CN109060746B - 一种比率型荧光检测方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于纳米成像探针应用技术领域，公开了一种比率型荧光检测方法及应用。本发明所提供的比率型荧光检测方法包括：将纳米探针加入到待测样本中，在同一束激发光的激发下，纳米探针中的两种荧光团分别发射波长相同的长寿命荧光信号和短寿命荧光信号；使用时间门荧光探测装置，关闭时间门功能，收集所述长寿命荧光信号和短寿命荧光信号的总强度；开启时间门功能，收集所述长寿命荧光信号的强度；以所述长寿命荧光信号强度与所述长寿命荧光信号、短寿命荧光信号总强度的比率值表征待测样本中待测物的浓度。利用本发明的方法检测可获得高准确度的原位比度信号，显著提高荧光检测的准确性，特别适用于活体检测中。

Description

一种比率型荧光检测方法及应用
技术领域
本发明属于纳米成像探针应用技术领域，特别涉及一种比率型荧光检测方法及应用。
背景技术
光学成像在科学探究生物体内部结构及生命活动过程中一直扮演着非常重要的角色。经过了几十年的发展，人们已经实现了从细胞到组织到活体的多尺度高灵敏成像。而光学检测由于无损非侵入式，灵敏，耗时短，功能强大等原因在临床检测中一直有着广泛的应用。
现有的比率成像模式通常是用一束激发光激发起来自两种不同荧光材料的、波长不同的两束荧光，然后利用这两束荧光强度的比值来判断样本中待测物量的多少。这种比率模式相对于利用单一荧光强度信号的检测模式排除了探针浓度本身对于定量检测的干扰。
然而，已有研究表明，不同波长的光在样本内部传播能力或者穿透能力是由光的波长和样本的种类决定的，所以两束光穿透同一样本后的衰减程度是不一样的，因此，在样本外部检测到的两束光的比率值和在样本内部原位处的比率值是不相等的，也就是说这一检测到的比率值是与探针在样本内所处深度相关的。
现有的另一种比率成像的技术原理也类似，采用两束不同的激发光去激发荧光探针收得两束不同的荧光信号，待测物的引入会改变某一激发条件下的能量传递过程进而引起荧光强度的变化；而另一激发条件下的传能过程通常不受待测物加入的影响，荧光强度也不发生改变，最终用这两束荧光的强度比率值来判断待测物的多少。
然而，这种比率成像技术也存在相同的缺点，两束激发光的波长不一样，穿透样本后的衰减程度也不一样，所以相同待测物浓度情况下，光强的比率值还跟阻挡的样本组织的厚度和种类有关，无法实现样本内部复杂情况下对待测物量的准确测定。
发明内容
本发明的目的在于提供一种可获得高准确度原位比度信号的比率型荧光检测方法及应用。
为解决上述技术问题，本发明的实施方式所提供的比率型荧光检测方法，包括如下步骤：(1)将纳米探针加入到待测样本中，所述纳米探针包含两种荧光团；(2)在同一激发光的激发下，所述两种荧光团分别发射波长相同的长寿命荧光信号和短寿命荧光信号；(3)使用时间门荧光探测装置，关闭时间门功能，收集所述长寿命荧光信号和短寿命荧光信号的总强度；开启时间门功能，收集所述长寿命荧光信号的强度；(4)以所述长寿命荧光信号强度与所述长寿命荧光信号、短寿命荧光信号总强度的比率值表征待测样本中待测物的浓度。所述待测样本包括人体、动物体、模式动物或复杂样本。
相对于现有技术而言，本发明的实施方式所提供得的高准确度原位比度信号的方法的核心有以下两个。
第一，是单激发同波长双发射的比率成像模式，这种成像模式输出的比度信号(即样本外探测到的比度信号)与原位比度信号值非常接近。申请人认为，首先，荧光的强度与荧光团的浓度相关，所以无法使用单一的荧光信号强度去定量的标定待测物的多少；其次，样本深处的光在进入和穿透样本内部的过程中会有吸收和散射过程发生，导致检测到的光强并不等于原位的信号强度。现有的比度检测成像模式，即用两束荧光强度的比率值Iλ1/Iλ2(λ1≠λ2)来标定待测物的多少，虽可以提供相对准确的定量信息；然而，根据生物光子学，不同波长的光在样本内部的传播能力并不相同。在传输理论中，使用吸收系数μa和散射系数μs来表征光子在单位长度上发生吸收和散射的概率。吸收和散射系数都是光的波长和生物组织类型的函数，总的来说样本内部组织对光的吸收系数随光的波长增加而忽大忽小，而生物组织对光的散射系数随光的波长增加而单调下降，且不同组织对相同波长的光的系数和散射系数不同。所以上述传统的比率模式所检测到的体外比度信号与原位处的比度信号是不相等的，是存在显著偏差的。而本发明创新性地利用两束波长相同的荧光的强度比率值来表征待测物浓度，而且这两束荧光是用一束激发光激发出来的，即单激发同波长双发射的比率成像/检测模式，这样可以最大程度的消除样本内部组成对荧光的吸收和散射过程对输出比度信号值的干扰，最大程度地实现对原位比度信号的保真。
第二，是适用这一成像模式的探针及时间门荧光探测装置。传统的光谱测量技术或者宽场成像技术是无法实现对同波段荧光信号的区分或者分别收集的。要实现本发明的比率型荧光检测方法，还需要配合特定的双通道解码同波段荧光技术，包括探针和时间门荧光探测装置。该种探针中所包含的两种荧光团能分别发射同波长的长寿命荧光信号和短寿命荧光信号；通过时间门荧光探测装置中的时间门功能的开启和关闭，可收集到长寿命荧光信号和短寿命荧光信号，从而完成了双通道解码同波段荧光。
在本发明的实施方式所提供的比率型荧光检测方法中，所述时间门荧光探测装置包括时间门单元和成像单元，所述时间门单元包括波形发生器和斩波器；所述成像单元包括环形激光、镜头和相机。斩波器向波形发生器输出信号，波形发生器控制环形激光发射激发光。上述时间门荧光探测装置以激发光关闭与斩波器开启之间的时间差作为延迟的时间门控，区分长寿命、短寿命的荧光信号。该种时间门荧光探测装置的工作过程中，在当时间门功能关闭时，两束荧光全部可以穿过斩波器中间的空档进入相机中，检测器收集到的是粒子和染料总的发光；当时间门功能开启时，通过设置适当的斩波器旋转频率及激光开启闭合的时间即可使得只有长寿命的粒子发光能够透过斩波器叶片中间的空档进入相机而短寿命的荧光被斩波器的叶片挡住。通过控制时间门功能的开闭，就能获得两束波长相同的荧光。
优选地，在本发明的实施方式所提供的比率型荧光检测方法中，纳米探针中的两种荧光团各自独立地选自：纳米粒子、有机染料、配合物和量子点，只要这两种荧光团可分别发射同波长、且可区分的长寿命荧光信号和短寿命荧光信号即可。
优选地，本发明实施方式中的纳米探针可为NaYF4:5％Nd@Cy860@PC、NaYF4:20％Yb@Cy965@PC、NaYF4:5％Nd@Rh780@PC或NaYF4:1％Tm@Rh760@PC。以NaYF4:5％Nd@Cy860@PC为例，在该种纳米探针中，纳米粒子NaYF4:5％Nd的寿命为53微秒，有机染料Cy860的寿命为纳秒级别。纳米粒子和有机染料的发光寿命的区别，决定了可通过时间门的筛选有效消除有机染料的短寿命荧光、只保留长寿命纳米粒子的发光。另外，通过卵磷脂(PC)的包裹使得复合材料在水中具有良好的水溶性、分散性及生物相容性。此外，由于有机染料Cy860对次氯酸有特异性响应，整个复合探针对于次氯酸同样具有特异性响应，随着次氯酸的加入染料的发光逐渐减弱，粒子的发射逐渐恢复。
本发明的实施方式还提供上述比率型荧光检测方法在活体内光学定量检测中的应用。
附图说明
图1是本发明具体实施方式中的比率型荧光检测方法的原理示意图；
图2是实施例1中制备的NaYF4:5％Nd@Cy860@PC纳米探针的电镜图；
图3是实施例1中随着次氯酸的加入，使用时间门荧光探测装置，分别在时间门功能开启(3-A)和关闭(3-B)状态下检测到的纳米探针的荧光发射强度变化；
图4是实施例1中根据附图3中的荧光发射强度变化得出的0mm组、2mm组和3mm组的长寿命荧光信号、短寿命荧光信号总强度的比率值；
图5是实施例1中随着次氯酸的加入，以常规光谱仪检测得到的纳米探针的发光强度变化；
图6是实施例2中随着PH值变化，使用时间门荧光探测装置，分别在时间门功能开启(6-A)和关闭(6-B)状态下检测到的纳米探针的荧光发射强度变化；
图7是实施例3中的小鼠体内比率型荧光检测结果图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明的各实施方式进行详细的阐述。然而，本领域的普通技术人员可以理解，在本发明各实施方式中，为了使读者更好地理解本申请而提出了许多技术细节。但是，即使没有这些技术细节和基于以下各实施方式的种种变化和修改，也可以实现本申请各权利要求所要求保护的技术方案。
本发明的具体实施方式提供了一种比率型荧光检测方法，包括如下步骤：(1)将纳米探针加入到待测样本中，所述纳米探针包含两种荧光团；(2)在同一激发光的激发下，两种荧光团分别发射波长相同的长寿命荧光信号和短寿命荧光信号；(3)使用时间门荧光探测装置，关闭时间门功能，收集所述长寿命荧光信号和短寿命荧光信号的总强度；开启时间门功能，收集所述长寿命荧光信号的强度；(4)以长寿命荧光信号强度与长寿命荧光信号、短寿命荧光信号总强度的比率值表征待测样本中待测物的浓度。附图1为上述比率型荧光检测方法的原理示意图。
在本发明的具体实施方式中，待测样本可以为人体、动物体、模式动物或复杂样本。
在发明的具体实施方式中，所使用的时间门荧光探测装置包括时间门单元和成像单元，所述时间门单元包括波形发生器、斩波器和激光器；所述成像单元包括环形激光、镜头和相机；斩波器向所述波形发生器输出信号，所述波形发生器控制所述环形激光发射激发光；且所述时间门荧光探测装置以激发光关闭与斩波器开启之间的时间差作为延迟的时间门控，区分长寿命、短寿命的荧光信号。
在本发明的具体实施方式中，所使用的纳米探针中的两种荧光团各自独立地选自：纳米粒子、有机染料、配合物和量子点。只要这两种荧光团可分别发射同波长、且可区分的长寿命荧光信号和短寿命荧光信号即可。具体地，优选如下纳米探针：NaYF4:5％Nd@Cy860@PC、NaYF4:20％Yb@Cy965@PC、NaYF4:5％Nd@Rh780@PC或NaYF4:1％Tm@Rh760@PC。
以下为几个具体的实施例。
实施例1基于纳米探针NaYF4:5％Nd@Cy860@PC的体外溶液样本内比率型荧光检测
取含0.1mmol纳米粒子的环己烷溶液向其中加入4mL二氯甲烷超声分散均匀，再向其中加入200μL Cy860乙醇溶液(0.5g/L)搅拌0.5h混合均匀，最后加入5mL卵磷脂(PC)二氯甲烷溶液(6g/L)，搅拌混合蒸去二氯甲烷，所得固体分散在水中即为NaYF4:5％Nd@Cy860@PC复合纳米探针，附图2是该纳米探针的电镜图。
取所制得复合探针于96孔板中，逐滴加入预先配好的次氯酸钠溶液，每次加完搅拌3min确保反应充分。将反应后溶液放入时间门成像系统内在时间门单元开启和关闭状态下分别成像，每次成像依次覆盖0mm，2mm和3mm猪肉片。激发光源为808nm激光，收取波段为890±10nm。由于染料对纳米粒子的发光有淬灭作用，在不加入次氯酸以前，时间门开启状态下收得的长寿命纳米粒子荧光强度几乎为零，时间门关闭状态下收得的也几乎全是来自有机染料的短寿命荧光信号。随着次氯酸的逐滴加入，染料的结构逐渐被破坏。附图3是使用时间门荧光探测装置，分别在时间门功能开启和关闭状态下检测到的纳米探针的荧光发射强度变化；图4是根据附图3中的荧光发射强度变化得出的0mm组、2mm组和3mm组的长寿命荧光信号、短寿命荧光信号总强度的比率值；图5是以常规光谱仪检测得到的纳米探针的发光强度变化。如附图3所示，纳米粒子的发光逐渐恢复，染料的发光逐渐减弱，所以如附图4所示，二者光强的比率值是随着次氯酸的滴加而递增的。本实施例所提供的方法可高准确度地测定复杂样本或者有生物组织阻挡情况下的待测样本次氯酸含量。
实施例2基于纳米探针NaYF4:1％Tm@Rh760@PC的体外溶液样本内比率型荧光检测
用与实施例1相同的方法制得NaYF4:1％Tm@Rh760@PC复合探针。将所制得探针溶液置于石英比色皿中，调节溶液pH值分别为0.74,2.88,4.9,7.5，然后将比色皿放在时间门光谱系统(将实施例1中时间门成像系统的相机换成光纤光谱仪即可)上在时间门单元开启和关闭状态下分别测试。激发光源为690nm激光，收取波段为800±5nm。图6是随着PH值变化，使用时间门荧光探测装置，分别在时间门功能开启和关闭状态下检测到的纳米探针的荧光发射强度变化。如附图6所示：复合探针在时间门单元开启状态下测得的荧光强度几乎不随pH的改变而改变；而在时间门关闭状态下测得的荧光强度随着溶液pH的升高而增强。用这种符合单激发同波长双发射比率模式构筑的比率型探针即可高准确度的测定复杂样本或者有生物组织阻挡情况下的待测样本pH值。
实施例3基于纳米探针NaYF4:5％Nd@Cy860@PC的小鼠体内比率型荧光检测
取4周龄Balb/c小鼠五只于足部分别注射25μL生理盐水和浓度依次为0.468mol/L,0.585mol/L,0.780mol/L,1.170mol/L的次氯酸钠溶液,然后依次注射25μL复合探针(3mol/L)。五分钟后在时间门成像系统上依次成像，激发光源为808nm激光，收取波段为890±10nm。根据所得结果观察发现，小鼠注射的次氯酸浓度越高，时间门单元开启状态下收集到的长寿命荧光越强而时间门单元关闭状态下收集到的短寿命荧光却越弱，短寿命荧光与长寿命荧光的强度比率值也随着次氯酸浓度的升高而降低。这与体外实验得到的结果是吻合的。提取中间三只老鼠足部相同位置的荧光强度做比率值分别为24.33,16.27,14.73，证明我们的方法在动物体内可以有效的区分次氯酸浓度的高低。附图7是小鼠体内比率型荧光检测结果图。
本领域的普通技术人员可以理解，上述各实施方式是实现本发明的具体实施例，而在实际应用中，可以在形式上和细节上对其作各种改变，而不偏离本发明的精神和范围。

Claims (9)

1.一种比率型荧光检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将纳米探针加入到待测样本中，所述纳米探针包含两种荧光团；
(2)在同一束激发光的激发下，所述两种荧光团分别发射波长相同的长寿命荧光信号和短寿命荧光信号；
(3)使用时间门荧光探测装置，所述时间门荧光探测装置以激发光关闭与斩波器开启之间的时间差作为延迟的时间门控，区分长寿命、短寿命的荧光信号；
关闭时间门功能，收集所述长寿命荧光信号和短寿命荧光信号的总强度；开启时间门功能，收集所述长寿命荧光信号的强度；
(4)以所述长寿命荧光信号强度与所述长寿命荧光信号、短寿命荧光信号总强度的比率值表征待测样本中待测物的浓度。
2.根据权利要求1所述的比率型荧光检测方法，其特征在于，所述待测样本包括动物体。
3.根据权利要求2所述的比率型荧光检测方法，其特征在于，所述动物体包括人体或模式动物。
4.根据权利要求1所述的比率型荧光检测方法，其特征在于，所述时间门荧光探测装置包括时间门单元和成像单元，所述时间门单元包括波形发生器和斩波器；所述成像单元包括环形激光、镜头和相机。
5.根据权利要求4所述的比率型荧光检测方法，其特征在于，所述斩波器向所述波形发生器输出信号，所述波形发生器控制所述环形激光发射激发光。
6.根据权利要求1所述的比率型荧光检测方法，其特征在于，所述纳米探针中的两种荧光团各自独立地选自：纳米粒子、有机染料或配合物。
7.根据权利要求6所述的比率型荧光检测方法，其特征在于，所述纳米探针为NaYF4:5％Nd@Cy860@PC、NaYF4:20％Yb@Cy965@PC、NaYF4:5％Nd@Rh780@PC或NaYF4:1％Tm@Rh760@PC。
8.根据权利要求7所述的比率型荧光检测方法，其特征在于，所述纳米探针中，纳米粒子NaYF4:5％Nd的寿命为53微秒，有机染料Cy860的寿命为纳秒级别，且两种材料都可以被808nm激光激发，在893nm处有发射。
9.权利要求1至8中任一项所述的比率型荧光检测方法在活体内光学定量检测中的应用。
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