KR101758114B1 - 에너지 전이에 따른 형광 수명을 측정하는 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 에너지 전이에 따른 형광 수명을 측정하는 방법에 관한 것으로, (a) 측정 신호로부터 복수의 픽셀 각각에 대한 형광 수명을 산출하는 단계와; (b) 상기 측정 신호로부터 복수의 상기 픽셀 각각에 대한 상기 측정 신호의 유효 면적을 산출하는 단계와; (c) 시료 내의 형광 물질의 에너지 전이 전의 제1 형광 수명과, 상기 형광 물질의 에너지 전이 후의 제2 형광 수명과, 상기 각 픽셀에서의 상기 형광 물질의 에너지 전이 비율을 변수로 하여, 상기 (a) 단계에서 산출된 형광 수명과 상기 (b) 단계에서 산출된 유효 면적을 기 등록된 피팅 방법에 적용하여 상기 제1 형광 수명과 상기 제2 형광 수명을 산출하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다. 이에 따라, 한 지점에 존재하는 형광 물질의 에너지 전이에 따른 에너지 전이 전후의 두 개의 형광 수명을 구분하여 측정할 수 있다.

Description

에너지 전이에 따른 형광 수명을 측정하는 방법{METHOD FOR MEASURING FLUORESCENCE LIFETIME ACCORDING TO ENERGY TRANSFER}
본 발명은 에너지 전이에 따른 형광 수명을 측정하는 방법에 관한 것으로써, 보다 상세하게는 한 지점에 존재하는 형광 물질의 에너지 전이에 따른 에너지 전이 전후의 두 개의 형광 수명을 구분하여 측정할 수 있는 에너지 전이에 따른 형광 수명을 측정하는 방법에 관한 것이다.
세포 내의 특정 분자 또는 단백질의 위치는, 형광 프로브로부터 방출되는 광의 세기를 측정하는 최근 개발된 형광 프로브 및 광학 형광 이미징 기술의 도움을 받아 효과적으로 검출될 수 있다. 그러나 사람들은 생물 시료 내의 특정 분자의 구조적 분포뿐 만 아니라, 불특정 분자 또는 단백질의 기능까지도 알고 싶어한다.
기능적 이미징은, pH, 이온 농도, 산소 포화 정도, 지엽적 압력, 열확산성, 등의 특정 파라미터들을 측량하는 것이다. 한 가지 접근 방법은 방출 스펙트럼이 지엽적 환경에 종속하는 형광 프로브를 이용하고 매개물의 스펙트럼 분해 응답을 분석하는 것이다. 주파수 도메인에서 측정된 프로브의 형광 방출 스펙트럼은 시간 도메인에서 측정 가능한 형광 마커의 이완수명(relaxation lifetime)과 관련이 있다. 그러므로, 시료 내의 프로브 근처의 전기, 화학 또는 기계적 특성과 같은 형광 프로브의 환경이 바뀌면, 프로브의 수명 측정에 의해 시간 도메인에서 검출되거나 프로브의 스펙트럼 측정에 의해 주파수 도메인에서 검출될 수 있다.
형광 프로브의 방출 스펙트럼의 분광 분석은 보통 느리고 시간 소모가 크므로, 형광 프로브의 형광 수명을 측정하는 것에 의해 프로브 근처의 지엽적 환경상태를 얻는 데 많은 노력을 해오고 있다. 이러한 형광수명 이미징 현미경(fluorescence lifetime imaging microscopy, FLIM)은 많은 생물학적 및 생물물리학적 연구들에 좋은 도구로 여겨지고 있다.
프로브의 수명은 형광 분자의 환경에 쉽게 영향받을 수 있으므로, FLIM 화상들은 이온, pH, 산소 농도와 같은 생물 시료의 전기적, 화학적, 생물학적 특성에 대한 정보를 얻는 데 사용된다. 보통 이온 또는 pH의 지엽적 농도는 형광 세기가 목표 분자의 농도에 비례하는 특정 형광 프로브를 이용하는 공촛점 현미경에 의해 측정된다.
하지만, 형광 세기는 감지하는 형광 프로브의 지엽적 농도 차이 및 광표백과 같은 다른 효과들에 쉽게 영향을 받을 수 있다. 형광 세기에 기초하는 기능적 이미징 기술과는 달리, 형광 수명 측정을 이용하는 기능적 이미징 방법은 광표백 또는 형광광자(fluorophores)의 불규칙한 농도에 둔감한 특성을 갖는다.
이와 같은 형광 수명을 측정하는 기술로 한국등록특허 제10-0885927호에 개시된 '형광수명 측정 방법 및 장치'와 한국등록특허 제10-1209230호에 개시된 '형광수명 측정장치 및 방법'이 있다.
형광분자에서 전자는 여기광에 의해 여기된 후에 여기 상태 (Excited state)에서 일정시간 머물다가 바닥상태로 전이되면서 형광 광자를 생성하게 되는데, 이때 전자가 광자로 전이되는 시간에 대한 확률 분포 함수는 전자의 여기가 이루어진 시점을 기준으로 지수함수(Exponential function)적으로 분포 한다.
형광 수명은 여기된 전자의 바닥상태로의 전이시간에 대한 평균 시간으로 정의되며, 이는 형광 분자의 여기 상태 폭과 관련이 있어, 형광 분자의 고유 특성을 반영한다. 따라서, 형광 수명 정보는 형광 물질의 농도와 무관하게 형광 물질 고유의 특성을 알게 해준다.
도 1의 (a)는 형광 수명이 2 ns일 때의 이상적인 지수 함수를 나타낸 것이다. 도 1의 (a)에 도시된 바와 같이, 형광 세기가 다르더라도 형광 수명은 변하지 않으므로 형광 물질의 농도와 무관하게 형광 물질 고유의 특성 정보를 획득할 수 있다.
도 1의 (b)에 도시된 바와 같이, 특정 형광 물질은 그 주변 환경과의 에너지 전이를 통해 형광 수명이 변하게 되는 특성을 갖는다. 이와 같은 에너지 전이를 이용한 기술로 퓌스터 공진 에너지 전이(Foster resonance energy transfer : FRET) 기술이 있다.
즉, 관계를 규명하고자 하는 단백질 A와 단백질 B가 존재하는 경우, 단백질 A에 제1 표지자를 붙이고, 단백직 B에 제2 표지자와 에너지 전이 관계를 갖는 제2 표지자를 붙힌 후, 반응이 일어나기 전과 일어난 후의 제1 표지자의 형광 수명을 측정하게 되면, 단백질 간의 반응 정도와 반응이 일어난 거리 등의 정보를 알아낼 수 있다.
단백질의 크기는 수 nm에서 수십 nm의 크기를 가지고 있어 일반 현미경으로는 관찰이 불가능한데, 형광 수명을 이용하는 경우 일반 현미경으로는 불가능한 정보를 규명할 수 있어, 의학 및 생명공학 분야에서 그 파급효과가 큰 기술이라 할 수 있다. 이 때, 측정 영역 내부에는 반응이 일어난 단백질과 반응이 일어나지 않은 단백질들이 섞여 있으며, 정확한 분석을 위해서는 두 개의 형광 수명 정보, 즉 반응이 일어난 단백질의 형광 수명 정보와, 반응이 일어나지 않은 형광 수명 정보를 구분해야 할 필요가 있다.
상기 한국등록특허 제10-1209230호에 개시된 방법을 살펴보면, 형광 펄스 신호의 평균 시간과, 시스템 임펄스 응답 함수의 평균 시간 간의 편차를 이용하여 형광 수명값을 계산하는 방법을 제안하고 있다. 이는 [수학식 1]과 같이 표현될 수 있으며, 도 2는 이를 도식적으로 설명한 도면이다.
[수학식 1]
Figure 112015116628813-pat00001
여기서, ie(t)는 측정된 형광 펄스 신호이고, iirf(t)는 측정 시스템의 시스템 임펄스 응답 함수(Impulse response function, IRF)이다. <Te>와 <Te 0>는 각각 형광 펄스 신호의 평균 시간과, 시스템 임펄스 응답 함수의 평균 시간으로 정의된다.
그런데, 상기의 한국등록특허를 비롯한 기존의 형광 수명을 측정하는 기술은 형광 수명 정보를 가지고 있는 형광인자가 하나있을 때, 정확한 형광 수명 정보를 추출하게 되고, 두 개 이상의 형광 수명 정보로 구성되는 형광인자가 존재할 경우, 두 형광수명의 평균값 만이 측정되는 단점이 있다.
근래에, 형광 물질의 에너지 전이 특성을 이용하여, 생체세포 및 조직의 중요한 생명활동 기작을 규명하는 연구들이 많이 이루어지고 있다. 이 때, 한 지점 안에서 에너지 전이 전의 형광 물질과, 에너지 전이 후의 형광 물질이 공존할 수 있기 때문에, 정확한 분석을 위해서는 두 상태의 형광 수명 정보를 구분할 수 있는 기술이 요구되고 있다.
이에, 본 발명은 상기와 같은 문제점을 해소하기 위해 안출된 것으로서, 한 지점에 존재하는 형광 물질의 에너지 전이에 따른 에너지 전이 전후의 두 개의 형광 수명을 구분하여 측정할 수 있는 에너지 전이에 따른 형광 수명을 측정하는 방법에 관한 것이다.
상기 목적은 본 발명에 따라, (a) 측정 신호로부터 복수의 픽셀 각각에 대한 형광 수명을 산출하는 단계와; (b) 상기 측정 신호로부터 복수의 상기 픽셀 각각에 대한 상기 측정 신호의 유효 면적을 산출하는 단계와; (c) 시료 내의 형광 물질의 에너지 전이 전의 제1 형광 수명과, 상기 형광 물질의 에너지 전이 후의 제2 형광 수명과, 상기 각 픽셀에서의 상기 형광 물질의 에너지 전이 비율을 변수로 하여, 상기 (a) 단계에서 산출된 형광 수명과 상기 (b) 단계에서 산출된 유효 면적을 기 등록된 피팅 방법에 적용하여 상기 제1 형광 수명과 상기 제2 형광 수명을 산출하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 에너지 전이에 따른 형광 수명을 측정하는 방법에 의해서 달성된다.
여기서, 상기 피팅 방법은 최소자승(Least-square) 피팅 방법을 포함할 수 있다.
또한, 상기 최소자승(Least-square) 피팅 방법에는 수학식
Figure 112015116628813-pat00002
(여기서, χ2은 최소자승 피팅 에러(Least-square fitting error)이고, αm, τq는 각각 상기 최소자승(Least-square) 피팅 방법에 적용될 가상의 변수이고, τavg,exp은 상기 (a) 단계에서 산출된 평균 수명이고, Aeff,exp은 상기 (b) 단계에서 산출된 유효 면적이고, τavg,m은 상기 가상의 변수로부터 산출되는 평균 수명이고, Aeff,m은 상기 가상의 변수로부터 산출되는 유효 면적이다)가 적용되어, 상기 최소자승 피팅 에러(Least-square fitting error)가 최소가 되게 하는 상기 가상의 변수를 상기 제1 형광 수명 및 상기 제2 형광 수명으로 산출될 수 있다.
그리고, 상기 측정 신호는 상기 시료에 여기광을 조사하여 수집되는 형광 광자로부터 측정되는 형광 펄스 신호와, 여기광이 상기 시료를 거치지 않고 측정된 시스템 임펄스 응답 신호를 포함하며; 상기 (a) 단계에서 형광 수명은 상기 형광 펄스 신호의 평균 시간과 상기 시스템 임펄스 응답 신호의 평균 시간 간의 편차에 의해 산출될 수 있다.
그리고, 상기 τavg,m은 수학식
Figure 112015116628813-pat00003
(여기서, n는 픽셀 넘버이고, αn은 n 번째 픽셀에서의 전체 형광 펄스 신호 대비 에너지 전이가 되지 않은 형광 펄스 신호 크기의 비율에 대한 가상의 변수이고, τ1은 상기 제1 형광 수명에 대응하는 가상의 변수이고, τ2는 상기 제2 형광 수명에 대응하는 가상의 변수이다)로 정의될 수 있다.
그리고, 상기 Aeff,m은 상기 시스템 임펄스 응답 신호와 상기 가상의 변수가 적용된 지수함수가 합성곱(Convolution)된 신호로부터 산출될 수 있다.
그리고, 상기 Aeff,m은
Figure 112015116628813-pat00004
(여기서,
Figure 112015116628813-pat00005
는 상기 가상의 변수가 적용된 상기 지수함수이고, iirf(t)는 상기 시스템 임펄스 응답 신호이고, αn은 n 번째 픽셀에서의 전체 형광 펄스 신호 대비 에너지 전이가 되지 않은 형광 펄스 신호 크기의 비율에 대한 가상의 변수이고, τ1은 상기 제1 형광 수명에 대응하는 가상의 변수이고, τ2는 상기 제2 형광 수명에 대응하는 가상의 수명이다)로 정의될 수 있다.
또한, 상기 τavg,m은 수학식
Figure 112015116628813-pat00006
(여기서, n는 픽셀 넘버이고, αn은 n 번째 픽셀에서의 전체 형광 펄스 신호 대비 에너지 전이가 되지 않은 형광 펄스 신호 크기의 비율에 대한 가상의 변수이고, τn1은 n 번째 픽셀에서의 상기 제1 형광 수명에 대응하는 가상의 변수이고, τn2는 n 번째 픽셀에서의 상기 제2 형광 수명에 대응하는 가상의 변수이다)로 정의되며; 상기 최소자승(Least-square) 피팅 방법은 픽셀 단위로 수행되어 상기 픽셀 단위로 상기 제1 형광 수명 및 상기 제1 형광 수명이 산출될 수 있다.
그리고, 상기 Aeff,m은 상기 시스템 임펄스 응답 신호와 상기 가상의 변수가 적용된 지수함수가 합성곱(Convolution)된 신호로부터 산출될 수 있다.
그리고, 상기 Aeff,m은
Figure 112015116628813-pat00007
(여기서,
Figure 112015116628813-pat00008
는 상기 가상의 변수가 적용된 상기 지수함수이고, iirf(t)는 상기 시스템 임펄스 응답 신호이고, αn은 n 번째 픽셀에서의 전체 형광 펄스 신호 대비 에너지 전이가 되지 않은 형광 펄스 신호 크기의 비율에 대한 가상의 변수이고, τn1은 n 번째 픽셀에서의 상기 제1 형광 수명에 대응하는 가상의 변수이고, τn2는 n 번째 픽셀에서의 상기 제2 형광 수명에 대응하는 가상의 변수이다)로 정의될 수 있다.
상기와 같은 구성에 따라, 본 발명에 따르면 한 지점에 존재하는 형광 물질의 에너지 전이에 따른 에너지 전이 전후의 두 개의 형광 수명을 구분하여 측정할 수 있는 에너지 전이에 따른 형광 수명을 측정하는 방법이 제공된다.
또한, 본 발명에 따르면 측정 지점, 즉 픽셀 단위로 형광 수명이 상이한 경우에도 각각의 픽셀 단위로 두 개의 형광 수명을 구분하여 측정 가능하게 된다.
도 1은 형광 수명의 특성을 설명하기 위한 도면이고,
도 2는 종래의 형광 수명을 측정하는 방법을 설명하기 위한 도면이고,
도 3은 본 발명에 따른 형광 수명 측정 시스템의 구성을 나타낸 도면이고,
도 4는 본 발명에 따른 형광 수명을 측정하는 방법을 설명하기 위한 제어 흐름도이고,
도 5는 본 발명에 따른 형광 수명을 측정하는 방법에서 제1 형광 수명, 제2 형광 수명, 에너지 전이 비율 간의 관계를 설명하기 위한 도면이고,
도 6 및 도 7은 본 발명에 따른 형광 수명을 측정하는 방법의 효과를 설명하기 위한 시뮬레이션 결과를 나타낸 도면이다.
이하에서는 첨부된 도면들을 참조하여 본 발명에 따른 실시예들에 대해 상세히 설명한다.
도 3은 본 발명에 따른 형광 수명 측정 시스템(100)의 구성을 나타낸 도면이다. 도 3을 참조하여 설명하면, 본 발명에 따른 형광 수명 측정 시스템(100)은 광원부(110), 형광 수명 측정 광학계(120) 및 형광 수명 측정부(130)를 포함한다.
광원부(110)는 시료를 향해 여기광을 조사한다. 본 발명에서는 광원부(110)가 시간에 대한 펄스 형태의 레이저 광을 조사하는 것을 예로 한다. 형광 수명 측정 광학계(120)는 광원부(110)로부터 조사된 여기광을 시료에 조사하고, 시료로부터 반사된 광, 예를 들어 시료 내의 형광 물질로부터 방출되는 형광 광자를 형광 수명 측정부(130)로 향하게 한다.
여기서, 형광 수명 측정 광학계(120)는 다양한 형태로 마련될 수 있는데, 일 예로 한국등록특허 제10-1209230호에 개시된 바와 같이, 다수의 광학 렌즈, 대역통과 필터, 다이크로익 필터(Dichroic filter)로 구성될 수 있다.
형광 수명 측정부(130)는 시료로부터 방출되어 형광 수명 측정 광학계(120)를 통해 들어오는 형광 광자를 수신하여 전기적인 측정 신호를 생성한다. 본 발명에 일 실시예에 따른 형광 수명 측정부(130)는 광 검출기(131), 증폭기(133) 및 디지타이저(134)를 포함하는 것을 예로 한다. 또한, 형광 수명 측정부(130)는 광 검출기(131)와 증폭기(133) 사이에 마련되는 필터(132)를 포함하여 구성될 수 있다.
광 검출기(131)는 형광 수명 측정 광학계(120)를 통과한 형광 광자를 수집하고, 수집된 형광 광자에 반응하여 전기적 신호인 측정 신호로 전환한다. 그리고, 광 검출기(131)에 의해 전환된 측정 신호는 필터(132)를 통과한다.
본 발명에서는 필터(132)로 전기적 가우시안 저역 통과 필터(132)가 사용되는 것을 예로 하는데, 전기적 가우시안 저역 통과 필터(132)는 시그널 복원을 위해 샘플링 주파수를 고려한 것이다.
보다 구체적으로 설명하면, 전기적 가우시안 저역 통과 필터(132)는 빔 스플리터, 즉 다이크로익 필터(Dichroic filter)로부터의 여기 펄스 신호를 소량 추출해 내는데 사용되는데, 스펙트럼적으로 여과된 순수한 형광신호는 광 검출기(131) 내로 주입되고, 전기적 펄스 신호로 변환된다. 광 검출기(131)로부터의 전기적 펄스 신호는 전자적 가우시안 저역 통과 필터(132)에 의해 시간적으로 증폭된다. 전기적 가우시안 저역 통과 필터(132)는 샘플링 속도가 상대적으로 느린 DAQ 보드가 시스템에 사용되더라도 빠른 형광 신호 수명을 측정 가능하게 한다.
전자적 가우시안 저역 통과 필터(132)를 통과한 전기 신호는 증폭기(133)에 의해 증폭된다. 그리고, 전기적으로 전이되고 증폭된 전기 신호는 디지타이저(134)에 의해 복원되고, 디지타이저(134)에 의해 복원된 신호를 분석하여 형광 수명이 측정된다.
이하에서는, 도 4 내지 도 ?을 참조하여, 상기와 같은 구성을 이용하여 형광 수명을 측정하는 방법에 대해 상세히 설명한다.
먼저, 측정 신호로부터 복수의 픽셀 각각에 대한 형광 수명을 산출한다(S40). 그리고, 측정 신호로부터 픽셀 각각에 대한 측정 신호의 유효 면적을 산출한다(S41).
그런 다음, 시료 내의 형광 물질의 에너지 전이 전의 제1 형광 수명과, 형광 물질의 에너지 전이 후의 제2 형광 수명, 그리고, 각 픽셀에서의 형광 물질의 에너지 전이 비율을 변수로 하여, S40 단계에서 산출된 형광 수명과, S41 단계에서 산출된 유효 면적을 기 등록된 피팅 방법에 적용하여 제1 형광 수명과 제2 형광 수명을 산출한다(S40).
이하에서는 상술한 과정을 통한 형광 수명을 측정하는 방법에 적용되는 원리에 대해 설명한다.
하나의 측정 지점에서 두 개의 형광 수명 정보, 즉 제1 형광 수명 정보가 함께 존재하는 경우, 형광 수명 측정 시스템(100)을 통해 측정된 형광 펄스 신호는 [수학식 2]와 같이 표현될 수 있다.
[수학식 2]
Figure 112015116628813-pat00009
[수학식 2]에서 ie(t)는 측정된 형광 펄스 신호로 신호의 세기 정보를 가지며, h(t)와, iirf(t)는 형광 수명 측정 시스템(100)의 시스템 임펄스 응답 함수(Impulse response function, IRF), 즉 시스템 임펄스 응답 신호(이하, '시스템 임펄스 응답 신호'라 함)이고, f(t)는 시스템 임펄스 응답이 고려되지 않은 순수한 형광 펄스 신호이다.
τ1은 제1 형광 수명을 나타내는 것으로, 시료 내의 형광 물질의 에너지 전이 전의 형광 수명, 즉 에너지 전이가 일어나지 않은 형광 물질의 형광 수명을 나타낸다. 또한, τ2는 제2 형광 수명을 나타내는 것으로, 시료 내의 형광 물질의 에너지 전이 후의 형광 수명, 즉 에너지 전이가 일어난 형광 물질의 형광 수명을 나타낸다. 그리고, αn은 n번째 측정 지점, 즉 n 번째 픽셀에서 형광 물질의 에너지 전이 비율(이하, '에너지 전이 비율'이라 함)을 나타내는 것으로, n 번째 픽셀에서 전체 형광 펄스 신호 대비 에너지 전이가 되지 않은 형광 펄스 신호 크기의 비율을 나타낸다.
본 발명에서는 시료에 여기광을 조사하여 수집되는 형광 광자로부터 측정되는 형광 펄스 신호와, 여기광이 시료를 거치지 않고 측정된 시스템 임펄스 응답 신호를 형광 수명 측정 시스템(100)을 통해 측정한다. 여기서, 형광 펄스 신호와 시스템 임펄스 응답 신호를 측정하는 방법은 한국등록특허 제10-0885927호에 개시되어 있는 바, 그 상세한 설명은 생략하며, 한국등록특허 제10-0885927호에 개시된 방법 이외의 방법도 적용 가능함은 물론이다.
여기서, 본 발명에 따른 형광 수명을 측정하는 방법에서, S40 단계에서 측정되는 형광 신호는 한국등록특허 제10-0885927호에 개시된 측정 방법이 적용되는 것을 예로 한다. 즉, [수학식 1]에서와 같이, 형광 펄스 신호의 평균 시간과 시스템 임펄스 응답 신호의 평균 시간의 편차를 이용하여 산출하는 것을 예로 한다.
이 때, 형광 펄스 신호와 시스템 임펄스 응답 신호의 평균 시간의 편차를 이용하여 산출되는 형광 수명(이하, '측정 형광 수명'이라 함)은, [수학식 2]에 나타낸 바와 같은 제1 형광 수명과 제2 형광 수명이 혼재된 상태의 값으로 본 발명에서는 형광 수명 측정 시스템(100)을 통해 측정된 측정 형광 수명을 이용하여 제1 형광 수명과 제2 형광 수명을 산출하게 된다.
여기서, 측정 형광 수명은 제1 형광 수명, 제2 형광 수명, 그리고 에너지 전이 비율에 의해 [수학식 3]과 같이 나타낼 수 있고, 도 5는 이를 도식적으로 나타내고 있다. 여기서, n, τ1, τ2, αn은 상술한 [수학식 2]에서와 동일하여, τavg,n은 n 번째 픽셀에서의 측정 형광 수명이다.
[수학식 3]
Figure 112015116628813-pat00010
그런데, [수학식 3]에서 n개의 픽셀을 통해 얻어지는 방정식은 n개이나, 미지수는 n+2개가 되므로, 본 발명에서는 S41 단계에서와 같이 측정 신호의 유효 면적 정보를 함께 적용하여 피팅 방법을 통해 미지수를 산출한다.
먼저, 형광 펄스 신호는 [수학식 2]와 같이 나타낼 수 있음은 상술한 바와 같다. 유효 면적의 산출은 [수학식 2]의 적분을 통해 가능하며, 이는 [수학식 3]과 같이 나타날 수 있다.
[수학식 4]
Figure 112015116628813-pat00011
[수학식 4]에서 Aeff,n는 측정된 유효 면적(이하, '측정 유효 면적'이라 함)으로, 측정 신호 중 형광 펄스 신호로부터 각 픽셀에 대해 산출되며, [수학식 4]은 산출된 측정 유효 면적과 제1 형광 신호, 제2 형광 신호 및 에너지 전이 비율과의 관계를 나타내고 있다.
상기와 같이, 측정 평균 수명과, 측정 유효 면적, 그리고, 제1 형광 신호, 제2 형광 신호 및 에너지 전이 비율과의 관계를 이용하여, 제1 형광 신호, 제2 형광 신호 및 에너지 전이 비율을 변수로 하여, 최소자승(Least-square) 피팅 방법이 적용하게 되면, [수학식 5]와 같이 표현될 수 있다.
[수학식 5]
Figure 112015116628813-pat00012
[수학식 5]에서, χ2은 최소자승 피팅 에러(Least-square fitting error)이고, αm, τq는 각각 최소자승(Least-square) 피팅 방법에 적용될 가상의 변수이고, τavg,exp은 측정 평균 수명이고, Aeff,exp은 측정 유효 면적이고, τavg,m은 가상의 변수로부터 산출되는 평균 수명이고, Aeff,m은 가상의 변수로부터 산출되는 유효 면적이다)이다.
τavg,m은 [수학식 3]이 반영되고, 이 때, [수학식 3]의 αn은 n 번째 픽셀에서의 전체 형광 펄스 신호 대비 에너지 전이가 되지 않은 형광 펄스 신호 크기의 비율, 즉 에너지 전이 비율에 대한 가상의 변수가 되고, τ1은 제1 형광 수명에 대응하는 가상의 변수가 되고, τ2는 제2 형광 수명에 대응하는 가상의 변수가 된다.
그리고, Aeff,m으로는 시스템 임펄스 응답 신호와 가상의 변수가 적용된 지수함수가 합성곱(Convolution)된 신호, 즉 [수학식 4]가 적용된다.
[수학식 5]에 나타난 바와 같이, 각 픽셀에 대한 측정 평균 신호와, 측정 유효 면적, 그리고 가상의 변수에 임의의 값들을 적용하고, 이를 M회 수행하면서 최소자승 피팅 에러(Least-square fitting error)가 최소가 되게 하는 가상의 변수, 즉 τ1과 τ2를 각각 제1 형광 수명 및 제2 형광 수명으로 산출하게 된다.
도 6 및 도 7은 본 발명에 따른 형광 수명을 측정하는 방법의 효과를 검증하기 위한 몬테 카를로 시뮬레이션(Monte Carlo Simulation) 결과를 설명하기 위한 도면이다.
몬테 카를로 시뮬레이션(Monte Carlo Simulation)을 위해, τ1 = 1ns, τ2 = 2ns를 갖는 지수함수에 대한 확률분포함수로부터 랜덤 변수를 생성하고, 실제 측정된 시스템 임펄스 응답 신호와 컨볼루션을 취해 실제 형광 펄스 신호와 유사한 신호를 생성하였다. 그리고, 각 픽셀에서의 τ1과 τ2의 비율이 0.2~0.8 사이에 있도록 시뮬레이션 신호를 생성하고, 이 신호로부터 평균 수명과 유효 면적을 산출하였다. 또한, 최소자승(Least-square) 피팅 방법을 위한 가상의 변수는 τ1 = 0.6~1.4ns, τ2 = 1.6~2.4ns, αn = 0~1로 설정하였다.
도 6은 몬테 카를로 시뮬레이션(Monte Carlo Simulation) 결과로, 최소자승 피팅 에러(Least-square fitting error)를 나타낸 것이고, 도 7은 도 6의 동그라미 부분을 확대한 도면이다. 그리고, [표 1]는 도 7의 각 케이스에 적용된 가상의 변수를 나타내고 있다.
[표 1]
Figure 112015116628813-pat00013
그리고, 측정 평균 수명, 그리고, 피팅 방법을 통해 산출된 제1 평균 수명 및 제2 평균 수명을 이용하여 에너지 천이 비율 αn의 산출이 가능하게 된다.
위 시뮬레이션 결과에서 확인할 수 있듯이, 본 발명에 따른 형광 수명을 측정하는 방법을 통해, 2% 이내의 오차 범위를 갖는 제1 형광 수명, 제2 형광 수명 및 에너지 천이 비율을 산출 가능하게 된다.
전술한 실시예에서는, 전체 픽셀에서 제1 형광 수명은 동일하고, 제2 형광 수명도 동일한 경우를 예로 하여 설명하였다. 반면, 본 발명에 따른 형광 수명을 측정하는 방법은 제1 형광 수명 각각와 제2 형광 수명 각각이 픽셀마다 상이한 경우에도 적용이 가능하다.
이 경우, [수학식 3]은 [수학식 6]과 같이 나타낼 수 있다.
[수학식 6]
Figure 112015116628813-pat00014
[수학식 6]에서, αn은 n 번째 픽셀에서의 에너지 전이 비율이고, τn1은 n 번째 픽셀에서의 제1 형광 수명이고, τn2는 n 번째 픽셀에서의 제2 형광 수명이다.
마찬가지로, [수학식 4]는 [수학식 7]과 같이 나타낼 수 있다.
[수학식 7]
Figure 112015116628813-pat00015
이 때, 최소자승(Least-square) 피팅 방법은 픽셀 단위로 수행되어 각 픽셀 단위로 제1 형광 수명과 제2 형광 수명이 산출 가능하게 된다.
본 실시예는 본 발명에 포함되는 기술적 사상의 일부를 명확하게 나타낸 것에 불과하며, 본 발명의 명세서에 포함된 기술적 사상의 범위 내에서 당업자가 용이하게 유추할 수 있는 변형 예와 구체적인 실시예는 모두 본 발명의 기술적 사상에 포함되는 것은 자명하다.
100 : 형광 수명 측정 시스템 110 : 광원부
120 : 형광 수명 측정 광학계 130 : 형광 수명 측정부
131 : 광 검출기 132 : 필터
133 : 증폭기 134 : 디지타이저

Claims (10)

  1. (a) 측정 신호로부터 복수의 픽셀 각각에 대한 형광 수명을 산출하는 단계와;
    (b) 상기 측정 신호로부터 복수의 상기 픽셀 각각에 대한 상기 측정 신호의 유효 면적을 산출하는 단계와;
    (c) 시료 내의 형광 물질의 에너지 전이 전의 제1 형광 수명과, 상기 형광 물질의 에너지 전이 후의 제2 형광 수명과, 상기 각 픽셀에서의 상기 형광 물질의 에너지 전이 비율을 변수로 하여, 상기 (a) 단계에서 산출된 형광 수명과 상기 (b) 단계에서 산출된 유효 면적을 기 등록된 피팅 방법에 적용하여 상기 제1 형광 수명과 상기 제2 형광 수명을 산출하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 에너지 전이에 따른 형광 수명을 측정하는 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 피팅 방법은 최소자승(Least-square) 피팅 방법을 포함하는 것을 특징으로 하는 에너지 전이에 따른 형광 수명을 측정하는 방법.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 최소자승(Least-square) 피팅 방법에는 수학식
    Figure 112015116628813-pat00016

    (여기서, χ2은 최소자승 피팅 에러(Least-square fitting error)이고, αm, τq는 각각 상기 최소자승(Least-square) 피팅 방법에 적용될 가상의 변수이고, τavg,exp은 상기 (a) 단계에서 산출된 평균 수명이고, Aeff,exp은 상기 (b) 단계에서 산출된 유효 면적이고, τavg,m은 상기 가상의 변수로부터 산출되는 평균 수명이고, Aeff,m은 상기 가상의 변수로부터 산출되는 유효 면적이다)가 적용되어, 상기 최소자승 피팅 에러(Least-square fitting error)가 최소가 되게 하는 상기 가상의 변수를 상기 제1 형광 수명 및 상기 제2 형광 수명으로 산출되는 것을 특징으로 하는 에너지 전이에 따른 형광 수명을 측정하는 방법.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 측정 신호는
    상기 시료에 여기광을 조사하여 수집되는 형광 광자로부터 측정되는 형광 펄스 신호와,
    여기광이 상기 시료를 거치지 않고 측정된 시스템 임펄스 응답 신호를 포함하며;
    상기 (a) 단계에서 형광 수명은 상기 형광 펄스 신호의 평균 시간과 상기 시스템 임펄스 응답 신호의 평균 시간 간의 편차에 의해 산출되는 것을 특징으로 하는 에너지 전이에 따른 형광 수명을 측정하는 방법.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 τavg,m은 수학식
    Figure 112015116628813-pat00017

    (여기서, n는 픽셀 넘버이고, αn은 n 번째 픽셀에서의 전체 형광 펄스 신호 대비 에너지 전이가 되지 않은 형광 펄스 신호 크기의 비율에 대한 가상의 변수이고, τ1은 상기 제1 형광 수명에 대응하는 가상의 변수이고, τ2는 상기 제2 형광 수명에 대응하는 가상의 변수이다)로 정의되는 것을 특징으로 하는 에너지 전이에 따른 형광 수명을 측정하는 방법.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 Aeff,m은 상기 시스템 임펄스 응답 신호와 상기 가상의 변수가 적용된 지수함수가 합성곱(Convolution)된 신호로부터 산출되는 것을 특징으로 하는 에너지 전이에 따른 형광 수명을 측정하는 방법.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 Aeff,m은
    Figure 112015116628813-pat00018

    (여기서,
    Figure 112015116628813-pat00019
    는 상기 가상의 변수가 적용된 상기 지수함수이고, iirf(t)는 상기 시스템 임펄스 응답 신호이고, αn은 n 번째 픽셀에서의 전체 형광 펄스 신호 대비 에너지 전이가 되지 않은 형광 펄스 신호 크기의 비율에 대한 가상의 변수이고, τ1은 상기 제1 형광 수명에 대응하는 가상의 변수이고, τ2는 상기 제2 형광 수명에 대응하는 가상의 수명이다)로 정의되는 것을 특징으로 하는 에너지 전이에 따른 형광 수명을 측정하는 방법.
  8. 제4항에 있어서,
    상기 τavg,m은 수학식
    Figure 112015116628813-pat00020

    (여기서, n는 픽셀 넘버이고, αn은 n 번째 픽셀에서의 전체 형광 펄스 신호 대비 에너지 전이가 되지 않은 형광 펄스 신호 크기의 비율에 대한 가상의 변수이고, τn1은 n 번째 픽셀에서의 상기 제1 형광 수명에 대응하는 가상의 변수이고, τn2는 n 번째 픽셀에서의 상기 제2 형광 수명에 대응하는 가상의 변수이다)로 정의되며;
    상기 최소자승(Least-square) 피팅 방법은 픽셀 단위로 수행되어 상기 픽셀 단위로 상기 제1 형광 수명 및 상기 제1 형광 수명이 산출되는 것을 특징으로 하는 에너지 전이에 따른 형광 수명을 측정하는 방법.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 Aeff,m은 상기 시스템 임펄스 응답 신호와 상기 가상의 변수가 적용된 지수함수가 합성곱(Convolution)된 신호로부터 산출되는 것을 특징으로 하는 에너지 전이에 따른 형광 수명을 측정하는 방법.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 Aeff,m은
    Figure 112015116628813-pat00021

    (여기서,
    Figure 112015116628813-pat00022
    는 상기 가상의 변수가 적용된 상기 지수함수이고, iirf(t)는 상기 시스템 임펄스 응답 신호이고, αn은 n 번째 픽셀에서의 전체 형광 펄스 신호 대비 에너지 전이가 되지 않은 형광 펄스 신호 크기의 비율에 대한 가상의 변수이고, τn1은 n 번째 픽셀에서의 상기 제1 형광 수명에 대응하는 가상의 변수이고, τn2는 n 번째 픽셀에서의 상기 제2 형광 수명에 대응하는 가상의 변수이다)로 정의되는 것을 특징으로 하는 에너지 전이에 따른 형광 수명을 측정하는 방법.
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