CN101760506A - 一种rhTNFR-Fc融合蛋白生物学活性的检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物技术领域，更具体的是一种重组人肿瘤坏死因子受体-Fc融合蛋白(rhTNFR-Fc)生物学活性的检测方法。本发明提供了一种rhTNFR-Fc生物学活性的检测方法，包括下列步骤：细胞培养；试剂配制；细胞处理；终点测定。本发明所提供的检测方法无需吸出培养液，无需有机溶剂溶解，测定时间缩短，具有灵敏度高、操作简便、结果稳定和可重复性强的特点，且大大减轻工作量，具有一定的实用性和经济性。

Description

一种rhTNFR-Fc融合蛋白生物学活性的检测方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，更具体的是一种重组人肿瘤坏死因子受体-Fc融合蛋白(rhTNFR-Fc)生物学活性的检测方法。

背景技术

类风湿性关节炎是严重影响人类健康的疾病，目前的常规治疗对约四分之一患者无效。研究发现，肿瘤坏死因子(TNF-α)在该疾病的病理进程中起关键作用。对TNF受体(TNFR)的研究表明，II型肿瘤坏死因子受体分布广泛，与肿瘤坏死因子的亲和力较强。这种可溶性受体可以中和TNF，在体内对TNF的活性起负调节作用。用受体免疫球蛋白融合技术，将受体的细胞外区与人免疫球蛋白的Fc段基因融合，在体外表达出相应的重组人肿瘤坏死因子受体(p75)2Fc融合蛋白(rhTNFR-Fc)，它已经开发成为一种新生物制品药物[1]。与化学药物不同，蛋白质类药物的药效体现在于细胞等方面的生物学活性。同时生物学活性的大小也影响药效的大小。所以生物学活性是药物质量控制的重要环节。

目前已经报道的rhTNFR-Fc的生物学活性的检测方法主要为：用改良的TNF-α生物学活性测定方法-采用L929细胞的MTT法[张翊，高凯，韩春梅等.药学学报，2003，38(3)：165-168]。检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒(Formazan)并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜(DMSO)能溶解细胞中的Formazan，用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。该方法已广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等。它的特点是灵敏度高、经济。缺点：由于MTT经还原所产生的Formazan产物不溶于水，需被有机溶剂溶解后才能检测。这不仅使工作量增加，也会对实验结果的准确性产生影响，而且溶解Formazan的有机溶剂对实验者也有损害。

发明内容

本发明所要解决的技术问题提供了一种rhTNFR-Fc生物学活性的检测方法，以解决现有检测方法-L929细胞的MTT法的不足。

为此，本发明公开了一种rhTNFR-Fc生物学活性的检测方法，包括下列步骤：

①细胞培养：取对数生长期的L929细胞，酶消化、离心弃上清，加入细胞培养液接种于细胞培养板中，置于37℃ 5％二氧化碳孵箱中，培养18-24h；

②试剂配制：阳性对照培养液：采用无血清或低血清细胞培养基稀释放线菌素D至终浓度为20μg/mL；阴性对照培养液：采用阳性对照培养液稀释TNF-α母液至终浓度为10ng/mlTNF-α；工作参考品培养液：采用阴性对照培养液稀释TNFR-Fc参考品，由0.5mg/mL倍比稀释5～10个浓度梯度；rhTNFR-Fc样品培养液：采用阴性对照培养液稀释rhTNFR-Fc样品，由0.5mg/mL倍比稀释5～10个浓度梯度；

③细胞处理：取已接种L929细胞的细胞培养板，弃去上清，吸去残留液体；加入已稀释好的rhTNFR-Fc样品培养液、工作参考品培养液和阴性对照培养液、阳性对照培养液，置于37℃ 5％二氧化碳孵箱中，培养18-24h；

④终点测定：加入WST-8溶液，在孵箱中继续孵育1～3小时，用酶标仪测量其A₄₅₀-A₆₅₀值。

本发明所依据的原理在于WST-8是一种类似于MTT的化合物，在电子耦合试剂存在的情况下，可以被线粒体内的一些脱氢酶还原生成橙黄色的Formazan(参考下列反应式)。细胞增殖越多越快，则颜色越深；细胞毒性越大，则颜色越浅。对于同样的细胞，颜色的深浅和细胞数目呈线性关系。

WST-8是MTT的一种升级替代产品，和MTT或其它MTT类似产品如XTT、MTS等相比有明显的优点。首先，MTT被线粒体内的一些脱氢酶还原生成的Formazan不是水溶性的，需要有特定的溶解液来溶解；而WST-8和XTT、MTS产生的Formazan都是水溶性的，可以省去后续的溶解步骤。其次，WST-8产生的Formazan比XTT和MTS产生的Formazan更易溶解。再次，WST-8比XTT和MTS更加稳定，使实验结果更加稳定。另外，WST-8和MTT、XTT等相比线性范围更宽，灵敏度更高。

本发明采用的技术方案是采用小鼠肺纤维瘤L929细胞，利用重组人肿瘤坏死因子受体-Fc融合蛋白中和TNF-α，并用WST-8检测细胞毒性，从而检测重组人肿瘤坏死因子受体-Fc融合蛋白生物学活性的方法

本发明使用的细胞培养基的类型没有限制，只要可用于细胞培养的培养基即可。优选的细胞培养基包括DMEM培养基和RPMI1640培养基。对上面提到的细胞培养基中可能含有的其他组份类型没有限制。

在一些具体实施方式中，所述细胞接种密度1×10⁴～5×10⁴个/孔。

本发明使用的酶的类型没有限制，只要可用于细胞间分离或脱落即可，可为一种或组合的蛋白酶例如胶原酶、胰蛋白酶、中性酶，其中优选胰蛋白酶。

本发明使用的细胞培养板没有限制，只要可用于细胞体外培养即可，优选96孔培养板。

在一些具体实施方式中，所述样品培养液和工作参考品培养液的浓度梯度相同，以便于试验数据的处理。

在一些具体实施方式中，所述WST-8的终浓度0.1～20mM。

MTT比色法需要的时间较长，其代谢产物为非水溶性的，需要加入有机溶剂溶解，步骤多、操作繁琐、重复性较差，极易引入系统误差，且MTT有毒性致突变性，操作时需进行安全防护，测定结果耗时较长。而本发明所提供的检测方法无需吸出培养液，无需有机溶剂溶解，测定时间缩短，具有灵敏度高、操作简便、结果稳定和可重复性强的特点，且大大减轻工作量，具有一定的实用性和经济性。

附图说明

图1一实施例中本发明方法的细胞生长抑制对数曲线；

图2一实施例中本发明方法的生长抑制对数曲线；

图3一实施例中本发明方法的生长抑制对数曲线；

图4一实施例中MTT法的生长抑制对数曲线；

图5一实施例中MTT法的生长抑制对数曲线；

图6一实施例中MTT法的生长抑制对数曲线；

具体实施方式

以下结合具体实施例，进一步阐明本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。比例和百分比基于重量，除非特别说明。

材料和试剂：

小鼠肺纤维瘤L929细胞ATCC(CCL-1^TM)；

放线菌素D      Sigma(A1410)；

TNF-α         Sigma(T6674)；

参考品(TNFR-Fc)Enbrel(AMGEN)；

WST-8          Dojindo(CK04-11)；

MTT            Sigma(M2128)。

实施例1：rhTNFR-Fc样品的获得

设计合成基因的寡核苷酸片段，通过重叠延伸PCR的办法获得rhTNFR-Fc全基因和中国仓鼠谷氨酰胺合成酶(Glutamine Synthetase，GS)全基因。将rhTNFR-Fc和GS基因通过分子生物学的方法(Sambrook等，分子克隆-实验室手册，第二版)整合进入pIRES(Clontech)，构建成可真核表达rhTNFR-Fc蛋白的真核表达质粒。

将该质粒转染CHO/K1(ATCC)细胞，由于质粒中整合了GS基因，因此利用GS的活性抑制药物MSX(Sigma)筛选获得稳定高水平表达rhTNFR-Fc蛋白的CHO细胞株。细胞株经驯化并适应无血清培养后，进入5升反应器中大规模培养。经14天无血清连续培养后，收获培养上清。

经离心过滤后，纯化培养上清，收集目的蛋白。利用蛋白A对IgG的特异性吸附作用，采用分离介质rProtein A Sepharose 4 Fast Flow(Amersham Biosciences)和QSepharose FF(Amersham Biosciences)进行亲和层析和离子交换层析，纯化获得rhTNFR-Fc蛋白。

实施例2：

本发明技术方案具体为：

A：复苏冻存的小鼠肺纤维瘤L929细胞，接种于培养瓶中培养增殖；

B：取对数生长期的L929细胞，胰蛋白酶消化，800rpm离心弃上清，加入5.0％FBS培养液调整细胞密度至1.5×10⁵个/孔，加入96孔培养板中，0.1ml/孔，培养24h过夜。

C：阳性对照：次日用无血清培养基稀释放线菌素D母液(1mg/ml)至终浓度20μg/mL，作为阳性对照。

D：阴性对照：用阳性对照液稀释TNF-α母液(10μg/ml)至10ng/ml。此阴性对照液作为样品的稀释液。

E：工作参考品的稀释：根据标示量，首先用样品稀释液稀释至0.5mg/mL，在96孔板中做10个5倍稀释。

F：待测样品的稀释：根据蛋白浓度，首先用样品稀释液稀释至0.5mg/mL或此浓度的7数倍，然后在96孔板中做10个5倍稀释。

G：取已接种L929细胞的96孔培养板，轻轻甩板，弃去上清，倒扣在已铺好的卷纸上吸去残留液体。

H：用加样器加入已稀释好的样品、工作参考品和阴性、阳性对照的培养液，100μL/孔。第12列加阳性对照，第11列加阴性对照。每个样品稀释度作4复孔。置于37℃ 5％二氧化碳孵箱中培养。

I：WST-8终点测定：96孔板在孵箱中继续孵育24h后，加入WST-8溶液终浓度0.1～20mM，在孵箱中继续孵育1～3小时，用酶标仪测量其A450-A650nm值。

MTT法终点测定：每孔加入MTT溶液20μL，于37℃ 5％二氧化碳孵箱中培养5小时。弃去培养板中液体后，向每孔中加入二甲基亚砜(DMSO)100μL，混匀后在酶标仪上，以630nm为参比波长，于波长570nm处测定吸光度。

J：结果分析：选用的回归模型为四参数方程，结果参见图1-6。算出样品或参考品的半数有效浓度(EC50)。(见下表1和表2)

表1、WST-8法测定结果

表2、MTT法测定结果

从以上结果中可以看出，WST-8法与MTT法相比来说，WST-8法是一种操作简单、结果更准确和稳定的：重组人肿瘤坏死因子受体-Fc融合蛋白生物学活性的检测方法。

本发明的范围不受所述具体实施方案的限制，所述实施方案只欲作为阐明本发明各个方面的单个例子，本发明范围内还包括功能等同的方法和组分。实际上，除了本文所述的内容外，本领域技术人员参照上文的描述和附图可以容易地掌握对本发明的多种改进。所述改进也落入所附权利要求书的范围之内。

Claims (8)

1.一种rhTNFR-Fc生物学活性的检测方法，包括下列步骤：

①细胞培养：取对数生长期的L929细胞，酶消化、离心弃上清，加入细胞培养液接种于细胞培养板中，置于37℃5％二氧化碳孵箱中，培养18～24h；

②试剂配制：阳性对照培养液：采用无血清或低血清细胞培养基稀释放线菌素D至终浓度为20μg/mL；阴性对照培养液：采用阳性对照培养液稀释TNF-α母液至终浓度为10ng/mlTNF-α；工作参考品培养液：采用阴性对照培养液稀释TNFR-Fc参考品，由0.5mg/mL倍比稀释5～10个浓度梯度；rhTNFR-Fc样品培养液：采用阴性对照培养液稀释rhTNFR-Fc样品，由0.5mg/mL倍比稀释5～10个浓度梯度；

③细胞处理：取已接种L929细胞的细胞培养板，弃去上清，吸去残留液体；加入已稀释好的rhTNFR-Fc样品培养液、工作参考品培养液和阴性对照培养液、阳性对照培养液，置于37℃5％二氧化碳孵箱中，培养18～24h；

④终点测定：加入WST-8溶液，在孵箱中继续孵育1～3小时，用酶标仪测量其A₄₅₀-A₆₅₀值。

2.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于所述细胞培养基可为DMEM培养基和RPMI1640培养基。

3.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于所述细胞接种密度1×10⁴～5×10⁴/孔。

4.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于所述酶可为胶原酶、胰蛋白酶、中性酶中之一或它们的任何组合。

5.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于所述酶为胰蛋白酶。

6.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于所述细胞培养板为96孔培养板。

7.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于所述样品培养液和工作参考品培养液的浓度梯度相同。

8.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于所述WST-8的终浓度0.1～20mM。

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