CN104122238A - 荧光探针中的比率探测方法 - Google Patents

Abstract

本发明提出了一种荧光探针中的比率探测方法，包括以下步骤：（a）使所述荧光探针测量待测物质，采用时间分辨荧光光谱技术测量获得探针的荧光衰减曲线；（b）通过拟合算法结合多指数模型，拟合所述荧光衰减曲线，提取其相应的αn及τn的数值，其中n为自然数；（c）根据αn及τn的数值随检测物质的变化趋势，将αn及τn分为两类数据：一类随检测物质的增加而增加，标记为αn+及τn+，另一类随检测物质的增加而减少标记为αn-及τn-；（d）计算上述两类数据的比值以实现检测物质的比率测量。本发明方法只需要一个激发波长及一个探测波长，通过计算其瞬态荧光曲线中不同寿命组分的比值就可以进行荧光比率探测。

Description

荧光探针中的比率探测方法

技术领域

本发明涉及荧光探针领域，特别是比率荧光探针和时间分辨荧光光谱技术领域。

背景技术

荧光探针有着广泛的应用，人们已经设计了多种荧光探针来探测溶液的pH值、溶液中金属离子浓度等等。当所探测物质的量（或者浓度）变化的时候，探针的荧光强度一般会随之变化。同时，探针发射的荧光强度还受多种因素影响，例如：激发光的功率、荧光探针浓度、光学元件、探测器的效率、样品的淬灭等，因此，为了定量的测量，一般倾向于要求荧光探针为比率荧光探针。

比率荧光探针一般至少具有两个不同的激发峰A1、A2及一个荧光发射峰F，或者至少具有一个吸收峰A和两个发射峰F1、F2。对于具有两个不同激发峰A1、A2的荧光探针，可以通过在A1、A2分别激发荧光FA1，FA2，并且计算其比值FA1/FA2。对于具有一个吸收峰A两个发射峰F1、F2的荧光探针，可以通过在A处激发样品，并计算F1/F2。

比值FA1/FA2或者F1/F2与待测量物质的量有关。通过计算比率的方法可以在一定程度上消除激发光功率、荧光探针浓度等参数的影响，从而实现定量测量。

但是，上述方法的缺点是要求荧光探针必须有两个这样的激发或者探测波长，并且这两个波长对于待测物质的响应不同。对于只有一个激发峰和一个发射峰的荧光探针通常无法实现比率测量。

随着荧光探测技术的发展，除了传统的稳态荧光测量方法外，瞬态荧光光谱技术也引起了人们的关注。现在已经有多种测量方法可以得到荧光的寿命信息。简而言之，通过一个非常短的光脉冲激发的荧光，其强度会随时间快速衰减。此衰减曲线可以采用单一指数衰减α*exp(-t/τ)进行拟合,τ为该物质的荧光寿命。但是荧光衰减曲线通常比较复杂，通过单指数拟合不能获得满意的拟合效果，此种情况下需要采用多指数 拟合，其中。此种情况下，平均荧光寿命为

本发明者发现在一些荧光探针中，随着探测物质的变化，拟合瞬态荧光衰减曲线的α与（或）τ都会发生相应的变化。通过计算这些参数比值的变化，可以提供一种新的荧光比率探测方法。这种方法只需要一个激发波长及一个探测波长，通过计算其瞬态荧光曲线中不同寿命组分的比值就可以进行荧光比率探测。

发明内容

本发明为了解决现有技术的上述缺陷,提出了一种荧光探测探针中的比率探测方法，包括以下步骤：

（a）使所述荧光探针测量待测物质，通过时间分辨荧光测量获得探针的荧光衰减曲线；

（b）通过拟合算法结合多指数模型，拟合所述荧光衰减曲线，提取其相应的αn及τn的数值，其中n为自然数；

（c）根据αn及τn的数值随检测物质的变化趋势，将αn及τn分为两类数据：一类随检测物质的增加而增加，标记为αn+及τn+，另一类随检测物质的增加而减少标记为αn-及τn-；以及

（d）计算上述两类数据的比值以实现检测物质的比率测量。

优选地，上述两类数据的比值包括 $\mathrm{\Σ}{\mathrm{\α}}_n^{+}/\mathrm{\Σ}{\mathrm{\α}}_n^{-},$ $\mathrm{\Σ}{\mathrm{\α}}_n^{+}*{\mathrm{\τ}}_n^{+}/\mathrm{\Σ}{\mathrm{\α}}_n^{-}*{\mathrm{\τ}}_n^{-},$ $\mathrm{\Σ}{\mathrm{\τ}}_n^{+}/\mathrm{\Σ}{\mathrm{\τ}}_n^{-}.$

优选地,上述两类数据的比值包括 $\mathrm{\Σ}{\mathrm{\α}}_n^{-}/\mathrm{\Σ}{\mathrm{\α}}_n^{+},$ $\mathrm{\Σ}{\mathrm{\α}}_n^{-}*{\mathrm{\τ}}_n^{-}/\mathrm{\Σ}{\mathrm{\α}}_n^{+}*{\mathrm{\τ}}_n^{+},$ $\mathrm{\Σ}{\mathrm{\τ}}_n^{-}/\mathrm{\Σ}{\mathrm{\τ}}_n^{+}$

本发明方法的有益效果：只需要一个激发波长和一个探测波长，避免了传统比率探测方法要求荧光探针至少具有两个激发波长一个探测波长或者一个激发波长两个探测波长。

一方面，一些只有一个激发峰和一个发射峰采用传统方法无法实现比率荧光测量的荧光探针采用本发明的技术可以实现比率荧光测量。

另一方面，因为，如果α_n中有几个变小，则其余的α_n会相应的变大以保持其和恒等于1，这种取其比值的方法比计算平均荧光寿命的方法具有更大的动态范围，所以具有更高的灵敏度，因此可以实现比传统比率荧光探测方法更灵敏的探测。

附图简要说明

图1（a）表示Peredox在无NADH和NADH饱和后的时间分辨荧光曲线；图1（b）表示了Peredox蛋白荧光拟合参数α1、α2、及α3与NADH浓度的关系图；图1（c）表示通过图1（b）中α1、α2、及α3计算所得的R，与平均荧光寿命Tave及实验测量的归一化稳态荧光强度。

图2（a）表示SuperFrex蛋白在420nm激发，514nm探测在无NADH及NADH饱和情况下的时间分辨荧光曲线；图2（b）表示在3个不同pH值情况下不同NADH浓度下α1、α2、及α3与NADH浓度的关系图；图2（c）表示在三个不同pH情况下(α2+α3)/α1与NADH浓度关系图。

具体实施方式

实施例1：在基于环形绿色荧光蛋白（cpGFP）的NADH探针中实现定量且高灵敏的测量方法。

本实施例采用Cell Metabolism14,545–554,2011报道的对NADH敏感的荧光蛋白探针，但是通过基因工程去除了mCherry红色荧光蛋白部分，仅保留了Peredox部分。

图1（a）表示了Peredox在无NADH和NADH饱和后的时间分辨荧光曲线。通过拟合仪器响应函数IRF与数学模型(i=1..3)的重卷积可以以很高的精度得到模型中n组参数α及τ的数值，n为自然数。本实施例中，n取3，即获取3组α及τ的数值。

图1（b）表示了Peredox蛋白荧光拟合参数α1（0.2ns）、α2（1.5ns）、及α3（3.2ns）与NADH浓度的关系图。其中Peredox的浓度为0.05μM。在NADH浓度增加时，τ3=3.2ns对应的α3百分比增加，τ1=0.2ns及τ2=1.5ns对应的α1及α2百分比减少。

图1（c）,通过图1（b）中α1（0.2ns）、α2（1.5ns）、及α3（3.2ns）计算所得的与平均荧光寿命，及实验测量的归一化稳态荧光强度（Normalized Intensity）。归一化稳态荧光强度采用无NADH的情况下测量所得荧光强度进行归一化计算所得，可见在NADH饱和后，其归一化稳态荧光强度从1变为2.8，动态范围为180%，因为此种测量方式在实际生物细胞测量中难以获得无NADH情况下荧光强度，所以难以进行归一化，不能实现比率测量。计算得到的平均寿命不依赖于测量中peredox浓度、激发光强度等参数，可以实现定量测量，但是其变化范围从无NADH时的2.3ns增加到NADH饱和后的3.0ns，动态范围仅仅为30%。而本发明的比率探测方法计算在没有NADH时候R=1.1，在NADH饱和的时候R=13,动态范围为1200%。而且R值与peredox浓度、激发光强度等参数，可以实现定量测量。

实施例2：在基于环形黄色荧光蛋白（cpYFP）的NADH探针SuperFrex中实现定量且高灵敏的测量方法。

此SuperFrex为通过基因技术新发明的蛋白，SuperFrex中的荧光生色团为黄色荧光蛋白YFP。此类蛋白基于传统的稳态荧光测量方法通常使用420nm及490nm两个激发波长激发，探测其在514nm左右发射荧光的强度并取其比值，从而实现比率测量。

图2（a）表示此SuperFrex蛋白在420nm激发，514nm探测在无NADH(No NADH)及NADH饱和情况下的时间分辨荧光曲线。通过拟合可以得到3组α及τ的数值。

图2（b）表示在3个不同pH值情况下不同NADH浓度下α1（约0.15ns）、α2（约0.8ns）、及α3（约1.9ns）与NADH浓度的关系图。SuperFrex的浓度为0.2μM。在NADH浓度增加时，τ2=0.8ns及τ3=1.9ns对应的α2及α3百分比增加，τ1=0.2ns对应的α1百分比减少。

图2（c）表示在三个不同pH情况下(α2+α3)/α1与NADH浓度关系图。由此可见，仅仅通过420nm激发，514nm探测，通过计算拟合参数(α2+α3)/α1的比率就可以实现NADH浓度的定量测量。在此基于YFP的样品中，本发明方法不仅可以实现比率测量，同时可以避免pH效应。

Claims (3)

1.荧光探针中的比率探测方法，其特征在于，包括以下步骤：

（a）使所述荧光探针测量待测物质，通过时间分辨荧光测量获得探针的荧光衰减曲线；

（b）通过拟合算法结合多指数模型拟合所述荧光衰减曲线，提取其相应的α_n及τ_n的数值，其中n为自然数；

（c）根据α_n及τ_n的数值随检测物质的变化趋势，将α_n及τ_n分为两类数据：一类随检测物质的增加而增加，标记为α_n ⁺及τ_n ⁺，另一类随检测物质的增加而减少标记为α_n ^-及τ_n ^-；以及

（d）计算上述两类数据的比值以实现所述待检测物质的比率测量。

2.根据权利要求1所述的比率探测方法，其特征在于：上述两类数据的比值包括 $\mathrm{\Σ}{\mathrm{\α}}_n^{+}/\mathrm{\Σ}{\mathrm{\α}}_n^{-},$ $\mathrm{\Σ}{\mathrm{\α}}_n^{+}*{\mathrm{\τ}}_n^{+}/\mathrm{\Σ}{\mathrm{\α}}_n^{-}*{\mathrm{\τ}}_n^{-},$ $\mathrm{\Σ}{\mathrm{\τ}}_n^{+}/\mathrm{\Σ}{\mathrm{\τ}}_n^{-}.$

3.根据权利要求1所述的比率探测方法，其特征在于：上述两类数据的比值包括 $\mathrm{\Σ}{\mathrm{\α}}_n^{-}/\mathrm{\Σ}{\mathrm{\α}}_n^{+},$ $\mathrm{\Σ}{\mathrm{\α}}_n^{-}*{\mathrm{\τ}}_n^{-}/\mathrm{\Σ}{\mathrm{\α}}_n^{+}*{\mathrm{\τ}}_n^{+},$ $\mathrm{\Σ}{\mathrm{\τ}}_n^{-}/\mathrm{\Σ}{\mathrm{\τ}}_n^{+}.$