JP5068388B2 - 累積時間分解発光二次元ゲル電気泳動法 - Google Patents
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Description
この分野の多くの従来技術は分子間相互作用、分子安定性、または分子内配列変化の研究のための蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)技術に関係し、またいくつかの技術は蛍光寿命画像化(FLIM)に関係する。これらはポリメラーゼ連鎖反応(polymerized chain reaction)(PCR)生成物の監視を含み(Rintamaki S.他、Journal of microbiological methods, (2002 Aug), Vol.50, No.3, pp.313-8)、他のものはDNAシークエンシングのベースコーリング用である(Lassiter S. J.他、Analytical chemistry, 2000 Nov 1, Vol.72, No.21, pp.5373-82)。これらの著者たちは、自動化されたDNAシーケンサ内の顕微鏡ヘッドを改造して近赤外時間分解蛍光寿命測定が可能になるようにした。したがって、この計器の設計、能力、および使用方法は本発明とは全く異なる性格のものであった。
今日、ゲルベースのプロテオミクスに用いる種々の蛍光プローブに広範囲の蛍光寿命が利用できるので、スキャン時間の最適化のための可変周波数パルスレーザダイオードは本発明の別の実施の形態である。
この点で、本発明の少なくとも1つの実施の形態を詳細に説明する前に、本発明はその応用の際に、以下の記述で説明しまたは図面に示す構造の詳細や構成要素の配置に限定されないことを理解すべきである。本発明は他の実施の形態が可能であり、また種々の方法で実現しまた実施することができる。また理解されるように、ここに用いる表現および用語は説明のためのものであって、制限するものと見なしてはならない。
したがって、上に述べたことは本発明の原理の単なる例示と見なすべきである。更に、多くの修正および変更は当業者にすぐに思い浮かべられるので、図示し説明した構造および動作に本発明を厳密に限定することは望ましくなく、したがって、全ての適当な修正および同等物は本発明の範囲内に入るものとする。
この例では、タンパク質をまずラットの気道から溶解洗浄により隔離する(文献14)。これは、2−DGE互換の尿素ベース溶解バッファ(7M尿素、2Mチオ尿素、4%w/vCHAPS、0.5%トリトンX100、2%v/vプロテアーゼ阻害剤カクテル)内の気道上皮プロテオームを瞬時に可溶性にする隔離法である。サンプルのタンパク質濃度はブラッドフォード(Bradford)の方法を用いて決定し、2−DGEを用いて分離する。400μgのタンパク質/サンプルの部分標本を溶解バッファで350μlまで希釈し、適当なpH範囲用のIPGバッファを1%v/vの最終濃度になるまで加える。タンパク質サンプルを室温で一晩再水和によりIPGストリップ(GE Healthcare)の上にロードして、MultiphorII電気泳動ユニットおよびEPS3501XL電源を20℃で用いて、次の勾配プロトコル(0−50Vで1分、50Vで1時間、50−1000Vで3時間、1000−3500Vで3時間、3500Vで19時間(全部で74.9kVh)で等電点電気泳動法(IEF)を行う。
喫煙者および喫煙未経験者から気管支肺胞洗浄により隔離したマクロファージを、2−DGE溶解バッファを用いて可溶性にする(例1参照)。研究に含まれた全ての人からの同じ量のタンパク質をプールして内部標準を作成し、メーカの推薦(GE Healthcare,Uppsala,Sweden)に従ってNHSエステル共役Cy2(最小DIGE試薬)で標識を付ける。喫煙者および喫煙未経験者からのタンパク質サンプルを無作為に2つのグループに分け、Cy3およびCy5最小DIGE試薬でそれぞれ標識を付ける。例1に述べたプロトコルに従って、2−DGEゲル上でCy2標識化内部標準を1つのCy3および1つのCy5標識化サンプルと共に分離する。3つの異なるタンパク質標識を、スペクトルおよび時間分解蛍光の組合せを用いた3つの異なるスキャニングプロトコルの自動化されたシーケンスで次のように可視化する。
B)Cy3蛍光色素(サンプル)を、波長532nm、パルスレート40MHz(25nsサイクル)のパルスダイオードレーザで励起する。50psの応答速度を持つAPD検出器を用いて発光を検出し、580±10nm(580bp20)の帯域エミッション・フィルタを適用する。
C)Cy5蛍光色素(サンプル)を、波長640nm、パルスレート40MHz(25nsサイクル)のパルスダイオードレーザで励起する。50psの応答速度を持つAPD検出器を用いて発光を検出し、670±10nm(670bp20)の帯域エミッション・フィルタを適用する。
例2に述べたプロトコルの追加のステップとしてSYPRO(TM)Ruby染色を行って、DIGEゲル内の全タンパク質含有量の定量化を容易にする。現在の技術では、スペクトルが重なるために(特にSYPRO(TM)Ruby、Cy3、およびCy5の発光曲線に関して)、DIGEとSYPRO(TM)Ruby蛍光色素とを同じ2−DGEゲル内で用いることができない。本発明の実施の形態は時間次元を用いて、これらを標準プロトコルに合併するのを容易にする(図3に例示するように)。例2に概説した手続きが終了した後、全タンパク質含有量を定量化するためのSYPRO(TM)Ruby染料を用いる後染色を、例1に概説したステップBおよびCに従って行う。
本発明では、Cy5.5またはCy7などの追加のCyDyeを用いた4重化DIDE解析が容易になる。第4のサンプルに追加のCyDye−NHS−エステル共役で標識を付け、例2で述べたように、Cy2標識化内部標準、Cy3標識化サンプル、およびCy5標識化サンプルで共に分離する。Cy7蛍光色素を組み込む場合は、波長735nm、パルスレート40MHz(25nsサイクル)のパルスダイオードレーザと、780±30nm(780bp60)のエミッション・フィルタで励起して、可視化ステップを例2に追加する。Cy5.5を組み込む場合は、二重検出器を用いる別の方法を適用すれば全スキャン時間を大幅に減らすことができる。原理の証明測定から、Cy2およびCy3の励起波長の重なりは、490nmの単一ダイオードレーザで両蛍光色素を励起するのに十分であることが分かった。
この例は、最近公表された、Spiess他(文献15)が飽和DIGE多重化を用いて、酸化剤に曝した後のシステインの酸化すなわち付加物形成を検出したという、タンパク質チオールのレドックス状態を決定するための方法の変更を含む。手短に述べると、非チオ尿素溶解バッファを用いて溶解洗浄により気道上皮タンパク質を隔離し(文献14)、還元したチオールに標識を付けるために過剰なマレイミド共役Cy3標識(250nM Cy3/mgタンパク質、>10倍過剰)で培養する。自由(過剰)Cy3標識の加水分解を完全にするために培養を16時間行う。次に、トリブチルホスフィンを24mMの最終濃度になるまで加えてジスルフィド結合を還元する。Cy5マレイミドを用いる第2の飽和標識化反応を行い、還元されたジスルフィド結合のシステインに標識を付ける。区別して標識を付けたタンパク質サンプルを、例1に述べたように2−DGEにより分離する。元の方法では、一定光源を励起に用いるTyphoon8600蛍光スキャナ(Molecular Dynamics,Sunnyvale,CA,GE Healthcareの一部門)を用いてCy3およびCy5のレベルを定量化した。銀染料により決定された全タンパク質含有量(図1参照)を正規化に用いた。
ぜんそく患者並びに健康な対象群から得られるブロンキオアルベオラ(broncheoalveolar)洗浄(BAL)流体からのタンパク質を、免疫ブロット法によりIL−13含有量について解析する。手短に述べると、メーカの使用説明書(Millipore,Bedfont,OR)に従ってBioMax遠心フィルタを用いてBAL流体タンパク質を濃縮し、例1に述べたように2−DGEで分離する。電気泳動の後に、ISO−DALTシステムを10℃、250mAで19時間にわたって、25mMのトリス、192mMのグリシン、10%(v/v)のメタノール内で用いて、タンパク質をSequiblot(TM)ポリビニルジフルオライド(PVDF)膜(0.2μmの細孔サイズ)にブロットする(blotted)。その後、ミルクタンパク質で膜のブロッキングを行い、PVDF膜をモノクローナル抗IL−13一次抗体で培養する。一次抗体はCy5共役抗マウス二次抗体を用いて検出する。
Claims (14)
- 一次元および二次元ゲル電気泳動の画像収集の方法であって、
タンパク質に結合された蛍光色素をパルスレーザスキャナで励起して、たんぱく質の検出および定量化のための蛍光寿命画像化測定値を画素毎のレベルで与え、蛍光減衰曲線の多次指数関数的当てはめを用いて、蛍光色素標識化タンパク質種から生じる蛍光と、ゲルマトリクス自身、ゲル内に存在する溶液または粒子、または散乱効果を含むグループから選択された他の源から生じる蛍光とを分離することを特徴とする、前記画像収集の方法。 - 前記タンパク質の検出および定量化は、ブロットした後に蛍光を定量化することを含む、請求項1記載の画像収集の方法。
- 前記パルスレーザスキャナは密閉したスキャナ容器内に納めたダイオードレーザである、請求項1記載の画像収集の方法。
- 前記パルスレーザスキャナは光ファイバケーブル・コンセントにより外部に取り付けて、用いる励起波長に最適の柔軟性を与える、請求項1記載の画像収集の方法。
- 前記方法はグレードアップした現在の計装で行う、請求項1記載の画像収集の方法。
- 前記方法は完全に閉じたスキャナシステムで行う、請求項1記載の画像収集の方法。
- 蛍光減衰曲線の多次指数関数的当てはめを用いて、後でバックグラウンド除去を行うために、蛍光色素標識化タンパク質種から生じる蛍光と、ブロットした膜を含む他の源から生じる蛍光とを分離することを更に含む、請求項1または2記載の画像収集の方法。
- 励起のために多数のレーザ波長を連続的に用いて、時間分解蛍光と蛍光色素のスペクトル分離との組合せを容易にし、スペクトル分離による多重化を用いて寿命減衰スペクトルの複雑さを減らすことを更に含む、請求項1記載の画像収集の方法。
- 二重蛍光寿命画像化測定がある、請求項8記載の画像収集の方法。
- 前記蛍光色素に特有の強度蛍光減衰曲線を積分して曲線の下の面積を計算することを更に含む、請求項1記載の画像収集の方法。
- 自動化およびユーザが使いやすい機能を組み込むことを更に含む、請求項1記載の画像収集の方法。
- 前記自動化およびユーザが使いやすい機能は、得られる一次元または二次元のゲル電気泳動の図形的および定量的計算、蛍光寿命画像化解析のための自動化プロトコル、前記バックグラウンド成分の除去、および二次元のゲル電気泳動に用いられる標準蛍光色素のための蛍光色素成分の強度画像のエクスポートの少なくとも1つを含む、請求項11記載の画像収集の方法。
- 自動化を最大にし、多重化に用いる多数の蛍光色素の連続スキャニングを含むユーザが定義する多数の異なるプロトコルの連続スキャニングのプログラミングを容易にすることを更に含む、請求項1記載の画像収集の方法。
- ゲルベースのプロテオミクスに用いる蛍光プローブと、スキャン時間の最適化のための可変周波数パルスレーザダイオードとを用いることを更に含む、請求項1記載の画像収集の方法。
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