CN113176239B - 一种确定荧光多肽自组装临界组装浓度的方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种确定荧光多肽自组装临界组装浓度的方法及其应用，所述确定荧光多肽自组装临界组装浓度的方法包括：通过时间分辨荧光光谱技术分别测试不同浓度的待测荧光多肽的荧光衰减曲线，并对所得荧光衰减曲线进行两指数拟合，得到拟合曲线；对所得拟合曲线中的长寿命光子数和短寿命光子数进行整理，计算长寿命光子数的占比和短寿命光子数的占比；构建所述长寿命光子数的占比和短寿命光子数的占比与所述待测荧光多肽的浓度的分布图，计算所述长寿命光子数的占比发生突变时对应的荧光多肽的浓度，即所述的荧光多肽自组装临界组装浓度。所述方法操作简单，结果准确，检测成本低，具有广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于材料检测技术领域，尤其涉及一种确定荧光多肽自组装临界组装浓度的方法及其应用。
背景技术
自组装是指分子、纳米材料、微米或更大尺度的物质等基本结构单元自发形成有序结构的过程。在自组装的过程中，基本结构单元在基于非共价键的相互作用下自发地组织或聚集为一个稳定、具有一定规则几何外观的结构。其中，以蛋白为结构单元通过自组装能形成高度有序的纤维结构。
临界组装浓度是自组装过程中一个重要的参数，采用不同的方法测量得到的结果可能存在较大的差异。目前，主要是通过外源性加入荧光分子(如Tht，硫黄素T)，根据自组装时形成的纤维引起荧光强度突变作为依据进行测量。刘春红等人(刘春红等，乳清蛋白自组装纤维形成的临界聚集质量浓度研究，中国食品学报，2016，16(1)，69～76.)曾经采用Tht荧光分析方法对乳清蛋白在pH 2.0，反应温度分别为343，353，358，363K及383K的条件下纤维形成的临界聚集质量浓度进行测量。但这种方法存在一定的局限性，对于某些与外源性荧光分子的发光位置相重叠的多肽荧光分子而言是无效的，另外荧光分子易发生荧光淬灭，对运输及储存的环境要求较高。
荧光多肽无法通过常规的荧光分析法测量其临界组装浓度。因此，如何提供一种准确的可以测量荧光多肽自组装临界组装浓度的方法，具有较强的适用性，已成为亟待解决的问题。
发明内容
针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供一种确定荧光多肽自组装临界组装浓度的方法及其应用，测量过程中未引入外源荧光分子，对多肽自身的结构及性质无影响，测量结果准确，不受外界因素影响，应用价值高。
为达此目的，本发明采用如下技术方案：
第一方面，本发明提供了一种确定荧光多肽自组装临界组装浓度的方法，所述确定荧光多肽自组装临界组装浓度的方法包括：
(1)通过时间分辨荧光光谱技术分别测试不同浓度的待测荧光多肽的荧光衰减曲线，并对所得荧光衰减曲线进行两指数拟合，得到拟合曲线；
对所得拟合曲线中的长寿命光子数和短寿命光子数进行整理，计算长寿命光子数的占比和短寿命光子数的占比；
(2)构建所述长寿命光子数的占比和短寿命光子数的占比与所述待测荧光多肽的浓度的分布图，计算所述长寿命光子数的占比发生突变时对应的荧光多肽的浓度，即所述的荧光多肽自组装临界组装浓度。
本发明中，根据荧光多肽的荧光寿命测量其自组装临界组装浓度。荧光寿命是荧光分子在受到激光激发后，分子吸收能量后从基态跃迁到激发态，再以辐射或非辐射跃迁返回基态，分子的荧光强度降低到最大荧光强度的1/e所需要的时间。由于荧光寿命与荧光分子的浓度无关，但与分子的微观结构和聚集状态有关，因此，采用这种方法测量得到的临界组装浓度不受待测多肽的浓度的影响，结果准确；并且在测量过程中未引入外源荧光分子，多肽本身的结构不受影响，不会因结构改变导致临界组装浓度的变化从而带来误差，进一步提高了检测的精密度。
本发明中，根据荧光多肽的荧光寿命测量确定自组装临界组装浓度的方法的原理如下：未组装的荧光多肽能量较高，稳定性较差，受激发后更易淬灭，因此荧光寿命较短；当发生自组装时，形成纳米纤维，稳定性增强，荧光淬灭的时间较长，因此荧光寿命较长。当荧光多肽的浓度在高于某一个数值时会发生自组装过程，荧光寿命显著变长，对应的长寿命分子的数量及占比也激增；当荧光多肽的浓度低于这个数值时则不会发生自组装，因此，此荧光多肽的浓度即为其自组装临界组装浓度。
本发明中，所述长寿命光子数即为发生了自组装的光子的数目，所述短寿命光子数即为未发生自组装的光子的数目。
优选地，步骤(1)中所述分别测试不同浓度的待测荧光多肽的荧光衰减曲线前还包括确定待测荧光多肽的激发波长和检测波长的步骤。
优选地，所述确定待测荧光多肽的激发波长和检测波长根据所述待测荧光多肽的紫外吸收光谱和/或荧光发生光谱确定。
优选地，步骤(1)的过程包括：
配置浓度范围较宽的所述待测荧光多肽的梯度溶液，通过时间分辨荧光光谱技术分别测试荧光衰减曲线，对所得荧光衰减曲线进行两指数拟合，对所得拟合曲线中的长寿命光子数和短寿命光子数进行整理，计算长寿命光子数的占比和短寿命光子数的占比，根据所述荧光衰减曲线和长寿命光子数占比确定荧光寿命发生突变的浓度范围，再在所述发生突变的浓度范围内配置浓度梯度溶液，分别测试浓度范围较窄的所述测荧光多肽的荧光衰减曲线，再次进行两指数拟合，得到准确的拟合曲线，并计算准确的长寿命光子数的占比和短寿命光子数的占比。
本发明中，先根据实际实验确定待测荧光多肽无法发生自组装的最高浓度和可以发生自组装所需的最低浓度，即为所述的浓度范围较宽的待测多肽溶液的端点浓度，在其中设置浓度梯度，测试荧光衰减曲线、拟合并计算长寿命光子数的占比后，确定的荧光寿命发生突变的浓度范围即为所述的浓度范围较窄的待测多肽的溶液浓度。
本发明中，通过两次测试荧光衰减曲线并进行两指数拟合，可以排除因浓度过高或过低产生的极端数值对拟合曲线的影响，仅选用荧光寿命发生突变的浓度范围进行计算，拟合的曲线更加贴合实际情况，计算结果更加准确。
优选地，步骤(1)中所述长寿命光子数的占比和短寿命光子数的占比为所述的准确的长寿命光子数的占比和短寿命光子数的占比。
优选地，所述两指数拟合使用的公式为：
式中：
y-光子数；
x-检测时间；
e-自然常数；
t1-长寿命时间；
t2-短寿命时间；
A1-长寿命光子数；
A2-短寿命光子数。
本发明中，假设体系内所有组分(游离态分子和聚集体)的荧光量子产率相等。
本发明中，A1和A2为拟合曲线的特定数值，代表曲线的固有属性。在拟合曲线的过程中，通过将测试荧光衰减曲线时测量得到的x、y、t1和t2的数值带入拟合公式中，即可计算得到A1和A2的数值。
优选地，t2为3.8～4.2ns，例如可以是3.8ns、3.9ns、4ns、4.1ns或4.2ns，优选为4ns。
本发明中，所述t1和t2的数值可根据待测荧光多肽的性质进行确定，此处规定t2为3.8～4.2ns，t1不做限定。
优选地，所述长寿命光子数的占比的计算公式为：
长寿命光子数占比＝A1/(A1+A2)×100％；
优选地，所述短寿命光子数的占比的计算公式为：
短寿命光子数占比＝A2/(A1+A2)×100％。
作为优选技术方案，本发明所述确定荧光多肽自组装临界组装浓度的方法，包括以下步骤：
(1)根据待测荧光多肽的紫外吸收光谱和/或荧光发生光谱，确定所述待测荧光多肽的激发波长和检测波长；
(2)配置浓度范围较宽的所述待测荧光多肽的梯度溶液，通过时间分辨荧光光谱技术分别测试荧光衰减曲线，对所得荧光衰减曲线进行两指数拟合，所述两指数拟合使用的公式为：
式中：
y-光子数；
x-检测时间；
e-自然常数；
t1-长寿命时间；
t2-短寿命时间；
A1-长寿命光子数；
A2-短寿命光子数；
其中，t2为3.8～4.2ns；
对所得拟合曲线中的长寿命光子数和短寿命光子数进行整理，计算长寿命光子数的占比和短寿命光子数的占比；
所述长寿命光子数的占比的计算公式为：
长寿命光子数占比＝A1/(A1+A2)×100％；
所述短寿命光子数的占比的计算公式为：
短寿命光子数占比＝A2/(A1+A2)×100％；
根据所述荧光衰减曲线和长寿命光子数占比确定荧光寿命发生突变的浓度范围，再在所述发生突变的浓度范围内配置浓度梯度溶液，分别测试浓度范围较窄的所述测荧光多肽的荧光衰减曲线，再次进行两指数拟合，得到准确的拟合曲线，并计算准确的长寿命光子数的占比和短寿命光子数的占比；
(3)构建所述长寿命光子数的占比和短寿命光子数的占比与所述待测荧光多肽的浓度的分布图，计算所述长寿命光子数的占比发生突变时对应的荧光多肽的浓度，即所述的荧光多肽自组装临界组装浓度。
第二方面，本发明提供了第一方面所述的确定荧光多肽自组装临界组装浓度的方法在荧光多肽自组装临界组装浓度检测中的应用。
本发明中，所述确定荧光多肽自组装临界组装浓度的方法无需借助外源的荧光分子，对多肽性质的影响较小，操作简单，结果准确，具有实际应用的价值。
相比于现有技术，本发明具有如下有益效果：
本发明所述的荧光多肽自组装临界组装浓度的确定方法根据多肽分子本身的荧光特性，根据荧光寿命进行检测，无需加入外源荧光分子，对荧光多肽的结构的影响较小，是对荧光多肽分子的直接表征，结果准确；采用两指数拟合公式进行拟合，拟合效果好，拟合度曲线的χ2在1.036～1.447之间，满足相关的标准；操作简便，检测成本低，具有重要的应用前景。
附图说明
图1A为本发明实施例1中浓度分别为1μg/mL、10μg/mL、100μg/mL、1mg/mL和6mg/mL的NapFFKY-dansyl溶液的荧光衰减曲线图片；
图1B为本发明实施例1中浓度分别为1μg/mL、10μg/mL、100μg/mL、1mg/mL和6mg/mL的NapFFKY-dansyl溶液的拟合曲线图片；
图1C为本发明实施例1中浓度分别为1μg/mL、2μg/mL、4μg/mL、6μg/mL、8μg/mL和10μg/mL的NapFFKY-dansyl溶液的荧光衰减曲线图片；
图1D为本发明实施例1中浓度分别为1μg/mL、2μg/mL、4μg/mL、6μg/mL、8μg/mL和10μg/mL的NapFFKY-dansyl溶液的拟合曲线图片；
图2为本发明实施例1中长寿命光子数的占比和短寿命光子数的占比与所述NapFFKY-dansyl的浓度的分布图；
图3A为本发明实施例1中浓度为4μg/mL的NapFFKY-dansyl溶液的透射电镜图片(比例尺＝200nm)；
图3B为本发明实施例1中浓度为6μg/mL的NapFFKY-dansyl溶液的透射电镜图片(比例尺＝200nm)；
图4A为本发明实施例2中浓度分别为1μg/mL、10μg/mL、100μg/mL、1mg/mL和6mg/mL的NapFFKYp-dansyl溶液的荧光衰减曲线图片；
图4B为本发明实施例2中浓度分别为1μg/mL、10μg/mL、100μg/mL、1mg/mL和6mg/mL的NapFFKYp-dansyl溶液的拟合曲线图片；
图4C为本发明实施例2中浓度分别为100μg/mL、200μg/mL、400μg/mL、500μg/mL、600μg/mL、800μg/mL和1mg/mL的NapFFKYp-dansyl溶液的荧光衰减曲线图片；
图4D为本发明实施例2中浓度分别为100μg/mL、200μg/mL、400μg/mL、500μg/mL、600μg/mL、800μg/mL和1mg/mL的NapFFKYp-dansyl溶液的拟合曲线图片；
图5为本发明实施例2中长寿命光子数的占比和短寿命光子数的占比与所述NapFFKYp-dansyl的浓度的分布图。
具体实施方式
为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
材料：
NapFFKYp-dansyl(式中，Nap-二萘乙酸基团，F-苯丙氨酸，K-赖氨酸，Yp-连接磷酸基团的酪氨酸，dansyl-丹磺酰基)通过如下方法进行合成：
CTC树脂溶胀后，加入2-CTC树脂(2g，2mmol)和20mL DCM，氮气吹动混合30min，DMF洗三次；加入Fmoc-Phe-OH(2.324g，6mmol)，二异丙基乙胺(DIPEA)2mL，二甲基甲酰胺(DMF)16mL，混合后加入固相合成管中，通氮气搅拌2h，用茚三酮溶液验证树脂颗粒为无色后，按照DCM:MeOH:DIPEA＝24mL:4.5mL:1.5mL的比例加入固相合成管中，通氮气30min，DMF洗涤三次；按照哌啶:DMF＝4mL:16mL的比例加入固相合成管中，通氮气30min，用茚三酮溶液验证树脂颗粒为黑色后，DMF洗涤5次；加入Fmoc-Phe-OH(2.324g，6mmol)，二异丙基乙胺(DIPEA)2mL，二甲基甲酰胺(DMF)16mL，HBTU(2.26g，6mmol)，混合后加入固相合成管中，通氮气2h，用茚三酮溶液验证树脂颗粒为无色后，按照哌啶:DMF＝4mL:16mL的比例加入固相合成管中，通氮气搅拌30min，用茚三酮溶液验证树脂颗粒为黑色后，DMF洗涤5次；加入Fmoc-Lys(Boc)-OH(2.8g，6mmol)，二异丙基乙胺(DIPEA)2mL，二甲基甲酰胺(DMF)16mL，HBTU(2.26g，6mmol)，混合后加入固相合成管中，通氮气搅拌2h，用茚三酮溶液验证树脂颗粒为无色后，按照哌啶:DMF＝4mL:16mL的比例加入固相合成管中，通氮气30min，用茚三酮溶液验证树脂颗粒为黑色后，DMF洗涤5次；加入Fmoc-Yp(2.88g，6mmol)，二异丙基乙胺(DIPEA)2mL，二甲基甲酰胺(DMF)16mL，HBTU(2.26g，6mmol)，混合后加入固相合成管中，通氮气搅拌2h，用茚三酮溶液验证树脂颗粒为无色后，按照哌啶:DMF＝4mL:16mL的比例加入固相合成管中，通氮气30min，取少量树脂用茚三酮溶液验证为黑色后，DMF洗涤5次；加入二萘乙酸(2-Nap)(1.12g，6mmol)，二异丙基乙胺(DIPEA)2mL，1-二甲基甲酰胺(DMF)16mL，HBTU(2.26g，6mmol)，混合后加入固相合成管中，通氮气搅拌2h，用茚三酮溶液验证树脂颗粒为无色后，DMF洗涤3次；取10mLTFA加入固相合成管中，通氮气搅拌2h，抽取得到滤液，再加入10mL TFA加入固相合成管中，通氮气搅拌2h，抽取得到二次滤液；将滤液滴加入乙醚中，取下层沉淀，离心，得到NapFFKYp多肽；
称取NapFFKYp(50.5mg，58.7μmol)和Na2CO3(12.4mg，11.7μmol)溶于3mL水；将DNS-Cl(15.8mg，58.7μmol)溶解在2mL THF溶液中；将两者混合，在60℃下搅拌10h，冷却至室温，用10％HCl溶液中和反应液至pH＝7.4，使用液相色谱柱分离提纯，得到NapFFKYp-dansyl目标分子。
碱性磷酸酶购自源叶生物。
本发明使用的检测仪器为购自英国爱丁堡的超快荧光寿命光谱仪FLS980，货号lifespecII010402。
实施例1
本实施例确定荧光多肽NapFFKY-dansyl(式中，Nap-二萘乙酸基团，F-苯丙氨酸，K-赖氨酸，Y-酪氨酸，dansyl-丹磺酰基)的自组装临界组装浓度，NapFFKY-dansyl的结构式如式I所示。
式I。
所述确定荧光多肽自组装临界组装浓度的方法包括：
(1)根据NapFFKY-dansyl的紫外吸收光谱和荧光发生光谱，并结合超快荧光寿命光谱仪FLS 980仪器所配备的发光源波长，确定400nm作为NapFFKY-dansyl的激发波长，517nm作为检测波长。
(2)使用PBS溶液，配置浓度分别为1μg/mL、10μg/mL、100μg/mL、1mg/mL和6mg/mL的梯度NapFFKYp-dansyl溶液，分别向不同浓度的NapFFKYp-dansyl溶液中加入终浓度为20U/mL的碱性磷酸酶，得到上述浓度梯度的NapFFKY-dansyl溶液；
通过时间分辨荧光光谱技术分别测试荧光衰减曲线，如图1A所示，对所得荧光衰减曲线进行两指数拟合，所述两指数拟合使用的公式为：
式中：
y-光子数；
x-检测时间；
e-自然常数；
t1-长寿命时间；
t2-短寿命时间；
A1-长寿命光子数；
A2-短寿命光子数；
其中，t2为4ns；
得到的拟合曲线如图1B所示；
对所得拟合曲线中的长寿命光子数和短寿命光子数进行整理，计算长寿命光子数的占比和短寿命光子数的占比；
所述长寿命光子数的占比的计算公式为：
长寿命光子数占比＝A1/(A1+A2)×100％；
所述短寿命光子数的占比的计算公式为：
短寿命光子数占比＝A2/(A1+A2)×100％；
拟合曲线参数、长寿命光子数占比及短寿命光子数占比如表1所示。
表1
由图1B可以看出，荧光寿命发生突变的浓度范围为1μg/mL～10μg/mL，对比表1中的数据也可以看出，浓度在1μg/mL～10μg/mL范围内时，长寿命光子数占比变化显著，证明在这个浓度范围内长寿命光子数的占比发生了突变。χ2数值均在1.0～1.5的范围内，证明结果准确。配置浓度分别为1μg/mL、2μg/mL、4μg/mL、6μg/mL、8μg/mL和10μg/mL的梯度NapFFKY-dansyl溶液，采用相同的方法测试荧光衰减曲线，如图1C所示，再次进行两指数拟合，得到准确的拟合曲线，如图1D所示，并计算准确的长寿命光子数的占比和短寿命光子数的占比。
准确的拟合曲线参数、长寿命光子数占比及短寿命光子数占比如表2所示。
表2
(3)构建所述长寿命光子数的占比和短寿命光子数的占比与所述待测荧光多肽的浓度的分布图，如图2所示，计算所述长寿命光子数的占比曲线的切线的交点对应的荧光多肽的浓度即所述长寿命光子数的占比发生突变时荧光多肽的浓度为4.75μg/mL，即所述的NapFFKY-dansyl的自组装临界组装浓度为4.75μg/mL。
另外，使用透射电子显微镜分别对浓度为4μg/mL和6μg/mL的NapFFKY-dansyl溶液进行观察，滴加5μL样品至400目碳涂层铜网，静置1min后，用滤纸贴在铜网边缘轻轻将余量样品溶液吸掉，使用醋酸铀染色剂浸染30s，再用去离子水轻洗2次，自然风干后在六硼化镧透射电子显微镜(T-20)下进行观察，结果如图3A和图3B所示，可以看出当溶液浓度为4μg/mL时，溶液中没有短纤维，当溶液浓度为6μg/mL时，溶液中形成了纳米纤维，进一步证明了NapFFKY-dansyl的自组装临界组装浓度计算结果的准确性，当浓度低于4.75μg/mL，溶液中的多肽分子不能发生自组装，而当浓度高于4.75μg/mL时，溶液中的多肽分子可通过自组装形成纳米纤维。
实施例2
本实施例确定荧光多肽NapFFKYp-dansyl的自组装临界组装浓度，NapFFKYp-dansyl的结构式如式II所示。
式II。
所述确定荧光多肽自组装临界组装浓度的方法包括：
(1)根据NapFFKYp-dansyl的紫外吸收光谱和荧光发生光谱，并结合超快荧光寿命光谱仪FLS 980仪器所配备的发光源波长，确定400nm作为NapFFKYp-dansyl的激发波长，517nm作为检测波长。
(2)使用PBS溶液，配置浓度分别为1μg/mL、10μg/mL、100μg/mL、1mg/mL和6mg/mL的梯度NapFFKYp-dansyl溶液，通过时间分辨荧光光谱技术分别测试荧光衰减曲线，如图4A所示，对所得荧光衰减曲线进行两指数拟合，所述两指数拟合使用的公式为：
式中：
y-光子数；
x-检测时间；
e-自然常数；
t1-长寿命时间；
t2-短寿命时间；
A1-长寿命光子数；
A2-短寿命光子数；
其中，t2为4ns；
得到的拟合曲线如图4B所示；
对所得拟合曲线中的长寿命光子数和短寿命光子数进行整理，计算长寿命光子数的占比和短寿命光子数的占比；
所述长寿命光子数的占比的计算公式为：
长寿命光子数占比＝A1/(A1+A2)×100％；
所述短寿命光子数的占比的计算公式为：
短寿命光子数占比＝A2/(A1+A2)×100％；
拟合曲线参数、长寿命光子数占比及短寿命光子数占比如表3所示。
表3
由图4B可以看出，荧光寿命发生突变的浓度范围为100μg/mL～1mg/mL，对比表3中的数据也可以看出，浓度在100μg/mL～1mg/mL范围内时，长寿命光子数占比变化显著，证明在这个浓度范围内长寿命光子数的占比发生了突变。χ2数值均在1.1～1.5的范围内，满足1.0～1.5的要求，证明结果准确。配置浓度分别为100μg/mL、200μg/mL、400μg/mL、500μg/mL、600μg/mL、800μg/mL和1mg/mL的梯度NapFFKYp-dansyl溶液，采用相同的方法测试荧光衰减曲线，如图4C所示，再次进行两指数拟合，得到准确的拟合曲线，如图4D所示，并计算准确的长寿命光子数的占比和短寿命光子数的占比。
准确的拟合曲线参数、长寿命光子数占比及短寿命光子数占比如表4所示。
表4
(3)构建所述长寿命光子数的占比和短寿命光子数的占比与所述待测荧光多肽的浓度的分布图，如图5所示，计算所述长寿命光子数的占比曲线的切线的交点对应的荧光多肽的浓度即所述长寿命光子数的占比发生突变时荧光多肽的浓度为211μg/mL，即所述的NapFFKYp-dansyl的自组装临界组装浓度为211μg/mL。
此外，对比实施例1和实施例2的结果，实施例1与实施例2中的待测荧光多肽的区别仅在于脱去了磷酸基团，但自组装临界组装浓度相差2个数量级。脱磷酸后，NapFFKY-dansyl的疏水性增强，使其更易于组装，而NapFFKYp-dansyl中的磷酸基团更加亲水，因此更不容易发生组装，这说明了多肽的自组装能力与其自身的亲疏水性质相关。
综上所述，本发明通过检测荧光多肽本身的荧光寿命来确定其自组装临界浓度，检测过程中未引入外源的荧光分子，蛋白自身的结构不受影响，检测时更接近其自然条件下的组装状态；操作简便，结果准确，成本较低，具有广阔的应用前景。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
Claims (11)
1.一种确定荧光多肽自组装临界组装浓度的方法，其特征在于，所述确定荧光多肽自组装临界组装浓度的方法包括：
(1)通过时间分辨荧光光谱技术分别测试不同浓度的待测荧光多肽的荧光衰减曲线，并对所得荧光衰减曲线进行两指数拟合，得到拟合曲线；
对所得拟合曲线中的长寿命光子数和短寿命光子数进行整理，计算长寿命光子数的占比和短寿命光子数的占比；
(2)构建所述长寿命光子数的占比和短寿命光子数的占比与所述待测荧光多肽的浓度的分布图，计算所述长寿命光子数的占比发生突变时对应的荧光多肽的浓度，即所述的荧光多肽自组装临界组装浓度；
所述长寿命光子数为发生了自组装的光子的数目；所述短寿命光子数为未发生自组装的光子的数目。
2.根据权利要求1所述的确定荧光多肽自组装临界组装浓度的方法，其特征在于，步骤(1)中所述分别测试不同浓度的待测荧光多肽的荧光衰减曲线前还包括确定待测荧光多肽的激发波长和检测波长的步骤。
3.根据权利要求2所述的确定荧光多肽自组装临界组装浓度的方法，其特征在于，所述确定待测荧光多肽的激发波长和检测波长根据所述待测荧光多肽的紫外吸收光谱和/或荧光发生光谱确定。
4.根据权利要求1所述的确定荧光多肽自组装临界组装浓度的方法，其特征在于，步骤(1)的过程包括：
配置浓度范围较宽的所述待测荧光多肽的梯度溶液，通过时间分辨荧光光谱技术分别测试荧光衰减曲线，对所得荧光衰减曲线进行两指数拟合，对所得拟合曲线中的长寿命光子数和短寿命光子数进行整理，计算长寿命光子数的占比和短寿命光子数的占比，根据所述荧光衰减曲线和长寿命光子数占比确定荧光寿命发生突变的浓度范围，再在所述发生突变的浓度范围内配置浓度梯度溶液，分别测试浓度范围较窄的所述测荧光多肽的荧光衰减曲线，再次进行两指数拟合，得到准确的拟合曲线，并计算准确的长寿命光子数的占比和短寿命光子数的占比。
5.根据权利要求4所述的确定荧光多肽自组装临界组装浓度的方法，其特征在于，步骤(1)中所述长寿命光子数的占比和短寿命光子数的占比为所述的准确的长寿命光子数的占比和短寿命光子数的占比。
6.根据权利要求1所述的确定荧光多肽自组装临界组装浓度的方法，其特征在于，所述两指数拟合使用的公式为：
式中：
y-光子数；
x-检测时间；
e-自然常数；
t1-长寿命时间；
t2-短寿命时间；
A1-长寿命光子数；
A2-短寿命光子数。
7.根据权利要求6所述的确定荧光多肽自组装临界组装浓度的方法，其特征在于，t2为3.8～4.2ns。
8.根据权利要求7所述的确定荧光多肽自组装临界组装浓度的方法，其特征在于，t2为4ns。
9.根据权利要求6或7所述的确定荧光多肽自组装临界组装浓度的方法，其特征在于，所述长寿命光子数的占比的计算公式为：
长寿命光子数占比＝A1/(A1+A2)×100％；
优选地，所述短寿命光子数的占比的计算公式为：
短寿命光子数占比＝A2/(A1+A2)×100％。
10.根据权利要求1所述的确定荧光多肽自组装临界组装浓度的方法，其特征在于，所述确定荧光多肽自组装临界组装浓度的方法包括：
(1)根据待测荧光多肽的紫外吸收光谱和/或荧光发生光谱，确定所述待测荧光多肽的激发波长和检测波长；
(2)配置浓度范围较宽的所述待测荧光多肽的梯度溶液，通过时间分辨荧光光谱技术分别测试荧光衰减曲线，对所得荧光衰减曲线进行两指数拟合，所述两指数拟合使用的公式为：
式中：
y-光子数；
x-检测时间；
e-自然常数；
t1-长寿命时间；
t2-短寿命时间；
A1-长寿命光子数；
A2-短寿命光子数；
其中，t2为3.8～4.2ns；
对所得拟合曲线中的长寿命光子数和短寿命光子数进行整理，计算长寿命光子数的占比和短寿命光子数的占比；
所述长寿命光子数的占比的计算公式为：
长寿命光子数占比＝A1/(A1+A2)×100％；
所述短寿命光子数的占比的计算公式为：
短寿命光子数占比＝A2/(A1+A2)×100％；
根据所述荧光衰减曲线和长寿命光子数占比确定荧光寿命发生突变的浓度范围，再在所述发生突变的浓度范围内配置浓度梯度溶液，分别测试浓度范围较窄的所述测荧光多肽的荧光衰减曲线，再次进行两指数拟合，得到准确的拟合曲线，并计算准确的长寿命光子数的占比和短寿命光子数的占比；
(3)构建所述长寿命光子数的占比和短寿命光子数的占比与所述待测荧光多肽的浓度的分布图，计算所述长寿命光子数的占比发生突变时对应的荧光多肽的浓度，即所述的荧光多肽自组装临界组装浓度。
11.权利要求1～10任一项所述的确定荧光多肽自组装临界组装浓度的方法在荧光多肽自组装临界组装浓度检测中的应用。
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| PB01 | Publication | ||
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