CN108998408B - 基于NF-κB信号通路的高通量气道炎症药物筛选细胞模型的制备方法及应用 - Google Patents

基于NF-κB信号通路的高通量气道炎症药物筛选细胞模型的制备方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于NF‑κB信号通路的高通量气道炎症药物筛选细胞模型的制备方法及其应用；该制备方法以支气管平滑肌细胞或支气管上皮细胞作为源细胞，利用刺激因子激活细胞内的NF‑κB，并通过均相时间分辨荧光技术，测定细胞内总NF‑κB比率和磷酸化NF‑κB比率，得NF‑κB的磷酸化水平；通过调整参数使模型组细胞内NF‑κB的磷酸化水平与正常组的比值≥1.2，得到细胞模型。本发明通过筛选细胞类型、密度，刺激因子类型、浓度和刺激时间等条件对NF‑κB磷酸化的影响，并采用HTRF法检测细胞中NF‑κB的磷酸化程度，进而构建了炎症细胞模型，为气道炎症药物筛选研究提供了依据。

Description

基于NF-κB信号通路的高通量气道炎症药物筛选细胞模型的 制备方法及应用
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，尤其涉及基于NF-κB信号通路的高通量气道炎症药物筛选细胞模型的制备方法及应用。
背景技术
免疫系统的激活是一个非常复杂的过程，转录因子核因子-κB(Trans criptionfactor nuclear factor-kappa B,NF-κB)可以被多种刺激物激活并控制不同基因及生物免疫应答，成为被广泛研究的免疫分子。
NF-κB可以诱导促炎性细胞因子基因转录，并影响自身免疫及获得性免疫应答，是多种炎症疾病的药物治疗靶点。NF-κB是一种二聚体蛋白，其亚基属于Rel原癌蛋白家族。在大部分细胞中，包括人支气管上皮细胞，主要的诱导型NF-κB由50kD(p50)和65kD(RelA，前p65)亚基组成。当细胞受到TNF、PMA等NF-κB激活剂刺激时，IkB即从三聚体中解离出来，暴露出p50亚基上的易位信号和p65亚基上的DNA结合位点，从而使异二聚物表现出NF-κB活性，并从细胞质中易位到细胞核中，与kB基序(kB motif)相结合，从而发挥转录调控作用。
研究发现，NF-κB在气道炎症的病理机制中也发挥着重要的作用，特别是支气管哮喘炎症，NF-κB广泛参与气道炎症反应，可调节气道异常状态下炎症因子的活性。有研究报道，在致敏、病菌等外界条件的刺激下，NF-κB的活化可导致肺巨噬细胞以及其他炎症细胞释放促炎性物质，如促炎性因子IL-1β和TNF-α，促嗜酸性细胞生存的粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(Granulocyte macrophage colony stimulating factor，GM-CSF)，趋化因子RANTES(调节T细胞表达和分泌)、单核细胞趋化蛋白(monocyte chemotactic protein，MCP-3)以及嗜酸性细胞活化趋化因子(可诱导嗜酸性细胞进入气道)。NF-κB还可调节哮喘气道中iNOS的表达，可使哮喘患者呼气中NO浓度增加。参与哮喘气道嗜酸性细胞募集的粘附分子ICAM-1及VCAM-1也通过NF-κB信号通路调节。
临床研究中，可在哮喘患者支气管活检中发现活化的NF-κB，尤其是气道上皮细胞中细胞核NF-κB的活性增强，并同时发现存在大量的促炎性因子、趋化因子、iNOS以及Cox-2的表达。实验动物哮喘模型及人支气管上皮细胞致敏后，也可在动物肺及细胞中发现活化的NF-κB。NF-κB通过这些途径调节气道炎症基因的协同表达，从而扩大和维持气道炎症反应。因此，检测细胞内NF-κB活化程度，对呼吸道炎症药物筛选具有重要意义。
在所报道的NF-κB检测相关文献中发现，目前NF-κB检测方法大致包括免疫组化、反转录酶-聚合酶链锁反应(Reverse transcriptase-polymerase chain reaction，RT-PCR)、蛋白免疫印迹(Western blot)，但三者共同存在的问题是检测步骤繁琐耗时，在快速高通量筛选气道炎症药物中存在一定的局限性。免疫组化染色技术操作简单、敏感性高、特异性强，能将形态和抗原定位结合，但影响免疫组化的因素较多，对于石蜡切片，脱片问题即较为常见，可影响染色及结果的判断；而对于细胞爬片及涂片而言，操作过程繁琐、效率低、且片子处理过程容易带入很多误差，使得结果可比性差。RT-PCR技术灵敏度高、特异性高、自动化程度高等特点，还可以对模板进行定量，但荧光染料能与非特异的双链DNA结合，容易产生假阳性信号。Western blot的主要优点即能反映蛋白质的分子量及亚型，但是在操作及样本预处理方面繁琐、费时，实验结果只有图像扫描，可定量性差，结果无法统计分析，影响分析的准确性。诸如此类的技术局限性，有必要寻找更简洁且适合快速高通量筛选的检测方法，以适应现在高效的科研研究。
故本发明基于NF-κB信号通路，通过刺激因子种类、细胞密度、刺激时间等条件的筛选，建立均相时间分辨荧光(Homogeneous Time-Resolved Fluorescence，HTRF)检测细胞炎症模型中NF-κB的细胞检测方法，为实验室呼吸道炎症药物细胞筛选研究平台的建立提供实验依据。
发明内容
本发明提供了一种基于NF-κB信号通路的高通量气道炎症药物筛选细胞模型的制备方法及应用，该方法通过采用HTRF法检测细胞中Total-NF-κB及Phospho-NF-κB的比率来确定NF-κB的磷酸化程度，进而构建炎症细胞模型，为气道炎症药物筛选研究提供了依据。
具体技术方案如下：
一种基于NF-κB信号通路的高通量气道炎症药物筛选细胞模型的制备方法，包括：以支气管平滑肌细胞或支气管上皮细胞作为源细胞，利用刺激因子激活细胞内的NF-κB，使NF-κB暴露磷酸化位点，并通过均相时间分辨荧光技术，测定细胞内总NF-κB比率和磷酸化NF-κB比率，得到细胞内NF-κB的磷酸化水平；
通过调整源细胞类型、细胞的密度以及刺激因子的类型、浓度和刺激时间，并测定参数调整后细胞内NF-κB的磷酸化水平变化情况，使模型组细胞内NF-κB的磷酸化水平与正常组细胞内NF-κB的磷酸化水平的比值≥1.2，得到用于高通量筛选气道炎症药物的细胞模型。
本发明中，“总NF-κB(Total-NF-κB)比率”是指细胞核内、核外的总的NF-κB表达量；而“磷酸化NF-κB比率”是指NF-κB三聚体脱落IkB蛋白后，暴露出磷酸化位点，而进入到细胞核内的NF-κB表达量。
“NF-κB的磷酸化水平”是指磷酸化NF-κB占总NF-κB的比例，即：NF-κB的磷酸化水平＝磷酸化NF-κB比率/总NF-κB(Total-NF-κB)比率。
在后期考察药物对其的影响时，既要观察磷酸化NF-κB比率，同时也要观察NF-κB的磷酸化水平。因为如果磷酸化蛋白表达下降，而总蛋白表达不变，那么说明该药物可以“直接”抑制蛋白的磷酸化；如果磷酸化蛋白表达量下降，而总蛋白表达也下降，此时磷酸化蛋白的比例不变，那么说明该药物仍然抑制了蛋白的磷酸化，只不过是“间接”的抑制作用，通过抑制总蛋白表达从而来抑制磷酸化蛋白的表达。
对于均相时间分辨荧光技术而言，当HTRF信号值S/N>1.2，则被认为是具有差异的(S/N＝HTRF Ratio样本/HTRF Ratio阴性)；而理论上模型组磷酸化水平与正常组比较有差异性，即认为模型成功，可用于药物筛选。但是，一般给予药物后磷酸化水平可能很难降低到正常水平；所以，本发明将HTRF信号值变为S/N>2，更易于药物的筛选。本发明实施例案例中，正常组磷酸化水平约15％，所以刺激后的磷酸化水平需至少达到30％。
故，所述模型组细胞内NF-κB的磷酸化水平与正常组细胞内NF-κB的磷酸化水平的比值≥2。
均相时间分辨荧光免疫分析的检测原理是基于荧光共振能量转移，依赖于能量转移的供体与受体特异性荧光性质。具有时间分辨荧光性质的镧系螯合物，其荧光有特异性，如衰变时间长，激发光和发射光之间的Stokes位移大等，是均相时间分辨荧光免疫分析最为常用的供体荧光发色基团、量子点。本发明的HTRF检测基于两个特异性抗体anti-YAP的时间分辨荧光共振能量转移进行夹层免疫分析，一个抗体用Eu3+-醚键标记(供体)，另一个抗体用d2标记(受体)。抗体特异性结合NF-κB，邻近的供体和受体产生时间分辨荧光共振能量转移信号，可特异性反应NF-κB磷酸化程度，其信号强度与能量转移呈正比关系。HTRF检测的优点有：特异性强，检测过程中无需洗板操作简单，样本使用量少(16μL)，数据读取时间短，检测结果可定量统计。
作为优选，所述支气管平滑肌细胞的密度为50～150k.孔-1。
作为优选，所述支气管上皮细胞的密度为5～50k.孔-1。更优选，所述支气管上皮细胞的密度为10k.孔-1。
作为优选，所述刺激因子为TNF-α或LPS。更优选，所述刺激因子为TNF-α。
作为优选，所述刺激因子为TNF-α，刺激因子的浓度为10～100ng/ml，刺激时间为5min～24h。
作为优选，所述刺激因子为LPS，刺激因子的浓度为1～40μg/ml，刺激时间为10min～24h。
更优选，所述源细胞为支气管上皮细胞，细胞密度为10k.孔-1；刺激因子为TNF-α，刺激因子的浓度为10ng.mL-1，刺激时间为10min。采用上述参数条件筛选的细胞模型中NF-κB磷酸化水平达到52.6％，与正常组组相比，有明显升高。
本发明还提供了所述制备方法制得的细胞模型。该细胞模型可用于高通量筛选气道炎症药物。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明方法通过筛选细胞类型、密度，刺激因子类型、浓度和刺激时间等条件对NF-κB磷酸化的影响，并采用HTRF法检测细胞中Total-NF-κB及Phospho-NF-κB的比率来确定NF-κB的磷酸化程度，进而构建了炎症细胞模型，为气道炎症药物筛选研究提供了依据。
附图说明
图1为不同密度的支气管平滑肌细胞(BSMC)对Total-NF-κB的影响。
图2为不同密度的支气管上皮细胞(HBE)对Total-NF-κB的影响。
图3为不同密度的支气管平滑肌细胞(BSMC)对磷酸化NF-κB(Phospho-NF-κB)的影响。
图4为不同密度的支气管上皮细胞(HBE)对磷酸化NF-κB(Phospho-NF-κB)的影响。
图5为不同密度的支气管平滑肌细胞(BSMC)对Phospho-NF-κB/Total-NF-κBde的影响。
图6为不同密度的支气管上皮细胞(HBE)对Phospho-NF-κB/Total-NF-κBde的影响。
图1～6中，空白：无细胞；阴性：无抗体；阳性：定标对照；BSMC50k：BSMC密度50k.孔-1且未经TNF-α刺激；BSMC 100k：BSMC密度100k.孔-1且未经TNF-α刺激；BSMC 150k：BSMC密度150k.孔-1且未经TNF-α刺激；TNF-α0.1μM 50k：BSMC密度50k.孔-1且经0.1μM TNF-α刺激；TNF-α0.1μM 100k：BSMC密度100k.孔-1且经0.1μM TNF-α刺激；TNF-α0.1μM 150k：BSMC密度150k.孔-1且经0.1μM TNF-α刺激。
图7为不同细胞种类和细胞密度对NF-κB的影响。
图8为饥饿处理后不同浓度LPS对HBE(10k.孔-1)中NF-κB的影响。
图9为不同浓度LPS、TNF-α对HBE(25k.孔-1)中NF-κB的影响。
图10为不同浓度LPS对HBE(25k.孔-1)中NF-κB的影响。
图11为不同刺激时间LPS、TNF-α对HBE(10k.孔-1)中NF-κB的影响。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步描述，以下列举的仅是本发明的具体实施例，但本发明的保护范围不仅限于此。
实施例1
1、材料、试剂配制、细胞培养以及HTRF测定方法
1.1试剂：NF-κB检测试剂盒(Cisbio公司，批号10-009-13)；TNF-α(Peprotech公司，批号101373)；LPS(sigma公司，批号：017M4112V)；DMEM/F12完全培养基(含FBS、bFGF、Insulin、Hydrocortisone、Penicillin、Streptomycin，齐氏生物科技有限公司生产，批号20150920)；0.25％Trypsin(含0.02％EDTA，吉诺生物医药技术有限公司，批号17052901)；胎牛血清(浙江天杭生物科技股份有限公司，批号20171011)；PBS(吉诺生物医药技术有限公司，批号17092406)；二甲基亚砜(DMSO)为分析纯，由惠普化工仪器有限公司提供。
1.2细胞株：人支气管上皮细胞(Human bronchial epithelial cell，HBE)，大鼠原代支气管平滑肌细胞(Bronchial smooth muscle cells，BSMC)，购自齐氏生物科技有限公司，本实验室液氮保存。
1.3仪器：Varioskan LUX多功能酶标检测仪(Thermo Scientific)；3111型CO2培养箱(Thermo公司)；HR40-II-A2型医用净化工作台(青岛海尔特种电器有限公司)；CK-40-F200型倒置显微镜(日本OLYMPUS公司)；xCELLigence RTCADP多功能实时无标记细胞分析仪、E-Plate 16、均购自艾森生物(杭州)有限公司；超低温冰箱(Thermo公司)；TC-20细胞计数仪(Bio-Rad公司)。
1.4试剂配制：
NF-κB检测试剂配制：①抗体工作液：Total/Phospho-NF-κB d2抗体及Total/Phospho-NF-κB Cryptate抗体稀释20倍，用时按1:1混合。②4X增补裂解缓冲液用封闭试剂和4X裂解缓冲液稀释25倍，备用，在2-8℃可储存2天。③1X增补裂解缓冲液配制用封闭试剂和1X裂解缓冲液稀释100倍，备用，在2-8℃可储存2天。④1X裂解缓冲液用蒸馏水稀释4X裂解缓冲液制备。
1.5细胞培养：BSMC及HBE培养于DMEM完全培养基中，37℃、5％CO2培养箱培养，待生长至覆盖培养瓶的80％面积时，传代培养。取对数生长期的细胞用于实验。
1.6统计学处理：实验数据以x-±相对标准偏差表示，采用SPSS 19.0统计软件进行处理，组间差异用T-Test检验进行统计分析，以P＜0.05为具有统计学意义。
1.7HTRF测定方法：
造模及处理过的细胞弃去上清液，并加入50μL增补裂解缓冲液1X，在室温摇床上振摇孵育30min，用移液枪上下吹打混匀后，每孔细胞裂解液，取两份16μL于384孔板中。一份加入Total-NF-κB及d2混合抗体共4μL，另一份加入Phospho-NF-κB(磷酸化-NF-κB)及d2混合抗体共4μL。
设置空白对照组、阴性对照组、阳性对照组和模型处理组；
其中，空白对照组：加入2μL检测缓冲液代替d2抗体；
空白对照组：正常细胞按上述处理后，各取16μL于384孔板中，分别加入2μLTotal/Phospho-NF-κB Cryptate抗体，2μL检测缓冲液。
阴性对照组：无细胞，各取16μL增补裂解缓冲液1X于384孔板中，分别加入2μLTotal/Phospho-NF-κB Cryptate抗体，2μL d2抗体，混合后加入。
阳性对照组：分别取Total/Phospho-NF-κB对照裂解液16μL于384孔板中，分别加入2μL Total/Phospho-NF-κB Cryptate抗体，2μL d2抗体，混合后加入。
模型处理组：造模后细胞按上述处理后，各取16μL于384孔板中，分别加入2μLTotal/Phospho-NF-κB Cryptate抗体，2μL d2抗体，混合后加入。
盖上板盖，室温过夜孵育后，在665nm和620nm处检测信号值，并计算比率(Ratio＝信号665nm/信号620nm×104)，CV％＝标准差/比率均值×100。
信号强度与其表达量成正比关系，所以Total-NF-κB比率表示细胞核内、核外的NF-κB表达量，即总NF-κB。磷酸化NF-κB代表NF-κB三聚体脱落IkB蛋白后，暴露出磷酸化位点，而进入到细胞核内的NF-κB表达量。
2、细胞模型的建立
2.1细胞密度及细胞种类对Total-NF-κB比率及NF-κB磷酸化程度的影响
分别将BSMC及HBE分成正常对照组及模型组，每个组调整BSMC细胞密度为150、100、50k.孔-1，HBE细胞密度为50、25、5k.孔-1；采用1.7部分提供的HTRF法进行测定。
BSMC经炎症因子TNF-α(0.1μM)刺激24h后，HTRF测定细胞NF-κB的变化。HBE经炎症因子TNF-α(10ng.mL-1)刺激24h后，HTRF测定细胞NF-κB的变化。
结果如下：
(1)图1、3、5考察不同密度的BSMC对NF-κB的影响，发现细胞密度太大影响细胞生长，细胞生长堆叠出现部分细胞死亡，影响实验结果。BSMC最低密度50k.孔-1下，Total NF-κB比率为1475，磷酸化程度约为45％。
(2)图2、4、6中采用HBE，发现在50k.孔-1细胞密度下，Total NF-κB比率为9866，但磷酸化程度仅为8.4％。
(3)图7中，从Total NF-κB比率基数可以看出不同细胞对NF-κB的效价有所差别，HBE要优于BSMC，但其磷酸化程度过低，原因可能与刺激因子刺激时间、浓度等相关。
2.2炎症因子刺激对HBE Total-NF-κB比率及NF-κB磷酸化程度的影响
HBE(25k.孔-1)分别经TNF-α(10、50、100ng.mL-1)及LPS(1～40μg.mL-1)处理相同时间后，HTRF测定细胞的NF-κB的变化，考察TNF-α及LPS刺激对细胞NF-κB的影响；HTRF法如1.7所示。
结果如下：考察不同炎症因子对HBE Total-NF-κB比率及NF-κB磷酸化程度的影响，发现相对于LPS，TNF-α刺激对细胞Total-NF-κB比率及NF-κB磷酸化程度较高，但不同浓度LPS、TNF-α的刺激对Total-NF-κB比率及NF-κB磷酸化程度无显著性差异，如图9所示。
扩大LPS浓度范围，进一步研究不同浓度LPS刺激HBE对Total-NF-κB比率及NF-κB磷酸化程度的影响，结果不同浓度间没有差异，且与正常组间也没有差异，如图10所示。
2.3细胞饥饿处理对实验结果的影响
HBE分为空白组、正常组及不同浓度的LPS组，每组再分为加血清培养和不加血清培养2组。
取100μL细胞于96孔组织培养板中，接种密度为10k.孔-1，将其放置于37℃的CO2培养箱中，待细胞贴壁后，换无血清培养基培养24h后(饥饿处理)。加血清组换成含有血清的培养基进行后续操作，不加血清组换成不含血清的培养基进行后续操作。空白组与正常组不做处理，LPS组加入不同浓度的LPS，使其终浓度分别为10、1μg.mL-1，孵育4h，HTRF测定细胞NF-κB的变化；HTRF法如1.7所示。
结果如下：饥饿处理及培养基是否含血清对细胞经LPS刺激后Total-NF-κB及磷酸化程度无明显影响，如图8所示。实验结果表明：饥饿处理及后续加药是否含有血清对磷酸化水平没有影响。
2.4刺激时长对HBE Total-NF-κB比率及NF-κB磷酸化程度的影响
细胞经TNF-α(10ng.mL-1)、LPS(10μg.mL-1)分别刺激10、30、60min后，HTRF测定细胞NF-κB磷酸化水平以及总NF-κB比率；HTRF法如1.7所示。为了实验更严谨，图11中采用饥饿处理，使细胞周期同步化，避免细胞所处的状态不同造成实验的误差，同时排除血清对实验的干扰。
考察不同刺激时间，LPS、TNF-α对HBE(10k.孔-1)NF-κB影响；结果发现，经TNF-α刺激10、30、60min后，细胞NF-κB磷酸化水平分别为52.6％、35.7％、22.4％，与正常对照组(14.2％)相比，有明显升高；而LPS在刺激不同时间后对细胞NF-κB磷酸化水平与正常对照组相比，无明显影响。如图11所示。

Claims (4)

1.一种基于NF-κB信号通路的高通量气道炎症药物筛选细胞模型的制备方法，其特征在于，包括：以支气管上皮细胞作为源细胞，利用刺激因子激活细胞内的NF-κB，使NF-κB暴露磷酸化位点，并通过均相时间分辨荧光技术，测定细胞内总NF-κB比率和磷酸化NF-κB比率，得到细胞内NF-κB的磷酸化水平；
使模型组细胞内NF-κB的磷酸化水平与正常组细胞内NF-κB的磷酸化水平的比值≥1.2，得到用于高通量筛选气道炎症药物的细胞模型；
所述支气管上皮细胞的密度为5～10k.孔-1；
所述刺激因子为TNF-α，刺激因子的浓度为10ng/ml，刺激时间为10min～60min。
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述源细胞为支气管上皮细胞，细胞密度为10k.孔-1；刺激因子为TNF-α，刺激因子的浓度为10ng.mL-1，刺激时间为10min。
3.如权利要求1或2所述制备方法制得的用于高通量筛选气道炎症药物的细胞模型。
4.如权利要求3所述的细胞模型在筛选气道炎症药物中的应用。
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