CN102037352A - 累积的时间分辨发射双向凝胶电泳 - Google Patents
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Abstract
本发明为蛋白质的胶内检测和定量提供了一种新的仪器设计。这种新平台称为累积的时间分辨发射双向凝胶电泳(CuTEDGE),利用荧光寿命成像的差异来区分来自特异性蛋白质标记的荧光和非特异性背景荧光,致使与现有技术相比在灵敏度和动态范围方面均有明显的改进。该平台主要用于双向凝胶电泳的图像获取,但也用于单向凝胶系统的蛋白质检测以及电转移到例如PVDF膜上的蛋白质。考虑到与现有方法相比,在检测和动态范围方面增加了高达5-6个数量级,所描述的发明在低丰度细胞蛋白质的检测中代表了技术的飞跃,这种技术的飞跃是生物标志物发现的领域中迫切需要的。
Description
技术领域
本发明涉及一种用于蛋白质的胶内检测和定量的方法和新的图像获取技术。这种新平台称为累积的时间分辨发射双向凝胶电泳(CuTEDGE),利用荧光寿命的差异来区分来自特异性蛋白质标记的荧光和非特异性背景荧光,致使与现有技术相比在灵敏度和动态范围方面均有明显的提高。
背景技术
“蛋白质组学”是指对基因组的全部蛋白质(蛋白质组)进行的研究,是由Marc Wilkins于1994年提出的术语。在过去十年里,已经开发了多种对细胞或组织内的成千上万种蛋白质同时定量的方法并且用于例如细胞过程的生物标志物发现或机理研究。双向凝胶电泳(2-DGE)是适合于完全蛋白质组学分析的第一种方法,并且还构成了蛋白质组学研究中的主力之一。2-DGE法包括在第一向根据蛋白质的电荷和在第二向根据蛋白质的分子大小来分离复杂的蛋白质样品,产生一种二维蛋白质斑点图,其中理想的是每个斑点相当于单独的蛋白质组分。然后,采用按化学计量与蛋白质结合的蛋白质染色剂来可视化蛋白质斑点,从而得到相当于蛋白质丰度的第三维度,便于定量的蛋白质组分析。
与最初的2-DGE技术有关的胶与胶之间的大变化问题已经通过掺入内标,例如差异凝胶电泳(DIGE)技术和Alexa标记的内标(ALIS)技术,得到了解决。两种构思均基于采用光谱学上分离的荧光染料标记的样品蛋白质和内标蛋白质,并在共同分离在2-DGE凝胶上。通过比率测量标准化,可以校正凝胶之间的变化,因此极大地提高了2-DGE技术的定量方面和总体的统计学检验功效。
在当前2-DGE方法中存在的主要制约是检测的灵敏度方面的限制。生物样品中的蛋白质丰度可能高达12个数量级这一事实,对在定量2-DGE中使用的蛋白质染色的灵敏度和动态范围均有很高的要求。以此为目标,动态范围为3-4个数量级的荧光染色已经取代了使用传统的比色染色法,例如动态范围通常局限于1-2个数量级的银染和考马斯亮蓝染色(图1)。
荧光染料可用于在2-DGE分离之前的共价标记(例如CyDyesTM,Alexa-dyes),以及电泳后染色过程的非共价标记(例如SYPRORubyTM,Deep PurpleTM)。然而,当前在市场上甚至进行蛋白质可视化的最好的荧光探针仅涵盖非常小部分的潜在的生理学范围,因为生理学的蛋白质丰度范围在几摩尔到微摩尔浓度,而对于最低DIGE的现有技术方法的检测限度通常限于纳克的蛋白质(图1)。
在当前使用的2-DGE中蛋白质检测和定量的荧光中,荧光染料的激发和产生的发射的测定同时发生。由于在时间上有效和技术角度上的实用,该方法被用于荧光扫描仪和基于CCD照相机的2-DGE图像获取仪器。但是,直接的荧光测量并不利用这些荧光染料的全部潜能。生物样本包含许多自发荧光组分,并且聚丙烯酰胺基质自身在一定程度上发射背景荧光。因此,为了优化信噪比,降低背景荧光和自发荧光的干扰非常必要。
在当前的2-DGE技术中,试图通过电泳后的计算机辅助定量分析中使用的软件算法在数学上去除产生的背景。然而,我们之前已经表明,大部分背景减除和校正算法改变了数据并将附加的变化引入到蛋白质斑点体积的定量中,并形成了倾斜的、非正态分布(1-4)。
通过时间分辨荧光(TRF),光子源可以来源于通过分离存在于给定像素中的各种荧光组分的衰减曲线。目前,TRE在相关领域中有许多应用,主要是显微镜应用于可视化定位、折叠动力学或溶液中蛋白质的运动(5,6)。目前,在2-DGE中使用的一些荧光染料已被用于这些相关领域中的时间分辨荧光应用中(例如,得自GE Healthcare,Uppsala,Sweden的CyDyesTM,和Alexa-dyes以及钌螯合物例如SYPRO RubyTM,二者均得自Molecular Probes,Eugene,OR,USA(7,8))。然而,目前该特征在现代2-DGE图像获取设备中的缺乏阻止了2-DGE中TRF的使用和开发。
相关技术描述
本领域大多数现有技术涉及用于研究分子间相互作用、分子稳定性或分子内构象变化的荧光共振能量转移(FRET)技术,而另一些现有技术涉及荧光寿命成像(FLIM)的使用。这些现有技术包括监测聚合酶链式反应(PCR)产物(Rintamaki S.et al,Journal ofmicrobiological methods,(2002Aug)Vol.50,No.3,pp.313-8),其他用于DNA测序中的碱基识别(Lassiter S J et al,分析化学,2000 Nov 1,Vol.72,No.21,pp.5373-82)。这些作者改良了自动化DNA测序仪中的显微镜头以便允许近红外的时间分辨荧光寿命测定。因此,该仪器的设计、功能和使用具有与本发明完全不同的特征。由该组进行的仪器改良是为分类目的而设计的,以便提高DNA测序的准确性和速度。实质上,利用寿命成像来区分具有不同寿命的两种荧光染料,表示通过平板凝胶电泳分离的不同的DNA片段的存在。在后续的研究中,作者将测序技术扩大至具有类似目的的聚合物微芯片平台(Llopis S Det al,电泳,2004 Nov,Vol.25,No.21-22,pp.3810-9)以及用于阅读来自DNA微阵列的荧光标记(Stryjewski et al SPIE(国际光学工程学会)会议录(2002),4626(生物医学纳米技术架构和应用),201-209)。用于本发明的背景减除的多维时间分辨荧光从未在任何这些应用中使用。相反,作者竭尽所能研究何种聚合物载体基质能够产生最少量的背景荧光以便保持单指数的工作流程,或者作为另外一种选择使用传统的背景校正方法例如阴性对照斑点的强度的时间门或减除。因此,在本发明的胶内(蛋白质)测定中使用的特定背景减除的多指数时间分辨荧光代表了出人意料的效果并且是一种新的技术。
本发明的目的是提供一种在全部蛋白质组研究中用于荧光标记蛋白质的胶内检测和定量的新平台。本发明涉及荧光寿命成像(FLIM)的使用。本发明的其他目的和优点通过以下的公开内容和所附的权利要求将更加完全地显而易见。
发明内容
CuTEDGE技术的主要实施例包括采用脉冲激光扫描仪来激发与蛋白质结合(共价或者通过离子力)的荧光染料。目前,在定量的2-DGE中用于图像获取的现有技术中的荧光激光扫描仪利用恒定光源激发。凝胶的恒定照明不利用荧光寿命方面的差异,并且检测到的发射相当于荧光染料和背景荧光的共同峰发射。相反,采用本发明描述的脉冲激光器扫描提供了在逐个像素水平上的FLIM测定(图2A-2C)。激光器,假定是二极管激光器,可以在密封的扫描仪外壳内进行内部封装,或者通过光缆出口在外部附着以便提供激发波长的最佳灵活性,即必须使用特定的二极管激光器。因此,该技术可以作为对现有仪器的更新,或者作为完全封闭的扫描仪系统。
本发明的另一实施例包括利用荧光衰减曲线的多指数拟合以分离来源于荧光标记的蛋白质种类的荧光和来源于其他来源例如凝胶基质自身、溶液或存在于凝胶中的微粒、或者散射效应的荧光。如图2A-2C所示,荧光衰减曲线的分离提供了光子水平上的背景减除。此外,CuTEDGE技术的实施例降低了在随后的图像分析中对软件辅助背景减除算法的需要,并且增加了通过这些算法引入的已知的实验方差。图4A-4B举例验证了2-DGE图像中荧光寿命的分布,其中示出了Cy2的伪彩色的寿命图像。
本发明的再一个实施例包括连续使用多激光器波长进行激发以促进TRF与荧光染料的光谱分离的组合。在当前的2-DGE方案中使用光谱分离以便于通过复用,例如DIGE(9)和ALIS(10)法校正在分离谱带中凝胶之间的变化。2-DGE中用于内标合并的复用方案对于2-DGE方法中固有的胶与胶之间的变化的校正至关重要,并且在基于凝胶的蛋白质组学领域中得到很好的确定。因此,包含该实施例使CuTEDGE仪器在采用当前的用于2-DGE中的内标方案的现有蛋白质组学工作流程中容易地实施。通过光谱分离而不是通过TRF采用复用技术也降低了寿命衰减光谱的复杂性,从而提高了CuTEDGE方法的背景减除能力。然而,与Cy2/Cy3染料对的情况一样,在掺入的荧光染料的激发波长与荧光寿命相容的情况下,还可以包括双重FLIM测定(实施例4)。
足够的灵敏度以及动态范围的光子检测器的掺入是本发明的又一个关键的实施例。传统上,2-DGE的图像获取仪器中已经使用了光电倍增管(PMT)技术以保证较宽的动态检测范围。然而,PMT检测器有限的量子效率(QE)在CuTEDGE应用中可能损害检测的灵敏度。因此,在可见光范围内QE高达90%的雪崩光二极管(APD)检测器可能证明在灵敏度方面有优势,而不利的一面是在检测的动态范围内具有潜在的限制。因此,配备有符合用户个体需要的检测器的CuTEDGE仪器的不同变体可能被设计为现有技术中已知的。
将荧光染料特异性的强度荧光衰减曲线积分以计算曲线下面积(AUC)是本发明的另一个主要的实施例。评估了利用作为输出格式的AUC(相当于荧光染料组分的总光子计数)而不是组分的振幅贡献以提供额外的1-2个数量级的动态范围的提高。
自动化和用户使用方便是CuTEDGE仪器的核心组分,特别是在需要的2-DGE图像的图解计算和定量计算方面。对于2-DGE中使用的标准荧光染料,包括FLIM分析的自动化方案、背景组分的减除和荧光染料组分的强度图像的输出。因此,为了便于使用现有的2-DGE图像分析软件,在产生的输出图像中将AUC表示为一维(Z)强度。采用32位标签图像文件格式(TIFF)或者等效格式替换当前使用的16位格式提供了接近10个数量级的数字动态范围,从而促进了通过CuTEDGE技术得到的像素强度的全动态范围。
为了使自动化最大化,本发明还促进了由用户定义的多个不同方案的顺序扫描的设计,例如用于复用的多种荧光染料的顺序扫描。
考虑到目前在基于凝胶的蛋白质组学中使用的各种荧光探针中可用的宽范围的荧光寿命,优化扫描时间的变频脉冲激光二极管是本发明的另一个实施例。
因此,已经相当广泛地概述了本发明的更加重要的特征以便可以更好地理解本发明的详细的描述,并且可以更好地体会本发明对于现有技术的贡献。本发明的附加技术特征将在以下进行描述。
在这方面,在详细解释本发明的至少一个实施例之前,应当理解的是本发明不限于其在以下说明书中记载的或者在附图中示出的详细构造和组件配置中的应用。本发明还有其他实施例并且通过各种方式能够实施和实现。而且,应当理解本文使用的短语和术语是出于描述的目的,不应认为限制本发明。
附图简要说明
图1显示了通过银染(细实线)与现有技术荧光DIGE测定(点划线)以及采用DIGE荧光染料和次优TRF仪器的最初原理验证测定(短划线)与采用本发明测定(粗实线)的比较的检测到的蛋白质丰度与实际蛋白质丰度的关系曲线图。
图2A显示了由CyDye标记蛋白质的胶内测定产生的荧光衰减曲线(光子数与时间)的多指数拟合的实例。
图2B显示了采用具有较长荧光寿命的荧光染料的荧光衰减曲线(光子数与时间)的多指数拟合的实例,显示对时间门测定的优化窗口(短划线)。
图2C是累积的背景荧光贡献与总的荧光的比较图。显示了在标准的、非时间分辨测定期间的发射水平(短划线)。
图3A显示了在采用恒定光源激发期间Cy3和Cy5的相对荧光、波长和时间的三维图。
图3B显示了在时间分辨测定,即在采用脉冲激光器激发期间Cy3和Cy5的相对荧光、波长和时间的三维图。
图3C是图3A中显示的荧光和波长组分的二维代表图,显示了Cy3和Cy5的激发曲线(实线)和发射曲线(短划线)。
图3D是图3B的时间组分和光子数组分的二维代表图,显示了Cy3和Cy5的寿命发射曲线。
图4A显示了在包含Cy2标记的蛋白质的2-DGE凝胶中显示不同寿命组分分布的伪彩色寿命图像。在右上角显示了时间尺度,白色代表最长的寿命,黑色代表较短的寿命。在图像的非斑点区域中的黑白相间外观起因于与丙烯酰胺基质(见图5)相关的较长的背景组分(4.2ns)与非常短的背景组分(0.2ns)的混合。
图4B显示了相对于常规的显示总荧光强度(无寿命分离)的2-DGE图像的蛋白质斑点谱带与寿命图像具有较高的对应关系,显示了聚丙烯酰胺凝胶的背景组分确实是通过寿命荧光应用从CyDye荧光染料中可明显地分离。
图5是在一维梯度凝胶中长的主要背景组分(4.2ns)的光子数与丙烯酰胺浓度的关系图。
图6是整个潜在的CuTEDGE仪器设计中的示意图。
图7显示了有助于用于蛋白质定量的斑点体积的三维图。
具体实施方式
本发明提供了一种用于在全部蛋白质组研究中荧光标记的蛋白质的胶内检测和定量的新平台并且基本上具有以下本文更加详细地讨论的实施例:图6中概述了CuTEDGE仪器的一般设计。在密封的扫描仪外壳内封装或者通过光缆在外部附着的脉冲激光二极管,用于荧光染料标记的蛋白质(共价或通过离子力)的胶内激发。通过支持凝胶的玻璃板的移动或者移动凝胶板下面的二向色滤波镜提供了扫描仪装置,便于凝胶的逐个像素扫描。通过运动/静止的二向色滤波器的发射的荧光将直接通过选择的发射滤波器并且进一步通过光缆进入内部封装的或者外部附着的检测器,这取决于仪器设计涉及的是封闭的扫描仪系统还是外部升级套件。光子计数板出口将数据传输到软件模块,该软件模块的目的在于荧光衰减曲线的全自动的多指数寿命拟合以分离来源于荧光染料标记的蛋白质种类的荧光和来源于其他不需要的背景荧光的荧光。对荧光染料具有特异性的积分的荧光衰减曲线,采用与进一步定量的2-DGE图像分析兼容的格式,输出为每种荧光染料一个强度图像。
本发明通过分别利用荧光染料的荧光衰减时间与背景荧光的内在差异,在基于凝胶的蛋白质组学研究中可以显著地提高整体信号强度和信噪比。通过使用脉冲激光器,可以测定全部荧光寿命的衰减曲线,如图3A-3D所示。利用穿过凝胶移动激光脉冲和检测器的装置,以便促进凝胶的逐个像素的扫描。一种方案包括用于移动在支持凝胶的静止玻璃台下面的一套镜子的步进电机控制器从而避免实际凝胶台的移动。这种反向装配有助于保持平板凝胶的静止从而避免易碎的聚丙烯酰胺凝胶的破裂,尤其是大版式凝胶的破裂。由于移动镜子而产生的变化距离将通过合适位置的延迟发生器进行校正。此外,该方案使用稳健的外壳以允许平板凝胶的水浸,否则,凝胶在复用所需要的高分辨率、顺序扫描期间会变干。替代方案包括逐步移去支持凝胶的扫描仪板。重要的是任一种装配提供了容易交换的脉冲二极管激光器以促进激发波长选择的灵活性。
TRF的最直接的使用是从检测到的光子发射曲线来计算平均寿命。省略了多指数拟合的不太复杂的TRF测定主要用于确定已知的荧光染料的存在与否。在复杂系统例如图2A中举例说明的Cy2标记的蛋白质的胶内检测中,无法将背景组分的贡献与来源于荧光染料的发射加以区别。利用恒定光源的非TRF测定导致恒定的发射水平相当于总荧光的峰水平(实线),并且与单指数TRF测定相似,无法将单个背景组分与总荧光区分开。
产生的单指数拟合不利于多种荧光组分的分离,结果来自背景和荧光体的发射汇总在一个单独的曲线上(图2C;实线)。因此,产生的单指数FLIM测定更适合于区分已知寿命的荧光染料的存在/缺乏,如在用于Sanger DNA测序中核酸的二进制分类和微阵列中核酸的检测的“相关技术描述”中所述的通过单指数TRF仪器进行的证明(11,12)。与之前的TRF应用于DNA微阵列相比,CuTEDGE技术计划用于2-DGE凝胶图像代表了很多挑战。最重要的是,微阵列中的斑点定位和斑点大小是已知的,从而容易地预先界定斑点边界。与此相反,由于斑点带型是基于蛋白质的物理化学性质,2-DGE中的斑点大小和斑点定位均未知。斑点分离带型中大的凝胶之间的变化进一步增加了2-DGE图像中斑点检测和定量的复杂性。微阵列中使用的固体表面的均一性远大于2-DGE中使用的聚丙烯酰胺凝胶基质的均一性。2-DGE中蛋白质的胶内定位致使背景荧光比用于微阵列中核酸检测的上位杂交更加复杂。因此,与微阵列成像系统相比,2-DGE图像获取需要在背景检测和减除方面更加稳健的系统。
由于在常规荧光应用中不能定量背景荧光,因此必须通过评价在荧光标记的分子周围的像素强度来评估背景发射。当前可用的2-DGE图像中背景减除的算法不是很准确,并且我们之前已经显示了大量的在重复性方面缺乏稳健性的这些算法的文献,因此导致了在定量分析中的显著差异(1-4)。
考虑到背景荧光和荧光染料中存在的荧光的寿命的充分分离,单指数TRF的应用能够比持续照明测定有改进,因为背景噪声能够通过时间延迟的测定得到降低(图2B)。然而,旨在排除背景发射的时间门通常导致荧光体的主发射峰也被排除(图2B)。在荧光染料的寿命基本上大于背景组分的寿命的情况下,可以采用时间门测定以排除来自定量的背景荧光。虽然该策略在信噪比方面稍有改进,一旦知道现有组分的寿命就可以排除对复杂拟合算法的需要。因此,如之前试图将单指数时间延迟的方法应用于微阵列所证实的那样,灵敏度和动态范围的提高是有限的(12)。
此外,目前在2-DGE中最频繁使用的基于花菁的荧光体(DIGECyDyes)的荧光寿命远小于聚丙烯酰胺基质周围的荧光寿命(分别为约1ns和约4ns;图2A),从而排除了时间门策略。因此,反褶积算法应用于多指数衰减是CuTEDGE技术的核心内容,以便于基于FLIM的背景减除,也用于这些短寿命的荧光染料的减除。
图2A中显示了时间分辨荧光(TRF),利用脉冲激光器激发(时间0),和定量随后的荧光衰减曲线。由Cy2标记的蛋白质的胶内检测而产生的衰减曲线的多指数拟合揭示了除荧光染料组分(1ns)之外的短背景组分(0.2ns)和长背景组分(4.2ns)。图5显示了主背景组分的强度(4.2ns)和梯度聚丙烯酰胺凝胶(R2=0.67)中丙烯酰胺浓度之间强烈相关,表明聚丙烯酰胺基质是该背景组分的来源。在整个聚丙烯酰胺梯度中组分的寿命保持稳定,仅改变了组分的强度。因此,背景减除策略在CuTEDGE技术中的应用是适用于各种浓度的梯度凝胶和无梯度凝胶的一种稳健的方法。多指数拟合促进了背景组分的减除,从而导致信噪比显著地增加。
采用3-重套的DIGE荧光染料(Cy2、Cy3和Cy5)进行的原理验证实验表明,在背景组分和荧光染料本身的寿命的分布方面具有明显差异(图4A)。传统强度图像和伪彩色寿命图像之间的比较清楚地证明了蛋白质斑点分离条带是重叠的。逐个像素的多指数拟合和随后的荧光染料组分的提取因此促进了在光子水平上的背景减除。原理验证测定显示,即使采用次佳仪器(与测定全部1mm深度凝胶的Typhoon扫描仪相比,允许最大测量深度为约1μm的改良的TRF显微镜),信噪比比现有的最佳激光扫描仪增加了超过10倍。如图1所示,生理蛋白质丰度的范围(x轴)对2-DGE中使用的各种蛋白质染色剂的线性检测范围(y轴)作图。比色法例如银染(细实线)通常提供1-2个数量级的动态范围,而荧光法例如最小DIGE(点划线)提供3-4个数量级的线性动态范围。当TRF应用于标准DIGE测定时(粗实线),采用现有的(短划线)TRF仪进行的原理验证测定显示动态范围提高3个数量级。在对新的CuTEDGE仪器概述的实施例实施之后,估计检测的动态范围和灵敏度提高额外的2-3个数量级(实线盒)。因此,与现有的2-DGE的图像获取技术相比,预期该主要实施例独自提供在灵敏度和动态范围方面几个数量级的提高。在测定中产生的特异性方面的增加不仅提供了更高的灵敏度,而且消除了来自散射效应或其他存在于凝胶中的荧光组分的混杂因子,包括凝胶基质本身、容积、微粒或保持在凝胶中的细胞碎屑。除了在检测的信噪比方面的提高之外,多指数FLIM方法因此还有助于减少在随后的图像分析中切割(斑点检测)和配准(斑点匹配)伴随的问题。当前,这些问题是定量2-DGE工作流程中的另一个主要瓶颈障碍,因为现今需要广泛的自动化斑点检测和匹配的手动编辑。由CuTEDGE技术产生的清洁器背景将因此提高图像配准的自动化并最终降低图像分析的主观性。在2-DGE分析软件中通过当前使用的背景减除算法引入的软件诱导的差异也被消除,因为该算法不再必要。
通过使用光谱学上分离的荧光染料的复用是很好建立的方法,用于弥补在2-DGE分离技术中固有的大的胶与胶之间的变化。但是,在大多数TRF应用中,通过使用不同荧光寿命的荧光染料来达到复用,而激发和发射光谱重叠。为了使CuTEDGE方法的通用性最大化,我们将光谱分离和时间分离组合为一种应用。因此,如实施例2所,多激光器波长将用于激发。该应用有助于TRF与当前在例如DIGE(9)和ALIS(10)方法中使用的光谱分离的组合,从而使CuTEDGE仪器容易地在采用当前2-DGE中的内标方案的现有蛋白质组学工作流程中实施。在采用现有的图像获取仪器的复用中,更长的获取时间对定量将没有任何明显影响。
图3A-3D图解示出了该工作流程。与在基于凝胶的蛋白质组学中使用的现有激光扫描仪中的情况一样,在采用恒定光源激发期间(图3A),必须充分分离激发曲线(图3C,实线)和发射曲线(图3C,点划线)以避免荧光染料之间的猝灭或重叠。由于连续激发,在整个测定过程中重叠保持一致(图3A)。因此,延长的测定窗口导致特异性和非特异性(背景)信号的相似性增大。在采用脉冲激光器激发期间(图3B),激发源在时间上(图3D)以及在光谱学上(图3C)与发射分离。这些光谱时间特征增加了不同荧光组分之间区别的另一维度,并且在光子水平为背景减除提供了方法(图2)。
由于采用恒定光源激发,激发光谱和发射光谱之间的光谱重叠持续(图3A),使得窄带通滤波器的使用成为强制性。相比之下,由CuTEDGE技术提供的光谱-时间分离将激发光谱和发射光谱及时分离(图3B),从而有可能采用在动态范围和灵敏度方面提高的宽带通滤波器。通过光谱分离而不是通过TRF的复用技术的使用也降低了寿命衰减光谱的复杂性,因此提高了CuTEDGE方法的背景减除能力。在激发波长一致的情况下,光谱分离方法也可以用于多个探针的同时测定。我们的原理验证测定表明,这是探针对Cy2和Cy3的情形,该探针对Cy2和Cy3均可以被490nm二极管激光器充分地激发。随后,通过使用二向色滤波器和双检测器可以促进发射的分离检测(见实施例4)。用于TRF复用的新荧光染料集开发之后,该新荧光染料在荧光寿命方面具有充分大的差异使荧光组分和背景组分均可以达到充分拟合,光谱分离方法可以被忽略。
现有的图像获取仪利用PMT来检测激发的荧光染料所发射的光子。虽然PMT具有较高的信号放大率(多达106),但光子计数的效率一般较低(QE约10%)。虽然APD检测器在可见光内显示高达90%的量子效率,但之前它们在图像获取仪器中的使用受到在每个检测到的光子之后它们的长停机时间所限制。APD检测器的主动猝灭的新方法解决了该问题,因此APD检测器的使用可能在灵敏度和动态范围方面具有显著的改进。但是,在需要宽动态范围的情况下,APD型检测器的有限的最大计数率可能仍是限制因子。因此,存在适合于CuTEDGE仪器的一系列检测器,并且根据需要的应用在个体CuTEDGE仪器的设计中检测的动态范围将不利于检测的灵敏度。
在CuTEDGE中使用的每种荧光染料的光谱-时间特征的提取让位于信号定量的新方法。在现有的FLIM应用中,每种组分的信号的振幅一般用于定量像素中每种组分的贡献。在CuTEDGE应用中,我们将不采用整个的曲线下面积(AUC)用于定量目的。与每种特定组分的适合的光子计数一致,AUC的使用将有助于增加检测的灵敏度以及动态范围。在应用连续激发的传统图像获取中,与振幅测定相比,AUC的积分没有显著提高测定的动态范围,因为所有的混杂因子与探针的信号相卷积,并因此与特定信号一起被放大。考虑到CuTEDGE中使用的多指数衰减曲线的去卷积,可以计算荧光染料特异的AUC。由于光谱-时间分离也有利于使用更宽的带通发射滤波器,计算产生的曲线下体积(VUC)的信噪比的改进将得到进一步提高。
对复杂的人工辅助的需要和在现有的FLIM软件中可用的寿命拟合算法的评价对于在本领域有深入了解的用户提出了很高要求。相比之下,CuTEDGE构思将提供高水平的自动化以便允许在时间分辨荧光领域中没有专门知识的蛋白质组研究者以时间有效的方式进行准确测定。
考虑到根据改变的聚丙烯酰胺浓度和缓冲液2-DGE中荧光组分的寿命保持恒定,对于目前2-DGE中使用的标准荧光染料,将包括逐个像素的寿命拟合的自动化方案和随后的相关组分的强度图像的输出。为了便于使用现有的2-DGE图像分析软件,因此在产生的输出图像中,将AUC表示为一维强度(Z)(见图7)。采用代替当前使用的16位格式提供接近10个数量级的数字动态范围,因而便于在通过CuTEDGE技术得到的动态范围中多个数量级的提高。为了提供仪器的最大灵活性,还将提供用户指导拟合的软件以及自动化扫描的常规构造以便容易的实施新荧光染料或凝胶基质的方案。
2-DGE的时间消耗方面常常限制了其在当前的大规模蛋白质组学研究中的可用性,并且自动化在任何蛋白质组学平台中都十分重要。除了以上所述的自动化的寿命拟合和随后的荧光染料组分的强度图像的计算之外,如用户定义的多种方案的自动化顺序扫描将因此成为CuTEDGE仪器中的标准特征。除了时间效率之外,该特征还有助于将各种荧光染料的曝光量最小化。顺序扫描促进了复用,例如通过最小DIGE方案举例说明的(实施例2)。顺序扫描的其他应用包括在饱和DIGE之后采用SYPROTM Ruby检测总蛋白(实施例5),或者采用附加的CyDye的4-重叠(实施例4)。
CuTEDGE仪器装备有变频脉冲激光器(例如0.1-40MHz)以便允许精确调整用于在目前2-DGE中使用的大量荧光染料的检测和定量方法。例如,用于钌复合物所报道的约350-500ns的非常长的寿命(7,8,13)将要求时间延迟的、累积的测定方法(图2B,实施例1),而诸如CyDyes的非常短的寿命(约1ns(8))提示具有来源于背景(图2A,实施例2)的衰减曲线的随后减除的FLIM更加适合获得这些荧光染料的最大灵敏度。变频模式将为后者提供非常短的扫描时间。
对于以上描述之后,应该认识到本发明部分的最佳维度关系,包括大小变化、材料、形状、形式、操作功能和方式、装配和使用,被认为对于本领域技术人员来说是显而易见的。
因此,上述被认为仅是本发明原理的示例性说明。此外,由于本领域的技术人员将容易地进行很多修改和改变,因此不希望将本发明限制在所示出的和所描述的准确构造和操作,因此可能借助的所有合适的修改和等同物均落在本法的范围之内。
实施例1
在本实施例中,首先通过裂解灌洗(14)从大鼠气道中提取蛋白质,提取方法为在2-DGE相容的尿素基裂解缓冲液(7M尿素,2M硫脲,4%w/v CHAPS,0.5%Triton-X 100,2%v/v蛋白酶抑制剂混合物)中快速溶解气道上皮蛋白质组。采用Bradford法确定蛋白质的浓度,并且用2-DGE分离蛋白质。采用裂解缓冲液将一等份的400μg蛋白质/样品稀释为350μl,并加入合适pH范围的IPG缓冲液至终浓度为1%v/v。通过在室温下过夜再水化,将蛋白质样品上样于IPG胶条(GEHealthcare)上,并采用Multiphor II Electrophoresis unit电泳仪和EPS3501XL power supply电泳槽,在20℃下通过以下梯度方案:0-50V,1min.;50V,1 hr;50-1000V,3 hr;1000-3500V,3hr;3500V,19hr(总计74.9kVh)进行等电聚焦(IEF)。在IEF之后,在平衡缓冲液(50mMtris-HCl pH 8.8,6M尿素,30%甘油,2%SDS)中孵育胶条2×15分钟。通过在第一次孵育时加入65mM DTT和在第二次孵育时加入10mM碘乙酰胺进行巯基的还原和烷化。然后,将胶条上样于20cm×25cm 10%T SDS-PAGE凝胶上并用0.5%IsoGel琼脂糖密封。第二向分离在Ettan DaIt电泳系统(GE Healthcare)中进行,在25mM Tris,192mM甘氨酸和0.1%SDS的缓冲液中,在10℃下,14mA/gel电泳至染料前端迁移18cm(约18小时)。
然后从玻璃装置中取出聚丙烯酰胺凝胶,并根据制造商的方案(Molecular Probes,Eugene,OR)用SYPRO RubyTM染色来可视化蛋白质。简单地说,将2-DGE凝胶固定在7%乙酸和10%乙醇中2×30分钟,然后在100%SYPROTM Ruby染色溶液中孵育过夜。随后,用100%甲醇脱色2-DGE凝胶5分钟以便去除凝胶表面上的染色微粒,之后用水平衡2×15分钟。
将SYPROTM Ruby染色的2-DGE凝胶直接放置在CuTEDGE扫描仪的玻璃板上,并采用像素大小为20-100μm的时间延迟的多指数寿命测定方案来可视化蛋白质。通过波长为490nm的脉冲二极管激光器和0.1-0.5MHz(2-10μs cycles)的低脉冲频率进行激发,以便允许完成SYPROTM Ruby的非常长寿命的荧光Ru复合物的延迟。
采用PMT检测器检测发射,并且应用了610±50nm(610bp100)的带通发射滤波器或者600nm的长通滤波器。将数据输出至能够同时拟合多达四种不同衰减算法的多指数荧光衰减拟合软件模块中。基于在SYPROTM Ruby蛋白质染色中使用的非常长的荧光寿命的钌(II)-三(红菲绕啉二磺酸盐)(RuTBS)分子,利用时间延迟的测定方法来排除背景荧光(图2B)。计算在时间间隔10-500ns期间RuTBS分子的衰减曲线的曲线下面积(AUC),并定义为给定X,Y坐标的扫描仪位置的像素强度(见图7)。
与通常用于SYPROTM Ruby染色的带通发射滤波器(610bp30)相比,时间延迟的测定便于保持较宽带通发射滤波器的灵敏度,因为大多数基质和生物分子的自发荧光发生在前5ns期间。较宽带通滤波器允许检测RuTBS的大部分宽发射峰,结果增加了灵敏度。在扫描完成之后,将产生的各X,Y坐标的AUC值合并为,可以通过选择的2-DGE分析软件分析的32位灰度tiff文件。
实施例2
利用2-DGE裂解缓冲液溶解通过支气管肺泡灌洗从吸烟和从不吸烟的人受试者体内提取的巨噬细胞(见实施例1)。通过合并来自该研究中包括的所有受试者的等量蛋白质生成内标,并根据生产商的建议(GE Healthcare,Uppsala,Sweden),并用共轭NHS酯的Cy2(最少DIGE试剂)标记。将来自吸烟和从不吸烟受试者的蛋白质样品随机分成两组,并分别用Cy3和Cy5(最少DIGE试剂)标记。根据实施例1中描述的方案,采用一份Cy3和一份Cy5标记的样品在2-DGE凝胶上共同分离Cy2标记的内标。采用光谱和时间分辨荧光的组合在三种不同的扫描方案的自动化顺序中可视化三种不同的蛋白质标记。具体操作如下:
A)通过波长为490nm,脉冲频率为40MHz(25ns循环)的脉冲二极管来激发Cy2荧光染料(内标)。采用响应速度为50ps的APD检测器来检测发射,并且应用520±20nm(520bp40)的带通发射滤波器。
B)通过波长为532nm,脉冲频率为40MHz(25ns循环)的脉冲二极管来激发Cy3荧光染料(样品)。采用响应速度为50ps的APD检测器来检测发射,并且应用580±10nm(580bp20)的带通发射滤波器。
C)通过波长为640nm,脉冲频率为40MHz(25ns循环)的脉冲二极管来激发Cy5荧光染料(样品)。采用响应速度为50ps的APD检测器来检测发射,并且应用670±10nm(670bp20)的带通发射滤波器。
将来自每个扫描程序的数据输出至能够同时拟合多种衰减算法的多指数荧光衰减拟合软件模块中。由于CyDyes的相对较短的衰减时间(0.9-1.5ns),因此计算每个像素相对于各CyDyes的全部衰减曲线下的AUC(图2A)。衰减曲线的多维拟合促进了在每个特定的波长的光子水平上背景发射的减除,该特定波长作为软件模块中的自动化特征提供(图6)。将每个X,Y坐标产生的AUC值合并至三个明显重叠的32位灰度图像文件中,该32位灰度图像文件适合采用具有DIGE功能的2-DGE分析软件分析。
实施例3
作为实施例2中所述方案的附加步骤,进行SYPROTM Ruby染色以便于DIGE凝胶中总蛋白质含量的定量。在现有技术中,由于光谱重叠,特别是在SYPROTM Ruby、Cy3和Cy5的发射曲线方面的光谱重叠,不可能在相同的2-DGE凝胶中使用DIGE和SYPROTM Ruby荧光染料。本发明的实施例利用时间尺寸以促进这些方法与标准方案的合并(如图3中举例证明的)。在完成实施例2中所概述的步骤之后,根据实施例1中概述的步骤B和C,在SYPROTM Ruby染色之后定量总蛋白质含量。
实施例4
尽管采用附加的CyDye,例如Cy5.5或Cy7,但本发明促进了4重DIGE分析。采用附加的CyDye-NHS酯共轭物标记第四个样品并采用如实施例2所述的Cy2标记的内标和Cy3和Cy5标记的样品共分离该样品。在掺入Cy7荧光染料的情况下,通过采用波长735nm、脉冲频率40MHz(25ns cycles)和发射滤波器780±30nm(780bp60)的脉冲二极管激光器的激发,将附加的可视化步骤添加到实施例2中。在掺入Cy5.5的情况下,可以应用采用双检测器的替代方法以极大地降低总扫描时间。原理验证测定表明,Cy2和Cy3的激发波长中的重叠足以允许采用490nm的单独的二极管激光器的两种荧光染料的激发。
通过应用二向色滤波器来分离基于波长的发射的光束,通过使用双检测器可以同时检测来自两种荧光染料的发射。由于Cy5和Cy5.5的光谱重叠类似于染料对Cy2/Cy3的光谱重叠,对该染料对还可以应用单独扫描/双检测方法,该方法采用分别与发射滤波器670BP20和710BP40nm组合的640nm脉冲激光器和合适的二向色滤波器。将来自每个检测器/扫描方案的数据输出至多指数荧光衰减拟合软件模块中。计算每个像素的相对于各CyDye的拟合的衰减曲线下的AUC。在每个特定波长的光子水平,衰减曲线的多维拟合促进了背景发射的减除(图6)。将每个X,Y坐标产生的AUC值合并为四个明显重叠的32位灰度tiff文件,从而适合采用具有DIGE功能的2-DGE分析软件分析。
实施例5
本实施例涉及最近公开的测定蛋白硫醇的氧化还原状态的方法的改变,其中Spiess等人(15)利用饱和DIGE复用来检测半胱氨酸在暴露于氧化剂之后的氧化作用或加合形式。简单地说,通过采用非硫脲裂解液(14)的裂解灌洗提取气道上皮蛋白质,并与过量的共轭马来酰亚胺的Cy3标记(250nM Cy3/mg蛋白质;>10倍过量)共同孵育,用于标记减少的硫醇。孵育进行16个小时以保证自由(过量)Cy3标记的完全水解。然后,加入磷酸三丁酯至终浓度为24mM以减少二硫键。采用Cy5马来酰亚胺进行第二个饱和标记反应以便标记减少二硫键的半胱氨酸。如实施例1所述,通过2-DGE分离不同标记的蛋白质样品。在原始方法中,采用利用恒定光源进行激发的Typhoon8600荧光扫描仪(Molecular Dynamics,Sunnyvale,CA,part of GEHealthcare)来定量Cy3和Cy5水平。通过银染(见图1)测定的总蛋白质含量用于标准化。
根据本发明,以上所述方法的灵敏度、特异性和动态范围可以通过将实施例2和实施例3中所述的方案组合得到提高。简单地说,该组合包括采用如实施例2所述的CuTEDGE技术可视化CyDyes,之后,采用如实施例3所述的CuTEDGE SYPROTM Ruby方案来定量总蛋白质含量。
实施例6
通过免疫印迹法,对取自哮喘患者以及健康对照组受试者的支气管肺泡灌洗(BAL)液的蛋白质分析IL-13含量。简单地说,根据生产商的说明(Millipore,Bedfont,OR),采用BioMax离心过滤器对BAL液蛋白质进行浓缩并采用如实施例1所述的2-DGE进行分离。电泳之后,利用ISO-DALT系统将蛋白质转移到Sequi-blotTM聚氟乙烯(PVDF)膜上(孔大小0.2μm),在25mM Tris,192mM甘氨酸,10%(v/v)甲醇中,10℃下,250mA持续19小时。随后,用牛奶蛋白质封闭膜,将PVDF膜与单克隆抗-IL-13第一抗体共同孵育。用共轭Cy5的抗小鼠第二抗体检测第一抗体。
通过640nm脉冲二极管激光器(40MHz)的激发来可视化Cy5标记,并且通过响应速度为50ps的APD检测器和670bp20发射滤波器来定量荧光。将数据输出至能够同时拟合多种衰减算法的多指数荧光衰减拟合软件模块中。计算每个像素的整个衰减曲线下的AUC。衰减曲线的多维拟合便于在每个特定波长的光子水平上,背景发射的减除。将每个X,Y坐标产生的AUC值合并为32位灰度tiff文件,从而适合采用2-DGE分析软件进行分析。
虽然结合特定实施例对本发明进行了描述,应当理解可能有多种改变、修改和实施例,因此,所有这些改变、修改和实施例被认为在本发明的精神和范围内。
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Claims (13)
1.一种双向凝胶电泳图像获取的改进方法,所述方法包括用脉冲激光扫描仪激发与蛋白质结合的荧光染料以便提供逐个像素水平上的荧光寿命成像测定。
2.如权利要求1所述的方法,其中,所述脉冲激光扫描仪是在密封的扫描仪外壳之内进行内部封装的二极管激光器。
3.如权利要求1所述的方法,其中,所述脉冲激光扫描仪通过光缆出口在外部附着以提供使用的激发波长的最佳灵活性。
4.如权利要求1所述的方法,其中,所述方法在改进的现有仪器上进行。
5.如权利要求1所述的方法,其中,所述方法是在完全封闭的扫描系统上进行。
6.如权利要求1所述的方法,进一步包括利用荧光衰减曲线的多指数拟合来分离来源于荧光染料标记的蛋白质种类的荧光和来源于其他来源例如凝胶基质本身、溶液或存在于凝胶中的微粒,或散射效应的荧光,用于随后的背景减除。
7.如权利要求1所述的方法,进一步包括连续使用激发的多激光器波长以促进时间分辨荧光与荧光染料的光谱分离的组合,采用通过光谱分离的复用技术以降低寿命衰减光谱的复杂性。
8.如权利要求7所述的方法,其中,用双荧光寿命成像测定。
9.如权利要求1所述的方法,进一步包括将荧光染料特异性的强度荧光衰减曲线积分以计算曲线下面积。
10.如权利要求1所述的方法,进一步包括将自动化特征和用户容易使用的特征合并。
11.如权利要求10所述的方法,其中,所述自动化特征和用户容易使用的特征包括:获得的单向或双向凝胶电泳的图解算法和定量算法中的至少一种、用于荧光寿命成像分析的自动化方案、背景组分的减除和在双向凝胶电泳中使用的标准荧光染料的荧光染料组分的强度图像的输出。
12.如权利要求1所述的方法,进一步包括将自动化最大化,便于由用户定义的多种不同方案的顺序扫描程序,包括用于复用的多种荧光染料的顺序扫描。
13.如权利要求1所述的方法,进一步包括使用在基于凝胶的蛋白质组学中使用的荧光探针和用于优化扫描时间的变频脉冲激光二极管。
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