CN110208230B - 用于活性氧检测的荧光共振差动比率探针的合成方法及检测装置和检测方法 - Google Patents

用于活性氧检测的荧光共振差动比率探针的合成方法及检测装置和检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及活体无损检测测量技术领域，公开了一种用于活性氧检测的荧光共振差动比率探针的合成方法及检测装置和检测方法，检测装置中，计算机与数据采集卡电连接，数据采集卡通过控制盒与近红外光激光器电连接，近红外激光器通过光纤与扩束镜光信号连接，光纤上设有准直器，数据采集卡通过CCD成像仪与采集镜头光信号连接，且CCD成像仪位于采集镜头的成像交点处，CCD成像仪通过滤光系统与采集镜头光信号连接，数据采集卡通过伺服跟踪系统与三维电动平台电连接，样品台固定在三维电动平台上，且样品台位于扩束镜和所述采集镜头的正下方。本发明为高精度、实时活性氧活体检测提供了一种可行性方案。

Description

用于活性氧检测的荧光共振差动比率探针的合成方法及检测 装置和检测方法
技术领域
本发明涉及活体无损检测测量技术领域，特别涉及一种用于活性氧检测的荧光共振差动比率探针的合成方法及检测装置和检测方法。
背景技术
活性氧的检测是生物研究和医学应用中的一个重要内容，当前主要是通过基于直接或间接监测活性氧产率、产量而获得细胞应激反应和治疗剂量等信息。由于生物体环境成分复杂且动态变化，同时大多数活性氧种类反应活性强、寿命短，许多方法受到限制，活性氧的荧光光学检测方法因为灵敏度高、适用范围广而被大量研究和应用。
目前活性氧的活体检测时荧光检测精度仍然受到多方面的影响，主要包括：活性氧传感分子的快速消耗和代谢影响了检测的精度；光传输过程中激发和发射光的生物组织光穿透能力差限制了检测的信噪比、灵敏度；光学检测活性氧时，激发光的不稳性和传输路径上的光干扰严重影响了检测的准确度。这些因素导致不能满足活体活性氧检测的要求，活性氧检测还是以定性为主。
发明内容
发明目的：针对现有技术中存在的问题，本发明提供一种用于活性氧检测的荧光共振差动比率探针的合成方法及检测装置和检测方法，为高精度、高效检测活性氧提供了一种可行性方案，并提出了荧光共振差分比率检测活性氧的新思路。
技术方案：本发明提供了一种用于活性氧的荧光共振差动比率检测装置，计算机与数据采集卡电连接，所述数据采集卡通过控制盒与近红外光激光器电连接， 所述近红外激光器通过光纤与扩束镜光信号连接，所述光纤上设有准直器，所述数据采集卡通过CCD成像仪与采集镜头光信号连接，且所述CCD成像仪位于所述采集镜头的成像交点处，所述CCD成像仪通过滤光系统与所述采集镜头光信号连接，所述数据采集卡通过伺服跟踪系统与三维电动平台电连接，样品台固定在所述三维电动平台上，且所述样品台位于所述扩束镜和所述采集镜头的正下方。
优选地，所述计算机为带有采集控制软件和图像分析重建软件以及电机控制软件的计算机。
优选地，所述的采集控制软件和图像分析重建软件均为MATLAB软件；所述的电机控制软件为LabView软件。
优选地，所述三维电动平台包括前后移动平台、左右移动平台和上下移动平台，所述前后移动平台、左右移动平台和上下移动平台由各自的步进电机分别驱动。三维电动平台由装有电机控制软件的计算机控制实现伺服跟踪；每采集完一次荧光信号，图像分析重建软件分析图像得出样品位置变动信息，并控制三维电动平台进行位置校正，图像分析重建软件利用差分比值计算出活性氧数据后，将结果和设定的阈值相比较，比较结果转变为控制激光强度和照射时间的信号，输出至激光控制盒控制激光。
优选地，所述前后移动平台、左右移动平台和上下移动平台由各自的步进电机驱动移动的最小步距均为10 μm。
优选地，所述伺服跟踪系统的最大跟踪工作范围为5 cm。
优选地，所述近红外光激光器发出的激光为连续激光，功率在0~20 W的范围内，波长在700nm~1000 nm的范围内。
优选地，所述滤光系统为540 nm、600 nm和800 nm带通的电控滤光转换系统。
优选地，所述扩束镜的透光波长在650～1050 nm的范围内。
本发明还提供了一种用于活性氧的荧光共振差动比率检测装置的检测方法，包括以下步骤：S1：将用于活性氧的荧光共振差动比率检测的近红外纳米荧光探针置入待测样品（优选加入的近红外纳米荧光探针的浓度为1 mg/ml）中，并将所述待测样品置于所述样品台上；S2：所述计算机通过所述控制盒控制所述近红外光激光器发出近红外激光，并通过所述准直器和所述扩束镜调整激光光斑面积，使激光光斑覆盖整个所述待测样品的检测区域，调整所述采集镜头的位置，使所述检测区域在所述CCD成像仪上成像最清晰且处于中间位置；当所述待测样品中有活性氧产生时，所述近红外纳米荧光探针发出荧光信号；S3：所述计算机通过控制所述近红外激光发射器控制近红外激光的激发强度，以使所述纳米荧光探针产生差动变化的荧光信号；S4：所述采集镜头接收所述荧光信号，然后经所述滤光系统滤除干扰光之后，所述数据采集卡通过所述CCD成像仪采集所述荧光信号，并将所述荧光信号传输并储存到所述计算机中；S5：所述计算机对所述荧光信号进行计算分析，获得所述待测样品的活性氧浓度和产量信息以及所述待测样品的移动信息；S6：所述计算机将所述活性氧浓度和产量信息与预设的阈值比较，并将比较结果输出到所述控制盒，通过所述控制盒实时控制所述近红外激光发射器的激光输出功率；并将所述移动信息输出到所述伺服跟踪系统，通过所述伺服跟踪系统实时控制所述三维电动平台跟踪所述待测样品的位置。
优选地，在所述S5中，所述活性氧浓度和产量信息通过以下公式计算得到：
Figure DEST_PATH_IMAGE002
；
其中，C为荧光分子浓度，k为吸收系数，μ为荧光激发量子效率，ΔI′ L10 、ΔI′ L20 、ΔI′ L2 、ΔF′ L 为检测的初始的540 nm发光，初始的800 nm发光，测量过程中800 nm发光和测量过程中600 nm荧光的发光差值。
优选地，在所述S6中，计算机利用图像分析重建软件对荧光信号进行计算分析，定量出活性氧产量和产量信息，并同时进行图像重建，获得图形化的活性氧浓度和产量信息；同时，通过图像特征分析获得待测样品的移动信息。
本发明还提供了一种用于活性氧的荧光共振差动比率检测的近红外纳米荧光探针的合成方法，包括以下步骤：S1-1：制备油酸包裹、核壳结构、980 nm近红外激发的上转换纳米粒子；将双羧基聚乙二醇PEG和不饱和磷脂分子用EDC（1-Ethyl-3-(3’-dimethylaminopropyl)carbodiimide）和NHS（N-Hydroxysuccinimide）活化后，共价连接形成羧基化的磷脂聚乙二醇分子（DSPE-PEG-COOH），层析提纯待用；S1-3：将所述DSPE-PEG-COOH分子和所述上转换纳米粒子共孵育并超声，实现充分包裹后以3500 g的离心加速度离心，去上清，重悬备用；S1-4：将所述活性氧检测分子RedoxSensor Red CC-1 stain和包裹好的所述上转换纳米粒子共孵育并超声，振荡过夜后离心去上清，重悬后得所述近红外纳米荧光探针。
优选地，在上述S1-1中，优选使用热沉淀法合成纳米粒子，包括以下步骤：将定量的稀土醋酸盐充分溶解后，置于烧瓶内除水除氧，在氩气保护下温控加热，最后通过多掺杂、多次结晶技术形成油酸包裹、核壳结构的980 nm近红外激发的上转换纳米粒子。调整合成过程中的掺杂比例，使合成的纳米粒子（NaYF4:Yb, Er, Tm @CaF2）特征为：50nm，980nm光激发，540和800 nm多波长发射。
优选地，在所述S1-3中，上转换纳米粒子修饰新生血管靶向分子c（RGDyK）环肽，但不限于该靶向分子，使近红外纳米荧光探针具有生物靶向性的靶向分子都可以，比如叶酸、HER-2抗体、生物素、HA多糖配体等。
优选地，在所述S1-4中，上转换纳米粒子用物理吸附负载活性氧检测分子但不限于物理吸附，也包括共价修饰、分子包裹和多孔结构负载等方式。
本发明的理论基础可由如下过程表示：
设上转换一部分光能I L1 经能量共振转移（FRET）传输给活性氧检测分子产生荧光F L 。由于实际检测中存在光子的传输损耗（吸收和散射等），因此F L 要小于实际发射强度，检测值设为F′ L ，而I L1 的实际检测值设为I′ L1 。因为所选荧光分子激发和荧光波长相近，近似认为其生物环境下的光传输参数相同，根据荧光激发理论并考虑光传输损耗关系可得，
Figure DEST_PATH_IMAGE004
（1）
其中，k为吸收系数，μ为荧光激发量子效率，C为荧光分子浓度，
Figure DEST_PATH_IMAGE006
为相应波长的环境传输损耗系数，F 0 为初始背景荧光。
上式表明荧光分子浓度受多个因素的影响，无法用简单的比率消除这些干扰。因此，两边微分得，
Figure DEST_PATH_IMAGE008
（2）
上式说明，对于有FRET关系的两个荧光分子A和B，如果改变能量激发输入，并同时检测出相应A和B荧光的对应变化量，即dF′ L 和dI′ L1 ，即可求出荧光分子B的浓度，结果不再受本底荧光、光源变化和环境因素等的影响。
在上述结果的基础上，考虑到上转换的多波长发光以及各波长强度比例关系，推导后可得
Figure DEST_PATH_IMAGE010
（3）
其中，b为I L2 发光波长的环境传输损耗系数, β为I L2 发光波长的上转换量子效率，ε为I L1 发光波长上转换量子效率，I′ L2 为I L2 的实际检测值。
由于上式中的a和b是随环境变化的未知常数且不易检测，考虑消掉该常数。根据I L1 和I L2 的关系进行微分整理可得
Figure DEST_PATH_IMAGE012
（4）
a值在初始时刻检测计算获得，此时dI′ L1 和dI′ L2 分别为dI′ L10 和dI′ L20 ，结果带入（3）式并将微分方程离散化得
Figure DEST_PATH_IMAGE014
（5）
该式表明，活性氧浓度（荧光分子浓度）和检测到的出射荧光及上转换发光的微分之比成正比。只要在初始较低能量共振转移损耗I L1 较强时改变一次激发光源强度获得
Figure DEST_PATH_IMAGE016
的值，利用过程中出射荧光和上转换的800 nm出射光的动态差分值，求其比值就可以精确检测活性氧浓度以及其分布成像。该方法使用了荧光能量共振转移的建立过程，并采用差分控制激发和检测，从而用于精确测量荧光探针的浓度，因此被称作荧光共振差分比率检测法。
有益效果：本发明中的近红外纳米荧光探针以近红外双光子吸收的上转换材料为基础，通过优化合成过程，合成出具有核壳结构的、生物兼容性好的、980nm光激发的高效率上转换纳米粒子，并在其上负载对活性氧敏感的活性氧检测分子。在使用该近红外纳米荧光探针进行活性氧检测的过程中，活性氧由近红外纳米荧光探针自带的活性氧检测分子稳定捕获，反应后的活性氧检测分子和上转换纳米粒子将形成能量供体和受体的共振关系，近红外激发时上转换纳米粒子产生540 nm和800 nm两种波长的上转换发光，其中540nm波段经能量共振转移激发荧光检测分子发出600 nm的荧光。；800 nm波段则直接被检测作为参比光。通过计算机对近红外激光的激发强度的调控（优选激发强度为500 -510 mW/cm2，激发时间为1 s），同时用CCD成像仪记录每次差动激发下的600 nm荧光和 800 nm 的上转换发光强度，检测出相应的包括荧光和上转换发射光的多个差动变化，被数据采集卡采集到的CCD成像仪数据传输并储存到带有采集控制软件和图像分析重建软件的计算机中，计算机对获得的差分数据进行比率计算，修正补偿后获得活性氧的精确浓度测量。
本发明利用上转换纳米粒子的优异的光学特性，实现了基于近红外光的纳米荧光探针的荧光激发，产生的红色荧光有利于携带的剂量信息高效穿透组织，荧光共振差分比率的光学检测方法能够克服组织传输的影响，该方法可提供治疗剂量的精确监测和高效控制。
本发明的有益效果在于：
第一、本发明为高精度、活体活性氧的检测提供了一种可行性方案。
第二、本发明用于活性氧的荧光共振差动比率检测装置，提出了活性氧检测的新思路，通过近红外纳米粒子和活性氧检测分子结合，当活性氧检测分子被氧化后，纳米粒子和氧化分子建立起荧光共振能量转移关系，在近红外激光的激发下发出荧光，经差动调控激发和检测计算获得活性氧浓度的信息，从而巧妙地避免了活性氧活体检测的诸多难题，实现了高灵敏、高精度的活性氧检测。
第三、本发明的用于活性氧的荧光共振差动比率检测的近红外纳米荧光探针，利用纳米粒子一体化实现了活性氧检测分子的负载和激发，并且实现了靶向递送的可能。同时，近红外纳米荧光探针充分利用了上转换过程的多光谱特性和近红外激发特性。同步实现了多信息传递和基于近红外光的纳米检测探针的荧光高效激发，产生的红色荧光也有利于携带的剂量信息高效穿透组织，该方法可提供治疗剂量的精确监测和高效控制。
附图说明
图1为本发明检测装置结构的示意图；
图2为本发明中近红外纳米荧光探针及探针构建示意图；
图3为近红外纳米荧光探针检测原理示意图；
图4为近红外纳米荧光探针细胞检测成像示意图；
图5 为活体检测应用实例。
具体实施方式
下面结合附图对本发明进行详细的介绍。
实施方式1：
系统结构及其构建
如图1，用于活性氧的荧光共振差动比率检测装置包括计算机1（带有采集控制软件（MATLAB软件）和图像分析重建软件（MATLAB软件）以及电机制软件（LabView软件））、数据采集卡2（型号为NI公司生产的PCI2400）、控制盒3、近红外光激光器4（发出的激光为连续激光，功率在0~20 W的范围内，波长在700nm~1000 nm的范围内，激光开关和功率经控制盒受电脑软件控制实现差动激发）、激光功率光纤5（数值孔径为0.22、光纤接头为SMA905、光纤芯径为200 μm）、准直器6、扩束镜7（焦距为4.6 mm，透光波长在650～1050 nm的范围内）、可见光检测CCD成像仪8、滤光系统9（540，600 和800 nm带通的滤光片9）、采集镜头10、伺服跟踪系统11（优选三维光电跟踪系统，最大跟踪工作范围为5 cm，最小分辨率为横向为1mm，纵向为2 mm）和三维电动平台12，计算机1与数据采集卡2电连接，数据采集卡2通过控制盒3与近红外光激光器4电连接，近红外激光器4通过光纤5与扩束镜7光信号连接，光纤5上设有准直器6，数据采集卡2通过CCD成像仪8与采集镜头10光信号连接，并且CCD成像仪8位于采集镜头10的成像交点处，CCD成像仪通过可变换带通的滤光系统9与采集镜头10光信号连接，数据采集卡2通过伺服跟踪系统11与三维电动平台12电连接，扩束镜7、CCD成像仪8、滤光系统9和采集镜头10分别设于三维电动平台12外，样品台13固定在三维电动平台12上，并且样品台13位于扩束镜7和采集镜头10的正下方。
上述三维电动平台12包括前后移动平台、左右移动平台和上下移动平台，前后移动平台、左右移动平台和上下移动平台由各自的步进电机分别驱动，且各自的步进电机驱动移动的最小步距均为10 μm。三维电动平台12由装有电机控制软件的计算机1控制实现伺服跟踪；每采集完一次荧光信号，图像分析重建软件分析图像得出样品位置变动信息，并控制三维电动平台12进行位置校正，图像分析重建软件利用比值计算出活性氧数据后，将结果和设定的阈值相比较，比较结果转变为控制激光强度和照射时间的信号，输出至激光控制盒控制激光。
实施方式2：
多通道近红外纳米荧光探针的合成
1）使用热沉淀法合成油酸包裹、核壳结构、980 nm近红外激发的上转换纳米粒子；将定量的稀土醋酸盐充分溶解后，置于烧瓶内除水除氧，在氩气保护下温控加热，最后通过多掺杂、多次结晶技术形成油酸包裹、核壳结构的980 nm近红外激发的上转换纳米粒子。调整合成过程中的掺杂比例，使合成的纳米粒子（NaYF4:Yb, Er, Tm @CaF2）特征为：50nm，980nm光激发，540和800 nm多波长发射。
2）将双羧基聚乙二醇PEG（2000）和不饱和磷脂（C52H80NO8P）分子用EDC和NHS活化后，共价连接形成DSPE-PEG-COOH分子，层析提纯待用。
3）将DSPE-PEG-COOH分子和上转换纳米粒子共孵育并超声，实现充分包裹后用3500 g离心加速度离心，去上清，重悬备用。
4）将活性氧检测分子RedoxSensor Red CC-1 stain和包裹好的上转换纳米粒子共孵育并超声，振荡过夜后离心去上清，重悬后得近红外纳米荧光探针。合成过程如图2。
实施方式3：
使用实施方式1中用于活性氧的荧光共振差动比率检测装置与实施方式2中的近红外纳米荧光探针用于检测活性氧的荧光共振差动比率，包括以下步骤：
1）在1 ml培养皿培养细胞中加入近红外纳米荧光探针，加入的近红外纳米荧光探针的浓度为1 mg/ml。同时，在培养皿中加入10 μg/ml的光敏剂焦脱镁叶绿酸-a（PPa），孵育3h后，用PBS清洗三次，最后加入1 ml PBS溶液，将培养皿置于样品台13上，用650 nm激光（10 mW/cm2）连续照射，利用光敏剂的光动力产生活性氧，同时实施活性氧检测。
2）计算机1通过控制盒2使近红外光激光器4发出980 nm的近红外激光，通过准直器6和扩束镜7调整激光光斑面积、以使激光光斑覆盖整个培养皿，调整采集镜头10的位置，使培养皿在CCD成像仪8上成像最清晰且处于中间位置；接着上转换近红外纳米荧光探针被980nm近红外激光激发；计算机1通过控制近红外激光发射器4发射的近红外激光的激发强度，功率为500 -510 mW/cm2，激发时间1 s，同时用CCD成像仪8记录每次差动激发下的600nm荧光和 800 nm 的上转换发光强度。采集镜头10接收荧光信号，然后经滤光系统9滤除干扰光之后，数据采集卡2通过CCD成像仪8采集荧光信号，并将荧光信号传输并储存到计算机1中。计算机1利用LabView软件，通过公式
Figure DEST_PATH_IMAGE002A
计算活性氧浓度和产量信息，并利用图像分析重建程序对数据采集卡2所采集的荧光信号数据进行成像，根据荧光强度、荧光变化率对所成的像的对应区域做统计学分析。检测成像方法和结果如图3和4。再将获得的活性氧浓度和产量信息与预设的阈值比较，比较结果输出到控制激光功率的控制盒3以实时控制近红外激光发射器4的激光输出功率；计算机1还通过图像特征分析获得样品的移动信息，并将移动信息输出到伺服跟踪系统11，通过伺服跟踪系统11实时控制三维电动平台12跟踪样品的位置。
实施方式4：
活体检测应用实例
培养肿瘤小鼠模型，待肿瘤长到0.5 cm3，按体重尾静脉注射100 μl光敏剂PPa（5mg/kg），5小时后肿瘤局部皮下注射活性氧探针，等待1小时后实施光照和活性氧的同步监测。 其中，用650 nm激光（10 mW/cm2）连续照射，利用光敏剂的光动力产生活性氧；980 nm近红外激光激发；计算机1通过差动控制近红外激光发射器4发射的近红外激光的激发强度，功率为500 -510 mW/cm2，激发时间1 s。每隔30 s检测一次。每次CCD成像仪8记录差动激发下的600 nm荧光和 800 nm 的上转换发光强度。采集镜头10接收荧光信号，然后经滤光系统9滤除干扰光之后，数据采集卡2通过CCD成像仪8采集荧光信号，并将荧光信号传输并储存到计算机1中。计算机1利用LabView软件，通过公式
Figure DEST_PATH_IMAGE002AA
计算活性氧浓度和产量信息，并利用图像分析重建程序对数据采集卡2所采集的荧光信号数据进行成像，根据荧光强度、荧光变化率对所成的像的对应区域做统计学分析。再将获得的活性氧浓度和产量信息与预设的阈值比较，比较结果输出到控制激光功率的控制盒3以实时控制近红外激光发射器4的激光输出功率；计算机1还通过图像特征分析获得样品的移动信息，并将获得的移动信息输出到伺服跟踪系统11，通过伺服跟踪系统11实时控制三维电动平台12跟踪样品的位置。检测成像结果如图5。
上述实施方式只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所做的等效变换或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种用于活性氧的荧光共振差动比率检测装置的检测方法，所述用于活性氧的荧光共振差动比率检测装置中，计算机（1）与数据采集卡（2）电连接，所述数据采集卡（2）通过控制盒（3）与近红外光激光器（4）电连接，所述近红外光激光器（4）通过光纤（5）与扩束镜（7）光信号连接，所述光纤（5）上设有准直器（6），所述数据采集卡（2）通过CCD成像仪（8）与采集镜头（10）光信号连接，且所述CCD成像仪（8）位于所述采集镜头（10）的成像焦点 处，所述CCD成像仪（8）通过滤光系统（9）与所述采集镜头（10）光信号连接，所述数据采集卡（2）通过伺服跟踪系统（11）与三维电动平台（12）电连接，样品台（13）固定在所述三维电动平台（12）上，且所述样品台（13）位于所述扩束镜（7）和所述采集镜头（10）的正下方；
其特征在于，所述检测方法包括以下步骤：
S1：将用于活性氧的荧光共振差动比率检测的近红外纳米荧光探针置入待测样品中，并将所述待测样品置于所述样品台（13）上；
S2：所述计算机（1）通过所述控制盒（3）控制所述近红外光激光器（4）发出近红外激光，并通过所述准直器（6）和所述扩束镜（7）调整激光光斑面积，使激光光斑覆盖整个所述待测样品的检测区域，调整所述采集镜头（10）的位置，使所述检测区域在所述CCD成像仪（8）上成像最清晰且处于中间位置；当所述待测样品中有活性氧产生时，所述近红外纳米荧光探针发出荧光信号；所述近红外光激光器（4）发出的激光波长为980 nm；
S3：所述计算机通过控制所述近红外光激光器发射的近红外激光的激发强度，以使所述纳米荧光探针产生差动变化的荧光信号；
S4：所述采集镜头（10）接收所述荧光信号，然后经所述滤光系统（9）滤除干扰光之后，所述数据采集卡（2）通过所述CCD成像仪（8）采集所述荧光信号，并将所述荧光信号传输并储存到所述计算机（1）中；
S5：所述计算机（1）对所述荧光信号进行计算分析，获得所述待测样品的活性氧浓度以及所述待测样品的移动信息；
其中，所述活性氧浓度通过以下公式获得：
Figure DEST_PATH_IMAGE001
；
其中，C为荧光分子浓度，k为吸收系数，μ为荧光激发量子效率，ΔI′ L10 、ΔI′ L20 、ΔI ′ L2 、ΔF′ L 分别为差动检测的初始的540 nm的发光差值，差动检测的初始的800 nm的发光差值，差动测量过程中800 nm的发光差值和差动测量过程中600 nm的荧光发光差值，荧光分子浓度代表活性氧浓度；
S6：所述计算机（1）将所述活性氧浓度与预设的阈值比较，并将比较结果输出到所述控制盒（3），通过所述控制盒（3）实时控制所述近红外光激光器（4）的激光输出功率；并将所述移动信息输出到所述伺服跟踪系统（11），通过所述伺服跟踪系统（11）实时控制所述三维电动平台（12）跟踪所述待测样品的位置；
所述近红外纳米荧光探针的合成方法包括以下步骤：
S1-1：制备氟化钙包裹、核壳结构的近红外激发的上转换纳米粒子，合成的上转换纳米粒子NaYF4:Yb, Er, Tm @CaF2的特征为：980nm光激发，540nm和800 nm多波长发射；
S1-2：将双羧基聚乙二醇PEG和不饱和磷脂分子用EDC和NHS活化后，共价连接形成羧基化的磷脂聚乙二醇DSPE-PEG-COOH分子，层析提纯待用；
S1-3：将所述DSPE-PEG-COOH分子和所述上转换纳米粒子共孵育并超声，实现充分包裹后离心，去上清，重悬备用；
S1-4：将活性氧检测分子RedoxSensor Red CC-1和包裹好的所述上转换纳米粒子共孵育并超声，振荡过夜后离心去上清，重悬后得所述近红外纳米荧光探针。
2.根据权利要求1所述的用于活性氧的荧光共振差动比率检测装置的检测方法，其特征在于：所述计算机（1）为带有采集控制软件和图像分析重建软件以及电机控制软件的计算机。
3.根据权利要求2所述的用于活性氧的荧光共振差动比率检测装置的检测方法，其特征在于：所述的采集控制软件和图像分析重建软件均为MATLAB软件；所述的电机控制软件为LabView软件。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的用于活性氧的荧光共振差动比率检测装置的检测方法，其特征在于：所述三维电动平台（12）包括前后移动平台、左右移动平台和上下移动平台，所述前后移动平台、左右移动平台和上下移动平台由各自的步进电机分别驱动。
5.根据权利要求4所述的用于活性氧的荧光共振差动比率检测装置的检测方法，其特征在于：所述前后移动平台、左右移动平台和上下移动平台由各自的步进电机驱动移动的最小步距均为10 μm。
6.根据权利要求1至3中任一项所述的用于活性氧的荧光共振差动比率检测装置的检测方法，其特征在于：所述近红外光激光器（4）发出的激光为连续激光，功率在0~20 W的范围内。
7.根据权利要求1所述的用于活性氧的荧光共振差动比率检测装置的检测方法，其特征在于：所述滤光系统（9）为540nm、600nm和800 nm带通的滤光转换系统。
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Assignee: JIANGSU KANGQIANG FOOD LTD.

Assignor: HUAIYIN INSTITUTE OF TECHNOLOGY

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Denomination of invention: Synthesis method, detection device and detection method of fluorescent resonance differential ratio probe for active oxygen detection

Granted publication date: 20220318

License type: Common License

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