CN113476371B - 一种能提升透明质酸分泌与胶原蛋白合成的组合物 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种能提升透明质酸分泌与胶原蛋白合成的组合物，其特征在于基于所述组合物的总重量，所述组合物包含：0.001重量％‑0.01重量％的柚子提取物、0.0005重量％‑0.0015重量％的SK INFLUX V混合物和0.00005重量％‑0.00015重量％神经酰胺II。
Description
技术领域
本发明涉及一种能够协同提升透明质酸和胶原蛋白的合成，从而调整皮肤状态的活性组合物。
背景技术
透明质酸是一种大分子酸性粘多糖，其广泛存在于生物体的结缔组织中，皮肤中透明质酸含量丰富。透明质酸还是具有较高临床价值的生化药物，广泛应用于各类眼科手术，如晶体植入、角膜移植和抗青光眼手术等。还可用于治疗关节炎和加速伤口愈合。将其用于化妆品中，能起到独特的保护皮肤作用，可保持皮肤滋润光滑、细腻柔嫩、富有弹性，具有防皱、抗皱、美容保健和恢复皮肤生理功能的作用。
胶原蛋白是一种肌体自然蛋白，其广泛存在于动物的皮肤、肌腱和其他组织中。胶原蛋白对皮肤表面的蛋白质分子具有较大的亲和力、较弱的抗原性、良好的生物相容性和生物降解安全性，可降解吸收，粘着力好。由胶原制成的手术缝合线既有与天然丝一样的高强度，又有可吸收性，在使用时既有优良的血小板凝聚性能，止血效果好，又有较好的平滑性和弹性，缝合结头不易松散，操作过程中不易损伤机体组织，对创面有很好的黏附性，一般情况下只需较短时间的压迫就可达到满意的止血效果。所以胶原蛋白可以制成粉状、扁状及海绵状的止血剂。同时用合成材料或胶原蛋白在血浆代用品、人造皮肤、人工血管、骨的修复和人工骨和固定化酶的载体等方面的研究和应用方面都十分的广泛。
成纤维细胞在一般创伤修复中的表现各种创伤均会造成不同程度的细胞变性、坏死和组织缺损，必须通过细胞增生和细胞间基质的形成来进行组织修复。在此修复过程中，成纤维细胞起着十分重要的作用。以伤口愈合过程为例，成纤维细胞通过有丝分裂大量增殖，并从4-5天或6天开始合成和分泌大量的胶原纤维和基质成分，与新生毛细血管等共同形成肉芽组织，填补伤口组织缺损，为表皮细胞的覆盖创造条件。在伤口愈合中，成纤维细胞主要来源于真皮乳头层的局部成纤维细胞和未分化的间充质细胞，以及血管周围的成纤维细胞和周细胞。内脏损伤时，参与修复过程的成纤维细胞多来自间质和包膜，以及粘膜下或浆膜下层的结缔组织。有人认为创伤愈合过程中伤处聚集的大量成纤维细胞，一方面是由成纤维细胞通过分裂增殖而来，另一方面，更多地是由邻近的间充质细胞、纤维细胞和毛细血管周细胞等演变或游走到伤处。在创伤修复的后期，成纤维细胞通过分泌胶原酶参与修复后组织的改建。在某些病理条件下，以成纤维细胞为主要细胞成分的肉芽组织或增生组织块还可以在非骨组织内发生钙化，引起异位骨化。但对于异位骨化的参与细胞及其机制尚不十分清楚，未分化间充质细胞、成纤维细胞、内皮细胞和毛细血管周细胞等可划归为诱导性骨祖细胞的细胞都有可能参与这一过程。
人体皮肤的真皮层内蕴含着数量巨大的成纤维细胞，而成纤维细胞的作用就是不断的产生胶原蛋白、透明质酸、弹性纤维等支撑皮肤年轻态的物质，年轻人的皮肤看起来光滑有弹性就是因为大量成纤维细胞的存在。
NF-κB(核因子激活的B细胞的κ-轻链增强)是一种蛋白质复合物，其控制转录的DNA，细胞因子产生和细胞存活。NF-κB几乎存在于所有动物细胞类型中，并参与细胞对刺激的反应，如应激、细胞因子、自由基、重金属、紫外线照射、氧化LDL和细菌或病毒抗原。NF-κB在调节对感染的免疫应答中起关键作用。NF-κB的不正确调节与皮肤状态紊乱、炎症和免疫发育等不当有关。
现有技术中存在对能够协同提升透明质酸和胶原蛋白的合成，从而调整皮肤状态的活性组合物的需求。
发明内容
本发明人意外发现包括特定比例的柚子提取物、SK-INFLUX V混合物和神经酰胺II的活性组合物能够最大程度地提升成纤维细胞分泌透明质酸并合成胶原蛋白以及调节NF-kB，从而调整皮肤状态。
因此，本发明的一个方面是提供一种能提升透明质酸分泌与胶原蛋白合成的组合物，基于所述组合物的总重量，所述组合物包含：0.001重量％-0.01重量％的柚子提取物、0.0005重量％-0.0015重量％的SK INFLUX V混合物和0.00005重量％-0.00015重量％神经酰胺II。
根据本发明的一个实施方案，基于所述组合物的总重量，所述能提升透明质酸分泌与胶原蛋白合成的组合物包含：0.001重量％-0.01重量％的柚子提取物、0.0005重量％-0.0015重量％的SK INFLUX V混合物和0.00005重量％-0.00015重量％神经酰胺II，其余为适合的溶剂例如DMSO。
本文使用的术语“柚子提取物”是指购自ICHIMARU公司的名称为“YUZU CERAMIDEB”的产品，其具体组成参见下表1。
本文使用的术语“SK INFLUX V混合物”是指购自EVONIK公司的名称为“SK INFLUXV”的产品，其具体组成参见下表1。
本文使用的术语“神经酰胺II”是指购自SEDERMA公司的名称为“CERAMIDE II”的产品，其具体组成参见下表1。
表1：YUZU CERAMIDE B、SK INFLUX V和CERAMIDE II的具体组成，其中百分比是指重量百分比。
根据一个优选的实施方案，基于所述组合物的总重量，所述组合物包含：0.001重量％-0.01重量％的柚子提取物、0.001重量％的SK INFLUX V混合物和0.0001重量％神经酰胺II。
根据一个优选的实施方案，所述组合物中柚子提取物、SK INFLUX V混合物和神经酰胺II的重量比为10-100:5-15:0.5-1.5。
根据一个优选的实施方案，所述组合物中柚子提取物、SK INFLUX V混合物和神经酰胺II的重量比为10-100:10:1。
本发明的另一个方面是提供包含柚子提取物、SK INFLUX V混合物和神经酰胺II的组合物在协同提升透明质酸和胶原蛋白的含量的用途。
本发明的另一个方面是提供包含柚子提取物、SK INFLUX V混合物和神经酰胺II的组合物在制备协同提升透明质酸和胶原蛋白的含量的药物或化妆品中的用途。
本发明的另一个方面是提供包含柚子提取物、SK INFLUX V混合物和神经酰胺II的组合物在协同提升透明质酸和胶原蛋白的含量并同时抑制NF-κB表达的用途。
本发明的另一个方面是提供包含柚子提取物、SK INFLUX V混合物和神经酰胺II的组合物在制备协同提升透明质酸和胶原蛋白的含量并同时抑制NF-κB的药物或化妆品中的用途。
根据一个优选的实施方案，基于所述组合物的总重量，所述组合物包含：0.001重量％-0.01重量％的柚子提取物、0.0005重量％-0.0015重量％的SK INFLUX V混合物和0.00005重量％-0.00015重量％神经酰胺II。
根据一个优选的实施方案，基于所述组合物的总重量，所述组合物包含：0.001重量％-0.01重量％的柚子提取物、0.001重量％的SK INFLUX V混合物和0.0001重量％神经酰胺II。
根据一个优选的实施方案，所述组合物中柚子提取物、SK INFLUX V混合物和神经酰胺II的重量比为10-100:5-15:0.5-1.5。
根据一个优选的实施方案，所述组合物中柚子提取物、SK INFLUX V混合物和神经酰胺II的重量比为10-100:10:1。
本发明的另一个方面是提供仅包含柚子提取物、SK INFLUX V混合物和神经酰胺II作为活性成分的组合物在协同提升透明质酸和胶原蛋白的含量的用途。
本发明的另一个方面是提供仅包含柚子提取物、SK INFLUX V混合物和神经酰胺II作为活性成分的组合物在协同提升透明质酸和胶原蛋白的含量并同时抑制NF-κB表达的用途。
本申请表明所述包括特定比例的柚子提取物、SK-INFLUX V混合物和神经酰胺II的活性组合物能够最大程度地提升透明质酸合成和胶原蛋白，同时能够有效抑制由TNF-a所诱导的NF-kB表达，从而提升皮肤状态。
附图说明
图1描述了ELISA技术原理。
图2描述了双荧光素报告基因原理。
图3描述了本发明组合物1-6和对比例组合物7-10以及空白和对照组合物对NF-kB的相对表达量的影响。
图4描述了本发明组合物1-6和对比例组合物7-10以及空白和对照组合物对胶原蛋白含量的影响。
图5描述了本发明组合物1-6和对比例组合物7-10以及空白和对照组合物对透明质酸含量的影响。
具体实施方式
实施例1-6：制备根据本发明的活性组合物
根据下表2的组分及其重量百分比制备根据本发明实施例1-6的活性组合物1-6：
表2：根据本发明实施例1-6的活性组合物1-6的组分及其重量百分比
| 序号 | 柚子提取物wt％ | SK INFLUX V wt％ | 神经酰胺II |
| 实施例1的组合物1 | 0.01 | 0.001 | 0.0001 |
| 实施例2的组合物2 | 0.001 | 0.001 | 0.0001 |
| 实施例3的组合物3 | 0.005 | 0.0005 | 0.00015 |
| 实施例4的组合物4 | 0.01 | 0.0015 | 0.00005 |
| 实施例5的组合物5 | 0.008 | 0.001 | 0.00012 |
| 实施例6的组合物6 | 0.005 | 0.001 | 0.0001 |
室温下先将直接商购的3种活性成分用DMSO按照表2比例的100倍配制成100X的储液，使用时将所述储液稀释100倍即得本发明实施例1-6的组合物1-6。
同时制备空白和对照组合物，其中空白为不添加任何上述3种活性成分，对照为仅添加溶剂DMSO。
对比例7-10：制备用于对比的活性组合物
根据下表3的组分及其重量百分比制备对比例7-10的组合物7-10：
表3：对比例组合物7-10的组分及其重量百分比
室温下先将直接商购的3种活性成分用DMSO按照表3比例的100倍配制成100X的储液，使用时将所述储液稀释100倍即得本发明对比例7-10的组合物7-10。
实施例11：体外人成纤维细胞的培养：
从温箱中取出培养瓶，向瓶底轻轻注入含10％牛血清的DMEM培养液5ml，然后缓缓翻转培养瓶，让培养液慢慢覆盖附于瓶壁上的组织小块，置于37℃温箱内培养。一周后取出培养瓶，弃去瓶内培养液，缓冲液漂洗两次后加相同的培养液5ml继续培养。以后待细胞萌出后，同样方法每周换液两次。待原代培养细胞生长基本融合成片时即可传代。吸出培养瓶内的培养液，缓冲液漂洗两次，向瓶内加入0.5％的胰蛋白酶溶液少许以覆盖瓶底为度。大约1分钟左右，镜下观察细胞胞质回缩，细胞间隙增大时立即吸出胰蛋白酶液，加入DMEM培养液终止消化。用吸管吸取培养液轻轻反复吹打瓶壁细胞使之脱落形成细胞悬液，按1：3比例分装传代，加入足量的DMEM培养液后置于37℃恒温培养箱内培养。每周换液两次，待细胞融合成单层再次传代。本实验均在第4-8代进行。
实施例12：细胞培养
将组合物1-10按照1:100比例(V/V)添加至培养基中，配置完成的终浓度如表2和表3所示，并将细胞培养基中添加不同浓度的3种活性成分的组合物1-10，继续培养24小时，收集上清液用于透明质酸和胶原蛋白的检测。
实施例13：细胞转染与NF-kB双荧光素报告基因测试
使用Lipo2000依照产品说明，配置转染试剂，该试剂包含Lipo2000培养液，SV40参照质粒和Nf-kB报告基因质粒，加入铺有成纤维细胞的96孔板后，继续培养24小时后更换培养液，加入含有上述根据本发明的组合物1-6和对比组合物7-10以及空白和对照组合物的培养液，培养24小时后，使用多道排枪向每个细胞孔中加入平衡至室温的含有底物的反应溶液，加样体积与细胞培养液体积相同并混匀。室温下孵育5-10min。放在振荡混匀仪或附带振板功能的仪器上，室温条件下，采用中高速振板5-10min。孵育后于化学发光仪或酶标仪中检测报告基因活性。并读数计算相对表达量，结果请见下表4。
表4：本发明组合物1-6和对比例组合物7-10以及空白和对照组合物对NF-kB的相对表达量的影响
实施例14：ELISA检测胶原蛋白和透明质酸
ELISA是以免疫学反应为基础，将抗原、抗体的特异性反应与酶对底物的高效催化作用相结合起来的一种敏感性很高的试验技术。由于抗原、抗体的反应在一种固相载体──聚苯乙烯微量滴定板的孔中进行，每加入一种试剂孵育后，可通过洗涤除去多余的游离反应物，从而保证试验结果的特异性与稳定性。本次使用的是ELISA双抗体夹心法。用0.05M碳酸盐包被缓冲液将抗体稀释至蛋白质含量为1-10μg/ml。在每个聚苯乙烯板的反应孔中加0.1ml，4℃过夜。次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次，每次3分钟。(简称洗涤，下同)。加一定稀释的上述根据本发明的组合物1-6和对比组合物7-10以及空白和对照组合物各0.1ml于上述已包被之反应孔中，置37℃孵育1小时。然后洗涤。同时做空白孔和阴性对照孔。加酶标抗体：于各反应孔中，加入新鲜稀释的酶标抗体(经滴定后的稀释度)0.1ml。37℃孵育0.5-1小时，洗涤。加底物液显色：于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液0.1ml，37℃10-30分钟。5.终止反应：于各反应孔中加入2M硫酸0.05ml。在ELISA检测仪上，于450nm处以空白对照孔调零后测各孔O·D值，检测结果见下表5。
表5：本发明组合物1-6和对比例组合物7-10以及空白和对照组合物对胶原蛋白和透明质酸含量的影响
上述实验结果表明，当柚子提取物的含量为0.001％-0.01％、SK INFLUX V混合物的含量为0.0005％-0.0015％以及CERII的含量为0.00005％-0.00015％的比例下，所述组合物具有提升透明质酸合成和胶原蛋白合成的效果，同时能够有效抑制由TNF-a所诱导的NF-κB表达；当柚子提取物的含量为0.001％-0.01％、SK INFLUX V混合物的含量为0.001％以及CERII的含量为0.0001％的比例下，所述组合物具有最优提升透明质酸合成和胶原蛋白合成的效果，同时能够有效抑制由TNF-a所诱导的NF-κB表达，从而提升皮肤状态。
Claims (6)
1.一种能提升透明质酸分泌与胶原蛋白合成的药物或化妆品组合物，其特征在于基于所述组合物的总重量，所述组合物包含：0.001重量％-0.01重量％的柚子提取物、0.0005重量％-0.0015重量％的SK INFLUX V混合物和0.00005重量％-0.00015重量％神经酰胺II；所述柚子提取物是指商品名为“YUZU CERAMIDE B”的产品；并且所述SK INFLUX V混合物是指商品名为“SK INFLUX V”的产品。
2.根据权利要求1所述的药物或化妆品组合物，其特征在于基于所述组合物的总重量，所述组合物包含：0.001重量％-0.01重量％的柚子提取物、0.001重量％的SK INFLUX V混合物和0.0001重量％神经酰胺II。
3.根据权利要求1所述的药物或化妆品组合物，其特征在于所述组合物中柚子提取物、SK INFLUX V混合物和神经酰胺II的重量比为10-100:5-15:0.5-1.5。
4.根据权利要求2所述的药物或化妆品组合物，其特征在于所述组合物中柚子提取物、SK INFLUX V混合物和神经酰胺II的重量比为10-100:10:1。
5.权利要求1-4任一项所述的包含柚子提取物、SK INFLUX V混合物和神经酰胺II的药物或化妆品组合物在制备协同提升透明质酸和胶原蛋白的含量的药物或化妆品中的用途。
6.权利要求1-4任一项所述的包含柚子提取物、SK INFLUX V混合物和神经酰胺II的药物或化妆品组合物在制备协同提升透明质酸和胶原蛋白的含量并同时抑制NF-κB的药物或化妆品中的用途。
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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