CN108998408A - 基于NF-κB信号通路的高通量气道炎症药物筛选细胞模型的制备方法及应用 - Google Patents

基于NF-κB信号通路的高通量气道炎症药物筛选细胞模型的制备方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于NF‑κB信号通路的高通量气道炎症药物筛选细胞模型的制备方法及其应用；该制备方法以支气管平滑肌细胞或支气管上皮细胞作为源细胞，利用刺激因子激活细胞内的NF‑κB，并通过均相时间分辨荧光技术，测定细胞内总NF‑κB比率和磷酸化NF‑κB比率，得NF‑κB的磷酸化水平；通过调整参数使模型组细胞内NF‑κB的磷酸化水平与正常组的比值≥1.2，得到细胞模型。本发明通过筛选细胞类型、密度，刺激因子类型、浓度和刺激时间等条件对NF‑κB磷酸化的影响，并采用HTRF法检测细胞中NF‑κB的磷酸化程度，进而构建了炎症细胞模型，为气道炎症药物筛选研究提供了依据。

Description

基于NF-κB信号通路的高通量气道炎症药物筛选细胞模型的 制备方法及应用
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，尤其涉及基于NF-κB信号通路的高通量气道炎症药物筛选细胞模型的制备方法及应用。
背景技术
免疫系统的激活是一个非常复杂的过程，转录因子核因子-κB(Trans criptionfactor nuclear factor-kappa B,NF-κB)可以被多种刺激物激活并控制不同基因及生物免疫应答，成为被广泛研究的免疫分子。
NF-κB可以诱导促炎性细胞因子基因转录，并影响自身免疫及获得性免疫应答，是多种炎症疾病的药物治疗靶点。NF-κB是一种二聚体蛋白，其亚基属于Rel原癌蛋白家族。在大部分细胞中，包括人支气管上皮细胞，主要的诱导型NF-κB由50kD(p50)和65kD(RelA，前p65)亚基组成。当细胞受到TNF、PMA等NF-κB激活剂刺激时，IkB即从三聚体中解离出来，暴露出p50亚基上的易位信号和p65亚基上的DNA结合位点，从而使异二聚物表现出NF-κB活性，并从细胞质中易位到细胞核中，与kB基序(kB motif)相结合，从而发挥转录调控作用。
研究发现，NF-κB在气道炎症的病理机制中也发挥着重要的作用，特别是支气管哮喘炎症，NF-κB广泛参与气道炎症反应，可调节气道异常状态下炎症因子的活性。有研究报道，在致敏、病菌等外界条件的刺激下，NF-κB的活化可导致肺巨噬细胞以及其他炎症细胞释放促炎性物质，如促炎性因子IL-1β和TNF-α，促嗜酸性细胞生存的粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(Granulocyte macrophage colony stimulating factor，GM-CSF)，趋化因子RANTES(调节T细胞表达和分泌)、单核细胞趋化蛋白(monocyte chemotactic protein，MCP-3)以及嗜酸性细胞活化趋化因子(可诱导嗜酸性细胞进入气道)。NF-κB还可调节哮喘气道中iNOS的表达，可使哮喘患者呼气中NO浓度增加。参与哮喘气道嗜酸性细胞募集的粘附分子ICAM-1及VCAM-1也通过NF-κB信号通路调节。
临床研究中，可在哮喘患者支气管活检中发现活化的NF-κB，尤其是气道上皮细胞中细胞核NF-κB的活性增强，并同时发现存在大量的促炎性因子、趋化因子、iNOS以及Cox-2的表达。实验动物哮喘模型及人支气管上皮细胞致敏后，也可在动物肺及细胞中发现活化的NF-κB。NF-κB通过这些途径调节气道炎症基因的协同表达，从而扩大和维持气道炎症反应。因此，检测细胞内NF-κB活化程度，对呼吸道炎症药物筛选具有重要意义。
在所报道的NF-κB检测相关文献中发现，目前NF-κB检测方法大致包括免疫组化、反转录酶-聚合酶链锁反应(Reverse transcriptase-polymerase chain reaction，RT-PCR)、蛋白免疫印迹(Western blot)，但三者共同存在的问题是检测步骤繁琐耗时，在快速高通量筛选气道炎症药物中存在一定的局限性。免疫组化染色技术操作简单、敏感性高、特异性强，能将形态和抗原定位结合，但影响免疫组化的因素较多，对于石蜡切片，脱片问题即较为常见，可影响染色及结果的判断；而对于细胞爬片及涂片而言，操作过程繁琐、效率低、且片子处理过程容易带入很多误差，使得结果可比性差。RT-PCR技术灵敏度高、特异性高、自动化程度高等特点，还可以对模板进行定量，但荧光染料能与非特异的双链DNA结合，容易产生假阳性信号。Western blot的主要优点即能反映蛋白质的分子量及亚型，但是在操作及样本预处理方面繁琐、费时，实验结果只有图像扫描，可定量性差，结果无法统计分析，影响分析的准确性。诸如此类的技术局限性，有必要寻找更简洁且适合快速高通量筛选的检测方法，以适应现在高效的科研研究。
故本发明基于NF-κB信号通路，通过刺激因子种类、细胞密度、刺激时间等条件的筛选，建立均相时间分辨荧光(Homogeneous Time-Resolved Fluorescence，HTRF)检测细胞炎症模型中NF-κB的细胞检测方法，为实验室呼吸道炎症药物细胞筛选研究平台的建立提供实验依据。
发明内容
本发明提供了一种基于NF-κB信号通路的高通量气道炎症药物筛选细胞模型的制备方法及应用，该方法通过采用HTRF法检测细胞中Total-NF-κB及Phospho-NF-κB的比率来确定NF-κB的磷酸化程度，进而构建炎症细胞模型，为气道炎症药物筛选研究提供了依据。
具体技术方案如下：
一种基于NF-κB信号通路的高通量气道炎症药物筛选细胞模型的制备方法，包括：以支气管平滑肌细胞或支气管上皮细胞作为源细胞，利用刺激因子激活细胞内的NF-κB，使NF-κB暴露磷酸化位点，并通过均相时间分辨荧光技术，测定细胞内总NF-κB比率和磷酸化NF-κB比率，得到细胞内NF-κB的磷酸化水平；
通过调整源细胞类型、细胞的密度以及刺激因子的类型、浓度和刺激时间，并测定参数调整后细胞内NF-κB的磷酸化水平变化情况，使模型组细胞内NF-κB的磷酸化水平与正常组细胞内NF-κB的磷酸化水平的比值≥1.2，得到用于高通量筛选气道炎症药物的细胞模型。
本发明中，“总NF-κB(Total-NF-κB)比率”是指细胞核内、核外的总的NF-κB表达量；而“磷酸化NF-κB比率”是指NF-κB三聚体脱落IkB蛋白后，暴露出磷酸化位点，而进入到细胞核内的NF-κB表达量。
“NF-κB的磷酸化水平”是指磷酸化NF-κB占总NF-κB的比例，即：NF-κB的磷酸化水平＝磷酸化NF-κB比率/总NF-κB(Total-NF-κB)比率。
在后期考察药物对其的影响时，既要观察磷酸化NF-κB比率，同时也要观察NF-κB的磷酸化水平。因为如果磷酸化蛋白表达下降，而总蛋白表达不变，那么说明该药物可以“直接”抑制蛋白的磷酸化；如果磷酸化蛋白表达量下降，而总蛋白表达也下降，此时磷酸化蛋白的比例不变，那么说明该药物仍然抑制了蛋白的磷酸化，只不过是“间接”的抑制作用，通过抑制总蛋白表达从而来抑制磷酸化蛋白的表达。
对于均相时间分辨荧光技术而言，当HTRF信号值S/N>1.2，则被认为是具有差异的(S/N＝HTRF Ratio样本/HTRF Ratio阴性)；而理论上模型组磷酸化水平与正常组比较有差异性，即认为模型成功，可用于药物筛选。但是，一般给予药物后磷酸化水平可能很难降低到正常水平；所以，本发明将HTRF信号值变为S/N>2，更易于药物的筛选。本发明实施例案例中，正常组磷酸化水平约15％，所以刺激后的磷酸化水平需至少达到30％。
故，所述模型组细胞内NF-κB的磷酸化水平与正常组细胞内NF-κB的磷酸化水平的比值≥2。
均相时间分辨荧光免疫分析的检测原理是基于荧光共振能量转移，依赖于能量转移的供体与受体特异性荧光性质。具有时间分辨荧光性质的镧系螯合物，其荧光有特异性，如衰变时间长，激发光和发射光之间的Stokes位移大等，是均相时间分辨荧光免疫分析最为常用的供体荧光发色基团、量子点。本发明的HTRF检测基于两个特异性抗体anti-YAP的时间分辨荧光共振能量转移进行夹层免疫分析，一个抗体用Eu3+-醚键标记(供体)，另一个抗体用d2标记(受体)。抗体特异性结合NF-κB，邻近的供体和受体产生时间分辨荧光共振能量转移信号，可特异性反应NF-κB磷酸化程度，其信号强度与能量转移呈正比关系。HTRF检测的优点有：特异性强，检测过程中无需洗板操作简单，样本使用量少(16μL)，数据读取时间短，检测结果可定量统计。
作为优选，所述支气管平滑肌细胞的密度为50～150k.孔-1。
作为优选，所述支气管上皮细胞的密度为5～50k.孔-1。更优选，所述支气管上皮细胞的密度为10k.孔-1。
作为优选，所述刺激因子为TNF-α或LPS。更优选，所述刺激因子为TNF-α。
作为优选，所述刺激因子为TNF-α，刺激因子的浓度为10～100ng/ml，刺激时间为5min～24h。
作为优选，所述刺激因子为LPS，刺激因子的浓度为1～40μg/ml，刺激时间为10min～24h。
更优选，所述源细胞为支气管上皮细胞，细胞密度为10k.孔-1；刺激因子为TNF-α，刺激因子的浓度为10ng.mL-1，刺激时间为10min。采用上述参数条件筛选的细胞模型中NF-κB磷酸化水平达到52.6％，与正常组组相比，有明显升高。
本发明还提供了所述制备方法制得的细胞模型。该细胞模型可用于高通量筛选气道炎症药物。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明方法通过筛选细胞类型、密度，刺激因子类型、浓度和刺激时间等条件对NF-κB磷酸化的影响，并采用HTRF法检测细胞中Total-NF-κB及Phospho-NF-κB的比率来确定NF-κB的磷酸化程度，进而构建了炎症细胞模型，为气道炎症药物筛选研究提供了依据。
附图说明
图1为不同密度的支气管平滑肌细胞(BSMC)对Total-NF-κB的影响。
图2为不同密度的支气管上皮细胞(HBE)对Total-NF-κB的影响。
图3为不同密度的支气管平滑肌细胞(BSMC)对磷酸化NF-κB(Phospho-NF-κB)的影响。
图4为不同密度的支气管上皮细胞(HBE)对磷酸化NF-κB(Phospho-NF-κB)的影响。
图5为不同密度的支气管平滑肌细胞(BSMC)对Phospho-NF-κB/Total-NF-κBde的影响。
图6为不同密度的支气管上皮细胞(HBE)对Phospho-NF-κB/Total-NF-κBde的影响。
图1～6中，空白：无细胞；阴性：无抗体；阳性：定标对照；BSMC50k：BSMC密度50k.孔-1且未经TNF-α刺激；BSMC 100k：BSMC密度100k.孔-1且未经TNF-α刺激；BSMC 150k：BSMC密度150k.孔-1且未经TNF-α刺激；TNF-α0.1μM 50k：BSMC密度50k.孔-1且经0.1μM TNF-α刺激；TNF-α0.1μM 100k：BSMC密度100k.孔-1且经0.1μM TNF-α刺激；TNF-α0.1μM 150k：BSMC密度150k.孔-1且经0.1μM TNF-α刺激。
图7为不同细胞种类和细胞密度对NF-κB的影响。
图8为饥饿处理后不同浓度LPS对HBE(10k.孔-1)中NF-κB的影响。
图9为不同浓度LPS、TNF-α对HBE(25k.孔-1)中NF-κB的影响。
图10为不同浓度LPS对HBE(25k.孔-1)中NF-κB的影响。
图11为不同刺激时间LPS、TNF-α对HBE(10k.孔-1)中NF-κB的影响。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步描述，以下列举的仅是本发明的具体实施例，但本发明的保护范围不仅限于此。
实施例1
1、材料、试剂配制、细胞培养以及HTRF测定方法
1.1试剂：NF-κB检测试剂盒(Cisbio公司，批号10-009-13)；TNF-α(Peprotech公司，批号101373)；LPS(sigma公司，批号：017M4112V)；DMEM/F12完全培养基(含FBS、bFGF、Insulin、Hydrocortisone、Penicillin、Streptomycin，齐氏生物科技有限公司生产，批号20150920)；0.25％Trypsin(含0.02％EDTA，吉诺生物医药技术有限公司，批号17052901)；胎牛血清(浙江天杭生物科技股份有限公司，批号20171011)；PBS(吉诺生物医药技术有限公司，批号17092406)；二甲基亚砜(DMSO)为分析纯，由惠普化工仪器有限公司提供。
1.2细胞株：人支气管上皮细胞(Human bronchial epithelial cell，HBE)，大鼠原代支气管平滑肌细胞(Bronchial smooth muscle cells，BSMC)，购自齐氏生物科技有限公司，本实验室液氮保存。
1.3仪器：Varioskan LUX多功能酶标检测仪(Thermo Scientific)；3111型CO2培养箱(Thermo公司)；HR40-II-A2型医用净化工作台(青岛海尔特种电器有限公司)；CK-40-F200型倒置显微镜(日本OLYMPUS公司)；xCELLigence RTCADP多功能实时无标记细胞分析仪、E-Plate 16、均购自艾森生物(杭州)有限公司；超低温冰箱(Thermo公司)；TC-20细胞计数仪(Bio-Rad公司)。
1.4试剂配制：
NF-κB检测试剂配制：①抗体工作液：Total/Phospho-NF-κB d2抗体及Total/Phospho-NF-κB Cryptate抗体稀释20倍，用时按1:1混合。②4X增补裂解缓冲液用封闭试剂和4X裂解缓冲液稀释25倍，备用，在2-8℃可储存2天。③1X增补裂解缓冲液配制用封闭试剂和1X裂解缓冲液稀释100倍，备用，在2-8℃可储存2天。④1X裂解缓冲液用蒸馏水稀释4X裂解缓冲液制备。
1.5细胞培养：BSMC及HBE培养于DMEM完全培养基中，37℃、5％CO2培养箱培养，待生长至覆盖培养瓶的80％面积时，传代培养。取对数生长期的细胞用于实验。
1.6统计学处理：实验数据以x-±相对标准偏差表示，采用SPSS 19.0统计软件进行处理，组间差异用T-Test检验进行统计分析，以P＜0.05为具有统计学意义。
1.7HTRF测定方法：
造模及处理过的细胞弃去上清液，并加入50μL增补裂解缓冲液1X，在室温摇床上振摇孵育30min，用移液枪上下吹打混匀后，每孔细胞裂解液，取两份16μL于384孔板中。一份加入Total-NF-κB及d2混合抗体共4μL，另一份加入Phospho-NF-κB(磷酸化-NF-κB)及d2混合抗体共4μL。
设置空白对照组、阴性对照组、阳性对照组和模型处理组；
其中，空白对照组：加入2μL检测缓冲液代替d2抗体；
空白对照组：正常细胞按上述处理后，各取16μL于384孔板中，分别加入2μLTotal/Phospho-NF-κB Cryptate抗体，2μL检测缓冲液。
阴性对照组：无细胞，各取16μL增补裂解缓冲液1X于384孔板中，分别加入2μLTotal/Phospho-NF-κB Cryptate抗体，2μL d2抗体，混合后加入。
阳性对照组：分别取Total/Phospho-NF-κB对照裂解液16μL于384孔板中，分别加入2μL Total/Phospho-NF-κB Cryptate抗体，2μL d2抗体，混合后加入。
模型处理组：造模后细胞按上述处理后，各取16μL于384孔板中，分别加入2μLTotal/Phospho-NF-κB Cryptate抗体，2μL d2抗体，混合后加入。
盖上板盖，室温过夜孵育后，在665nm和620nm处检测信号值，并计算比率(Ratio＝信号665nm/信号620nm×104)，CV％＝标准差/比率均值×100。
信号强度与其表达量成正比关系，所以Total-NF-κB比率表示细胞核内、核外的NF-κB表达量，即总NF-κB。磷酸化NF-κB代表NF-κB三聚体脱落IkB蛋白后，暴露出磷酸化位点，而进入到细胞核内的NF-κB表达量。
2、细胞模型的建立
2.1细胞密度及细胞种类对Total-NF-κB比率及NF-κB磷酸化程度的影响
分别将BSMC及HBE分成正常对照组及模型组，每个组调整BSMC细胞密度为150、100、50k.孔-1，HBE细胞密度为50、25、5k.孔-1；采用1.7部分提供的HTRF法进行测定。
BSMC经炎症因子TNF-α(0.1μM)刺激24h后，HTRF测定细胞NF-κB的变化。HBE经炎症因子TNF-α(10ng.mL-1)刺激24h后，HTRF测定细胞NF-κB的变化。
结果如下：
(1)图1、3、5考察不同密度的BSMC对NF-κB的影响，发现细胞密度太大影响细胞生长，细胞生长堆叠出现部分细胞死亡，影响实验结果。BSMC最低密度50k.孔-1下，Total NF-κB比率为1475，磷酸化程度约为45％。
(2)图2、4、6中采用HBE，发现在50k.孔-1细胞密度下，Total NF-κB比率为9866，但磷酸化程度仅为8.4％。
(3)图7中，从Total NF-κB比率基数可以看出不同细胞对NF-κB的效价有所差别，HBE要优于BSMC，但其磷酸化程度过低，原因可能与刺激因子刺激时间、浓度等相关。
2.2炎症因子刺激对HBE Total-NF-κB比率及NF-κB磷酸化程度的影响
HBE(25k.孔-1)分别经TNF-α(10、50、100ng.mL-1)及LPS(1～40μg.mL-1)处理相同时间后，HTRF测定细胞的NF-κB的变化，考察TNF-α及LPS刺激对细胞NF-κB的影响；HTRF法如1.7所示。
结果如下：考察不同炎症因子对HBE Total-NF-κB比率及NF-κB磷酸化程度的影响，发现相对于LPS，TNF-α刺激对细胞Total-NF-κB比率及NF-κB磷酸化程度较高，但不同浓度LPS、TNF-α的刺激对Total-NF-κB比率及NF-κB磷酸化程度无显著性差异，如图9所示。
扩大LPS浓度范围，进一步研究不同浓度LPS刺激HBE对Total-NF-κB比率及NF-κB磷酸化程度的影响，结果不同浓度间没有差异，且与正常组间也没有差异，如图10所示。
2.3细胞饥饿处理对实验结果的影响
HBE分为空白组、正常组及不同浓度的LPS组，每组再分为加血清培养和不加血清培养2组。
取100μL细胞于96孔组织培养板中，接种密度为10k.孔-1，将其放置于37℃的CO2培养箱中，待细胞贴壁后，换无血清培养基培养24h后(饥饿处理)。加血清组换成含有血清的培养基进行后续操作，不加血清组换成不含血清的培养基进行后续操作。空白组与正常组不做处理，LPS组加入不同浓度的LPS，使其终浓度分别为10、1μg.mL-1，孵育4h，HTRF测定细胞NF-κB的变化；HTRF法如1.7所示。
结果如下：饥饿处理及培养基是否含血清对细胞经LPS刺激后Total-NF-κB及磷酸化程度无明显影响，如图8所示。实验结果表明：饥饿处理及后续加药是否含有血清对磷酸化水平没有影响。
2.4刺激时长对HBE Total-NF-κB比率及NF-κB磷酸化程度的影响
细胞经TNF-α(10ng.mL-1)、LPS(10μg.mL-1)分别刺激10、30、60min后，HTRF测定细胞NF-κB磷酸化水平以及总NF-κB比率；HTRF法如1.7所示。为了实验更严谨，图11中采用饥饿处理，使细胞周期同步化，避免细胞所处的状态不同造成实验的误差，同时排除血清对实验的干扰。
考察不同刺激时间，LPS、TNF-α对HBE(10k.孔-1)NF-κB影响；结果发现，经TNF-α刺激10、30、60min后，细胞NF-κB磷酸化水平分别为52.6％、35.7％、22.4％，与正常对照组(14.2％)相比，有明显升高；而LPS在刺激不同时间后对细胞NF-κB磷酸化水平与正常对照组相比，无明显影响。如图11所示。

Claims (10)

1.一种基于NF-κB信号通路的高通量气道炎症药物筛选细胞模型的制备方法，其特征在于，包括：以支气管平滑肌细胞或支气管上皮细胞作为源细胞，利用刺激因子激活细胞内的NF-κB，使NF-κB暴露磷酸化位点，并通过均相时间分辨荧光技术，测定细胞内总NF-κB比率和磷酸化NF-κB比率，得到细胞内NF-κB的磷酸化水平；
通过调整源细胞类型、细胞的密度以及刺激因子的类型、浓度和刺激时间，并测定参数调整后细胞内NF-κB的磷酸化水平变化情况，使模型组细胞内NF-κB的磷酸化水平与正常组细胞内NF-κB的磷酸化水平的比值≥1.2，得到用于高通量筛选气道炎症药物的细胞模型。
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述支气管平滑肌细胞的密度为50～150k.孔-1。
3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述支气管上皮细胞的密度为5～50k.孔-1。
4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述刺激因子为TNF-α或LPS。
5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述刺激因子为TNF-α，刺激因子的浓度为10～100ng/ml，刺激时间为5min～24h。
6.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述刺激因子为LPS，刺激因子的浓度为1～40μg/ml，刺激时间为10min～24h。
7.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述源细胞为支气管上皮细胞，细胞密度为5～50k.孔-1；刺激因子为TNF-α，刺激因子的浓度为0.5～100ng.mL-1，刺激时间为5～40min。
8.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述源细胞为支气管上皮细胞，细胞密度为10k.孔-1；刺激因子为TNF-α，刺激因子的浓度为10ng.mL-1，刺激时间为10min。
9.如权利要求1～8任一项所述制备方法制得的用于高通量筛选气道炎症药物的细胞模型。
10.如权利要求9所述的细胞模型在筛选气道炎症药物中的应用。
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