。在经过无血清培养处理(如4-16h，更优为6-8h)后，在TSZ短时间诱导(3-4h)就能产生十分显著的细胞程序性坏死，从而实现快速、超高灵敏度的检测TNFα的生物学活性。
无血清的处理过程中，很有可能细胞中TNFα通路相关蛋白的表达被激活或抑制，从而在加入药物后TNFα作用的受体蛋白将变得对更加敏感。
所述无血清培养处理包括：对测试细胞进行完全生长培养基(含血清)培养，之后去除血清，培养适当的时间，优选3～10小时。
基础培养基添加血清，较佳地还添加抗生素等物质后，形成的培养基称为完全培养基，也叫(血清)细胞培养基。基础培养基能维持细胞生存，但欲使细胞生长和繁殖，还需添加天然培养基，所述血清例如是牛血清，牛血清中含有促细胞增殖的各种生长因子和其他多种有利于细胞生存的物质。为防止污染，培养液中一般会添加一定量的抗生素。完全培养基根据添加血清量的多少，可分为细胞生长培养基和细胞维持培养基，用于不同细胞和不同研究。
基于本发明人优化的检测方法，利用TSZ与所述测试细胞混合，诱导测试细胞程序性凋亡后，可通过多种方法进行细胞坏死程度的测定，进而确定TNFα生物活性。所述测定细胞坏死程度的方法包括选自：细胞毒性检测法，细胞活力检测法。所述细胞毒性检测法包括：细胞外乳酸脱氢酶(LDH)检测法，MTT法等；或所述细胞活力检测法包括：WST-1、CCK8、CTL、CTL Plus、Calcein AM等。
作为本发明的一种优选方式，采用细胞外乳酸脱氢酶(LDH)检测法。LDH是稳定的胞浆酶，存在所有的细胞中，当胞膜损伤时快速释放到细胞培养液中。LDH活性通过两个酶催化反应：LDH氧化乳酸盐生成丙酮酸盐，然后丙酮酸盐和四唑盐INT反应生成甲臜结晶。甲臜结晶量在培养液中的增加，与裂解的细胞数增加直接相关。甲臜结晶染料是水溶的，可以用分光光度计在特定波长检测。根据本发明的实施例，该体系中，利用乳酸脱氢酶细胞毒性检测方法，检测下限可以接近1pg/ml。
作为本发明的另一种可选方式，采用CellTiter-Lum发光法(CTL)，其是一种通过化学发光法测定细胞内ATP含量从而用于定量检测活细胞数目的方法。借助ATP依赖的萤光素酶催化的萤光素发光反应，ATP可以通过测定化学发光来进行定量。由于ATP含量能很好地反映活细胞的数目，而ATP含量和发光强度成正比，这样就可以通过化学发光强度来计算出细胞活力或细胞数目。
作为本发明的另一种可选方式，采用CCK8检测法，其是用于测定细胞增殖或毒性实验中活细胞数目的一种无放射性的比色检测法。其基本原理为：利用WST-8(2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑单钠盐)，它在电子载体1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯(1-Methoxy PMS)的作用下被细胞中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色甲臜产物(Formazan dye)。生成的甲臜物的数量与活细胞的数量成正比。因此可利用这一特性直接进行细胞增殖和毒性分析。
基于本发明人优化的方法，本发明还提供了用于高灵敏度测定TNFα生物活性的试剂盒，其中包括：(a)测试细胞，所述测试细胞包括选自：NRK-52E、HT-29、L-929细胞，或其组合；(b)完全生长培养基(含血清)；(c)无血清的生长培养基(不含血清)；(d)SM-164和Z-VAD-FMK。根据本发明优化的方法，测试细胞的前期处理是非常重要的，也即利用完全生长培养基培养，之后进行无血清培养处理，因此，(b)和(c)的培养基是必要的特征。
作为本发明的优选方式，所述试剂盒中还包括细胞毒性检测试剂，细胞活力检测试剂；更具体例如包括但不限于：细胞外乳酸脱氢酶(LDH)检测试剂，MTT检测试剂；较佳地，所述细胞活力检测法包括：WST-1检测试剂、CCK8检测试剂、CTL检测试剂、CTL Plus检测试剂、Calcein AM检测试剂。
为了便于进行TNFα生物活性的确定，还可以在所述试剂盒中添加TNFα生物活性确定的标准品，可通过将测定结果与标准品进行比较，来了解待测TNFα的生物活性。此外，也可在试剂盒中添加阴性对照品，从而有利于进行检测结果的直观比较。
作为本发明的优选方式，可将SM-164和Z-VAD-FMK制备成混合液的形式，按照质量体积比，SM-164和Z-VAD-FMK的混合比例为1:(200～1000)；较佳地为1:(300～800)。
作为本发明的优选方式，所述试剂盒中，还可包括说明本发明的操作方法的使用说明书，以便于本领域技术人员已恰当的方法进行操作，获得理想的检测效果。
本发明的主要优点在于：
1.灵敏度高：本发明利用重组人TNFα在无血清培养及组合试剂中活性被显著放大来进行高灵敏度的TNFα生物活性检测，具有检测灵敏度极高、耗时短、检测便捷等优点；常规的基于TNFα的细胞毒性的技术方法检测下限约为90pg/ml，本发明则可将检测灵敏度提高50-100倍。
2.检测便捷：诱导细胞毒性仅需4h内即可完成，细胞毒性的检测根据后续所使用的技术方法，进行几分钟至几十分钟即可完成。
3.重复性好，多次重复实验检测结果曲线都很接近，结果稳定，很适合进行高通量检测。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。
除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
材料
Hela、A549、BGC-823、MCF-7、NRK-52E、HT-29、L-929及RAW 264.7为商品化的，购自国家模式与特色实验细胞资源库/中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库(GNR 8)。
TNFα：碧云天产品(P5322)-10μg。
细胞培养所需DMEM培养基，胎牛血清等：购自Gibco。
青霉素-链霉素溶液(100X)：碧云天在售产品C0222。
SM-164药品：碧云天在售产品SC0114。
Z-VAD-FMK药品：碧云天在售产品C1202。
LPS：碧云天在售产品S1732。
PBS：碧云天在售产品C0221A。
LDH乳酸脱氢酶细胞毒性检测试剂盒：碧云天在售产品C0016。
CellTiter-LumiTM发光法细胞活力检测试剂盒为碧云天在售产品C0065。
Cell Counting Kit-8(CCK-8试剂盒)为碧云天在售产品C0037。
酶标仪：购自ThermoFisher。
96孔板：碧云天在售产品FCP962。
实施例1、TNFα生物活性检测方法
一、SZ试剂的制备
使用DMEM基础培养基(不含血清和抗生素)稀释配制50nM SM-164+25μM Z-VAD-FMK(后续简称SZ试剂)。
二、细胞处理
(1)取生长良好的Hela、A549、BGC-823、MCF-7、NRK-52E、HT-29、L-929细胞经过胰酶消化后，使用DMEM完全生长培养基(即DMEM基础培养基+10％胎牛血清+1％青-链霉素)制成细胞悬液。然后，接种在96孔细胞培养板上，调整细胞量，次日细胞生长至约70-95％左右、细胞贴壁时，进行后续实验。
(2)将(1)的培养产物分成两组，一组进行常规的换液处理，即更换一次DMEM完全生长培养基；另一组更换为无血清基础培养基，包括：从(1)的含有贴壁细胞的孔板中吸去原培养基，更换无血清基础培养基进行培养，该培养基为DMEM基础培养基+1％青-链霉素、其中不含有胎牛血清；培养6h。
之后，使用TNFα+SZ试剂诱导细胞坏死。
三、TNFα+SZ试剂(TSZ)试验步骤
1、TNFα的浓度溶液的准备：先使用PBS将待检测的TNFα(P5322-10μg)配制成10μg/ml。
梯度稀释：使用SZ试剂先将TNFα稀释成2500pg/ml，然后再等比稀释成1250、625、312.5、156.25、78.13、39.06、19.53、9.77、4.88、2.44、1.22、0pg/ml(简称为TSZ试剂)。每个浓度体积不少于100μl。此外，也可稀释为后续试验/图例中特定的浓度。
2、取出前述“二”中制备的96孔细胞培养板(其中含有经6h无血清基础培养基培养的贴壁细胞)，吸去原有的培养基，加入含不同浓度TNFα的TSZ试剂，每孔体积100μl。
3、培养箱中继续放置4h。
4、显微镜下观察，通常细胞发生明显的坏死，即可进行后续检测。
5、使用C0037 Cell Counting Kit-8(CCK-8试剂盒)、C0065 CellTiter-LumiTM发光法细胞活力检测试剂盒或参照碧云天C0016乳酸脱氢酶细胞毒性检测试剂盒(根据试剂盒中操作流程)检测TSZ试剂诱导后细胞外LDH的含量。
6、多功能酶标仪上得到数据以后，以TNFα浓度为横坐标(选用以10为底的log对数坐标轴)，多功能酶标仪读数为纵坐标作线型图，以确定不同TNFα样品的生物活性水平的高低。
四、结果
1、使用TSZ组合药物细胞(Hela、A549、BGC-823、MCF-7)诱导程序性坏死的效果测试
如前面“三、试验步骤”中的方法处理，Hela、A549、BGC-823、MCF-7细胞用TSZ处理4小时后，利用碧云天C0016乳酸脱氢酶细胞毒性检测试剂盒检测LDH释放的结果如图1A～D，多数细胞对TSZ药物中TNFα(浓度1ng/ml，10ng/ml)并不敏感。
本发明人反复测试中发现，TSZ对上述几种细胞(Hela、A549、BGC-823、MCF-7)没有明显作用，即使在适当的时候更换无血清基础培养基培养也没有作用(对于NRK-52E等少数细胞来说，更换无血清基础培养基培养才能起到显著增加敏感度的效果，具体见后文)。
因此，使用TSZ组合药物在常见的Hela、A549、BGC-823、MCF-7细胞上进行细胞程序性坏死诱导测试，这些细胞对TSZ药物中TNFα的浓度不敏感，无明显的程序性坏死现象产生。
2、NRK-52E、HT-29、L-929细胞经无血清基础培养基培养对敏感度的影响
本发明人比较了NRK-52E、HT-29、L-929细胞的TSZ处理效果。结果显示，普通的含血清培养的细胞经使用TSZ可诱导产生一定程度的程序性坏死；而令人惊讶的是，经无血清基础培养基培养6h后再使用TSZ诱导细胞产生程序性坏死，可以极为有效地提升程序性坏死诱导效果，增加细胞毒性检测灵敏度，这在三种细胞中呈现了较为一致的结果，如图2A～C。
因此，NRK-52E、HT-29、L-929细胞在使用TSZ诱导前经无血清基础培养基培养6h，可以大大提高细胞对TSZ药物的敏感度，能够有效提升程序性坏死的诱导效果，增加细胞毒性检测的灵敏度。
3、诱导细胞(NRK-52E、HT-29、L-929)程序性坏死后进行TNFα生物学活性的计算
如前面“试验步骤”中的方法处理，包括进行无血清基础培养基培养8h；不同浓度的TNFα诱导4h后，利用碧云天C0016乳酸脱氢酶细胞毒性检测试剂盒检测细胞外LDH含量。
(1)以OD490对TNFα浓度作图，以标准品的最低、最高读数的平均值作平行于X轴的直线，以各相应样品曲线与该直线的交点，在X轴读出半致死量的TNFα浓度。
(2)TNFα生物学活性的计算公式：
TNFα活性(IU/mg)＝标准品效价×(标准品半致死剂量(ED50)/样品半致死剂量)。
对于NRK-52E、HT-29、L-929三种细胞的检测结果如图3，所获得的曲线呈典型的“S”型，TNFα约在1-1000pg/ml之间与OD490呈强相关性。
根据图3A～C可见，NRK-52E的半致死剂量(ED50)为21.5pg/ml、HT-29的ED50为39.1pg/ml、L-929的ED50为19.5pg/ml；三种细胞所检测重组人TNFα样品的ED50约为标准品的2倍。参考标准品，本方法的检测TNFα生物活性的灵敏度可以达到低值1pg/ml级别。这样的灵敏度与本领域常规方法的检测灵敏度(范围约为90～11250pg/ml)相比，具有显著的进步。
因此，基于诱导NRK-52E、HT-29、L-929细胞程序性坏死并且后续进行LDH释放的检测方法，可以用于TNFα的生物活性检测，检测灵敏度非常高。
上述测定结果也显示，NRK-52E、HT-29、L-929细胞可以使用TNFα+SZ试剂在短时间内诱导产生明显的坏死，耗时仅需3-4小时。
4、诱导细胞(NRK-52E、HT-29、L-929)程序性坏死后进行CCK8或CellTiter-Lumi的检测
如前面“试验步骤”中的方法处理，经无血清基础培养基培养5h、并诱导细胞程序性坏死，使用CCK-8试剂盒或CellTiter-LumiTM发光法细胞活力检测试剂盒进行CCK8或CellTiter-Lumi的检测。
TNFα浓度为横坐标(选用以10为底的log对数坐标轴)，酶标仪读数(OD450)为纵坐标作图，结果如图4A～B。
该结果说明，基于诱导细胞程序性坏死并且后续进行CCK8或CellTiter-Lumi的检测方法，可以用于TNFα的生物活性检测。
该结果也显示，基于诱导细胞程序性坏死的方法，后续可以和多种细胞毒性或细胞活性检测试剂盒配合使用，用于检测TNFα的生物活性。相应的细胞毒性或细胞活性检测试剂盒包括但不限于MTT法、WST-1、CCK8、CTL、CTL Plus、Calcein AM等方法。
5、灵敏度检测
利用前面“试验步骤”中所述的步骤进行检测、结合无血清基础培养基培养7h，分别设置TNFα浓度为1pg/ml、2pg/ml、4pg/ml，进行LDH释放的检测，确定检测灵敏度。
结果如图5A～C，1pg/ml TNFα+SZ诱导细胞产生程序性坏死后细胞外LDH含量与阴性组(SZ试剂诱导)的对比有显著性差异。也即，该方法在TNFα浓度为1pg/ml时已能检测出显著性差异。
因此，本发明的方法对于TNFα生物活性的检测灵敏度下限可以达到1pg/ml。
6、稳定性检测
如前同样的方法、结合无血清基础培养基培养6h，基于诱导细胞程序性坏死并且后续进行LDH释放的检测，1个月内三次在L-929、HT-29、NRK-52E细胞上进行的TNFα标准品活性测试的结果。不同时期培养的同一批次的细胞进行上述实验，细胞复苏长好后传代铺板，达到一定汇合度即可进行实验。
结果如图6A～C，该方法重复性很好，不同时间测定后制作的曲线大部分重合。因此，本发明的方法有很好的检测稳定性。
实施例2、细胞培养液上清中TNFα活性的检测
本实施例中，进行细胞培养液上清中TNFα活性的检测，操作方法如下：
1、RAW264.7细胞(小鼠单核巨噬细胞)接种在12孔细胞培养板中，待细胞汇合度达75-90％即可进行实验。
2、使用完全生长培养基(即DMEM基础培养基+10％胎牛血清+1％青-链霉素)稀释配制1μg/ml LPS，在培养箱中孵育24h，诱导细胞分泌产生TNFα；设置不加LPS的阴性对照组(Vehicle)。
3、取阴性组和LPS组孔板中RAW264.7细胞上清各100μl，使用PBS将细胞上清按照1：20稀释，使用稀释后的两种RAW264.7细胞上清液直接稀释SM-164和Z-VAD-FMK配制成2ml的TNFα+50nM SM-164+25μM Z-VAD-FMK(简称TSZ试剂)。
4、然后如前所述处理NRK-52E、HT-29、L-929细胞、无血清基础培养基培养6h(NRK-52E、HT-29、L-929贴壁细胞吸去培养液，换上无血清培养液培养6小时)后，使用不同的TSZ试剂诱导L-929、HT-29、NRK-52E细胞4h，使其产生程序性坏死。
5、使用碧云天C0016乳酸脱氢酶细胞毒性检测试剂盒检测L-929、HT-29、NRK-52E细胞外LDH含量。对应标准品的检测曲线，计算出培养液上清中TNFα的含量，从而比较LPS处理与未处理的RAW 264.7细胞上清中TNFα的含量的差异。
结果如图7A～C，本检测方法可以用于细胞培养液上清中TNFα活性的检测。使用1μg/ml LPS处理RAW 264.7细胞24h，细胞外产生显著水平的TNFα，取其稀释后的上清配制成的TSZ试剂。换上无血清培养液培养6小时后用该TSZ试剂诱导细胞，三种细胞均产生明显的程序性坏死，细胞外LDH水平显著升高。该方法在三种细胞上检测的细胞上清中TNFα水平结果比较一致(均约为900pg/ml)。
本发明人考察了无血清培养液培养的较佳时间，结果显示，无血清培养应控制在合理的时间范围内：时间相对过短时(如短于2小时)，无明显的诱导效果；时间相对过长(例如时间长于12小时)时，一定程度地影响(越长则影响越严重)后续药物诱导和检测，影响检测准确性。
应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (19)

1.一种高灵敏度测定TNFα生物活性的方法，其特征在于，所述方法包括：
(1)提供测试细胞，所述测试细胞选自：NRK-52E、HT-29、L-929细胞；对测试细胞进行完全生长培养基培养，之后去除血清、继续培养3～10小时；所述完全生长培养基包括基础培养基以及血清，所述基础培养基为DMEM，McCOY's 5A或EMEM；
(2)将待测TNFα与SM-164和Z-VAD-FMK混合；
(3)以(2)与(1)的细胞混合，诱导(1)的细胞程序性坏死；测定细胞坏死程度，进而确定TNFα生物活性；
所述的方法为非诊断性的方法。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，(1)中，所述的完全生长培养基还包括抗生素。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，(1)中，所述完全生长培养基中，含有5～20%(v/v)的血清。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，(1)中，去除血清后，继续培养4～9小时。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，(1)中，去除血清后，继续培养4.5～8小时。
6.如权利要求4所述的方法，其特征在于，(1)中，所述的去除血清是在细胞贴壁后，通过换液的方法更换为不含血清的基础培养基。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，(2)中，按照质量体积比，SM-164和Z-VAD-FMK的混合比例为1:(200～1000)。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，(2)中，按照质量体积比，SM-164和Z-VAD-FMK的混合比例为1:(300～800)。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述测定细胞坏死程度的方法选自：细胞毒性检测法，细胞活力检测法。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述细胞毒性检测法包括：细胞外乳酸脱氢酶检测法，MTT法。
11. 如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述细胞活力检测法包括：WST-1细胞增殖和细胞毒性检测、Cell Counting Kit-8检测、CellTiter-Lumi发光法细胞活力检测、CellTiter-Lumi Plus发光法细胞活力检测、钙黄绿素AM细胞活力检测。
12.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述的方法检测TNFα生物活性的检测限为1pg/ml。
13.一种用于高灵敏度测定TNFα生物活性的试剂盒，其特征在于，其中包括：
(a) 测试细胞，所述测试细胞选自：NRK-52E、HT-29、L-929细胞，或其组合；
(b) 完全生长培养基，其包括基础培养基以及血清；
(c) 无血清的基础培养基；
(d) SM-164和Z-VAD-FMK；所述的试剂盒中还包括：TNFα生物活性确定的标准品，阴性对照品，细胞毒性检测试剂，细胞活力检测试剂及使用说明书；
所述基础培养基为DMEM，McCOY's 5A或EMEM。
14.如权利要求13所述的试剂盒，其特征在于，所述细胞毒性检测试剂包括：细胞外乳酸脱氢酶检测试剂，MTT检测试剂。
15. 如权利要求13所述的试剂盒，其特征在于，所述细胞活力检测试剂包括：WST-1细胞增殖和细胞毒性检测试剂、Cell Counting Kit-8检测试剂、CellTiter-Lumi发光法细胞活力检测试剂、CellTiter-Lumi Plus发光法细胞活力检测试剂、钙黄绿素AM细胞活力检测试剂。
16.如权利要求13所述的试剂盒，其特征在于，所述的完全生长培养基还包括抗生素。
17.如权利要求13所述的试剂盒，其特征在于，所述完全生长培养基中，含有5～20%(v/v)的血清。
18.如权利要求13所述的试剂盒，其特征在于，按照质量体积比，SM-164和Z-VAD-FMK的混合比例为1:(200～1000)。
19.如权利要求18所述的试剂盒，其特征在于，按照质量体积比，SM-164和Z-VAD-FMK的混合比例为1:(300～800)。
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