CN103983555B - 一种检测生物分子相互作用的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种检测生物分子相互作用的方法。所述方法包括：将修饰于微球表面的固定相分子与一系列不同浓度的连接荧光分子的流动相分子共同孵育；使孵育后的样品通过流式细胞仪，统计不同浓度的流动相分子条件下的不同表面荧光强度的微球的数目；根据所述统计的微球的数目，拟合出所述固定相分子与所述流动相分子相互作用的平衡结合常数和/或平衡解离常数。所述方法检测时间短，不受反应分子的溶解度的限制，对于反应分子的分子量要求不高，可以定量检测分子量较小的短肽相互作用。

Description

一种检测生物分子相互作用的方法

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，涉及生物分子相互作用的检测，尤其涉及检测蛋白、短肽等生物分子相互作用的方法。

背景技术

生物分子的相互作用在正常生命活动、疾病的发生过程中都起着非常重要的作用。因此，检测生物分子的相互作用在很多基础研究中是尤为必要的步骤。目前常用的检测方法有表面等离激元共振技术(SPR)、等温滴定量热(ITC)和石英晶体微天平(QCM)。

SPR是一种新兴的生物化学检测技术，于1982年首次使用于气体检测和生物传感器中。30年来，SPR技术在实现方式，应用领域扩展方面有了飞速的发展。如今的SPR具有以下优点：免标记，实时监测，无损伤检测(参考LiedbergB.等人，SensorsandActuators1983,4,29.；RichR.L.等人，AnalyticalBiochemistry2007,361(1),1-6.)。ITC也是一种研究生物热力学与生物动力学的重要方法，它通过高灵敏度、高自动化的微量热仪连续、准确地监测和记录一个变化过程的量热曲线，原位、在线和无损伤地同时提供热力学和动力学信息，方法灵敏，精度高，可以获得生物分子相互作用的完整热力学参数，包括结合常数和摩尔结合熵等(参考PierceM.M.等人，Methods1999,19(2)213-221.)。QCM是通过测量吸附在石英晶片表面的分子质量来研究分子间相互作用，可以提供相互作用过程中的动力学信息(参考OkadaT.等人，BiosensorsandBioelectronics2007，22，1480–1486.)。这些技术虽然能够获得相应的信号，但是应用过程中局限性仍很大，而且获得结果与引起信息变化的因素间的关系十分复杂。尤其是SPR和ITC，前者对芯片基底要求高，由于灵敏度的限制，使得该检测方法对样品分子量有要求(大于1KD)，此外芯片对有机溶剂的耐受力有限，因此对样品的溶解度也有限制；后者在具体应用过程中对溶剂成分要求一致，对于疏水性较强的生物分子成功率不高。

针对上述问题，本发明引入一种新的检测生物分子相互作用的方法，建立在Langmuir吸附模型的基础上，将微球与流式细胞技术(FCM)相结合，克服溶解度、分子量的限制，最终可以定量地得到蛋白、多肽、核酸等生物分子间相互作用的平衡解离常数。

发明内容

本发明的目的在于提供一种检测生物分子相互作用的方法，所述方法检测时间短，不受反应分子的溶解度的限制，对于反应分子的分子量要求不高，可以定量检测分子量较小的短肽相互作用。

一种检测生物分子相互作用的方法，包括：

将修饰于微球表面的固定相分子与一系列不同浓度的连接荧光分子的流动相分子共同孵育；

使孵育后的样品通过流式细胞仪，统计不同浓度的流动相分子条件下的不同表面荧光强度的微球的数目；

根据所述统计的微球的数目，拟合出所述固定相分子与所述流动相分子相互作用的平衡结合常数和/或平衡解离常数。

作为本发明的优选方案，所述固定相分子选自多肽、蛋白质、DNA、RNA或寡核苷酸。

优选地，所述流动相分子选自多肽、蛋白质、DNA、RNA或寡核苷酸。

优选地，所述固定相分子选自多肽和/或蛋白质，所述流动相分子选自多肽和/或蛋白质。

本发明检测生物分子相互作用的方法可用于检测例如多肽与蛋白质的相互作用、蛋白质与蛋白质的相互作用、多肽与多肽的相互作用、蛋白质与DNA的相互作用、蛋白质与RNA的相互作用、蛋白质与寡核苷酸的相互作用、DNA与DNA的相互作用、DNA与RNA的相互作用、RNA与RNA的相互作用，等等。

作为本发明的优选方案，所述微球的材料选自聚合物、硅、二氧化硅、金属、金属氧化物、玻璃和石英中的任意一种或至少两种组成的复合材料。基本上目前生物学上常用的微球均可用于本发明。

作为本发明的优选方案，所述荧光分子选自异硫氰酸荧光素、3H-吲哚菁类染料、藻红蛋白、多甲藻叶绿蛋白或别藻青蛋白，优选异硫氰酸荧光素。这些荧光分子都是生物学上常用的荧光标记分子，可以使用任一种或至少两种。

作为本发明的优选方案，所述修饰于微球表面的固定相分子是通过生物素-链霉亲和素之间的强相互作用、共价连接、自组装或静电吸附方式将所述固定相分子固定于所述微球表面的。

优选地，所述修饰于微球表面的固定相分子是通过生物素-链霉亲和素之间的强相互作用将所述固定相分子固定于所述微球表面的。

将分子修饰到微球表面的方法是本领域技术人员所熟知的，只要能够保证生物分子的活性不受影响，任何修饰方法均可用于本发明，如各种偶联技术。已知通过生物素-链霉亲和素之间的强相互作用、共价连接、自组装或静电吸附方式将生物分子固定到微球上能够很好地保持生物分子的活性。

作为本发明的优选方案，所述微球为链霉亲和素包被的微球，所述固定相分子为生物素标记的生物分子。

优选地，所述微球为表面修饰链霉亲和素的聚苯乙烯微球。

生物素与链霉亲和素之间的相互作用是自然界中很强的分子间相互作用，通过此方式可以确保生物分子固定到微球表面的稳定性。

作为本发明的优选方案，所述微球为表面修饰链霉亲和素的聚苯乙烯微球；所述固定相分子为生物素标记的多肽和/或蛋白质；所述流动相分子为连接异硫氰酸荧光素的多肽和/或蛋白质。

作为本发明的优选方案，所述孵育的温度条件为35～40℃，优选为37℃。

作为本发明的优选方案，所述生物分子相互作用具体是生物分子或小分子与靶蛋白之间的相互作用。

作为本发明的优选方案，所述拟合采用吸附公式：进行；其中，θ为表面覆盖率，C_a为流动相分子的浓度，K_A为固定相分子和流动相分子相互作用的平衡结合常数，n为流动相分子与固定相分子相互作用的化学计量数之比。

本发明的有益效果为：本发明检测生物分子相互作用的方法适用于蛋白质、多肽、DNA和RNA等生物分子，通过检测可以得到两个生物分子的相互作用的平衡结合常数和/或平衡解离常数。相对于其它现有技术，本发明的方法检测时间短，不受反应分子的溶解度的限制，对于反应分子的分子量要求不高，可以定量检测分子量较小的短肽相互作用。

附图说明

图1是本发明检测生物分子相互作用的方法的流程和原理示意图。

图2是实施例1中F8-F8相互作用曲线，编号1、2和3分别代表三次测量的数据，其中黑色粗线为拟合曲线。

图3是实施例2中蛋白A-IgG(ProteinA-IgG)相互作用曲线，编号1、2和3分别代表三次测量的数据，其中黑色粗线为拟合曲线。

图4是实施例3中E-coil-K-coil相互作用曲线，编号1、2和3分别代表三次测量的数据，其中黑色粗线为拟合曲线。

图5是实施例4中链霉亲和素-生物素(SA-Biotin)相互作用曲线，编号1、2和3分别代表三次测量的数据，其中黑色粗线为拟合曲线。

具体实施方式

为使本发明的目的、方案和效果更加清楚明了，下面对本发明进行详细描述。

为有助于理解本发明，下面定义了一些术语。本文定义的术语具有本发明相关领域的普通技术人员通常所理解的含义。

除非另外说明，本文中浓度单位“μM”是指“μmol/L”，“mM”是指“mmol/L”，“M是指“mol/L”。

除非另外说明，本文中“固定相Mol_S”是指修饰于微球表面的固定相分子，“流动相Mol_L”是指连接荧光分子的流动相分子。

除非另外说明，本文中“K_D”是两种生物分子相互作用的平衡解离常数，“K_A”是两种生物分子相互作用的平衡结合常数。

除非另外说明，本文中的“FCM”是指流式细胞技术。

本发明的目的是针对目前生物分子相互作用的测量技术分辨性、溶解度和分子量等方面的约束，大大限制了对测量的广泛性，提供一种检测生物分子相互作用的方法。

本发明提供的检测生物分子相互作用的方法，建立在Langmuir吸附原理的基础上，通过微球与流式细胞术相结合，可以定量地测量蛋白、多肽等相互作用的平衡解离常数和平衡结合常数。

本发明提供的检测生物分子相互作用的方法，可包括微球修饰，相互作用，仪器检测和数据拟合方法。图1示出了本发明检测生物分子相互作用的方法的一种流程和原理示意图。

其中，所述微球修饰将固定相Mol_S偶联于微球表面，以及结合于生物分子修饰层的流动相Mol_L。

本发明的实施例中，所述固定相Mol_S是修饰了生物素(Biotin)的生物分子中的任意一种，流动相Mol_L是连接荧光分子的生物分子中的任意一种，所述荧光分子可以是异硫氰酸荧光素(FITC)、3H-吲哚菁类染料(Cy3和Cy5)、藻红蛋白(PE)、多甲藻叶绿蛋白(PerCP)或别藻青蛋白(APC)等。优选地，所述流动相Mol_L是连接荧光分子FITC的生物分子中的任意一种。

本发明的实施例中，通过生物素-链霉亲和素(SA)之间的强相互作用，将固定相Mol_S偶联在微球表面，所述微球为表面修饰SA的聚苯乙烯微球。也可以采用酰胺键等共价连接、自组装和静电吸附等偶联方式，将固定相Mol_S偶联在微球表面。

本发明的实施例中，所述相互作用指偶联固定相Mol_S的微球与一系列不同浓度的流动相Mol_L进行孵育。孵育条件为置于37℃摇床中过夜，摇动速度150r/min。

本发明的实施例中，所述仪器检测的方式为，将上述微球样品通过流式细胞仪，检测流动相Mol_L一系列不同浓度条件下，不同表面荧光强度的微球的数目统计。

本发明的实施例中，所述拟合的方法采用拟合公式Langmuir吸附公式：

$\mathrm{\θ}=\frac{{\mathrm{nK}}_A{C}_a}{1+K_A{C}_a}$

其中，θ为表面覆盖率，C_a为流动相分子的浓度，K_A为固定相分子和流动相分子相互作用的平衡结合常数，n为流动相分子与固定相分子相互作用的化学计量数之比。平衡解离常数K_D＝1/K_A。

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。本领域技术人员将会理解，以下实施例仅为本发明的优选实施例，以便于更好地理解本发明，因而不应视为限定本发明的范围。

本领域的技术人员应理解，本发明的实施例虽然没有穷举多肽、蛋白质、DNA、RNA或寡核苷酸等生物分子间的相互作用，但是基于本发明的精神本领域的技术人员可以推论本发明的方法可用于上述任意生物分子间的相互作用的检测。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所用的实验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂厂商购买得到的；使用的试剂均为分析级试剂。

实施例1：测量两条短肽之间的相互作用

本实例代表测量一类分子质量小于1KD，且溶解性较差的短肽之间的相互作用。

1、所用物质的化学结构

多肽：SQ-1氨基酸序列为Biotin-FFFFFFFF(SEQIDNO：1)，SQ-2氨基酸序列为FITC-FFFFFFFF(SEQIDNO：2)，由上海科肽生物技术有限公司合成纯度为98％。

2、测定方法

配制1×PBS溶液：称取0.4gNaCl，0.01gKCl，182mgNa₂HPO₄·12H₂O，12mgKH₂PO₄，0.01gNaN₃，使用50mL二次水溶解，用0.22μm水相滤膜过滤，待用。

多肽处理方法：取1mg的SQ-1，用50μLDMSO溶解，超声5分钟使溶解完全，再向其中加入950μLPBS溶液。取1mg的SQ-2，用50μLDMSO溶解，超声5分钟使溶解完全，再向其中加入653μLPBS溶液，此时SQ-2溶液的浓度为1mM。

取SQ-2溶液50μL，并加入450μLPBS溶液，得到浓度为100μM的SQ-2溶液。接下来，取浓度为100μM的SQ-2溶液50μL，并加入450μLPBS溶液，得到浓度为10μM的SQ-2溶液。同样地，最终得到一系列浓度分别为0.001μM，0.01μM，0.1μM，1μM，10μM，100μM的SQ-2溶液。

微球处理方法：根据微球的使用说明，将购买的微球悬浮液涡旋处理30s，此时悬液中微球分散已经均匀。微球购自BangsLaboratories,Inc.公司，直径约为4.95μm，结合能力为0.076μgbiotin-FITC/mg微球。

清洗：取2μL微球悬液，PBS溶液中清洗两遍，所使用离心机设置转速10000rpm，时间为3min。

孵育：将上述清洗后的微球稀释至500μL，加入上述SQ-1溶液50μL后，将样品放置于37℃摇床中，孵育3h。

分装：取出上微球样品按照上述清洗的方法清洗两遍后稀释至600μL，然后分装于12支离心管中，依次编号为0-11，每个离心管中加入量为50μL。

相互作用反应：按照下表1分别向上述12支离心管中加样。

表1

然后将上述样品摇匀后放置于37℃摇床中，孵育过夜。

FCM：在流式细胞仪(acousticfocusingcytometer,AppliedBiosystems,LifeTechnologies,Carlsbad,CA)中，设置发射波长488nm，检测波长530nm，吸样量为200μL。将0号样品放置于仪器样品架并开始检测，根据微球大小，在前向角信号(FSC)，侧向角信号(SSC)的散点图中设门，并在记录检测结果前通过调整电压值设置阈值，使得荧光强度的数量统计图中，门中的微球荧光强度低于阈值荧光强度5％以下，设置完成后，计数10,000个。

在上述门设置以及计数条件下，依次检测1-11号样品，记录下相应的检测值，即高于阈值荧光强度的数量百分比。

3、拟合数据

根据所得的一系列浓度下的荧光强度的数量统计图，利用Origin8软件进行Langmuir吸附公式的拟合，其中记录的高于阈值荧光强度对应的微球数量占总数量的百分比对应于公式中的表面覆盖率θ，根据公式拟合，可以得到对应的K_D值。拟合曲线如图2所示。结果表明：根据三次测量得到的数据，拟合得到平衡解离常数K_D分别为1.81E-9，1.48E-9，9.66E-10，平均K_D＝1.42E-9。

实施例2：测量ProteinA-IgG之间的相互作用

本实例代表测量一类蛋白质-蛋白质的相互作用。

1、所用物质的化学结构

蛋白A-生物素(ProteinA-Biotin，武汉博士德生物工程有限公司，产品规格0.5mL，浓度1mg/mL，1:20的生物素标记)，IgG-FITC(武汉博士德生物工程有限公司，产品规格0.1mL，浓度2mg/mL，1:4-6的FITC标记)。

2、测定方法

配制1×PBS溶液：称取0.4gNaCl，0.01gKCl，182mgNa₂HPO₄·12H₂O，12mgKH₂PO₄，0.01gNaN₃，使用50mL二次水溶解，用0.22μm水相滤膜过滤，待用。

处理方法：购买的IgG-FITC规格为0.1mL，浓度是2mg/mL，即13.3μM。加入33μLPBS溶液至133μL，此时IgG-FITC溶液的浓度为10μM。取上述IgG-FITC溶液50μL，并加入450μLPBS溶液，得到浓度为1μM的IgG-FITC溶液。接下来，取浓度为1μM的IgG-FITC溶液50μL，并加入450μLPBS溶液，得到浓度为0.1μM的IgG-FITC溶液。同样地，最终得到一系列浓度分别为0.01μM，0.1μM，1μM的IgG-FITC溶液。

微球处理方法：根据微球的使用说明，将购买的微球悬浮液涡旋处理30s，此时悬液中微球分散已经均匀。微球购自BangsLaboratories,Inc.公司，直径约为4.95μm，结合能力为0.076μgbiotin-FITC/mg微球。

清洗：取出0.875μL微球悬液，PBS溶液中清洗两遍，所使用离心机设置转速10000rpm，时间为3min。

孵育：将上述清洗后的微球稀释至500μL，加入上述ProteinA-Biotin溶液50μL后，将样品放置于37℃摇床中，孵育3h。

分装：取出上微球样品按照上述清洗的方法清洗两遍后稀释至350μL，然后分装于7支离心管中，依次编号为0-6，每个离心管中加入量为50μL。

相互作用反应：按照下表2分别向上述7支离心管中加样。

表2

然后将上述样品摇匀后放置于37℃摇床中，孵育过夜。

FCM：在流式细胞仪(acousticfocusingcytometer,AppliedBiosystems,LifeTechnologies,Carlsbad,CA)中，设置发射波长488nm，检测波长530nm，吸样量为200μL。将0号样品放置于仪器样品架并开始检测，根据微球大小，在前向角信号(FSC)，侧向角信号(SSC)的散点图中设门，并在记录检测结果前通过调整电压值设置阈值，使得荧光强度的数量统计峰图中，门中的微球低于阈值荧光强度以下的数量低于5％，设置完成后，计数10,000个。

在上述门设置以及计数条件下，依次检测1-6号样品，记录下相应的检测值，即高于阈值荧光强度的数量百分比。

3、拟合数据

根据所得的一系列浓度下的荧光强度的数量统计图，利用Origin8软件进行Langmuir吸附公式的拟合，其中记录的高于阈值荧光强度对应的微球数量占总数量的百分比对应于公式中的表面覆盖率θ，根据公式拟合，可以得到对应的K_D值。拟合曲线如图3所示。结果表明：根据三次测量得到的数据，拟合得到平衡解离常数K_D分别为2.17E-9，1.66E-9，1.72E-9，平均K_D＝1.85E-9。文献中报道的K_D＝10^-7～10^-8(参考B.等人，TheJournalofBiologicalChemistry1986,261(22),10240-10247.；LundL.N.等人，JournalofMolecularRecognition2011,24,945-952.)。

实施例3：测量Ecoil-Kcoil之间的相互作用

本实例代表测量一类K_D在10^-12量级的较强的多肽相互作用。

1、所用物质的化学结构

多肽：SQ-3：E-coil氨基酸序列为Biotin-(EVSALEK)₅(SEQIDNO：3，下标5表示个重复序列)，SQ-4：K-coil氨基酸序列为FITC-(KVSALKE)₅(SEQIDNO：4，下标5表示个重复序列)，由上海科肽生物技术有限公司合成纯度为98％。

2、测定方法

配制1×PBS溶液：称取0.4gNaCl，0.01gKCl，182mgNa₂HPO₄·12H₂O，12mgKH₂PO₄，0.01gNaN₃，使用50mL二次水溶解，用0.22μm水相滤膜过滤，待用。

多肽处理方法：取1mg的SQ-4，用50μLDMSO溶解，超声5分钟使溶解完全，再向其中加入189μLPBS，此时SQ-4溶液的浓度为1mM。

取上述SQ-4溶液50μL，并加入450μLPBS溶液，得到浓度为100μM的SQ-4溶液。接下来，取浓度为100μM的SQ-4溶液50μL，并加入450μLPBS溶液，得到浓度为10μM的SQ-4溶液。同样地，最终得到一系列浓度分别为10E-6μM，10E-5μM，10E-4μM，10E-3μM的SQ-4溶液。

微球处理方法：根据微球的使用说明，将购买的微球悬浮液涡旋处理30s，此时悬液中微球分散已经均匀。微球购自BangsLaboratories,Inc.公司，直径约为4.95μm，结合能力为0.076μgbiotin-FITC/mg微球。

清洗：取1.125μL微球悬液，PBS溶液中清洗两遍，所使用离心机设置转速10000rpm，时间为3min。

孵育：将上述清洗后的微球稀释至500μL，加入上述SQ-3溶液50μL后，将样品放置于37℃摇床中，孵育3h。

分装：取出上微球样品按照上述清洗的方法清洗两遍后稀释至450μL，然后分装于9支离心管中，依次编号为0-8，每个离心管中加入量为50μL。

相互作用反应：按照下表3分别向上述9支离心管中加样。

表3

然后将上述样品摇匀后放置于37℃摇床中，孵育过夜。

FCM：在流式细胞仪(acousticfocusingcytometer,AppliedBiosystems,LifeTechnologies,Carlsbad,CA)中，设置发射波长488nm，检测波长530nm，吸样量为200μL。将0号样品放置于仪器样品架并开始检测，根据微球大小，在前向角信号(FSC)，侧向角信号(SSC)的散点图中设门，并在记录检测结果前通过调整电压值设置阈值，使得荧光强度的数量统计峰图中，门中的微球低于阈值荧光强度以下的数量低于5％，设置完成后，计数10,000个。

在上述门设置以及计数条件下，依次检测1-8号样品，记录下相应的检测值，即高于阈值荧光强度的数量百分比。

3、拟合数据

根据所得的一系列浓度下的荧光强度的数量统计图，利用Origin8软件进行Langmuir吸附公式的拟合，其中记录的高于阈值荧光强度对应的微球数量占总数量的百分比对应于公式中的表面覆盖率θ，根据公式拟合，可以得到对应的K_D值。拟合曲线如图4所示。结果表明：根据三次测量得到的数据，拟合得到平衡解离常数K_D分别为3.95E-13，1.45E-12，6.82E-13，平均K_D＝8.42E-13。文献中报道的K_D＝10^-11～10^-12(参考CrescenzoG.D.等人，Biochemistry2003,42,1754-1763.)。

实施例4：测量SA-Biotin之间的相互作用

本实例代表测量一类K_D在10^-15量级，自然界中非常强的生物分子相互作用。

1、所用物质的化学结构

多肽：SQ-5氨基酸序列为Biotin-KKKKKKKK-FITC(SEQIDNO：5)，由上海科肽生物技术有限公司合成纯度为98％。

2、测定方法

配制1×PBS溶液：称取0.4gNaCl，0.01gKCl，182mgNa₂HPO₄·12H₂O，12mgKH₂PO₄，0.01gNaN₃，使用50mL二次水溶解，用0.22μm水相滤膜过滤，待用。

多肽处理方法：取1mg的SQ-5，使用50μLDMSO溶解，超声5分钟使溶解完全，再向其中加入590μLPBS溶液，此时SQ-5溶液的浓度为1mM。

取出上述SQ-5溶液50μL，并加入450μLPBS溶液，得到浓度为100μM的SQ-5溶液。接下来，取出浓度为100μM的SQ-5溶液50μL，并加入450μLPBS溶液，得到浓度为10μM的SQ-5溶液。同样地，最终得到一系列浓度分别为0.1μM，1μM，10μM，100μM的SQ-5溶液。

微球处理方法：根据微球的使用说明，将购买的微球悬浮液涡旋处理20s，此时悬液中微球分散已经均匀。微球购自BangsLaboratories,Inc.公司，直径约为4.95μm，结合能力为0.076μgbiotin-FITC/mg微球。

清洗：取出1.125μL微球悬液，PBS溶液中清洗两遍，所使用离心机设置转速10000rpm，时间为3min。

孵育：将上述清洗后的微球稀释至500μL，加入上述SQ-5溶液50μL后，将样品放置于37℃摇床中，孵育3h。

分装：取出上微球样品按照上述清洗的方法清洗两遍后稀释至450μL，然后分装于9支离心管中，依次编号为0-8，每个离心管中加入量为50μL。

相互作用反应：按照下表4分别向上述9支离心管中加样。

表4

然后将上述样品摇匀后放入放置于37℃摇床中，孵育过夜。

FCM：在流式细胞仪(acousticfocusingcytometer,AppliedBiosystems,LifeTechnologies,Carlsbad,CA)中，设置发射波长488nm，检测波长530nm，吸样量为200μL。将0号样品放置于仪器样品架并开始检测，根据微球大小，在前向角信号(FSC)，侧向角信号(SSC)的散点图中设门，并在记录检测结果前通过调整电压值设置阈值，使得荧光强度的数量统计峰图中，门中的微球低于阈值荧光强度以下的数量低于5％，设置完成后，计数10,000个。

在上述门设置以及计数条件下，依次检测1-8号样品，记录下相应的检测值，即高于阈值荧光强度的数量百分比。

3、拟合数据

根据所得的一系列浓度下的荧光强度的数量统计图，利用Origin8软件进行Langmuir吸附公式的拟合，其中记录的高于阈值荧光强度对应的微球数量占总数量的百分比对应于公式中的表面覆盖率θ，根据公式拟合，可以得到对应的K_D值。拟合曲线如图5所示。结果表明：根据三次测量得到的数据，拟合得到平衡解离常数K_D分别为6.32E-16，6.34E-17，9.33E-17，平均K_D＝2.62E-16。文献中报道的K_D＝～10^-15(参考GreenN.M.等人，AdvancesinProteinChemistry1975，29，85-133.)。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细特征以及详细方法，但本发明并不局限于上述详细特征以及详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细特征以及详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明选用组分的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (16)

1.一种检测生物分子相互作用的方法，包括：

将修饰于微球表面的固定相分子与一系列不同浓度的连接荧光分子的流动相分子共同孵育；

使孵育后的样品通过流式细胞仪，统计不同浓度的流动相分子条件下的不同表面荧光强度的微球的数目；

根据所述统计的微球的数目，采用Langmuir吸附公式拟合出所述固定相分子与所述流动相分子相互作用的平衡结合常数和/或平衡解离常数。

2.根据权利要求1所述的检测生物分子相互作用的方法，其特征在于，所述固定相分子选自多肽、蛋白质、DNA、RNA或寡核苷酸。

3.根据权利要求1所述的检测生物分子相互作用的方法，其特征在于，所述流动相分子选自多肽、蛋白质、DNA、RNA或寡核苷酸。

4.根据权利要求1所述的检测生物分子相互作用的方法，其特征在于，所述固定相分子选自多肽和/或蛋白质，所述流动相分子选自多肽和/或蛋白质。

5.根据权利要求1所述的检测生物分子相互作用的方法，其特征在于，所述微球的材料选自聚合物、硅、二氧化硅、金属、金属氧化物、玻璃和石英中的任意一种或至少两种组成的复合材料。

6.根据权利要求1所述的检测生物分子相互作用的方法，其特征在于，所述荧光分子选自异硫氰酸荧光素、3H-吲哚菁类染料、藻红蛋白、多甲藻叶绿蛋白或别藻青蛋白。

7.根据权利要求1所述的检测生物分子相互作用的方法，其特征在于，所述荧光分子为异硫氰酸荧光素。

8.根据权利要求1所述的检测生物分子相互作用的方法，其特征在于，所述修饰于微球表面的固定相分子是通过生物素-链霉亲和素之间的强相互作用、共价连接、自组装或静电吸附方式将所述固定相分子固定于所述微球表面的。

9.根据权利要求1所述的检测生物分子相互作用的方法，其特征在于，所述修饰于微球表面的固定相分子是通过生物素-链霉亲和素之间的强相互作用将所述固定相分子固定于所述微球表面的。

10.根据权利要求1所述的检测生物分子相互作用的方法，其特征在于，所述微球为链霉亲和素包被的微球，所述固定相分子为生物素标记的生物分子。

11.根据权利要求1所述的检测生物分子相互作用的方法，其特征在于，所述微球为表面修饰链霉亲和素的聚苯乙烯微球。

12.根据权利要求1所述的检测生物分子相互作用的方法，其特征在于，所述微球为表面修饰链霉亲和素的聚苯乙烯微球；所述固定相分子为生物素标记的多肽和/或蛋白质；所述流动相分子为连接异硫氰酸荧光素的多肽和/或蛋白质。

13.根据权利要求1所述的检测生物分子相互作用的方法，其特征在于，所述孵育的温度条件为35～40℃。

14.根据权利要求1所述的检测生物分子相互作用的方法，其特征在于，所述孵育的温度条件为37℃。

15.根据权利要求1项所述的检测生物分子相互作用的方法，其特征在于，所述生物分子相互作用具体是生物分子或小分子与靶蛋白之间的相互作用。

16.根据权利要求1所述的检测生物分子相互作用的方法，其特征在于，所述拟合采用吸附公式：进行；其中，θ为表面覆盖率，C_a为流动相分子的浓度，K_A为固定相分子和流动相分子相互作用的平衡结合常数，n为流动相分子与固定相分子相互作用的化学计量数之比。