TW202031678A

TW202031678A - 用於胞移作用及相關方法之遞送構築體

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Publication number: TW202031678A
Application number: TW108140533A
Authority: TW
Inventors: 艾瑪柏瑞特; 艾爾柏特希特; 查理斯歐森; 蘭德Ｊ瑪西; 泰爾瑪哈穆德; 偉軍馮
Original assignee: 美商應用分子運輸公司
Priority date: 2018-11-07
Filing date: 2019-11-07
Publication date: 2020-09-01
Also published as: IL282987B2; BR112021009003A2; ES2911075T3; PL3650037T3; JP2022506990A; US20210338828A1; WO2020097394A1; KR20210110294A; CO2021007402A2; IL282987B; AU2019377117A1; EA202191280A1; US20200306383A1; EP3650037A1; PT3650037T; US11027020B2; CN113423722A; MX2021005346A; CL2021001209A1; IL282987A

Abstract

本發明提供包含諸如IL-22之治療性負荷部分及載劑之非天然存在的融合分子。本發明亦提供用於生產、純化、再摺疊、調配及投與融合分子之方法及組合物。本文亦提供使用經純化分子來治療及預防疾病或病症之方法及組合物。

Description

用於胞移作用及相關方法之遞送構築體

由於蛋白質無法擴散穿過完整上皮障壁或通過緊密連接點穿過障壁，所以腸道上皮阻礙了經口投與諸如蛋白質之較大治療性分子的努力。一旦由上皮細胞吸收，治療蛋白即可進入破壞性溶酶體遷移路徑或可經釋放返回至腸內腔中。不能容易地穿過腸上皮轉運可為研發商業上可行之口服調配物，詳言之對於基於多肽之治療劑的限制因素。

諸如靜脈投與或皮下投與之非經腸投與可為一種解決方案，但此等投與路徑通常可產生相當大的副作用、降低治療功效及降低患者便利性，其可負面影響遵從性。需要用於穿過上皮(例如腸道上皮)轉運治療劑之改良的組合物及方法。

另外，為了以高產量及以低內毒素含量獲得正確摺疊、生物活性及穩定多肽之生物活性多肽之純化及再摺疊仍視為對生物治療劑(例如多肽)之成本及資源有效生產之最具有挑戰性態樣中之一者。因此，亦需要用於產生(醱酵、再摺疊、純化及調配)此類生物活性分子之改良方法。

在各種態樣中，本發明提供一種遞送構築體，其包含SEQ ID NO: 15或SEQ ID NO: 17中所闡述之胺基酸序列或與其具有至少90%、95%或99%序列一致性之胺基酸序列。

在各種態樣中，本發明提供一種遞送構築體，其包含由SEQ ID NO: 7或SEQ ID NO: 9中所闡述之胺基酸序列組成的載劑。在一些情況下，將載劑偶合至異源有效負載。在一些情況下，異源有效負載為人類IL-22。在一些情況下，人類IL-22由SEQ ID NO: 11中所闡述之胺基酸序列組成。在一些情況下，將載劑共價或非共價偶合至IL-22。在一些情況下，載劑經由間隔子共價偶合至IL-22。在一些情況下，間隔子由SEQ ID NO: 13中所闡述之胺基酸序列組成。在一些情況下，遞送構築體由SEQ ID NO: 15或SEQ ID NO: 17中所闡述之胺基酸序列組成。

本文提供一種治療個體之發炎性疾病之方法，該方法包含向個體投與有效量之本文所述之遞送構築體(例如SEQ ID NO: 15或SEQ ID NO: 17)。在一些情況下，發炎性疾病為肝炎、肥胖症、脂肪肝病、肝臟發炎或胰臟炎、克羅恩氏病(Crohn's disease)、潰瘍性結腸炎、結腸袋炎(pouchitis)、直腸炎、多發性硬化症、全身性紅斑性狼瘡症、移植物抗宿主疾病、類風濕性關節炎或牛皮癬。在一些情況下，疾病為克羅恩氏病或潰瘍性結腸炎。

在某些實施例中，本文描述用於獲得經純化之非天然存在之融合蛋白質的方法，該方法包含：對包含該非天然存在之融合蛋白質的混合物進行陰離子交換層析，以獲得包含該非天然存在之融合蛋白質的第一溶離份；其中該非天然存在之融合蛋白質包含IL-22及載劑。在一些實施例中，其中進行陰離子交換層析包含使非天然存在之融合蛋白質結合至陰離子交換樹脂及為非天然存在之融合蛋白質之後續溶離提供增加的鹽梯度以獲得第一溶離份。在一些實施例中，進行陰離子交換層析包含使混合物與包含胺官能基化之聚甲基丙烯酸酯珠粒之樹脂接觸。在一些實施例中，樹脂為NH₂ -750F樹脂。

在一些實施例中，該方法進一步包含在進行陰離子交換層析之前，再摺疊非天然存在之融合蛋白質。在一些實施例中，再摺疊非天然存在之融合蛋白質包含使來自包涵體的經離液劑溶解之蛋白質與再摺疊溶液接觸，其中再摺疊溶液包含：精胺酸(0.75 M至1.25 M)；甘油(2%至20% v/v)；半胱胺酸(0.5 mM至10 mm)；及胱胺(0.2 mM至10 mM)；其中再摺疊溶液之pH在7.5與8.5之間。在一些實施例中，精胺酸以介於0.9 M與1.1 M之間的濃度存在於再摺疊溶液中；甘油以介於7%與13% (w/w)之間的濃度存在於再摺疊溶液中；半胱胺酸以介於1.5 mM與6 mM之間的濃度存在於再摺疊溶液中；胱胺以介於0.6 mM與3 mM之間的濃度存在於再摺疊溶液中；及再摺疊溶液之pH在7.8與8.2之間。

在一些實施例中，該方法進一步包含使包含第一溶離份之樣品經受羥基磷灰石樹脂以獲得包含非天然存在之融合蛋白質的第二溶離份。在一些實施例中，羥基磷灰石樹脂為CaPure-羥基磷灰石樹脂。在一些實施例中，該方法進一步包含對包含第一溶離份之樣品進行陽離子交換層析。在一些實施例中，進行陽離子交換層析包含使包含第一溶離份之樣品與包含硫酸酯官能基化聚甲基丙烯酸酯珠粒之樹脂接觸。在一些實施例中，樹脂為TOYOPEARL硫酸酯-650F樹脂。

在一些實施例中，一旦接觸細胞，載劑即促進非天然存在之融合蛋白質之內飲作用或胞移作用。在一些具體實例中，一旦與細胞接觸，載劑即促進非天然存在之融合蛋白質之胞移作用。在一些實施例中，細胞為腸道上皮細胞。在一些實施例中，腸道上皮細胞為極化腸道上皮細胞。在一些實施例中，載劑為天然存在或非天然存在之Cholix多肽之截斷變體。在一些實施例中，載劑與SEQ ID NO: 1、2、3、4、5、6、7、8、9、22或23中之任一者具有至少70%、80%、85%、90%、95%、98%、99%或100%序列一致性。在一些實施例中，非天然存在之融合蛋白質與SEQ ID NO: 14-21中之任一者之序列具有至少70%、80%、85%、90%、95%、98%、99%或100%序列一致性。在一些實施例中，IL-22與SEQ ID NO: 10、11或12中之任一者具有至少85%、90%、95%、98%、99%或100%序列一致性。

在一些實施例中，載劑本身具有第一等電點(pI)，且IL-22本身具有第二等電點，其中第一等電點比第二等電點低至少1 pH單位、至少1.5 pH單位、至少1.7 pH單位或至少2 pH單位。舉例而言，在一些實施例中，載劑之pI在4.8與5.4之間、在4.9與5.3之間、在5.0與5.2之間，諸如約5.1之pI。在一些實施例中，IL-22之pI在約6.8與7.4之間，諸如在約6.9與7.3之間、在約7.0與7.2之間，諸如約7.1。在一些實施例中，非天然存在之融合蛋白質藉由本文所描述之方法中之任一者獲得。

在某些實施例中，本文描述再摺疊包含載劑及IL-22之非天然存在之融合蛋白質的方法，該方法包含： (i)使包含非天然存在之融合蛋白質的包涵體與包含離液劑之溶解溶液接觸以產生可溶性非天然存在之融合蛋白質；(ii)使非天然存在之融合蛋白質與再摺疊溶液接觸，其中再摺疊溶液包含：精胺酸(0.75 M至1.25 M)；甘油(2%至20% v/v)；半胱胺酸(0.5 mM至10 mM)；及胱胺(0.2 mM至10 mM)；其中再摺疊溶液之pH在7.5與8.5之間。

在一些實施例中，精胺酸以介於0.9 M與1.1 M之間的濃度存在於再摺疊溶液中；甘油以介於7%與13% (w/w)之間的濃度存在於再摺疊溶液中；半胱胺酸以介於1.5 mM與6 mM之間的濃度存在於再摺疊溶液中；胱胺以介於0.6 mM與3 mM之間的濃度存在於再摺疊溶液中；及再摺疊溶液之pH在7.8與8.2之間。

交叉引用

本申請案主張2018年11月7日申請之美國臨時申請案第62/756,889號、2019年8月16日申請之美國臨時申請案第62/888,133號及2019年8月16日申請之美國臨時申請案第62/888,238號、2019年9月11日申請之國際申請案第PCT/US2019/050708號及2019年3月8日申請之國際申請案第PCT/US2019/021474號之權益，該等申請案以全文引用之方式併入本文中。以引用之方式併入

本說明書中所提及之所有公開案、專利及專利申請案均以引用的方式併入本文中，其引用的程度如同各單獨的公開案、專利或專利申請案經特定及單獨地表明以引用的方式併入一般。

本發明描述非天然存在之融合蛋白質(例如能夠轉運一或多個異源有效負載分子之遞送構築體)及用於再摺疊及純化非天然存在之融合蛋白質的方法。舉例而言，非天然存在之融合蛋白質可為本文所述之IL-22遞送構築體。

除了熟習此項技術者對此等術語之理解之外，論述下文術語以說明如在本說明書中所使用之術語之含義。除非上下文另外明確指示，否則如本文及隨附申請專利範圍中所使用，單數形式「一(a/an)」及「該」包括複數個指示物。應進一步注意，申請專利範圍可撰寫成排除任何視情況選用之要素。因此，此陳述意欲與對所主張要素之敍述結合充當使用如「僅僅(solely)」、「僅(only)」及其類似術語之此類排他性術語或使用「否定性」限制之前提基礎。

本文中呈現之某些範圍或數值，其中數值之前具有術語「約」。術語「約」在本文中使用意謂加或減1%、2%、3%、4%或5%之術語所指代之數字。如本文所用，術語「個體(subject)」及「個別(individual)」可互換使用且可為任何動物，包括哺乳動物(例如人類或非人類動物)。

如本文所用，術語「治療(treat/treating/treatment)」及其他文法等同者，包括緩解、緩和或減輕疾病或病狀之一或多個症狀；減輕、預防或減少疾病或病狀之一或多個症狀的表像、嚴重程度或頻率；減輕或預防疾病或病狀之一或多個症狀之潛在原因；抑制疾病或病狀，諸如遏制疾病或病狀之發展、緩解疾病或病狀、促使疾病或病狀消退、緩解由疾病或病狀所引起之病狀或預防性及/或治療性抑制疾病或病狀之症狀。

如本文所描述，在上下文中之胺基酸序列，術語「序列一致性百分比(%)」及與其相關術語為在比對序列且必要時引入間隙以獲得最大序列一致性百分比且不將任何保守取代考慮為序列一致性之部分之後，在候選序列中之胺基酸殘基與所選序列中之胺基酸殘基一致之百分比。出於確定胺基酸序列一致性百分比之目的，比對可以此項技術內之各種方式達成，例如使用可公開獲得之電腦軟體，諸如Clustal Omega、BLAST、BLAST-2、ALIGN、ALIGN-2或Megalign (DNASTAR)軟體。熟習此項技術者可確定用於量測比對之適當參數，包括用於達成所比較序列之全長內之最大比對所需的任何演算法。

術語「多肽」及「蛋白質」在本文中可互換使用，以指代胺基酸殘基之聚合物。肽基本上亦包括任何聚胺基酸，包括(但不限於)肽模擬物，諸如由醚而不是醯胺鍵接合之胺基酸。有效負載及遞送構築體

本文提供能夠經由胞移作用穿過上皮細胞(例如極化腸道上皮細胞)及至固有層 中轉運一或多種異源有效負載分子(例如一或多種治療有效負載)之遞送構築體。遞送構築體可包含偶合至異源有效負載之載劑。遞送構築體可為非天然存在之融合蛋白質。載劑可能夠使用內源性遷移路徑穿過極化上皮細胞(例如極化腸道上皮細胞)轉運異源有效負載。利用內源性遷移路徑，而不是使用被動擴散，可允許載劑快速穿梭異源有效負載且有效地穿過上皮細胞，而不損害此等細胞之障壁功能或異源有效負載之生物活性。本文進一步提供用於純化及再摺疊本文所述之遞送構築體之方法。

本文中之載劑可衍生自藉由細菌分泌之多肽。此類載劑可衍生自來自霍亂弧菌(Vibrio Cholerae )或綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa )分泌之多肽。藉由霍亂弧菌分泌之多肽可為Cholix多肽。衍生自Cholix多肽之載劑可為天然存在或非天然存在的。舉例而言，非天然存在之Cholix多肽可由SEQ ID NO: 1中所闡述之胺基酸序列(Cholix¹ ^- ⁶³⁴ 之實例)組成(表 1 )。衍生自Cholix多肽之載劑可為衍生自Cholix之多肽的經截斷及/或突變變體。舉例而言，載劑可包含具有SEQ ID NO : 1或SEQ ID NO : 26之胺基酸殘基1-206、1-245、1-251、1-266及1-386之彼等胺基酸序列或由其組成。在一些情況下，此等載劑具有彼等SEQ ID NO : 4之胺基酸殘基1-206、1-245、1-251、1-266及1-386之胺基酸序列。一或多個突變可包括一或多個取代、一或多個缺失及/或一或多個加成。例如本文中之載劑可包含V1L取代。換言之，在一些實施例中，與Cholix相關之載劑在位置「1」處具有白胺酸胺基酸。(位置1係指不具有N-端甲硫胺酸之變體之第一胺基酸或包括N-端甲硫胺酸之變體中之第二位置。換言之，在確定載劑之長度時，忽略N-端甲硫胺酸(若存在)。) 在一些實施例中，包含V1L取代之載劑經歷N-端胺基酸之裂解減少或消去。在一些實施例中，包含V1L取代之載劑經歷N-端胺基酸之乙醯化減少或消去。相對於天然存在之Cholix變體，本文所提供之載劑可具有經降低(例如降低至少50%)或削磨之ADP核糖基化活性(例如延長因子2之核糖基化)。在一些實施例中，載劑可包含N-端甲硫胺酸。在其他實施例中，不存在N-端甲硫胺酸。

經截斷之Cholix載劑可由SEQ ID NO: 26(式 I )中闡述之序列之胺基酸殘基1-386組成、基本上由該等胺基酸殘基組成或包含該等胺基酸殘基。經截斷之Cholix載劑可由SEQ ID NO: 26(式 I )中闡述之序列之胺基酸殘基1-266組成、基本上由該等胺基酸殘基組成或包含該等胺基酸殘基。在此等情況下，載劑可由SEQ ID NO: 1中所闡述之序列之胺基酸殘基1-266組成、基本上由該胺基酸殘基組成或包含該胺基酸殘基。因此，在一些情況下，載劑由SEQ ID NO: 2(Cholix^1-386 之實例)或SEQ ID NO: 3(Cholix¹ ^- ²⁶⁶ 之實例)中所闡述之胺基酸序列組成。在一些情況下，載劑具有由SEQ ID NO: 2表示之具有V1L取代之胺基酸序列。因此，在一些情況下，載劑由SEQ ID NO: 4(V1L-Cholix¹ ^- ³⁸⁶ 之實例)或SEQ ID NO: 5(V1L Cholix¹ ^- ²⁶⁶ 之實例)中所闡述之胺基酸序列組成。此等載劑中之任一者可包括在其N-端處一或多個用於在各種微生物(例如細菌)中表現之胺基酸，例如N-端甲硫胺酸。此類載劑可具有SEQ ID NO: 6-9中所闡述之胺基酸序列。

Cholix多肽可為包含以下的蛋白質、基本上由以下組成之或由以下組成的蛋白質：與SEQ ID NO: 1-9或SEQ ID NO: 22-23中之任一者中所闡述之胺基酸序列具有至少80%、85%、90%、95%、98%或99%序列一致性或具有100%序列一致性之氨基酸序列。Cholix多肽之一個實例在本文中提供為SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 22。本文亦涵蓋能夠穿過極化上皮細胞(例如極化腸道上皮細胞)轉運有效負載的經截斷之Cholix多肽變體。相較於參考序列，例如SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 22或SEQ ID NO: 26，或與其具有至少80%、85%、90%、95%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列，此等Cholix多肽可在206至633之胺基酸位置中之任一者處截斷。

本文亦涵蓋包含與以上序列具有高度序列一致性之載劑的遞送構築體。此類高度序列一致性可包括至少90%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性。因此，在一些情況下，載劑包含與SEQ ID NO: 6-9中所闡述之胺基酸序列具有至少90%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之序列一致性。

本文中所涵蓋之載劑可偶合至有效負載，諸如異源有效負載。此類有效負載可為治療有效負載。治療有效負載可為細胞介素、激素、生長因子、治療性抗體、抗原、以上任一者之功能片段或具有生物、治療活性之任何其他蛋白質或個體可能缺乏之蛋白質(例如，某一蛋白質之基因/遺傳缺陷)。本文中所涵蓋之細胞介素包括單體趨化細胞素及介白素(在本文中亦縮寫為「IL」)。介白素可為IL-22。介白素可來自任何物種(例如來自人類或嚙齒動物)。介白素可為人類介白素。人類IL-22可具有SEQ ID NO: 10(IL-22¹ ^- ¹⁷⁹ )或SEQ ID NO: 11(IL-22³⁴ ^- ¹⁷⁹ )中所闡述之胺基酸序列。本文中之IL-22可在其N-端進一步包括甲硫胺酸，例如當此類IL-22蛋白質細菌表現時。在一個實例中，IL-22具有SEQ ID NO: 12(M+IL-22³⁴ ^- ¹⁷⁹ )中所闡述之胺基酸序列。本文中之IL-22可在其N-端進一步包括甲硫胺酸，例如當此類IL-22蛋白質細菌表現時。在一個實例中，IL-22具有SEQ ID NO: 12(M+IL-22³⁴ ^- ¹⁷⁹ )中所闡述之胺基酸序列。IL-22可包含以下、基本上由以下組成或由以下組成：SEQ ID NO: 10或與其具有至少80%、85%、90%、95%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列或其片段。IL-22可包含以下、基本上由以下組成或由以下組成：SEQ ID NO: 11(IL-22³⁴ ^- ¹⁷⁹ )(其為IL-22之分泌形式)或與其具有至少80%、85%、90%、95%、98%或99%序列一致性的胺基酸序列或其片段。IL-22可在其N-端包括甲硫胺酸，例如當此類IL-22蛋白質細菌表現時。此類IL-22可由SEQ ID NO: 12(M+IL-22³⁴ ^- ¹⁷⁹ )中所闡述之胺基酸序列組成、基本上由該胺基酸序列組成或包含該胺基酸序列。

在一些情況下，本文中之任一遞送構築體中所用之載劑可為蛋白質或能夠穿過上皮(例如個體之極化腸道上皮)轉運治療有效負載之另一類型之分子。此類轉運可包括胞移作用。如本文所提及，「胞移作用」係指融合分子通過極化上皮細胞之遷移。此類遷移准許生物活性負荷自極化上皮細胞之基側膜釋放。胞移作用過程可涉及載劑與在上皮細胞(例如極化腸道上皮細胞)之頂面及/或基面上以及細胞內之一或多種受體及/或蛋白質的一或多種相互作用。載劑可能夠在不損害上皮、載劑及/或有效負載之生物及/或治療功能的情況下穿過上皮轉運治療有效負載。

載劑可共價或非共價且直接或間接偶合至治療有效負載。治療有效負載可直接偶合至載劑之N-端或C-端。在載劑共價偶合至有效負載之情況下，載劑可經由間隔子(本文中亦稱為連接子)偶合至此類有效負載。間隔子可包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20個或更多個胺基酸殘基。間隔子胺基酸殘基可為例如甘胺酸、絲胺酸及/或色胺酸。間隔子可為可裂解或不可裂解之間隔子。可裂解間隔子可藉由酶或以pH依賴性方式裂解。

本文中所涵蓋之間隔子之實例包括寡肽序列，諸如S、(GS)x、(GGS)x、(GGGS)x (SEQ ID NO: 27)、(GGGGS)x (SEQ ID NO: 28)或(GGGGGS)x (SEQ ID NO: 29)，其中x=1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15。在一些情況下，間隔子由SEQ ID NO: 13((G₄ S)₃ )中所闡述之序列(GGGGSGGGGSGGGGS)組成、基本上由其組成或包含該序列。在一些情況下，間隔子由SEQ ID NO: 31((G₄ S)₅ )中所闡述之序列(GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS)組成、基本上其組成或包含該序列。在一些情況下，遞送構築體包含非共價連接(例如經由離子相互作用、凡得瓦相互作用(van der Waals interactions)、π-π相互作用等)之治療有效負載及載劑。載劑可在其N-端及/或C-端上進一步包含一或多個特徵、元素、胺基酸或修飾。舉例而言，一些實施例包括在載劑之N-端處之N-端甲硫胺酸。亦可存在其他修飾(例如乙醯化)，包括針對在異源系統中表現之修飾。

本文中之遞送構築體可具有在SEQ ID NO: 15或17中所闡述之胺基酸序列(M+Cholix¹ ^- ²⁶⁶ -(G₄ S)₃ -IL-22³⁴ ^- ¹⁷⁹ 之實例)(表 1 )。其他遞送構築體可具有在SEQ ID NO: 24或25中所闡述之胺基酸序列(例如當在諸如CHO細胞之哺乳動物細胞中表現時)。此等例示性遞送構築體轉運IL-22穿過完整、極化腸道上皮細胞並至固有層中。

在各種實施例中，非天然存在之融合蛋白質具有在SEQ ID NO: 14-21、24或25中所闡述之胺基酸序列，或與其具有至少80%、85%、90%、95%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列。圖 16 中說明包含在SEQ ID NO: 15中所闡述之胺基酸序列的非天然存在之融合蛋白質的載劑、間隔子及有效負載之示意圖。

表 1 展示與本文所揭示之方法組合使用的生物活性分子之例示性胺基酸序列。表 1 - 例示性胺基酸序列

類別	SEQ ID NO	胺基酸序列
Cholix^1-634	SEQ ID NO: 1	VEEALNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPMDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKVITVKQGIEQKPVEQRIHFSKGNAMSALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLTDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPEVAERLSDLRRINENNPGMVTQVLTVARQIYNDYVTHHPGLTPEQTSAGAQAADILSLFCPDADKSCVASNNDQANINIESRSGRSYLPENRAVITPQGVTNWTYQELEATHQALTREGYVFVGYHGTNHVAAQTIVNRIAPVPRGNNTENEEKWGGLYVATHAEVAHGYARIKEGTGEYGLPTRAERDARGVMLRVYIPRASLERFYRTNTPLENAEEHITQVIGHSLPLRNEAFTGPESAGGEDETVIGWDMAIHAVAIPSTIPGNAYEELAIDEEAVAKEQSISTKPPYKERKDELK
Cholix^1-386	SEQ ID NO: 2	VEEALNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPMDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKVITVKQGIEQKPVEQRIHFSKGNAMSALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLTDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPEVAERLSDLRRINENNPGMVTQVLTVARQIYNDYVTHHPGLTPEQTSAGAQA
Cholix^1-266	SEQ ID NO: 3	VEEALNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPMDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKVITVKQGIEQKPVEQRIHFSKG
(V1L)-Cholix^1-386	SEQ ID NO: 4	LEEALNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPMDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKVITVKQGIEQKPVEQRIHFSKGNAMSALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLTDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPEVAERLSDLRRINENNPGMVTQVLTVARQIYNDYVTHHPGLTPEQTSAGAQA
(V1L)-Cholix^1-266	SEQ ID NO: 5	LEEALNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPMDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKVITVKQGIEQKPVEQRIHFSKG
M+Cholix^1-386	SEQ ID NO: 6	MVEEALNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPMDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKVITVKQGIEQKPVEQRIHFSKGNAMSALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLTDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPEVAERLSDLRRINENNPGMVTQVLTVARQIYNDYVTHHPGLTPEQTSAGAQA
M+Cholix^1-266	SEQ ID NO: 7	MVEEALNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPMDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKVITVKQGIEQKPVEQRIHFSKG
M+(V1L)-Cholix^1-386	SEQ ID NO: 8	MLEEALNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPMDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKVITVKQGIEQKPVEQRIHFSKGNAMSALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLTDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPEVAERLSDLRRINENNPGMVTQVLTVARQIYNDYVTHHPGLTPEQTSAGAQA
M+(V1L)-Cholix^1-266	SEQ ID NO: 9	MLEEALNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPMDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKVITVKQGIEQKPVEQRIHFSKG
IL-22^1-179	SEQ ID NO: 10	MAALQKSVSSFLMGTLATSCLLLLALLVQGGAAAPISSHCRLDKSNFQQPYITNRTFMLAKEASLADNNTDVRLIGEKLFHGVSMSERCYLMKQVLNFTLEEVLFPQSDRFQPYMQEVVPFLARLSNRLSTCHIEGDDLHIQRNVQKLKDTVKKLGESGEIKAIGELDLLFMSLRNACI
IL-22^34-179	SEQ ID NO: 11	APISSHCRLDKSNFQQPYITNRTFMLAKEASLADNNTDVRLIGEKLFHGVSMSERCYLMKQVLNFTLEEVLFPQSDRFQPYMQEVVPFLARLSNRLSTCHIEGDDLHIQRNVQKLKDTVKKLGESGEIKAIGELDLLFMSLRNACI
M+IL-22^34-179	SEQ ID NO: 12	MAPISSHCRLDKSNFQQPYITNRTFMLAKEASLADNNTDVRLIGEKLFHGVSMSERCYLMKQVLNFTLEEVLFPQSDRFQPYMQEVVPFLARLSNRLSTCHIEGDDLHIQRNVQKLKDTVKKLGESGEIKAIGELDLLFMSLRNACI
(G₄ S)₃	SEQ ID NO: 13	GGGGSGGGGSGGGGS
M+Cholix^1-386 -(G₄ S)₃ -IL-22^34-179	SEQ ID NO: 14	MLEEALNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPMDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKVITVKQGIEQKPVEQRIHFSKGNAMSALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLTDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPEVAERLSDLRRINENNPGMVTQVLTVARQIYNDYVTHHPGLTPEQTSAGAQAGGGGSGGGGSGGGGSAPISSHCRLDKSNFQQPYITNRTFMLAKEASLADNNTDVRLIGEKLFHGVSMSERCYLMKQVLNFTLEEVLFPQSDRFQPYMQEVVPFLARLSNRLSTCHIEGDDLHIQRNVQKLKDTVKKLGESGEIKAIGELDLLFMSLRNACI
M+Cholix^1-266 -(G₄ S)₃ -IL-22^34-179	SEQ ID NO: 15	MVEEALNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPMDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKVITVKQGIEQKPVEQRIHFSKGGGGGSGGGGSGGGGSAPISSHCRLDKSNFQQPYITNRTFMLAKEASLADNNTDVRLIGEKLFHGVSMSERCYLMKQVLNFTLEEVLFPQSDRFQPYMQEVVPFLARLSNRLSTCHIEGDDLHIQRNVQKLKDTVKKLGESGEIKAIGELDLLFMSLRNACI
M+(V1L)-Cholix^1-386 -(G₄ S)₃ -IL-22^34-179	SEQ ID NO: 16	MVEEALNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPMDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKVITVKQGIEQKPVEQRIHFSKGNAMSALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLTDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPEVAERLSDLRRINENNPGMVTQVLTVARQIYNDYVTHHPGLTPEQTSAGAQAGGGGSGGGGSGGGGSAPISSHCRLDKSNFQQPYITNRTFMLAKEASLADNNTDVRLIGEKLFHGVSMSERCYLMKQVLNFTLEEVLFPQSDRFQPYMQEVVPFLARLSNRLSTCHIEGDDLHIQRNVQKLKDTVKKLGESGEIKAIGELDLLFMSLRNACI
M+(V1L)-Cholix^1-266 -(G₄ S)₃ -IL-22^34-179	SEQ ID NO: 17	MLEEALNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPMDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKVITVKQGIEQKPVEQRIHFSKGGGGGSGGGGSGGGGSAPISSHCRLDKSNFQQPYITNRTFMLAKEASLADNNTDVRLIGEKLFHGVSMSERCYLMKQVLNFTLEEVLFPQSDRFQPYMQEVVPFLARLSNRLSTCHIEGDDLHIQRNVQKLKDTVKKLGESGEIKAIGELDLLFMSLRNACI
Cholix^1-386 -(G₄ S)₃ -IL-22^34-179	SEQ ID NO: 18	VEEALNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPMDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKVITVKQGIEQKPVEQRIHFSKGNAMSALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLTDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPEVAERLSDLRRINENNPGMVTQVLTVARQIYNDYVTHHPGLTPEQTSAGAQAGGGGSGGGGSGGGGSAPISSHCRLDKSNFQQPYITNRTFMLAKEASLADNNTDVRLIGEKLFHGVSMSERCYLMKQVLNFTLEEVLFPQSDRFQPYMQEVVPFLARLSNRLSTCHIEGDDLHIQRNVQKLKDTVKKLGESGEIKAIGELDLLFMSLRNACI
(V1L)-Cholix^1-386 - (G₄ S)₃ -IL-22^34-179	SEQ ID NO: 19	LEEALNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPMDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKVITVKQGIEQKPVEQRIHFSKGNAMSALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLTDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPEVAERLSDLRRINENNPGMVTQVLTVARQIYNDYVTHHPGLTPEQTSAGAQAGGGGSGGGGSGGGGSAPISSHCRLDKSNFQQPYITNRTFMLAKEASLADNNTDVRLIGEKLFHGVSMSERCYLMKQVLNFTLEEVLFPQSDRFQPYMQEVVPFLARLSNRLSTCHIEGDDLHIQRNVQKLKDTVKKLGESGEIKAIGELDLLFMSLRNACI
Cholix^1-266 -(G₄ S)₃ -IL-22^34-179	SEQ ID NO: 20	VEEALNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPMDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKVITVKQGIEQKPVEQRIHFSKGGGGGSGGGGSGGGGSAPISSHCRLDKSNFQQPYITNRTFMLAKEASLADNNTDVRLIGEKLFHGVSMSERCYLMKQVLNFTLEEVLFPQSDRFQPYMQEVVPFLARLSNRLSTCHIEGDDLHIQRNVQKLKDTVKKLGESGEIKAIGELDLLFMSLRNACI
(V1L)-Cholix^1-266 - (G₄ S)₃ -IL-22^34-179	SEQ ID NO: 21	LEEALNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPMDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKVITVKQGIEQKPVEQRIHFSKGGGGGSGGGGSGGGGSAPISSHCRLDKSNFQQPYITNRTFMLAKEASLADNNTDVRLIGEKLFHGVSMSERCYLMKQVLNFTLEEVLFPQSDRFQPYMQEVVPFLARLSNRLSTCHIEGDDLHIQRNVQKLKDTVKKLGESGEIKAIGELDLLFMSLRNACI
(V1L)-Cholix^1-634	SEQ ID NO: 22	LEEALNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPMDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKVITVKQGIEQKPVEQRIHFSKGNAMSALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLTDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPEVAERLSDLRRINENNPGMVTQVLTVARQIYNDYVTHHPGLTPEQTSAGAQAADILSLFCPDADKSCVASNNDQANINIESRSGRSYLPENRAVITPQGVTNWTYQELEATHQALTREGYVFVGYHGTNHVAAQTIVNRIAPVPRGNNTENEEKWGGLYVATHAEVAHGYARIKEGTGEYGLPTRAERDARGVMLRVYIPRASLERFYRTNTPLENAEEHITQVIGHSLPLRNEAFTGPESAGGEDETVIGWDMAIHAVAIPSTIPGNAYEELAIDEEAVAKEQSISTKPPYKERKDELK
M+(V1L)-Cholix^1-634	SEQ ID NO: 23	MLEEALNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPMDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKVITVKQGIEQKPVEQRIHFSKGNAMSALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLTDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPEVAERLSDLRRINENNPGMVTQVLTVARQIYNDYVTHHPGLTPEQTSAGAQAADILSLFCPDADKSCVASNNDQANINIESRSGRSYLPENRAVITPQGVTNWTYQELEATHQALTREGYVFVGYHGTNHVAAQTIVNRIAPVPRGNNTENEEKWGGLYVATHAEVAHGYARIKEGTGEYGLPTRAERDARGVMLRVYIPRASLERFYRTNTPLENAEEHITQVIGHSLPLRNEAFTGPESAGGEDETVIGWDMAIHAVAIPSTIPGNAYEELAIDEEAVAKEQSISTKPPYKERKDELK
Cholix^1-266 -(G₄ S)₃ -IL-22^34-179	SSEQ ID NO: 24	VEEALNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPMDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKVITVKQGIEQKPVEQRIHFSKGGGGGSGGGGSGGGGSAPISSHCRLDKSNFQQPYITNRTFMLAKEASLADNNTDVRLIGEKLFHGVSMSERCYLMKQVLNFTLEEVLFPQSDRFQPYMQEVVPFLARLSNRLSTCHIEGDDLHIQRNVQKLKDTVKKLGESGEIKAIGELDLLFMSLRNACI
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M+Cholix^1-266 -(G₄ S)₁ -IL-22^34-179	SEQ ID NO: 32	MVEEALNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPMDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKVITVKQGIEQKPVEQRIHFSKGGGGGSAPISSHCRLDKSNFQQPYITNRTFMLAKEASLADNNTDVRLIGEKLFHGVSMSERCYLMKQVLNFTLEEVLFPQSDRFQPYMQEVVPFLARLSNRLSTCHIEGDDLHIQRNVQKLKDTVKKLGESGEIKAIGELDLLFMSLRNACI
M+Cholix^1-266 -(G₄ S)₅ -IL-22^34-179	SEQ ID NO: 33	MVEEALNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPMDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKVITVKQGIEQKPVEQRIHFSKGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSAPISSHCRLDKSNFQQPYITNRTFMLAKEASLADNNTDVRLIGEKLFHGVSMSERCYLMKQVLNFTLEEVLFPQSDRFQPYMQEVVPFLARLSNRLSTCHIEGDDLHIQRNVQKLKDTVKKLGESGEIKAIGELDLLFMSLRNACI
M+ IL-22^34-179 -(G₄ S)₁ -Cholix^1-266	SEQ ID NO: 34	MAPISSHCRLDKSNFQQPYITNRTFMLAKEASLADNNTDVRLIGEKLFHGVSMSERCYLMKQVLNFTLEEVLFPQSDRFQPYMQEVVPFLARLSNRLSTCHIEGDDLHIQRNVQKLKDTVKKLGESGEIKAIGELDLLFMSLRNACIGGGGSVEEALNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPMDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKVITVKQGIEQKPVEQRIHFSKG
M+Cholix^1-386 -(G₄ S)₁ -IL-22^34-179	SEQ ID NO: 35	MVEEALNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPMDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKVITVKQGIEQKPVEQRIHFSKGNAMSALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLTDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPEVAERLSDLRRINENNPGMVTQVLTVARQIYNDYVTHHPGLTPEQTSAGAQAGGGGSAPISSHCRLDKSNFQQPYITNRTFMLAKEASLADNNTDVRLIGEKLFHGVSMSERCYLMKQVLNFTLEEVLFPQSDRFQPYMQEVVPFLARLSNRLSTCHIEGDDLHIQRNVQKLKDTVKKLGESGEIKAIGELDLLFMSLRNACI
Cholix一致序列	SEQ ID NO: 26	X1-E-X3-X4-L-X6-I-F-D-E-C-R-S-P-C-X16-L-T-P-E-X21-G-K-X24-I-Q-S-K-L-X30-I-P-X33-D-V-V-L-D-E-G-V-L-Y-Y-S-M-T-I-N-D-E-Q-N-D-I-X56-D-E-X59-K-G-E-S-I-I-T-X67-G-E-F-A-T-X73-R-A-T-R-H-Y-V-X81-Q-D-A-P-F-G-V-I-X90-L-D-I-T-T-E-N-G-T-K-X101-Y-S-X104-N-R-K-X108-X109-E-F-X112-I-X114-W-L-V-X118-X119-G-E-D-S-P-A-S-I-K-I-S-X131-D-E-X134-D-Q-X137-R-N-I-I-E-V-P-K-L-Y-S-I-D-L-D-N-Q-T-L-E-Q-W-X160-X161-Q-G-N-V-X166-F-X168-V-T-R-P-E-X174-X175-I-A-I-S-W-P-S-V-S-Y-X186-A-A-X189-K-X191-G-X193-R-H-K-R-W-A-X200-W-X202-T-X204-X205-X206-X207-X208-X209-L-X211-X212-X213-X214-X215-X216-X217-X218-X219-X220-X221-X222-X223-X224-C-T-X227-G-X229-X230-W-X232-G-G-X235-Y-X237-T-V-A-G-X242-P-X244-X245-I-X247-V-K-Q-G-X252-E-Q-K-X256-V-E-Q-R-I-H-F-S-X265-X266-N-A-X269-X270-X271-L-A-A-H-R-V-C-G-V-P-L-E-T-L-A-R-X288-R-K-P-R-X293-L-X295-D-D-L-X299-C-X301-Y-X303-A-Q-X306-I-V-S-L-F-X312-A-T-R-X316-L-F-X319-H-X321-D-S-X324-F-T-L-N-L-X330-X331-Q-X333-P-X335-V-X337-E-R-L-X341-X342-X343-R-X345-I-N-E-X349-N-P-G-X353-V-X355-Q-V-L-T-X360-A-R-Q-I-Y-N-D-Y-V-T-X371-H-P-X374-L-X376-P-E-Q-T-S-A-X383-A-Q-A-A-D-I-L-S-L-X393-X394-P-D-X397-D-X399-X400-C-V-A-X404-X405-X406-D-Q-A-N-I-N-X413-E-S-R-S-G-R-S-Y-L-X423-E-N-R-A-V-I-T-X431-Q-G-V-T-N-W-T-Y-Q-E-L-X443-X444-X445-H-Q-X448-L-T-X451-E-X453-Y-V-F-V-G-Y-H-G-T-N-H-X465-A-A-Q-X469-I-V-N-R-I-X475-P-V-P-R-G-X481-X482-T-E-X485-E-X487-X488-W-G-G-X492-Y-V-X495-T-X497-A-X499-X500-X501-X502-X503-Y-X505-R-X507-X508-X509-G-T-X512-X513-X514-X515-X516-X517-T-X519-X520-X521-X522-X523-X524-R-G-V-M-L-X530-V-Y-X533-X534-X535-A-S-L-E-R-F-Y-R-X544-N-X546-X547-L-E-X550-X551-X552-X553-X554-X555-X556-X557-V-I-G-H-X562-L-P-L-R-N-E-A-F-T-G-X573-X574-X575-X576-X577-G-X579-X580-E-T-X583-I-G-W-D-X588-A-I-X591-X592-V-A-I-P-S-T-I-P-G-N-X603-Y-X605-X606-L-X608-X609-X610-E-E-A-X614-A-X616-E-Q-S-I-S-X622-K-P-P-Y-K-E-X629-X630-D-E-L-K；其中X1選自由V及L組成之群；X3選自由E及D組成之群；X4選自由A及E組成之群；X6選自由N及K組成之群；X16選自由S及L組成之群；X21選自由P及L組成之群；X24選自由P及Q組成之群；X30選自由S及F組成之群；X33選自由S及G組成之群；X56選自由K及M組成之群；X59選自由D及G組成之群；X67選自由I及F組成之群；X73選自由V及I組成之群；X81選自由N及S組成之群；X90選自由H及N組成之群；X101選自由T及M組成之群；X104選自由Y及F組成之群；X108選自由E及D組成之群；X109選自由G及S組成之群；X112選自由A及T組成之群；X114選自由N及H組成之群；X118選自由P及I組成之群；X119選自由I及P組成之群；X131選自由V及I組成之群；X134選自由L及I組成之群；X137選自由Q及K組成之群；X160選自由K及E組成之群；X161選自由T及N組成之群；X166選自由S及F組成之群；X168選自由S及A組成之群；X174選自由H及Q組成之群；X175選自由以下各者組成之群：N、S、SIAKQS及SIAKQSIAKQS；X186選自由K及N組成之群；X189選自由Q、E及H組成之群；X191選自由E、N及D組成之群；X193選自由S及A組成之群；X200選自由H及N組成之群；X202選自由以下各者組成之群：H、L、F及R；X204選自由G及T組成之群；X205選自由L及S組成之群；X206選自由A及P組成之群；X207選自由L、E及K組成之群；X208選自由C及V組成之群；X209選自由W、V及T組成之群；X211選自由V組成之群且無胺基酸；X212選自由P組成之群且無胺基酸；X213選自由M、I、L組成之群且無胺基酸；X214選自由D組成之群且無胺基酸；X215選自由A組成之群且無胺基酸；X216選自由I組成之群且無胺基酸；X217選自由Y及C組成之群；X218選自由N及F組成之群；X219選自由Y及F組成之群；X220選自由I及E組成之群；X221選自由T及D組成之群；X222選自由Q及P組成之群；X223選自由Q、E及A組成之群；X224選自由N、L及Q組成之群；X227選自由L及Y組成之群；X229選自由D及E組成之群；X230選自由N及D組成之群；X232選自由F、H及Y組成之群；X235選自由S及A組成之群；X237選自由E及K組成之群；X242選自由T及I組成之群；X244選自由K、E及G組成之群；X245選自由V及A組成之群；X247選自由T及M組成之群；X252選自由I及M組成之群；X256選自由P、T及A組成之群；X265選自由K、Q及N組成之群；X266選自由G及K組成之群；X269選自由M及I組成之群；X270選自由S及E組成之群；X271選自由A及T組成之群；X288選自由S及G組成之群；X293選自由D及Y組成之群；X295選自由T、P及Q組成之群；X299選自由S及Q組成之群；X301選自由A及V組成之群；X303選自由Q及N組成之群；X306選自由N及Q組成之群；X312選自由V及L組成之群；X316選自由I及M組成之群；X319選自由S及T組成之群；X321選自由L及I組成之群；X324選自由V及I組成之群；X330選自由D、E及H組成之群；X331選自由E及G組成之群；X333選自由E及A組成之群；X335選自由E及A組成之群；X337選自由A及T組成之群；X341選自由S、D及T組成之群；X342選自由D及A組成之群；X343選自由L及I組成之群；X345選自由R及Q組成之群；X349選自由N及D組成之群；X353選自由M及V組成之群；X355選自由T及I組成之群；X360選自由V及I組成之群；X371選自由H及E組成之群；X374選自由G及L組成之群；X376選自由T及I組成之群；X383選自由G及S組成之群；X393選自由F及L組成之群；X394選自由C及Y組成之群；X397選自由A及T組成之群；X399選自由K、E及G組成之群；X400選自由S、P及H組成之群；X404選自由S及L組成之群；X405選自由N及D組成之群；X406選自由N及S組成之群；X413選自由I及V組成之群；X423選自由P及L組成之群；X431選自由P及Q組成之群；X443選自由E及D組成之群；X444選自由A及T組成之群；X445選自由T及K組成之群；X448選自由A及T組成之群；X451選自由R及Q組成之群；X453選自由G及D組成之群；X465選自由V及A組成之群；X469選自由T、S及N組成之群；X475選自由A、S及T組成之群；X481選自由N及S組成之群；X482選自由N及D組成之群；X485選自由N、S及K組成之群；X487選自由E、R及K組成之群；X488選自由K、A及E組成之群；X492選自由L及V組成之群；X495選自由A及S組成之群；X497選自由H及D組成之群；X499選自由E及S組成之群；X500選自由V及L組成之群；X501選自由A及N組成之群；X502選自由H及Y組成之群；X503選自由G及R組成之群；X505選自由A及T組成之群；X507選自由I及L組成之群；X508選自由K及Q組成之群；X509選自由E及K組成之群；X512選自由G及A組成之群；X513選自由E、D及N組成之群；X514選自由以下各者組成之群：Y、G、A及N；X515選自由G及E組成之群；X516選自由L及G組成之群；X517選自由P及L組成之群；X519選自由R、P及T組成之群；X520選自由A及E組成之群；X521選自由E及K組成之群；X522選自由R、Q及K組成之群；X523選自由D、K及E組成之群；X524選自由A、T及S組成之群；X530選自由R及K組成之群；X533選自由I及L組成之群；X534選自由P及H組成之群；X535選自由R及Q組成之群；X544選自由T及I組成之群；X546選自由T、A及I組成之群；X547選自由P及D組成之群；X550選自由N及K組成之群；X551選自由A及E組成之群；X552選自由E、R及D組成之群；X553選自由E、N及R組成之群；X554選自由H及L組成之群；X555選自由I及V組成之群；X556選自由T及E組成之群；X557選自由以下各者組成之群：Q、R、H及D；X562選自由S及P組成之群；X573選自由P及T組成之群；X574選自由E及D組成之群；X575選自由S、A及R組成之群；X576選自由A、E及V組成之群；X577選自由G、E及D組成之群；X579選自由E及S組成之群；X580選自由D及N組成之群；X583選自由V及A組成之群；X588選自由M及I組成之群；X591選自由H及Y組成之群；X592選自由A及G組成之群；X603選自由A及S組成之群；X605選自由E及A組成之群；X606選自由以下各者組成之群：E、A、Q、G、V及R；X608選自由A、P及T組成之群；X609選自由I、T及P組成之群；X610選自由D及A組成之群；X614選自由V及VVKEAI組成之群；X616選自由K及E組成之群；X622選自由T、A及P組成之群；且X629選自由R、Q及H組成之群；且X630選自由K組成之群且無胺基酸。

在一些實施例中，非天然存在之融合蛋白質包含：選自由SEQ ID NO: 1-9、22-23及26中所闡述之序列中之任一者組成之群的載劑及選自由SEQ ID NO: 10-12中所闡述之序列中之任一者組成之群的有效負載或由其組成，且其中載劑及有效負載視情況藉由選自由SEQ ID NO: 13及27-29中所闡述之序列中之任一者組成之群的間隔子偶合。

本文進一步提供醫藥組合物，其包含遞送構築體及一或多種醫藥學上可接受之載劑。在一些情況下，遞送構築體由SEQ ID NO: 15中所闡述之胺基酸序列組成。在一些情況下，遞送構築體由SEQ ID NO: 17中所闡述之胺基酸序列組成。此類醫藥組合物可經調配以用於投與個體。在一些情況下，醫藥組合物經調配以用於經口投與個體。

包含遞送構築體之醫藥組合物可投與有需要其之個體(例如人類)以治療疾病。可使用本發明之遞送構築體治療之疾病包括自體免疫疾病及發炎疾病。在一些情況下，疾病為上皮細胞損傷或上皮細胞膜之損壞(例如在腸胃導管中)。在一些情況下，疾病為肝炎、肥胖症、脂肪肝病、肝臟發炎或胰臟炎、克羅恩氏病((例如瘺管性克羅恩氏病)、潰瘍性結腸炎(例如輕度至中度或中度至重度)、結腸袋炎、直腸炎、多發性硬化症、全身性紅斑性狼瘡症、移植物抗宿主疾病、類風濕性關節炎或牛皮癬。純化方法及組合物

本發明涵蓋用於獲得經純化之非天然存在之融合蛋白質的方法。非天然存在之融合蛋白質可包含IL-22及載劑，且視情況包含將IL-22偶合至載劑之間隔子。非天然存在之融合蛋白質可為包含以下的蛋白質、基本上由以下組成或由以下組成的蛋白質：與SEQ ID NO: 14-21、24或25中所闡述之胺基酸序列具有至少80%、85%、90%、95%、98%或99%序列一致性或具有100%序列一致性之胺基酸序列。本文所述之方法及組合物之優點包括維持經純化之多肽或蛋白質之高純度及生物活性。

本文所揭示之方法之特定優點包括：a)歸因於使用專門研發之摺疊緩衝液之正確摺疊，非天然存在之融合蛋白質的高生物活性；b)與低毒性配對的經純化之非天然存在之融合蛋白質之高化學純度；c)經歷純化之材料之高回收率；d)能夠可靠生產及供應之結果之再現性；e)可製造性及可擴縮性至多公克及多公斤規模，以用於臨床及商業應用；f)材料和資源的可持續使用為臨床相關分子提供了一種成本及邏輯上有效的純化方法。另外，經改良之製造方法可提高可研發用於治療用途之此等經純化的蛋白質之速度(圖 22 )。

用於純化本文所述之非天然存在之融合蛋白質的例示性製程展示於圖 17 中，其進一步說明在純化製程中之各階段非天然存在之融合蛋白質的例示性純度及回收量。

如本文所用，「純度(purity)」指示所需蛋白質(例如非天然存在之融合蛋白質)或所需形式之蛋白質(例如非天然存在之融合蛋白質之單體、經校正的非天然存在之融合蛋白質或其組合)在組合物中之含量，該組合物亦可包含非所需蛋白質或非所需形式之蛋白質(例如非天然存在之融合蛋白質之聚集體、不正確摺疊之蛋白質或其組合)。含量可由所需蛋白質或所需形式之蛋白質的百分比(%)表示。舉例而言，純度可大於40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%或99%，或可為100%。術語「經純化(purified)」可用於指示組合物已經歷純度增加。純度增加可歸因於本文所描述之純化程序，諸如陰離子交換層析、羥基磷灰石層析、陽離子交換層析或其組合。

在一些情況下，本發明之方法及組合物包含使用串聯進行之至少兩個層析管柱,隨後進行濃縮/緩衝液交換步驟(超過濾/透濾(UF/DF)以濃縮且緩衝液交換溶液)。層析管柱可為低壓層析系統，諸如來自通用電氣(General Electric，GE)之AKTA Avant 150管柱或AKTA Pilot管柱。在一些情況下，至少一個管柱含有陰離子交換樹脂(例如NH₂ -750F樹脂)及至少一個管柱含有羥基磷灰石樹脂(例如CaPure®樹脂)。在一些情況下，含有陰離子交換樹脂之至少一個管柱用於捕捉步驟，而含有羥基磷灰石樹脂之至少一個管柱用於拋光步驟。在一些情況下，替代羥基磷灰石管柱(或除羥基磷灰石管柱之外)，可使用陽離子交換管柱。舉例而言，在一些實施例中，陽離子交換管柱具有硫酸酯官能基化聚甲基丙烯酸酯樹脂，諸如TOYOPEARL硫酸酯-650F。在UF/DF之後，經溶解蛋白質之純度可自44%提高至47%，在陰離子交換層析之後可自93%提高至97%，在羥基磷灰石層析之後可提高至至少99%。在陰離子交換層析之後，經溶解蛋白質之回收率可自70%提高至73%，在羥基磷灰石層析之後可提高至至少97%。

自包涵體分離非天然存在之融合蛋白質

在一些實施例中，將待純化之非天然存在之融合蛋白質自包涵體(IB)分離。如本文所述之IB可為穩定物質(諸如蛋白質及多肽)之核或細胞質聚集體。在一些實施例中，將包含來自醱酵之非天然存在之融合蛋白質(例如SEQ ID NO: 14-21)的雙洗滌包涵體(double-washed inclusion bodies，DWIB)再懸浮於特定緩衝液系統中(參見實例 6 )。

在一些情況下，DWIB之濃度為約0.5 g DWIB/100 mL緩衝液至約5 g DWIB/10 mL緩衝液。在一些情況下，DWIB之濃度為約2 g DWIB/50 mL緩衝液至約5 g DWIB/50 mL緩衝液。在一些情況下，DWIB之濃度為約1 g DWIB/20 mL緩衝液至約1 g DWIB/10 mL緩衝液。在一些情況下，DWIB之濃度為至少1 g DWIB/100 mL緩衝液。在一些情況下，DWIB之濃度為至少1 g DWIB/10 mL緩衝液。

用於再懸浮之緩衝液系統可包含多種緩衝劑及成分。在一些情況下，用於再懸浮之緩衝液系統包含濃度為至少1 M、至少2 M、至少4 M、至少6 M、至少8 M之胍/鹽酸(Gu-HCl)。在一些情況下，Gu-HCl之濃度為約4 M至約8 M。在一些情況下，用於再懸浮之緩衝液系統包含Tris緩衝液，其中Tris之濃度為至少5 mM、至少10 mM、至少20 mM、至少50 mM或至少100 mM。在一些情況下，Tris緩衝液之濃度為約40 mM至約60 mM。Tris緩衝液可為Tris-HCl。Tris-HCl之pH可為8.0至8.5。Tris-HCl之pH可為8.2。在一些情況下，用於再懸浮之緩衝液系統包含二硫蘇糖醇(dithiothreitol，DTT)。DTT之濃度可為至少7 mM、8 mM、9 mM、10 mM、20 mM、30 mM、40 mM、50 mM、60 mM或70 mM。DDT之濃度可為7 mM至11 mM、8 mM至10 mM或9 mM至10 mM。在一些情況下，用於再懸浮之緩衝液系統包含乙二胺四乙酸(EDTA)。EDTA之濃度可為至少1 mM、1.5 mM、2 mM或2.5 mM。EDTA之濃度可為1 mM至2.5 mM或1.9 mM至2.1 mM。在一些實施例中，用於再懸浮之緩衝液系統包含以下、基本上由以下組成或由以下組成：Tris緩衝液、Gu-HCl及DTT。用於再懸浮之緩衝液系統之pH可為約6至約10。在一些情況下，緩衝液系統之pH為約7.5至約8.5。在一些情況下，緩衝液系統之pH為至少7。在一些情況下，緩衝液系統之pH為至少8。在一些情況下，緩衝液系統之pH為至少8.5。

經溶解之非天然存在之融合蛋白質之還原

還原劑可添加至再懸浮溶液中。還原劑可為二硫蘇糖醇(DTT)。所用還原劑之量可視再懸浮溶液之體積及存在於該溶液中之融合蛋白質而定。在一些情況下，所用還原劑之量為約0.025 mM至約50 mM、0.5 mM至30 mM、1 mM至10 mM。在一些情況下，所用還原劑之量為至少(或在其之間) 2 mM、3 mM、4 mM、5 mM、6 mM、7 mM、8 mM、9 mM或10 mM。

經溶解之非天然存在之融合蛋白質(例如SEQ ID NO: 14-21)溶液可在約2℃至約40℃範圍內之各種溫度下培育。在一些情況下，可在室溫(RT)下培育蛋白質溶液。可在攪拌溶液的同時進行培育。溶液可在磁性攪拌盤上攪拌且隨後離心。離心可在約1,000 xg至約20,000 xg下進行。在一些情況下，在4℃下在15,970 xg下進行離心90分鐘。培育時間可在約20分鐘至約180分鐘之範圍內變化，視成分濃度、融合蛋白質(例如SEQ ID NO: 14-21)之濃度而定。

在如本文所述之整個方法及程序中之各種溶液中的蛋白質濃度可使用Bradford分析進行。經溶解之非天然存在之融合蛋白質的濃度可為約1 mg/mL至約50 mg/mL。在一些情況下，經溶解之非天然存在之融合蛋白質的最終濃度可為約3 mg/mL至約30 mg/mL。在一些情況下，經溶解之非天然存在之融合蛋白質的最終濃度可為約5 mg/mL至約20 mg/mL。在一些情況下，經溶解之非天然存在之融合蛋白質的最終濃度可為至少15 mg/mL。

非天然存在之融合蛋白質之再摺疊

本發明之非天然存在之融合蛋白質由於其特定三維結構或摺疊可發揮其生物活性。因此，此等多肽之再摺疊在研發此等用於醫藥應用之多肽中可為重要的。包含至少一種載劑及IL-22之融合蛋白質的合乎需要的再摺疊可包含將載劑或IL-22再摺疊成類似於同源天然存在之載劑或IL-22序列之第三結構的第三結構或摺疊成使得維持載劑及IL-22之所需活性(例如融合蛋白質之胞移作用)的第三結構。本文所描述之方法可包含再摺疊經溶解之非天然存在之融合蛋白質以產生經再摺疊之非天然存在之融合蛋白質。再摺疊可在進行陰離子交換層析之前發生。

可添加經溶解之蛋白質(例如SEQ ID NO: 14-21)至再摺疊溶液，亦稱為再摺疊緩衝溶液。所用經溶解蛋白質之量可為0.1 mg/mL至1 mg/mL、1 mg/mL至100 mg/mL、1 mg/mL至50 mg/mL、1 mg/mL至10 mg/mL、5 mg/mL至20 mg/mL或約15 mg/mL。經溶解蛋白質之量可為至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10 mg/mL。經溶解蛋白質之量可為不超過0.1、0.5、1、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90或100 mg/mL。再摺疊溶液之pH可在7.5與8.5之間或約7.0。

再摺疊緩衝溶液可包含胺基酸、多元醇、鹽、糖、氧化還原試劑、離液劑或其組合。胺基酸可為脯胺酸、甘胺酸、精胺酸或丙胺酸。多元醇可為甘油。鹽可為氯化鈉(NaCl)、氯化鉀(KCl)或氯化鎂(MgCl₂ )。糖可為葡萄糖或蔗糖。氧化還原試劑可為半胱胺酸、胱胺、麩胱甘肽、二硫蘇糖醇(DTT)或硫酸銅(CuSO₄ )。在一些實施例中，再摺疊緩衝液包含Tris-鹼、精胺酸-HCl、脲、EDTA、甘油、L-半胱胺酸、胱胺-2HCl、DTT、Gu-HCl或其組合。在一些實施例中，再摺疊緩衝液包含以下、基本上由以下組成或由以下組成：pH為8.5之Tris、精胺酸甘油、半胱胺酸及胱胺。Tris緩衝液之濃度可在約20 mM至約200 mM範圍內，其中pH範圍為約6至約9。精胺酸-HCl之濃度可在約0.1 M至約1.5 M、約0.75 M至1.25 M之範圍內或約1.0 M。脲之濃度可在約0.5 M至1.5 M範圍內。EDTA之濃度可在1 mM至3 mM範圍內。甘油之濃度可在約2% v/v至約20% v/v、約8% v/v至約12% v/v範圍內或約10% v/v。半胱胺酸之濃度可為1 mM至5 mM、2 mM至4 mM或約3 mM。半胱胺酸可為L-半胱胺酸。胱胺之濃度可在約0.5 mM至約5 mM、約1 mM至約4 mM範圍內或約3 mM。胱胺可為胱胺-2HCl。DTT之濃度可在約0.1 mM至約1 mM範圍內。Gu-HCl之濃度可在約50 mM至約500 mM範圍內。再摺疊緩衝液可包含以下、基本上由以下組成或由以下組成：Tris、L-精胺酸、脲、EDTA、半胱胺酸及胱胺。再摺疊緩衝液可包含以下、基本上由以下組成或由以下組成：pH為8.5之100 mM Tris、1 M精胺酸、10% (v/v)甘油、3 mM L-半胱胺酸及1 mM胱胺-2HCl。可將經溶解之非天然存在之融合蛋白質添加至再摺疊緩衝液以產生再摺疊混合物。在添加至再摺疊混合物之後，非天然存在之融合蛋白質的濃度可為約0.1 mg/mL至1.0 mg/mL、0.5 mg/mL至1.5 mg/mL、0.75 mg/mL至1.25 mg/mL或約1 mg/mL。再摺疊混合物中之非天然存在之融合蛋白質的濃度可為小於0.5 mg/mL、0.6 mg/mL、0.7 mg/mL、0.8 mg/mL、0.9 mg/mL或1.0 mg/mL。

在各種實施例中，使用約100 mL至約10,000 L體積之再摺疊緩衝液。在一些情況下，體積為約50 mL至約1500 L。在一些情況下，體積為約10 L至約300 L。在一些情況下，體積為至少200 L。

再摺疊溶液可具有一定溫度。舉例而言，可將再摺疊溶液預冷卻至約2-12℃。在一些情況下，將再摺疊溶液預冷卻至至少約3℃。此再摺疊製程可視所用蛋白質及應用而最佳化(圖 18 )。

在本發明之一些實施例中，再摺疊混合物培育一定時間段。在一些情況下，該製程可為約一小時、兩小時、四小時、五小時或20小時。在一些情況下，再摺疊製程花費約15至約25小時。在一些情況下，根據溶液之組成(例如，濃度或體積)將蠕動泵設定為某一流動速率以將經溶解物質遞送至再摺疊溶液中。在一些情況下，將蠕動泵之流動速率設定為60-80 ml/分鐘。最佳化製程利用15個不同基質、12個變數及200個再摺疊反應之實驗設計(DOE)。藉由消去製程進行決策。

在各種實施例中，可進行定量分析以確定包含經再摺疊之非天然存在之融合蛋白質的溶液中之正確摺疊之蛋白質的量或百分比。在一些情況下，進行SEC-HPLC以確定存在於再摺疊樣品中之適當摺疊之非天然存在之融合蛋白質的量。

經再摺疊之非天然存在之融合蛋白質的純度可為45%至65%、40%至60%或45%至55%。經再摺疊之非天然存在之融合蛋白質的純度可為至少40%、45%、50%或55%。

經溶解之 IL - 22 遞送構築體之切向流式過濾 ( Tangential flow filtration ， TFF )

在各種實施例中，蛋白質再摺疊與具有某些截止分子量(MWCO)之切向流式過濾(TFF)系統(例如Millipore)及超過濾/透濾(UF/DF)系統組合進行或在其之前進行。

蛋白質再摺疊混合物可隨後藉由TFF處理以濃縮且緩衝液交換溶液。在一些情況下，該製程藉由超過濾/透濾(UF/DF)進行。在超過濾期間，溶液可濃縮至8倍至12倍，或約10倍。在使用透濾緩衝液之透濾期間，超過濾之後可進行5倍緩衝液交換。UF/DF可包含使用具有1-2 m² TFF平板卡匣之10-20 kDa MWCO Millipore Ultracell Pellican3之過濾器。特定參數(亦即TMP)可視蛋白質之分子特徵而變化。透濾緩衝液可包含pH為約7至約8.5之10-25 mM Tris-鹼及50-200 mM NaCl。特定參數可視蛋白質之分子特徵而變化。UF/DF製程結束時之最終體積可為約5 L至約100 L。在一些情況下，最終體積在約10至約50 L範圍內。在一些情況下，最終體積在約80 mL至約10 L範圍內。

隨後可使用流式過濾系統進行過濾。在一些情況下，流式過濾系統為AkroPac過濾器系統及Cole-Parmer蠕動泵及導管。可進行Bradford分析以確定蛋白質濃度、產率及步驟回收率。

在各種實施例中，可進行定量分析以確定樣品溶液中正確摺疊之蛋白質的量或百分比。在一些情況下，進行SEC-HPLC以確定存在於再摺疊及UF/DF樣品中之適當摺疊之非天然存在之融合蛋白質的量。

在UF/DF之後包含再摺疊非天然存在之融合蛋白質的溶液之純度可為35%至55%、40%至50%、43%至47%或約45%。在UF/DF之後包含再摺疊非天然存在之融合蛋白質的溶液之純度可為至少35%、40%或45%。在UF/DF之後，經溶解的、再摺疊之非天然存在之融合蛋白質的回收率可為87%至97%、90%至94%、92%至93%或約92.5%。(亦可使用其他濃度及緩衝液交換系統。)

非天然存在之融合蛋白質之純化及回收

如先前所描述，使用以串聯方式之兩種層析，諸如陰離子交換層析法及羥基磷灰石層析(或替代地陽離子交換層析)可使得來自溶液之非天然存在之融合蛋白質(諸如本文所述之IL-22遞送構築體)之純度及回收率增加。在本發明之各種實施例中，層析特異性(例如管柱類型、樹脂、流動速率、緩衝液系統、梯度及傳導率)視各種參數(例如待純化之蛋白質)而確定及最佳化。如本文所描述，可使用多種純化管柱進行蛋白質純化。

陰離子交換層析

本文所描述之方法可包含對包含非天然存在之融合蛋白質的混合物進行陰離子交換層析(AEX)。混合物可為包含再摺疊非天然之融合蛋白質的溶液。進行陰離子交換層析可產生包含非天然存在之融合蛋白質的第一溶離份。

多種樹脂可與本發明之方法及組合物組合使用。在一些情況下，樹脂包括胺官能基化聚甲基丙烯酸酯珠粒。在一些情況下，陰離子交換樹脂NH₂ -750F用於蛋白質純化。具有至少15 cm、20 cm、25 cm或30 cm之床層高度之管柱可用樹脂填充。具有床層高度為10 cm至50 cm之管柱可以確保管柱體積之方式用樹脂填充，該管柱體積可促進適當動態結合能力(例如＞20 g/L)以使得能夠產生所需數量之蛋白質。在一些情況下，管柱之動態結合能力為5 g/L至100 g/L、20 g/L至約50 g/L、15 g/L至30 g/L或20 g/L至25 g/L。

用於陰離子交換層析中之溶離(例如，梯度溶離)之緩衝液系統可包含一種、兩種、三種或四種不同緩衝溶液(例如，緩衝液A至D)。在一些實施例中，兩種緩衝液用於陰離子交換層析且在本文中稱為緩衝液A及緩衝液B。在一些情況下，緩衝溶液包含Tris(例如10-50 mM，pH7-9)及/或NaCl(例如0.1-5 M)。在一些情況下，緩衝溶液進一步包含甘油。在一些實施例中，用於陰離子交換層析中之一或多種緩衝溶液(諸如緩衝液A或緩衝液B)包含以下、基本上由以下組成或由以下組成：pH 7.5之Tris及NaCl，及視情況選用之甘油。

緩衝液A可包含pH為7.5之10 mM至30 mM、15 mM至25 mM、19 mM至21 mM或約20 mM Tris。緩衝液A可包含0.25 M至0.95 M、0.35 M至0.75 M、0.45 M至0.55 M、約0.5 M、0.65 M至0.75 M或約0.7 M NaCl。緩衝液B可包含pH為7.5之10 mM至30 mM、15 mM至25 mM、19 mM至21 mM或約20 mM Tris。緩衝液B可包含1 M至3 M、1.5 M至2.5 M、1.9 M至2.1 M或約2 M NaCl。緩衝液A可進一步包含8%至12%、9%至11%或約10% (v/v)甘油。緩衝液B可進一步包含8%至12%、9%至11%或約10% (v/v)甘油。

對於SEQ ID NO: 15之陰離子交換層析，緩衝液A可包含pH為7.5之20 mM Tris及0.5 M NaCl，且緩衝液B可包含pH為7.5之20 mM Tris及2.0 M NaCl(表 4 )。對於SEQ ID NO: 17之陰離子交換層析，緩衝液A可包含pH為7.5之20 mM Tris及0.5 M NaCl，且緩衝液B可包含pH為7.5之20 mM Tris及2.0 M NaCl。對於SEQ ID NO: 14之陰離子交換層析，緩衝液A可包含pH為7.5之20 mM Tris、0.7 M NaCl及10% (v/v)甘油，且緩衝液B可包含pH為7.5之20 mM Tris、2.0 M NaCl及10% (v/v)甘油(表 5 )。

在一些實施例中，將一定體積之鹽溶液添加至蛋白質溶液中。在一些情況下，將濃度為約0.1至約5 M之NaCl溶液添加至蛋白質溶液中。

可將蛋白質溶液裝載至管柱上使得可觀測到特定流動速率及特定管柱滯留時間以確保蛋白質與固相(例如樹脂)之適當相互作用。在一些情況下，控制流動速率使得管柱滯留時間為約30秒至約6分鐘，或約5分鐘。管柱滯留時間可為至少30秒，或1、2、3、4或5分鐘。管柱滯留時間可不超過3、4、5、6、7、8、9或10分鐘。可收集且分析流過物以確定是否存在未結合之蛋白質，其視為損失。對於蛋白質分析及純化，在約280 nm處測定蛋白質濃度之吸光度及SEC-HPLC測定蛋白質純度。

在一些實施例中，將第一緩衝液之百分比(例如0-100%)或流動速率(例如1-10 mL/min)與第二緩衝液組合以獲得管柱純化系統之特定最終流動速率(例如1-10 mL/min)。舉例而言，針對蛋白質純化進行20個管柱體積(CV)0.0-62.5% B (100-37.5% A)之線性梯度，隨後對另外5個CV進行階段梯度至100% B (0% A)。在一些情況下，40個CV梯度為0-75% B (100-25% A)，梯度增加至100% B，10個CV可作為指示91-93%純蛋白質及＞90%之回收率之溶離梯度進行。

第一溶離份中之非天然存在之融合蛋白質之純度可為90%至99%或91%至95%。第一溶離份中之經溶解的非天然存在之融合蛋白質之純度可為至少90%、91%、92%、93%、94%或95%。第一溶離份中之經溶解的非天然存在之融合蛋白質之回收率可為61%至81%、66%至76%或71%至72%。

陽離子交換層析或羥基磷灰石層析

本文所描述之方法可進一步包含使在陰離子交換層析之後獲得之第一溶離份經受陽離子交換樹脂以獲得包含非天然存在之融合蛋白質的第二溶離份。陽離子交換樹脂可為硫酸酯官能基化之甲基丙烯酸酯樹脂。陽離子交換樹脂可為TOYOPEARL®硫酸酯-650F樹脂。

本文所描述之方法可另外地或可替代地包含使在陰離子交換層析之後獲得之第一溶離份經受羥基磷灰石樹脂以獲得包含非天然存在之融合蛋白質的第二溶離份。羥基磷灰石樹脂可為進一步包含鈣親和力之陽離子交換樹脂。羥基磷灰石樹脂可包含磷酸鈣。羥基磷灰石樹脂可包含化學式Ca₁₀ (PO₄ )₆ (OH)₂ 。羥基磷灰石樹脂可包含30 µm至50 µm、35 µm至45 µm或約39 µm之粒度。羥基磷灰石樹脂可為CaPure®樹脂。

CaPure®樹脂之優點可包括：a)耐鹽性，允許在水溶液中以高傳導率進行蛋白質吸附；b)在負載之前不需要製備蛋白質(例如融合蛋白質，諸如SEQ ID NO: 14-21)；c)產生高回收率(＞90%)；d)高結合能力(＞20 mg/mL樹脂)；e)藉由移除低分子量(LMW)雜質而提高純度；及f)確保內毒素間隙(＜1.0 EU/mg)。

陽離子交換樹脂或羥基磷灰石樹脂可用於封裝層析管柱。管柱可包含10 cm至50 cm或約20 cm之床層高度。管柱可包括至少10 cm、15 cm、20 cm、25 cm或30 cm之床層高度。管柱可包含不超過20 cm、30 cm、40 cm或50 cm之床層高度。在一些情況下，羥基磷灰石混合模式樹脂CaPure®用於封裝具有10-50cm之床層高度的管柱，其確保促進最大10-100 g/L之動態結合能力之管柱體積以使得能夠產生所需數量之蛋白質。

用於在羥基磷灰石層析中溶離(例如，梯度溶離)之緩衝液系統可包含一種、兩種、三種或四種不同緩衝溶液(例如，緩衝液A至D)。在一些實施例中，兩種緩衝液用於羥基磷灰石層析且在本文中稱為緩衝液A及緩衝液B。在一些情況下，緩衝溶液包含Tris(例如10-50 mM，pH7-9)及/或NaCl(例如0.1-5 M)。在一些情況下，緩衝溶液進一步包含甘油。在一些實施例中，用於羥基磷灰石層析之第一緩衝溶液(諸如緩衝液A)包含以下、基本上由以下組成或由以下組成：pH為7.5之Tris、NaCl及CaCl₂ 。在一些實施例中，用於羥基磷灰石層析之第二緩衝溶液(諸如緩衝液B)包含以下、基本上由以下組成或由以下組成：pH為7.0之磷酸鈉、NaCl及CaCl₂ 。

緩衝液A可包含pH為7.5之10 mM至30 mM、15 mM至25 mM、19 mM至21 mM或約20 mM Tris。緩衝液A可包含80 mM至120 mM、90 mM至110 mM或約100 mM NaCl。緩衝液A可包含0.5 mM至1.5 mM、0.75 mM至1.25 mM、0.9 mM至1.1 mM或約1 mM CaCl₂ 。緩衝液B可包含pH為7.0之150 mM至250 mM、175 mM至225 mM、190 mM至210 mM或約200 mM磷酸鈉。緩衝液B可包含50 mM至150 mM、75 mM至125 mM、90 mM至110 mM或約100 mM NaCl。緩衝液B可包含0.5 mM至1.5 mM、0.75 mM至1.25 mM、0.9 mM至1.1 mM或約1 mM CaCl₂ 。

對於SEQ ID NO: 15之羥基磷灰石層析，緩衝液A可包含pH為7.5之20 mM Tris、100 mM NaCl及1 mM CaCl₂ ，且緩衝液B可包含pH為7.0之200 mM磷酸鈉、100 mM NaCl及1 mM CaCl₂ (表 6 )。對於SEQ ID NO: 17之羥基磷灰石層析，緩衝液A可包含pH為7.5之20 mM Tris、100 mM NaCl及1 mM CaCl₂ ，且緩衝液B可包含pH為7.0之200 mM磷酸鈉、100 mM NaCl及1 mM CaCl₂ 。對於SEQ ID NO: 14之羥基磷灰石層析，緩衝液A可包含pH為7.5之20 mM Tris、100 mM NaCl及1 mM CaCl₂ ，且緩衝液B可包含pH為7.0之200 mM磷酸鈉、100 mM NaCl及1 mM CaCl₂ (表 7 )。

在使用陽離子交換樹脂或羥基磷灰石樹脂之後，經溶解的蛋白質之純度可為99%至100%。在使用羥基磷灰石樹脂之後，經溶解的蛋白質之純度可為至少95%、96%、97%、98%、99%或100%。在使用羥基磷灰石樹脂之後，經溶解的蛋白質之回收率可為85%至100%、96%至99%或97%至98%。羥基磷灰石樹脂可為CaPure®。

在管柱層析期間收集之含有經純化之化合物(例如融合蛋白質)的溶離份可使用緩衝液交換或透濾進行濃縮及調配以投與。舉例而言，可使用TFF系統(例如Pall公司)濃縮及調配在CaPure®期間收集之溶離份以濃縮蛋白質。可將蛋白質濃縮至20 mg/mL之最終濃度，隨後進行5倍緩衝液交換。過濾製程可使用超過濾/透濾(UF/DF)及具有10 kDa MWCO Millipore Pellican3、0.114 m² TFF平板卡匣之過濾器進行。過濾系統之MWCO可視待純化之蛋白質(例如分子量)而變化。透濾緩衝液可由pH為約7.0之10-20 mM磷酸鈉、50-100 mM NaCl組成。可隨後使用採用AkroPac 0.8/0.2 μm過濾器及Cole-Parmer蠕動泵及導管之流式過濾系統來過濾經調配之SEQ ID NO: 14-21。經純化及調配之蛋白質可在-80℃下以等分試樣儲存直至進一步使用。

在特定實施例中，藉由SEC-HPLC(使用TSKgel GW3000SWXL、5 µm、7.8 mm ID×30.0 cm L管柱(Tosoh Bioscience, 8541))分析之蛋白質可展示高於97%純度(通常＞98%)。蛋白質分析

來自不同溶離份之樣品可藉由SDS-PAGE(使用Bio-Rad ChemiDoc^TM MP成像系統)分析，且在管柱層析期間收集之溶離份可使用Thermo Fisher Nanodrop One^TM 分析蛋白質含量。蛋白質檢測或分析之一般技術包括凝膠電泳、螢光顯微法、毛細電泳法、質譜分析、電泳遷移分析或核磁共振。治療方法

在本發明之各種實施例中，提供包含本發明之融合分子的醫藥組合物，其用於治療及/或預防發炎性疾病。此等醫藥組合物可經調配用於經口遞送。「發炎性疾病」可包括與急性或慢性發炎相關之所有疾病。急性發炎為身體對有害刺激之初始回應且由血漿及白血球(諸如粒細胞)自血液移動至受傷組織中之增加產生。多種生物化學事件傳播及促成發炎回應，其涉及局部血管系統、免疫系統及受傷組織內之各種細胞。長期發炎稱為慢性發炎，其引起存在於發炎部位之細胞類型之進行性變換且特徵在於自發炎過程起同時進行的組織之破壞及癒合。發炎性疾病可由例如燒傷、化學刺激物、凍傷、毒素、由病原體感染、物理損傷、由過敏引起之免疫反應、電離輻射或異物(諸如碎片、廢屑及碎屑)引起。在一些實施例中，發炎性疾病為上皮細胞損傷、肝炎、肥胖症、脂肪肝病、肝臟發炎、胰臟炎、克羅恩氏病、瘺管性克羅恩氏病、潰瘍性結腸炎、輕度至中度潰瘍性結腸炎、中度至重度潰瘍性結腸炎、結腸袋炎、直腸炎、多發性硬化症、全身性紅斑性狼瘡症、移植物抗宿主疾病、類風濕性關節炎或牛皮癬。

本文進一步描述用於治療個體之疾病或病狀之方法，其包含向個體投與非天然存在之融合蛋白質。在一些實施例中，疾病或病狀為上皮細胞損傷、肝炎、肥胖症、脂肪肝病、肝臟發炎、胰臟炎、克羅恩氏病、瘺管性克羅恩氏病、潰瘍性結腸炎、輕度至中度潰瘍性結腸炎、中度至重度潰瘍性結腸炎、結腸袋炎、直腸炎、多發性硬化症、全身性紅斑性狼瘡症、移植物抗宿主疾病、類風濕性關節炎或牛皮癬。非天然存在之融合蛋白質可經口投與個體。個體可為人類。實例

此等實例僅出於說明之目的提供且不限制本文所提供之申請專利範圍之範疇。實例 1 遞送構築體之表達

在此實例中，通常描述作為包含衍生自Cholix、間隔子序列及治療有效負載之載劑序列的單個胺基酸序列之遞送構築體之製備。

首先，藉由PCR擴增編碼SEQ ID NO: 15之遞送構築體之核酸序列，將NdeI與EcoRI、PstI與PstI、AgeI與EcoRI或PstI與EcoRI部位之限制酶對併入PCR產物之兩端。在限制酶消化之後，將PCR產物克隆至用於細胞表現之適當質體中，該質體用對應限制酶對消化。質體編碼包含SEQ ID NO: 15中所闡述之胺基酸序列之遞送構築體。

遞送構築體表現如下：將大腸桿菌BL21(DE3) pLysS勝任細胞(Novagen, Madison, Wis.)在適當質體之存在下使用標準熱休克法(heat-shock method)轉化以產生遞送構築體表現細胞，在含胺苄青黴素之培養基上選定，且分離且使用抗生素在Luria-Bertani培養液(Difco; Becton Dickinson, Franklin Lakes, N.J.)中生長，隨後藉由在OD 0.6下添加1 mM異丙基-D-硫代哌喃半乳糖苷(IPTG)來誘導蛋白質表現。在IPTG誘導之後兩小時，藉由以5,000 rpm離心10分鐘來採集細胞。在細胞裂解之後分離包涵體，且用水以1 g/10 mL之比率洗滌兩次。將來自細胞裂解之集結粒用水再懸浮，隨後在4℃下以10,000 rpm離心一小時。接著重複此洗滌一次。其中將經雙洗滌之IB(DWIB)溶解於含有50 mM Tris-HCl(pH 8.2)、6 M胍HCl及10 mM二硫蘇糖醇(DTT)之緩衝液中。隨後將經溶解物質稀釋成含有0.1 M Tris(pH=8.5，在4℃下)、1.0 ML-精胺酸、10%甘油、3 mM L-半胱胺酸、1 mM胱胺-2HCl之再摺疊緩衝液。藉由陰離子交換層析(Q瓊脂糖凝膠離子交換)及Superdex 200凝膠過濾層析(瑞典Amersham Biosciences公司)純化具有SEQ ID NO: 15之再摺疊蛋白質。藉由SDS-PAGE及分析HPLC (Agilent公司Palo Alto, Calif.)來評估蛋白質之純度。

評估遞送構築體以檢驗關於其預期分子大小之適當摺疊。在誘導之後，自包涵體收集所表現之蛋白質。使用包涵體，藉由凝膠電泳檢驗遞送構築體之表現程度，且將表觀分子量與計算質量進行比較。

結果表明以高產率及純度穩定且有效生產功能性遞送構築體。實例 2 活體外 模型評估有效負載穿過上皮細胞單層之轉運

此實例表明經設計以評估本文所描述之有效負載或遞送構築體之轉運特性的活體外 模型。

圖 1 示意性地展示包含上皮細胞單層上方之端室及此上皮細胞單層下方之基底室的設置。

對於頂端至底外側滲透率，將測試物品(例如，遞送構築體、有效負載等)添加至頂端(A)側且在基側(B)側面上測定滲透量。對於底外側至頂端滲透率，將測試物品添加至底外側(B)側面且在頂端(A)側測定滲透量。

可根據以下等式表述資料為滲透率(Papp)：Papp=(dQ/dt)/(C0*A)。Q/dt為滲透速率，C0為測試物品之初始濃度，且A為單層之面積。可根據以下等式計算流出轉運率(Re)：(Re)=Papp(B-A)/Papp(A-B)。Re＞2可指示P-gp或其他活性流出轉運體之潛在基質。

可使用SMI-100或Caco-2細胞評估載劑或遞送構築體在活體外 之胞移作用功能。

對於Caco-2細胞，進行ELISA分析以評估載劑或遞送構築體經由胞移作用移動穿過Caco-2細胞單層之能力。在37℃下之5% CO₂ 中，使Caco-2 (ATCCHTB-37 ™ )細胞維持於完整培養基：補充有10%胎牛血清、2.5 mM麩醯胺酸、100 U青黴素/ml及100 μg鏈黴素/ml(Gibco BRL, Grand Island, N.Y.)的達爾伯克改良伊格爾培養基F12(Dulbecco's modified Eagle's medium F12，DMEM F12)中。每2至3天用此培養基(經指定之完全培養基)飼餵細胞且每5至7天繼代。為了分析，將細胞接種至24或96孔板中且使其生長以匯合。

Caco-2細胞在經膠原蛋白塗佈之0.4 μm孔徑聚碳酸酯膜跨孔載劑(Corning-Costar, Cambridge, MA)上生長為匯合單層，且在達到如使用chopstick Millicell-ERS®電壓錶(Millipore)所量測之＞250 Ω·cm² 的跨上皮電阻(TER)之後18-25天使用。在37℃下在頂端施加4.7 nM、23.6 nM及236 nM之遞送構築體之後，藉由量測在某些時間點(例如15分鐘、30分鐘及45分鐘)處之所轉運蛋白質的量來確定載劑或遞送構築體穿過此等單層之頂端至底外側(A→B)之轉運。在研究過程期間，TER量測值及10 kDa螢光聚葡萄糖之範圍(使用HPLC粒徑篩析協定來量測)用以驗證單層障壁特性。遞送構築體(例如SEQ ID NO: 15)之轉運程度藉由在基於細胞之細胞毒性分析中所收集之培養基滴定來測定。所轉運之遞送構築體藉由使用用於捕獲及檢測之抗體(例如抗載劑或抗有效負載，諸如抗IL-22抗體)之酶聯免疫吸附分析(enzyme linked immunosorbant assay，ELISA)來量測。

在使用之前在37℃下使建立於細胞培養插入物上之人類小腸組織之匯合單層(SMI-100, MatTek公司; Ashland, MA, USA)穩定24 h。僅將具有＞400 Ω•cm² 之跨上皮電阻(TEER)的插入物視為具有足夠的單層完整性以用於研究。藉由評估70 kD聚葡萄糖轉運之遏制來進行單層完整性之次級驗證。使用轉運緩衝液(PBS)洗滌該等腔室一次。以20 µg/mL之濃度製備之測試分子以100 µL體積施加至插入物之頂端表面。在各時間點處替換500 µL PBS之底外側體積以用於轉運研究。各實驗條件進行重複三次。實例 3 IL - 22 穿過極化腸道上皮細胞之載劑介導之轉運

此實例表明載劑(SEQ ID NO: 7)可活體外 穿過極化腸道上皮細胞轉運IL-22有效負載(SEQ ID NO: 11)。此實例進一步表明具有SEQ ID NO: 7之載劑可活體內 將轉運穿過極化腸道上皮細胞及至固有層轉運生物活性IL-22有效負載。

根據實例 2 且如圖 1 中針對頂端(A)至基底(B)轉運所說明，遞送構築體(SEQ ID NO: 15)穿過Caco-2細胞單層及小腸上皮組織(在本文中亦稱為SMI-100)之轉運藉由將遞送構築體施加於上皮細胞之頂膜來測試。實驗重複進行兩次且在頂端施加之後15、30及45分鐘收集來自基側腔室之樣品以確定所轉運蛋白質之量。胞移作用蛋白質之量使用如實例 2 中所描述之ELISA分析量測。

圖 2 及圖 3 中之資料展示當偶合至IL-22(SEQ ID NO: 11)時，載劑(SEQ ID NO: 7)引起IL-22有效負載以時間依賴性方式轉運穿過Caco-2(圖 2 )及SMI-100(圖 3 )單層兩者，且與不偶合至載劑之單獨的IL-22(SEQ ID NO: 12, M+ IL-22³⁴ ^- ¹⁷⁹ )相比，遞送構築體使得超過約2-3倍的IL-22穿過上皮細胞。

對於活體內 實驗，使用雄性威斯塔大鼠測試胞移作用。使用12/12小時日間/夜間循環在每籠圈養3-5隻雄性威斯塔大鼠，且當該等雄性威斯塔大鼠在置放於研究時為約225-275 g(大致6-8週大)。在日間階段期間使用不恢復協定進行實驗，該不恢復協定持續使用異氟醚麻醉。進行暴露中間空腸區域之4-5 cm腹部中線切開。在磷酸鹽緩衝鹽水(phosphate buffered saline，PBS)中製備呈3.86x10^- ⁵ M之遞送構築體(SEQ ID NO: 15)的儲備溶液，其中藉由使用29規格針頭腔內注射(ILI)來投與50 µL(每250 g大鼠)。隨後使用永久性標記物來標記注射部位腸系膜。在研究終止時，將所捕獲之標記腸片段之3-5 mm區域分離且處理以用於顯微評估。

遞送構築體(SEQ ID NO: 15)之胞移作用活性的結果展示於圖 4 中，表明當以包括偶合至IL-22之Cholix衍生之載劑(SEQ ID NO: 7)的遞送構築體之部分的形式提供時，大量IL-22有效負載(SEQ ID NO: 11)活體內 穿過完整且經極化之腸道上皮。此顯微影像展示，在將SEQ ID NO: 15之遞送構築內腔施加至威斯塔大鼠之空腸之後，IL-22有效負載(SEQ ID NO: 11)自腸道上皮之頂端部位(藉由白色箭頭#1突出顯示)轉運至上皮細胞之基底部位(藉由白色箭頭#2突出顯示)且達至固有層 (縮寫為「l.p.」)。影像進一步展示，IL-22相互作用且以顯著程度結合至位於固有層內之細胞及極化上皮之外部基底膜上(藉由白色箭頭#3突出顯示)之IL-22受體。IL-22位置由白色箭頭#2及#3指示。實例 4 重組人類 IL - 22 結合至鼠類 IL - 22 受體

此實例表明重組型人類IL-22(rhIL-22，SEQ ID NO: 12)以與重組鼠類IL-22(rmIL-22)相當之劑量依賴性方式結合至鼠類IL-22受體。

圖 5A 表明隨促效劑濃度(以pM為單位)而變之鼠類FL83 B細胞中之STAT3磷酸化，其中促效劑為rhIL-22(SEQ ID NO: 12)或rmIL-22。資料展示rhIL-22及rmIL-22以濃度依賴性方式誘導STAT3磷酸化，表明人類IL-22蛋白質可如小鼠IL-22有效地結合且誘導信號轉導通過小鼠IL-22受體。

圖 5B 表明rhIL-22(SEQ ID NO: 12)及rmIL-22亦誘導鼠類Hepa1-6細胞中之STAT3磷酸化。

圖 6A 表明rhIL-22(SEQ ID NO: 12)及rmIL-22以劑量依賴性方式誘導鼠類FL83 B細胞中之STAT5磷酸化，表明人類IL-22蛋白質可與小鼠IL-22類似有效地結合且誘導信號轉導通過小鼠IL-22受體。

圖 6B 表明rhIL-22(SEQ ID NO: 12)及rmIL-22亦誘導鼠類Hepa1-6細胞中之STAT5磷酸化，但在後續實驗中將需要進行額外劑量範圍。

此等資料提供較強證據表明rhIL-22(例如，如在具有SEQ ID NO: 10或11之遞送構築體中所用)能夠活化鼠類細胞中之STAT3及STAT5，因此提供將此類遞送構築體用於鼠類模型中來評估IL-22活性及功能之基本原理。實例 5 具有 SEQ ID NO : 15 之遞送構築體在結腸炎模型中之活體內 功效

此實例表明與單獨的IL-22(SEQ ID NO: 12)相比，在硫酸葡聚糖鈉(DSS)小鼠模型中，經由具有SEQ ID NO: 13之連接子偶合至具有SEQ ID NO: 11之IL-22的包含Cholix衍生之載劑之SEQ ID NO: 7的具有SEQ ID NO: 15之遞送構築體之活體內 功效。

圖 7A 展示活體內研究設計及時刻表之概述，其用於比較經口(p.o.)投與兩個每日一次劑量含量1 mg/kg及30 mg/kg之SEQ ID NO: 15的遞送構築體及一個每日一次投與(腹膜內(i.p.)) 4 mg/kg之rhIL-22。在正常食物餵飼、8-10週齡、約23 g雌性C57BL/6小鼠中進行活體內 研究。結腸炎係用飲用水中之2.5%硫酸葡聚糖鈉(DSS)進行任意化學誘導。研究終點包括體重、疾病活性指數、結腸長度及重量，及病理組織學之變化百分比。

圖 7B 展示用於圖 7A 中所述之研究中的實驗及對照組的特徵。

圖 8A 展示相對於不同實驗及對照組之第0天，在研究第10天動物之體重變化百分比(%)。如藉由單因子變異數分析所評估，藉由具有SEQ ID NO: 12 之rhIL-22或具有SEQ ID NO: 15之遞送構築體的基線(第0天對第10天)體重變化相對於媒劑並不顯著。如藉由單因子變異數分析所評估，陽性模型對照(環孢靈)CsA相對於媒劑顯著不同。

圖 8B 展示歷經初次10個研究日之實驗及對照動物之體重變化。如藉由雙因子變異數分析(*、**、***)所評估，在研究時段內之CsA組平均體重相對於媒劑對照組第6天至第10天顯著改善。如藉由雙因子變異數分析(*)所評估，rhIL-22(i.p.)體重相對於媒劑對照組在第10天顯著改善，*p＜0.05、**p＜0.01、***p＜0.001。

圖 9 展示以確定IL-22血漿含量之血漿ELISA實驗之結果。結果顯示，在以劑量依賴性方式經口管飼1 mg/kg及30 mg/kg劑量之具有SEQ ID NO: 15之遞送構築體之後血漿rhIL-22濃度傾向於增加血漿之含量(*p＜0.05、**p＜0.01、***p＜0.001、****p＜0.0001；平均+SEM；n=2隻未處理、5隻經媒劑處理、5隻經CsA處理、10隻經其他處理)。

此等資料顯示，具有SEQ ID NO: 15之遞送構築體在經由經口管飼投與之後誘導對體重改善之劑量依賴性趨勢。在以劑量依賴性方式經口管飼1 mg/kg及30 mg/kg劑量之具有SEQ ID NO: 15之遞送構築體之後IL-22經量測在血漿中之含量增加。此等資料表明經口投與具有SEQ ID NO: 15之遞送構築體能夠在DSS小鼠模型中減少結腸炎症狀，其類似於腹膜內投與rhIL-22。

另外，藉由向如下文所述之CD-1小鼠投與rhIL-22來評價用於可經口投與具有SEQ ID NO: 15之遞送構築體的生物標記物。

圖 10A 展示經設計以鑑別在健康CD-1小鼠中之單次(急性給藥)rhIL-22之後靶接合之一或多種生物標記物的單次劑量之活體內 研究之概述。

圖 10B 展示經設計以鑑別在健康CD-1小鼠中之單次及多次劑量之rhIL-22之後靶接合之一或多種生物標記物的多個劑量(次長期給藥)活體內 研究之概述。

圖 11A 展示急性及次長期投與rhIL-22一致地增加rhIL-22濃度。

圖 11B 展示在描述於圖 11A 中之急性及次長期給藥實驗期間所量測之一些藥物動力學參數。

圖 12A 展示回應於在急性給與rhIL-22(SEQ ID NO: 12)之後1天及在次長期給與rhIL-22(SEQ ID NO: 12)5天之後的經誘導循環之鼠類C反應蛋白(mCRP)濃度。結果顯示在兩個研究組中之循環mCRP之時間依賴性增加。

圖 12B 展示在急性給與rhIL-22(SEQ ID NO: 12)之後1天血漿mCRP濃度之倍數變化。

圖 12C 展示在次長期給與rhIL-22(SEQ ID NO: 12)5天之後血漿mCRP濃度之倍數變化。

圖 13A 展示回應於在急性給與rhIL-22(SEQ ID NO: 12)之後1天及在次長期給與rhIL-22(SEQ ID NO: 12)5天之後的經誘導循環之鼠類血清澱粉樣蛋白A(mSAA)濃度。結果展示在兩個研究組中之循環mSAA之時間依賴性增加，在投與之後約8小時具有近似血漿峰值濃度。

圖 13B 展示在急性給與rhIL-22(SEQ ID NO: 12)之後1天血漿mSAA濃度之倍數變化。

圖 13C 展示在次長期給與rhIL-22(SEQ ID NO: 12)5天之後血漿mSAA濃度之倍數變化。

圖 14A 展示回應於在急性給與rhIL-22(SEQ ID NO: 12)之後1天及在次長期給與rhIL-22(SEQ ID NO: 12)5天之後的經誘導循環之再生胰島衍生之蛋白3β(Reg3β)。

圖 14B 展示在急性給與rhIL-22(SEQ ID NO: 12)之後1天血漿Reg3𝛽濃度之倍數變化。

圖 14C 展示在次長期給與rhIL-22(SEQ ID NO: 12)5天之後血漿Reg3𝛽濃度之倍數變化。

此等結果表明靶接合之三種潛在的IL-22PD生物標記物：C反應蛋白(CRP)、血清澱粉樣蛋白A(SAA)及再生胰島衍生之蛋白3β(Reg3β)，其可用於評估遞送構築體(諸如具有SEQ ID NO:15或17之彼等)之藥物動力學(PD)之研究中。實例 6 蛋白質溶解

將來自SEQ ID NO: 15醱酵之627 g雙洗滌包涵體(DWIB)再懸浮於4500 mL之8M胍/HCl(Gu-HCl)及pH為8.0之50 mM Tris中。隨後，添加pH為8.5之50 mM Tris以使體積達到6.0 L。在攪拌盤上溫和攪拌該溶液且添加9.225 g還原劑二硫蘇糖醇(DTT)。6L之最終溶解的蛋白質(SEQ ID NO: 15)溶液由6 M Gu-HCl、pH為8.0之50 mM Tris、10 mM DTT及約1 g DWIB/10 mL緩衝液組成。將經溶解之蛋白質(SEQ ID NO: 15)溶液在室溫(RT)下培育，同時在磁性攪拌盤上攪拌，且隨後在4℃下在15,970×g下離心90分鐘。將包含經溶解之蛋白質的上清液小心地轉移至總體積為5520 mL之新容器中。藉由Bradford分析進行蛋白質濃度測定且經測定為15 mg/mL。

資料證明蛋白質溶解可使用以上程序進行。實例 7 蛋白質再摺疊

此實例表明蛋白質再摺疊作為如圖 17 之流程圖中所描述之純化製程之一部分。

小心地將再摺疊溶液進行研究、完善且最佳化(圖 18 )。最佳化製程利用15個不同基質、12個變數及200個再摺疊反應之實驗設計(DOE)。藉由消去製程進行決策。初始再摺疊混合物(含有初始再摺疊溶液及經再摺疊溶解之蛋白質(SEQ ID NO: 15))呈現於表 2 中。經經優化之再摺疊混合物(含有經優化之再摺疊溶液及經再摺疊溶解之蛋白質(SEQ ID NO: 15))呈現於表 3 中。表 2 - 初始再摺疊混合物

100 mM Tris pH 8.5(在4℃下)

0.5 M精胺酸

1 M脲

2 mM EDTA

0.3 mM GSH

1 mM GSSG

0.2 mg/mL再摺疊濃度

表 3 - 經優化之再摺疊混合物

100 mM Tris pH 8.5(在4℃下)

1.0 M精胺酸

10%甘油

3 mM L-半胱胺酸

1 mM胱胺-2HCl

＞0.1 mg/mL再摺疊濃度

將105 L再摺疊溶液在4℃下培育16小時且隨後經由使用0.8/0.2 μm膜之流式過濾器(藉由Pall公司之AkroPac或藉由Sartorius之Sartopore 2XLG)及Cole-Parmer蠕動泵及導管過濾。

將來自實例 6 之經溶解蛋白質(SEQ ID NO: 15) (105 g)添加至預冷卻至4℃之100 L經優化的再摺疊溶液中。

使用設定在73 ml/分鐘之Cole-Parmer蠕動泵將此製程程式化至一小時。此製程在4℃下之冷室中進行。

相對於SEQ ID NO: 15之聚集體，經優化之再摺疊緩衝溶液產生更大量之SEQ ID NO: 15(圖 19 - 20 )。使用初始摺疊溶液產生約10%-15%經正確再摺疊之SEQ ID NO: 15。使用經優化之再摺疊溶液產生約45%-55%經正確再摺疊之SEQ ID NO: 15。實例 8 藉由 TFF UF / DF 之蛋白質濃度及緩衝液交換

此實例表明使用基於超過濾/透濾(UF/DF)原理之切向流式過濾(TFF)的蛋白質濃度及緩衝液交換。

經再摺疊之蛋白質(例如SEQ ID NO: 15)係藉由TFF系統(Millipore)處理以使其濃縮10倍且緩衝液交換5倍。該製程藉由使用四個10 kDa MWCO Millipore Ultracell Pellican3、1.14 m² TFF平板卡匣之超過濾/透濾(UF/DF)進行。透濾緩衝液由pH為7.5之20 mM Tris-鹼及100 mM NaCl組成。在UF/DF製程結束時之最終體積為10 L。此物質隨後使用流式過濾系統過濾，該流式過濾系統採用藉由Pall公司之AkroPac 0.8/0.2 μm過濾器及Cole-Parmer蠕動泵及導管。進行Bradford分析以確定蛋白質濃度、產率及步驟回收率。此時，進行定量SEC-HPLC以確定存在於再摺疊及UF/DF樣品中之具有SEQ ID NO: 15之經適當摺疊之蛋白質的量。使用具有已知濃度之可商購的BSA作為參考標準，自該參考標準產生用於Bradford分析之標準曲線。使用Agilent 1100 HPLC系統及TSKgel SuperSW3000、4 µm、4.6 mm ID×30.0 cm L(Tosoh Bioscience, 18675)管柱。基於此定量分析，確定再摺疊效率。

資料展示蛋白質再摺疊可使用緩衝液交換及TFF UF/DF進行。實例 9 使用捕捉步驟 NH₂ - 750F ®樹脂之蛋白質層析

此實例表明使用NH₂ -750F®樹脂之蛋白質陰離子交換層析中之捕捉步驟。

使用來自通用電氣(GE)之AKTA Avant 150或AKTA Pilot FPLC系統進行蛋白質層析。使用Tosoh陰離子交換樹脂NH₂ -750F®來封裝具有至少20 cm之最小床層高度之管柱且確保將促進20-25 g/L之動態結合能力之管柱體積。使用20 mM乙酸鈉(pH 4.5)或20 mM檸檬酸鈉(pH 4.5)之緩衝液來填充管柱。所用緩衝液如下：緩衝液A：pH為7.5之20 mM Tris、0.5 M NaCl；緩衝液B：pH為7.5之20 mM Tris、2.0 M NaCl。用0.5 M NaOH溶液在30分鐘之接觸時間下清洗NH₂ -750F管柱，且隨後用緩衝液A平衡至少3個管柱體積(CV)，或直至pH及傳導率在預期值(pH 7.5-pH 7.7、約49 mS/cm +/- 1 mS/cm)下達到穩定線。

在裝載至管柱上之前，UF/DF蛋白質(SEQ ID NO: 15)溶液藉由添加5 M儲備溶液補充有0.4 M NaCl且量測傳導率以確保49 mS/cm +/- 2 mS/cm之傳導率。蛋白質(SEQ ID NO: 15)溶液以最少5分鐘管柱滯留時間之流動速率裝載至管柱上，且收集流過物。管柱用3 CV緩衝液A洗滌或直至吸光度在280 nm回復，且在基線穩定，在280 nm下幾乎為0.0 mAU。此時，進行自0.0至62.5% B之20個CV之線性梯度，隨後對另外5個CV進行階段梯度至100% B。在整個過程中收集溶離份且其體積不超過管柱體積之0.5。藉由使用Bio-Rad ChemiDoc^TM MP成像系統之SDS-PAGE分析來自不同溶離份之樣品，且將含有超過90% SEQ ID NO: 15之溶離份混合且命名為NH₂ -750F集區。考慮到SEQ ID NO: 15之消光係數為1.22且260/280 nm比率＜0.6，藉由在280 nm(A280)下讀取吸光度，使用Thermo Fisher Nanodrop One^TM 量測NH₂ -750F集區之蛋白質濃度。NH₂ -750F集區含有大致1.0 M NaCl。

在SEQ ID NO: 15之NH₂ -750F純化之後的例示性層析圖展示於圖 21A (使用20 cm之床層高度及10 mL之管柱體積)及圖 21B ( 使用30 cm之床層高度及4.6 L之管柱體積)中。

NH₂ -750F純化之概述展示於表 4 (對於SEQ ID NO: 15)及表 5 (對於SEQ ID NO: 14)中，SEQ ID NO: 14一般以類似於SEQ ID NO: 15之方式製備、再摺疊及純化。表 4 - SEQ ID NO : 15 之 NH₂ - 750F 純化之概述

SEQ ID NO: 15
緩衝液A	20 mM Tris pH 7.5、0.5M NaCl
緩衝液B	20 mM Tris pH 7.5、2.0M NaCl
床層高度	最小20 cm
滯留時間	5.0分鐘
梯度	0.0 - 62.5%B, 20 CV
結合能力	20-25 g/L(在40 g/L下失效)
純度	93-96%
回收率	71-76%
內毒素	＜ 1.0 EU/mg

表 5 - SEQ ID NO : 14 之 NH₂ - 750F 純化之概述

SEQ ID NO: 14
緩衝液A	20 mM Tris pH 7.5、0.7M NaCl、10%甘油
緩衝液B	20 mM Tris pH 7.5、2.0M NaCl、10%甘油
床層高度	最小20 cm
滯留時間	5.0分鐘
梯度	0.0 - 62.5%B、20 CV
結合能力	20-25 g/L
純度	≥93-96%
回收率	80-93%
內毒素	＜ 1.0 EU/mg

實例 10 使用 CaPure ® 步驟之蛋白質層析

此實例表明使用CaPure®程序在蛋白質層析中之拋光純化步驟。

使用來自通用電氣(GE)之AKTA Avant 150或AKTA Pilot FPLC系統進行SEQ ID NO: 15及SEQ ID NO: 14之蛋白質的蛋白質層析。Tosoh羥基磷灰石混合模式樹脂CaPure®用於填充用於SEQ ID NO: 15及SEQ ID NO: 14中之每一者的管柱，其具有至少10 cm之最小床層高度且確保將促進最大20 g/L之動態結合能力的管柱體積。用於SEQ ID NO: 15之緩衝液如下:緩衝液A：pH為7.5之20 mM Tris、100 mM NaCl及1 mM CaCl₂ ；緩衝液B：pH為7.0之200 mM磷酸鈉、100 mM NaCl及1 mM CaCl₂ 。用於SEQ ID NO: 14之緩衝液如下：緩衝液A：pH為7.5之20 mM Tris、100 mM NaCl及1 mM CaCl₂ ；緩衝液B：pH為7.0之200 mM磷酸鈉、100 mM NaCl及1 mM CaCl₂ 。隨後用0.5 M NaOH以30分鐘或更長之接觸時間清潔各CaPure®管柱，且隨後用緩衝液A平衡至少3個管柱體積(CV)，或直至pH及傳導率在預期值(pH 7.5-pH 7.7，約11 mS/cm +/- 1 mS/cm下達到穩定線。在將NH₂ -750F集區裝載至管柱上之前不需要處理該NH₂ -750F集區。此顯著降低蛋白質損失、時間及資源。將NH₂ -750F集區以最少5分鐘管柱滯留時間之流動速率裝載至管柱上，且收集流過物。管柱用3 CV緩衝液A洗滌或直至吸光度在280 nm回復，且在基線穩定，幾乎為0.0 mAU。此時，進行25個CV 0-25% B之線性梯度，隨後對另外5個CV進行階段梯度至100% B。在整個過程中收集溶離份且其體積在管柱體積之0.36至1.43範圍內，視溶離曲線而定。藉由使用ChemiDoc^TM MP成像系統之SDS-PAGE分析來自不同溶離份之樣品，且將含有超過95% SEQ ID NO: 15或SEQ ID NO: 14之溶離份混合且命名為CaPure集區。考慮到SEQ ID NO: 15之消光係數為1.22且260/280 nm比率＜0.6，藉由在280 nm(A280)下讀取吸光度，使用Thermo Fisher Nanodrop One^TM 量測CaPure集區之蛋白質濃度。

在SEQ ID NO: 15之CaPure®純化之後的例示性層析圖展示於圖 22A (使用10 cm之床層高度及5 mL之管柱體積)及圖 22B (使用21 cm之床層高度及800 mL之管柱體積)中。

CaPure®純化之概述展示於表 6 (對於SEQ ID NO: 15)及表 7 (對於SEQ ID NO: 14)中。表 6 - SEQ ID NO : 15 之 CaPure ® 純化之概述

SEQ ID NO: 15
緩衝液A	20 mM Tris pH 7.5、100 mM NaCl、1 mM CaCl₂
緩衝液B	磷酸鈉pH為7.0之200 mM、100 mM NaCl、1 mM CaCl₂
床層高度	20 cm
滯留時間	5.0分鐘
梯度	0.0 - 25%B、25 CV
結合能力	20 g/L
純度	＞98%
回收率	＞92%
內毒素	＜ 1.0 EU/mg

表 7 - SEQ ID NO : 14 之 CaPure ® 純化之概述

SEQ ID NO: 14
緩衝液A	20 mM Tris pH 7.5、100 mM NaCl、1 mM CaCl₂
緩衝液B	pH為7.0之200 mM磷酸鈉、100 mM NaCl、1 mM CaCl₂
床層高度	20 cm
滯留時間	5.0分鐘
梯度	0.0 - 25%B、25 CV
結合能力	20 g/L
純度	＞98%
回收率	＞92%
內毒素	＜ 1.0 EU/mg

實例 11 藉由 TFF UF / DF 之蛋白質濃度

此實例表明藉由TFF UF/DF程序之蛋白質調配物。

藉由TFF系統(Pall公司)將CaPure®集區濃縮至20 mg/mL之最終濃度，隨後5倍緩衝液交換。該製程藉由使用三個10 kDa MWCO Millipore Pellican3、0.114 m² TFF平板卡匣之超過濾/透濾(UF/DF)進行。透濾緩衝液由pH為7.0之10 mM磷酸鈉、100 mM NaCl組成。經調配之SEQ ID NO: 15隨後使用流式過濾系統過濾，該流式過濾系統採用藉由Pall公司之AkroPac 0.8/0.2 μm過濾器及Cole-Parmer蠕動泵及導管。隨後將經調配之SEQ ID NO: 15在-80℃下以等分試樣儲存且隨後進行分析以確保其生物物理學品質：(1)藉由使用Thermo Fisher Nanodrop One^TM 在具有260/280比率＜0.6之280 nm處量測吸光度且考慮到蛋白質消光係數為1.22，蛋白質(例如SEQ ID NO: 15)濃度為20 mg/mL；(2)藉由Charles River Laboratories設備量測LAL內毒素含量小於1.0 EU/mg；(3)藉由SEC-HPLC之純度大於97%純度(通常＞98%)，其使用TSKgel GW3000SWXL、5µm、7.8 mm ID×30.0 cm L管柱(Tosoh Bioscience, 8541)；(4)使用Bio-Rad裝置及其相關ChemiDoc^TM MP成像系統進行SDS-PAGE分析。實例 12 經純化融合分子之活體內 活性之評估

此實例表明用於檢驗融合分子相對於其攜帶生物活性負荷穿過完整上皮之能力的適當摺疊之方法。

具有SEQ ID NO: 15之融合蛋白質由大腸桿菌表現且自包涵體收集且使用如上文實例 8 中所述之混洗交換緩衝液系統摺疊。所得物質根據實例 9 及實例 10 中所述之方法純化，且如例如表 4 - 7 中所概述，視融合分子之分子特徵而定。基於SDS PAGE，製備物蛋白質純度為約98%。上皮細胞用濃度為25 nM及250 nM之具有SEQ ID NO: 15之融合分子處理。與未經處理之匹配細胞相比，經SEQ ID NO: 15處理之細胞產生細胞數目之劑量依賴性降低，如藉由活細胞/死細胞之流動式細胞測量術(flow cytometry)所評估。值表示為n=4±標準差。實例 13 融合蛋白質純化之規模放大

此實例表明使用SEQ ID NO: 15之融合蛋白質之純化方法之規模放大(圖 7A 及7B )。

以兩個不同規模純化具有SEQ ID NO: 15之融合蛋白質。

使用填充有NH₂ -750F®樹脂體積為10 mL及以下參數之層析管柱進行第一純化：床層高度：20 cm；滯留時間：5分鐘(流動速率：2 mL/min)；緩衝液A：pH為7.5之20 mM Tris、0.5 M NaCl；緩衝液B：pH為7.5之20 mM Tris、2 M NaCl，且使用以下梯度：對於20個管柱體積(CV)0.0-62.5% B。獲得純度為93-96%、回收率＞71%且內毒素含量＜1.0 EU/mg之具有SEQ ID NO: 15之融合蛋白質。

使用填充有NH₂ -750F®樹脂體積為4.6 L及以下參數之層析管柱進行第二純化：床層高度：30 cm；滯留時間：11.55分鐘(流動速率：400 mL/min)；緩衝液A：pH為7.5之20 mM Tris、0.5 M NaCl；緩衝液B：pH為7.5之20 mM Tris、2 M NaCl，且使用以下梯度：對於20個管柱體積(CV)0.0-62.5% B。獲得純度為93-96%、回收率＞71%且內毒素含量＜1.0 EU/mg之具有SEQ ID NO: 15之融合蛋白質。實例 14 製程步驟回收率之間的一致性

進行純化製程以純化SEQ ID NO: 15之融合蛋白質四次(批次1-4)，且在純化製程之各階段之後評估此融合蛋白質之回收率(表 8 )。在此等重複實驗之間融合蛋白質之回收率存在較高程度之一致性。表 8 －在 4 個重複純化製程中 SEQ ID NO : 15 之融合蛋白質之的回收率

製程步驟	製程描述	批次1	批次2	批次3	批次4	平均值(%)
2	UF/DF再摺疊	98.60%	94%	92.40%	85%	92
3	NH₂ -750F	68.60%	66.30%	76%	74.50%	71.35%
4	CaPure	99%	96.40%	100%	94.80%	97.55
5	UF/DF調配	97.80%	100%	98.75%	100%	99.14

此等資料表明，本發明之方法及組合物允許大規模生產及純化治療融合蛋白質，且本文所揭示之方法及組合物在規模放大期間提供高度一致性。

本文中所揭示及主張之所有方法均可根據本發明在無不當實驗之情況下進行及執行。雖然已根據較佳實施例描述了本發明之組合物及方法，但熟習此項技術者應顯而易見的是，變化可在不背離本發明之概念、精神及範疇的情況下應用於本文所述之方法以及方法之步驟或步驟順序中。更特定言之，顯而易見地，在化學上及生理上相關之某些藥劑可替代本文所描述之藥劑，同時獲得相同或類似結果。熟習此項技術者顯而易見的所有該等類似替代物及修改視為在由隨附申請專利範圍所界定的本發明之精神、範疇及概念內。實例 15 SEQ ID NO : 15 與 SEQ ID NO : 17 之比較

對表示SEQ ID NO: 15及SEQ ID NO: 17之經純化之組合物進行液相層析-質量分光光度(LC-MS)，且結果分別表示於圖 23B 以及圖23A 中。以類似於上文關於SEQ ID NO: 15之組合物所描述之方式產生、再摺疊及純化SEQ ID NO: 17之組合物。實例 16 遞送構築體之活體內評估

此實例描述與媒劑相比之具有SEQ ID NO: 15之序列之遞送構築體的活體內評估。

圖 24 展示用於評估在構築體口服(本文中縮寫為P.O.)遞送之後具有SEQ ID NO: 15之序列之遞送構築體轉運穿過腸道上皮且轉運至循環中的(單次劑量)研究概述。此等實驗中所用之動物為未禁食之CD-1雄性小鼠。主要研究終點為總血漿IL-22暴露量，且次要終點為血漿生物標記物，包括IL-22結合蛋白(例如IL-22BP)。

表 9 提供關於實驗設置之細節，包括關於液體(未經調配)遞送構築體及媒劑之資訊。表 9 - 活體內研究之實驗設置

組別	測試物品	媒劑	調配物	劑量 (mpk)	路徑	N ( 4 / 兩個 TP )	時間點 ( 小時數 )
1	媒劑	PBS, pH 7	藥團水溶液	na	P.O.	4	1
2	SEQ ID NO: 15 (液體)	PBS, pH 7	藥團水溶液	90	P.O.	8 (4*2)	1, 2, 4, 6

表 10 概述如在此實驗中遞送之SEQ ID NO: 15構築體之特性。表 10 - 以液體形式遞送之遞送構築體之特性

組別	組別	Cmax (pg/mL)	Tmax ( 小時 )	AUC (0-6 小時 )
SEQ ID NO: 15液體	n/a	24488	2	58126

在表 9 中所示之各別時間點量測總電漿IL-22曝露量。圖 25A 展示總體全身性IL-22暴露量(以pg/mL為單位)且圖 25B 展示在獲取血液樣品及量測結果之各種時間點之IL-22BP暴露量(以pg/mL為單位)。圖 26A -圖 26B 展示此研究中所測試之各組之個別量測結果及資料點。

觀測到經口投與具有SEQ ID NO: 15中所闡述之序列的遞送構築體在血漿中提供IL-22。實例 17 間隔子長度及將有效負載偶合至載劑之 N - 端或 C - 端並不顯著影響有效負載之生物活性

此實例展示各種長度之胺基酸連接子及當異源有效負載包括於遞送構築體中時將異源有效負載偶合至載劑之N-端並不顯著影響有效負載結合其標靶之能力。所檢查之胺基酸連接子為SEQ ID NO: 13(GGGGSGGGGSGGGGS)、SEQ ID NO: 28(GGGGS)及SEQ ID NO: 31(GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS)。

藉由接種DiscoverX HEK293細胞且使用所展示之濃度之促效劑(含有IL-22有效負載之遞送構築體)培育細胞16小時(每孔5,000個細胞)來進行IL-l22受體二聚分析。使用PathHunter^® eXpress IL22RA1/IL10RBB二聚分析在培養盤讀取器上讀取終點發光。

圖 27A 展示具有SEQ ID NO: 13、28及31之胺基酸間隔子之長度當該胺基酸間隔子包括於具有SEQ ID NO: 15、32及33之遞送構築體中時不影響IL-22(SEQ ID NO: 11)誘導IL-22受體二聚之能力。對照重組人類IL-22(rhIL-22, SEQ ID NO: 12)之受體二聚之誘導係藉由黑色曲線展示。

圖 27B 展示經由具有SEQ ID NO: 28之間隔子使IL-22有效負載(SEQ ID NO: 11)偶合至包含SEQ ID NO: 1之胺基酸殘基1-266的載劑之N-端或C-端並不顯著改變具有SEQ ID NO: 32、34及35之遞送構築體誘導IL-22受體二聚之能力。對照重組人類IL-22(rhIL-22)之受體二聚之誘導係藉由黑色曲線展示。

使用Colo205細胞與10 µL具有各種濃度之促效劑(各別遞送構築體或IL-22對照物)一起培育15分鐘來進行pSTAT3活化分析。隨後使用MSD STAT3培養盤(目錄號N450SMA-1)讀取pSTAT3活化之程度。

圖 27C 展示具有SEQ ID NO: 13、28及31之胺基酸間隔子的長度當該胺基酸間隔子包括於具有SEQ ID NO: 15、32及33之遞送構築體中時不影響IL-22(SEQ ID NO: 11)誘導pSTAT3活化之能力。對照重組人類IL-22(rhIL-22, SEQ ID NO: 12)之pSTAT3活化係藉由黑色曲線展示。

圖 27D 展示經由具有SEQ ID NO: 28之間隔子使IL-22有效負載(SEQ ID NO: 11)偶合至包含SEQ ID NO: 1之胺基酸殘基1-266的載劑之N-端或C-端並不顯著改變具有SEQ ID NO: 32、34及35之遞送構築體之誘導pSTAT3活化的能力。對照重組人類IL-22(rhIL-22)之pSTAT3活化係藉由黑色曲線展示。

本發明之新穎特徵詳細闡述於隨附申請專利範圍中。將參考闡述利用本發明原理之例示性實施例及其附圖的以下詳細描述來獲得對本發明之特徵及優點的較佳理解：

圖 1 示意性地展示包含上皮細胞單層上方之端室及此上皮細胞單層下方之基底室的設置。對於頂端至基側滲透率，將測試物品(例如遞送構築體、有效負載等)施加至頂端(A)側，且在基側(B)側面上測定滲透(例如胞移轉運)物質之量。

圖 2 展示一種遞送構築體(SEQ ID NO: 15)，其包括經由間隔子(SEQ ID NO: 13)偶合至IL-22(SEQ ID NO: 11)之載劑(SEQ ID NO: 7)，以時間依賴性方式穿過完整的、極化Caco-2腸道上皮細胞單層轉運IL-22有效負載(在將遞送構築體施加至如上文圖1中所描述之單層基膜上之後15、30及45分鐘量測基側部位之蛋白質之量)。資料進一步展示，當將具有SEQ ID NO: 7之載劑及IL-22(SEQ ID NO: 11)之遞送構築體施用至Caco-2上皮細胞時，相較於當IL-22(SEQ ID NO: 12)未偶合至載劑時，超過約2-3倍之IL-22穿過Caco-2上皮細胞單層。

圖 3 展示遞送構築體(SEQ ID NO: 15)使得IL-22(SEQ ID NO: 11)以時間依賴性方式穿過完整及極化SMI-100腸道上皮細胞單層經轉運(在將遞送構築體施加至單層基膜之後15、30及45分鐘量測基側腔室中之蛋白質之量)。資料進一步展示，當將包括偶合至IL-22(SEQ ID NO: 11)之具有SEQ ID NO: 7之載劑的遞送構築體施加至SMI-100上皮細胞時，相比於當IL-22(SEQ ID NO: 12)未偶合至載劑時，超過約2-3倍之IL-22穿過SMI-100上皮細胞單層。

圖 4 表明包括經由間隔子(SEQ ID NO: 13)偶合至IL-22(SEQ ID NO: 11)之載劑(SEQ ID NO: 7)的遞送構築體(SEQ ID NO: 15)導致IL-22在活體內穿過完整及極化腸道上皮細胞經大量地轉運。腸道上皮之頂端部位由白色箭頭#1突出顯示。固有層 縮寫為「l.p.」。極化上皮之外基底膜由白色箭頭#2突出顯示。白色箭頭#3指示IL-22位置。

圖 5A 表明隨促效劑濃度(以pM為單位)而變的鼠類FL83 B細胞中之STAT3磷酸化，其中促效劑為重組人類IL-22(rhIL-22，SEQ ID NO: 12)或重組鼠類IL-22 (rmIL-22; MAVLQKSMSFSLMGTLAA SCLLLIALWAQEANALPVNTRCKLEVSNFQQPYIVNRTFMLAKEASLA DNNTDVRLIGEKLFRGVSAKDQCYLMKQVLNFTLEDVLLPQSDRFQPYMQEVVPFLTKLSNQLSSCHISGDDQNIQKNVRRLKETVKKLGESGEIKAIGELDLLFMSLRNACV (SEQ ID NO: 30))。資料展示rhIL-22及rmIL-22以濃度依賴性方式誘導STAT3磷酸化，表明人類IL-22蛋白質可如小鼠IL-22有效地結合且誘導信號轉導通過小鼠IL-22受體。

圖 6A 表明rhIL-22(SEQ ID NO: 12)及rmIL-22以劑量依賴性方式誘導鼠類FL83 B細胞中之STAT5磷酸化，表明人類IL-22蛋白質可如小鼠IL-22有效地結合且誘導信號轉導通過小鼠IL-22受體。

圖 6B 表明rhIL-22(SEQ ID NO: 12)及rmIL-22亦誘導鼠類Hepa1-6細胞中之STAT5磷酸化。

圖 7A 展示活體內 研究設計及時刻表之概述，其用於比較經口(p.o.)投與兩個每日一次劑量含量1 mg/kg及30 mg/kg之具有SEQ ID NO: 15之遞送構築體及一個每日一次投與(腹膜內(i.p.)) 4 mg/kg之rhIL-22。在正常食物餵飼、8-10週齡、約23 g雌性C57BL/6小鼠中進行活體內 研究。結腸炎係用飲用水中之2.5%硫酸葡聚糖鈉(DSS)進行任意化學誘導。研究終點包括體重、疾病活性指數、結腸長度及重量，及病理組織學之變化百分比。

圖 8A 展示相對於不同實驗及對照組之第0天，在研究第10天動物之體重變化百分比(%)。如藉由單因子變異數分析(1-way ANOVA)所評估，藉由具有SEQ ID NO: 12 之rhIL-22或具有SEQ ID NO: 15之遞送構築體的基線(第0天對第10天)體重變化相對於媒劑並不顯著。如藉由單因子變異數分析所評估，陽性模型對照(環孢靈)CsA相對於媒劑顯著不同。

圖 11A 展示急性及次長期投與rhIL-22一致地增加IL-22濃度。

圖 11B 展示在描述於圖 11A中之急性及次長期給藥實驗期間所量測之一些藥物動力學參數。

圖 12A 展示回應於在急性給與rhIL-22(SEQ ID NO: 12)之後1天及在次長期給與rhIL-22(SEQ ID NO: 12)5天之後的經誘導循環之鼠類C反應蛋白(murine C-reactive protein，mCRP)濃度。結果顯示在兩個研究組中之循環mCRP之時間依賴性增加。

圖 13A 展示回應於在急性給與rhIL-22(SEQ ID NO: 12)之後1天及在次長期給與rhIL-22(SEQ ID NO: 12)5天之後的經誘導循環之鼠類血清澱粉樣蛋白A(murine serum amyloid protein A，mSAA)濃度。結果展示在兩個研究組中之循環mSAA之時間依賴性增加，在投與之後約8小時具有近似血漿峰值濃度。

圖 15 說明展示經改善之可製造性可如何實現臨床轉譯之流程圖。

圖 16 說明SEQ ID NO: 15為異源融合蛋白質，其包含經由間隔子(SEQ ID NO: 13)連接至介白素-22(IL-22，SEQ ID NO: 11)之載劑結構域(SEQ ID NO: 7)。異源融合蛋白質可在大腸桿菌(E. coli )包涵體(IB)中螯合且因此需要再摺疊及/或純化。

圖 17 說明概述本文所描述之異源融合蛋白質(諸如SEQ ID NO: 14-21)及包含SEQ ID NO: 1-9、22或23之載劑之融合蛋白質的再摺疊、純化及調配之流程圖。

圖 18 說明對SEQ ID NO: 15之構築體之改良的再摺疊效率之迭代最佳化。

圖 19 為粒徑篩析層析(size-exclusion chromatograph，SEC)，其展示經優化再摺疊蛋白質(SEQ ID NO: 15)及具有較高分子質量且因此較少滯留時間之蛋白質聚集體之信號。

圖 20 說明初始及最優化再摺疊蛋白質(SEQ ID NO: 15)之例示性SDS-PAGE。

圖 21A - 21B 說明在使用陰離子交換樹脂NH₂ -750F進行SEQ ID NO: 15之第一管柱純化之後的粒徑篩析層析。圖 21A 說明在使用具有10 mL管柱體積及20 cm床層高度之陰離子交換樹脂NH₂ -750F進行SEQ ID NO: 15之第一管柱純化之後的粒徑篩析層析。圖 21B 說明在使用具有4.6 L管柱體積及30 cm床層高度之陰離子交換樹脂NH₂ -750F進行SEQ ID NO: 15之第一管柱純化之後的粒徑篩析層析。

圖 22A - 22B 說明在使用羥基磷灰石樹脂CaPure®進行SEQ ID NO: 15之第二管柱純化之後的粒徑篩析層析。圖 22A 說明在使用具有5 mL管柱體積、10 cm床層高度及0-25% B、25C梯度之羥基磷灰石樹脂Ca⁺⁺ Pure進行SEQ ID NO: 15之第二管柱純化之後的粒徑篩析層析。圖 22B 說明在使用具有800 mL管柱體積、21 cm床層高度及0-25% B、25CV梯度之羥基磷灰石樹脂CaPure®進行SEQ ID NO: 15之第二管柱純化之後的粒徑篩析層析。對於各圖，對應於來自不同溶離份之樣品的SDS-PAGE自CaPure®樹脂溶離。

圖 23A - 23B 說明在純化異源融合蛋白質之後的液相層析-質量分光光度(liquid chromatography-mass spectrophotometry，LC-MS)。圖 23A 說明SEQ ID NO: 17之LC-MS層析圖。峰1說明正確再摺疊SEQ ID NO: 17。圖 23B 說明SEQ ID NO: 15之LC-MS層析圖。峰1說明經校正再摺疊之SEQ ID NO: 15。峰2說明具有經裂解之末端甲硫胺酸之SEQ ID NO: 15(藉由SEQ ID NO: 20說明)。峰3說明具有經裂解之末端甲硫胺酸(藉由SEQ ID NO: 20說明)及所得N-端胺基酸之乙醯化的SEQ ID NO: 15。

圖 24 說明實例 16 之研究概述，其用於評估在構築體口服(本文中縮寫為P.O.)遞送之後具有序列SEQ ID NO: 15之遞送構築體轉運穿過腸道上皮且至循環中。

圖 25A - 25B 說明展示在投與SEQ ID NO: 15之遞送構築體之後，IL-22血漿濃度隨時間變化的圖。圖 25A 說明在投與SEQ ID NO: 15之遞送構築體之後，總IL-22血漿濃度隨時間變化。圖 25B 說明在投與SEQ ID NO: 15之遞送構築體之後，IL-22BP血漿濃度隨時間之變化。

圖 26A (媒劑)及圖 26B (SEQ ID NO: 15)為展示對於個別小鼠之IL-22血漿濃度隨時間變化之圖。

圖 27A - 27D 說明間隔子長度及將有效負載偶合至載劑之N-或C-端並不顯著影響有效負載之生物活性。圖 27A 說明各種胺基酸間隔子之長度並不影響誘導IL-22受體二聚。圖 27B 說明將IL-22有效負載偶合至載劑之N-或C-端並不影響誘導IL-22二聚合。圖 27C 說明各種胺基酸間隔子之長度並不影響誘導pSTAT3活化。圖 27D 說明將IL-22有效負載偶合至載劑之N-或C-端並不影響誘導pSTAT3活化。

Claims

一種遞送構築體，其包含SEQ ID NO: 15或SEQ ID NO: 17中所闡述之胺基酸序列。
如請求項1之遞送構築體，其中該遞送構築體包含SEQ ID NO: 15中所闡述之胺基酸序列。
如請求項1之遞送構築體，其中該遞送構築體包含SEQ ID NO: 17中所闡述之胺基酸序列。
一種包含載劑之遞送構築體，其中該載劑：在位置195至347中之任一者處具有其C端；在位置3處具有麩胺酸及在位置4處具有丙胺酸；及能夠穿過極化上皮細胞進行胞移作用。
如請求項4之遞送構築體，其中該載劑之長度為266個胺基酸。
如請求項4或請求項5之遞送構築體，其中該載劑由SEQ ID NO: 7或SEQ ID NO: 9中所闡述之胺基酸序列或與其具有至少90%、95%或99%序列一致性之胺基酸序列組成。
如請求項6之遞送構築體，其中該載劑由SEQ ID NO: 7中所闡述之胺基酸序列組成。
如請求項6之遞送構築體，其中該載劑由SEQ ID NO: 9中所闡述之胺基酸序列組成。
如請求項4至8中任一項之遞送構築體，其中將該載劑偶合至有效負載。
如請求項9之遞送構築體，其中該有效負載為IL-22。
如請求項10之遞送構築體，其中IL-22由SEQ ID NO: 11中所闡述之胺基酸序列組成。
如請求項9至11中任一項之遞送構築體，其中將該載劑非共價偶合至IL-22。
如請求項9至11中任一項之遞送構築體，其中將該載劑共價偶合至IL-22。
如請求項13之遞送構築體，其中該載劑經由間隔子共價偶合至IL-22。
如請求項14之遞送構築體，其中該間隔子由SEQ ID NO: 13中所闡述之胺基酸序列組成。
如請求項1至15中任一項之遞送構築體，其中該遞送構築體由SEQ ID NO: 15或SEQ ID NO: 17中所闡述之胺基酸序列組成。
一種治療個體之發炎性疾病之方法，該方法包含向該個體投與有效量之如請求項1至16中任一項之遞送構築體。
如請求項17之方法，其中該發炎性疾病為肝炎、肥胖症、脂肪肝病、肝臟發炎或胰臟炎、克羅恩氏病(Crohn's disease)、潰瘍性結腸炎、結腸袋炎(pouchitis)、直腸炎、多發性硬化症、全身性紅斑性狼瘡症、移植物抗宿主疾病、類風濕性關節炎或牛皮癬。
如請求項18之方法，其中該疾病為克羅恩氏病或潰瘍性結腸炎。
一種用於獲得經純化之非天然存在之融合蛋白質的方法，該方法包含：對包含該非天然存在之融合蛋白質的混合物進行陰離子交換層析，以獲得包含該非天然存在之融合蛋白質的第一溶離份；其中該非天然存在之融合蛋白質包含IL-22及載劑。
如請求項20之方法，其中進行陰離子交換層析包含將該非天然存在之融合蛋白質結合至陰離子交換樹脂，及為該非天然存在之融合蛋白質之後續溶離提供增加的鹽梯度以獲得該第一溶離份。
如請求項20至21中任一項之方法，其中進行陰離子交換層析包含使該混合物與包含胺官能基化聚甲基丙烯酸酯珠粒之樹脂接觸。
如請求項22之方法，其中該樹脂為NH₂ -750F樹脂。
如請求項20至23中任一項之方法，其進一步包含在進行陰離子交換層析之前再摺疊該非天然存在之融合蛋白質。
如請求項24之方法，其中再摺疊該非天然存在之融合蛋白質包含使來自包涵體之經離液劑溶解之蛋白質與再摺疊溶液接觸，其中該再摺疊溶液包含：精胺酸(0.75 M至1.25 M)；甘油(2%至20% v/v)；半胱胺酸(0.5 mM至10 mM)；及胱胺(0.2 mM至10 mM)；其中該再摺疊溶液之pH在7.5與8.5之間。
如請求項25之方法，其中：精胺酸以介於0.9 M與1.1 M之間的濃度存在於該再摺疊溶液中；甘油以介於7%與13% (w/w)之間的濃度存在於該再摺疊溶液中；半胱胺酸以介於1.5 mM與6 mM之間的濃度存在於該再摺疊溶液中；胱胺以介於0.6 mM與3 mM之間的濃度存在於該再摺疊溶液中；及該再摺疊溶液之pH在7.8與8.2之間。
如請求項20至26中任一項之方法，其進一步包含使包含該第一溶離份之樣品經受羥基磷灰石樹脂以獲得包含該非天然存在之融合蛋白質的第二溶離份。
如請求項27之方法，其中該羥基磷灰石樹脂為CaPure-羥基磷灰石樹脂。
如請求項20至26中任一項之方法，其進一步包含對包含該第一溶離份之樣品進行陽離子交換層析。
如請求項29之方法，其中進行陽離子交換層析包含使包含該第一溶離份之樣品與包含硫酸酯官能基化聚甲基丙烯酸酯珠粒之樹脂接觸。
如請求項30之方法，其中該樹脂為TOYOPEARL硫酸酯-650F樹脂。
如請求項20至31中任一項之方法，其中一旦與細胞接觸，該載劑即促進該非天然存在之融合蛋白質之內飲作用或胞移作用。
如請求項32之方法，其中一旦與該細胞接觸，該載劑即促進該非天然存在之融合蛋白質之胞移作用。
如請求項32或請求項33之方法，其中該細胞為腸道上皮細胞。
如請求項34之方法，其中該腸道上皮細胞為極化腸道上皮細胞。
如請求項20至35中任一項之方法，其中該載劑為天然存在或非天然存在之Cholix多肽之截斷變體。
如請求項20至36中任一項之方法，其中該載劑與SEQ ID NO: 2、3、4、5、6、7、8、9、22或23中之任一者具有至少70%、80%、85%、90%、95%、98%、99%或100%序列一致性。
如請求項20至37中任一項之方法，其中該非天然存在之融合蛋白質與SEQ ID NO: 14-21中之任一者之序列具有至少70%、80%、85%、90%、95%、98%、99%或100%序列一致性。
如請求項20至38中任一項之方法，其中IL-22與SEQ ID NO: 10、11或12中之任一者具有至少85%、90%、95%、98%、99%或100%序列一致性。
如請求項20至39中任一項之方法，其中該載劑本身具有第一等電點(pI)，且IL-22本身具有第二等電點，其中該第一等電點比該第二等電點低至少1 pH單位、至少1.5 pH單位、至少1.7 pH單位或至少2 pH單位。
一種非天然存在之融合蛋白質，其藉由如請求項20至41中任一項之方法獲得。
一種再摺疊包含載劑及IL-22之非天然存在之融合蛋白質的方法，該方法包含： (i)使包含該非天然存在之融合蛋白質的包涵體與包含離液劑之溶解溶液接觸以產生可溶性非天然存在之融合蛋白質； (ii)使該非天然存在之融合蛋白質與再摺疊溶液接觸，其中該再摺疊溶液包含：精胺酸(0.75 M至1.25 M)；甘油(2%至20% v/v)；半胱胺酸(0.5 mM至10 mM)；及胱胺(0.2 mM至10 mM)；其中該再摺疊溶液之pH在7.5與8.5之間。
如請求項42之方法，其中：精胺酸以介於0.9 M與1.1 M之間的濃度存在於該再摺疊溶液中；甘油以介於7%與13% (w/w)之間的濃度存在於該再摺疊溶液中；半胱胺酸以介於1.5 mM與6 mM之間的濃度存在於該再摺疊溶液中；胱胺以介於0.6 mM與3 mM之間的濃度存在於該再摺疊溶液中；及該再摺疊溶液之pH在7.8與8.2之間。
一種包含偶合至有效負載之Cholix多肽的遞送構築體，其中該Cholix多肽在位置195至347中之任一者處具有其C端，且能夠穿過極化上皮細胞進行胞移作用。
如請求項44之遞送構築體，其中該Cholix多肽異源偶合至該有效負載。