KR20180132833A - Mcm 결핍과 관련된 장애의 치료를 위한 메틸말로닐 조효소 a 뮤타아제 (mcm) 융합 구조체 - Google Patents

Abstract

본 발명은 메틸말로닐 CoA 뮤타아제와 관련된 장애의 치료를 위한 단백질 대체 요법에 관한 조성물 및 방법을 제공한다.

Description

MCM 결핍과 관련된 장애의 치료를 위한 메틸말로닐 조효소 A 뮤타아제 (MCM) 융합 구조체

관련 출원

본 출원은 2016년 4월 12일 출원된 미국 가출원 62/321,359의 이익, 및 이에 대한 우선권을 주장하며, 그 내용은 전문이 본원에 참고로 포함된다.

서열 목록의 통합

"BIOB008001WOSeqList.txt"라고 명명된 텍스트 파일의 내용물은 2017년 4월 10일에 생성되었고 크기가 69 KB이며, 그 전체가 참고로 포함된다.

본 발명의 분야

본 명세서는 일반적으로 효소 대체 요법 (enzyme replacement therapy; ERT)에서 사용에 적합한 메틸말로닐 CoA 뮤타아제 (MCM) 융합 단백질 구조체에 관한 것이다.

메틸말론산혈증 (methylmalonic Acidemia; MMA)은 장기간 생존에 대한 불량한 예후를 가진 50,000 내지 100,000명의 인간 당 약 1명의 발병률을 갖는 상염색체 열성 유전병(autosomal recessive inherited disorder)이다.

MMA 사례 중 약 60%는 숙시닐-CoA로의 메틸말로닐-CoA의 아이소머화를 촉진하고 보조인자로서 코발라민 (B-12)을 필요로 하는 미토콘드리아 효소 메틸말로닐 CoA 뮤타아제 (MCM)의 결함을 유도하는 MUT 유전자의 돌연변이로부터 발생한다. 숙시닐-CoA는 다양한 아미노산 및 지방에 대한 시트르산 회로 (또는 "크렙스 회로(Krebs cycle)")로의 진입 지점이다.

업계에 공지된 바와 같이, 프로피오닐-조효소 A (CoA)를 통한 크렙스 회로로의 진입을 위한 분기 사슬(branched chain) 아미노산 아이소류신 및 발린, 뿐만 아니라 메티오닌, 트레오닌, 홀수 사슬(odd-chain) 지방산, 및 콜레스테롤의 이화작용은 숙시닐-CoA로의 1-메틸말로닐-CoA의 아이소머화를 필요로 한다. 상기 언급된 바와 같이, 이 전환은 미토콘드리아 매트릭스에 위치한 핵-암호화된 호모다이머 아포효소(apoenzyme) (비활성 효소) (1)인 메틸말로닐-CoA 뮤타아제 (MCM) 및 코발라민 (비타민 B-12)으로부터 유래된 MCM에 대한 보조인자인 아데노실코발라민을 수반한다.

보통 초기 유아기에 나타나는 MMA의 효과는 경도에서부터 생명을 위협하는 정도까지 다양하다. 영향을 받은 유아는 구토, 탈수증, 약한 근긴장도 (근긴장 저하증(chypotonia)), 발달 지체, 과도한 피로 (무기력증(lethargy)), 비대해진 간 (간 비대증(hepatomegaly)), 및 체중 증가 및 예상 속도로의 성장에 실패 (성장 장애)를 경험할 수 있다. 장기 합병증은 수유 문제, 지적 장애, 만성 신장 질환, 및 췌장의 염증 (췌장염(pancreatitis))을 포함할 수 있다. 치료하지 않으면, 이 장애는 때때로 혼수상태 및 사망으로 이어질 수도 있다.

비타민 B-12 (하이드록소코발라민) 비-반응성 MMA 환자에 대한 최근의 관리 접근법은 프로피온산 생성 아미노산의 식이 제한, 영양 보충 관리 및 경계 모니터링을 포함한다. 간 또는 조합된 간/신장 이식은 가장 심각한 임상 소견을 받은 것들을 치료하는데 사용되었다 (2).

MMA에 걸린 환자, 심지어 간 이식을 받은 환자들은 병리학적으로 요세관 간질 신장염 (tubulointerstitial nephritis)을 특징으로 하는 (4, 5), 진행성 신장 기능 장애에 걸릴 수 있으며 (3), 결국은 신장 이식을 필요로 한다. 환자 집단, 심지어는 집중 치료된 환자 집단에서 볼 수 있는 질환 소견은 안정성을 증가시키고 신부전으로부터 보호하기 위해 새로운 요법, 이상적으로는 간과 신장 둘 다를 표적화할 수 있는 요법의 필요성을 입증한다.

최근 rAAV9 유전자 요법은 24시간 내에 Mut cDNA의 간 세포 이식 유전자 발현을 유도하고, Mut-/- 마우스를 치사로부터 효과적으로 구제하며, 장기간 생존은 부여된 장기간 생존이 대사 작용을 개선하고, 신장 기능 및 조직학의 현저한 보존을 유도한다는 것이 보고되었다. 늙고 처리된 Mut-/- 마우스에, 인간 임상 시험에 사용된 것과 유사한 용량 (그램 당 2.5x10⁹ GC의 rAAV9)의 벡터의 전신 재투여는 순환성 대사산물을 저하시키고, 생체 내(in vivo) 프로피오네이트 산화 능력을 증가시키고, 신장 및 간에서 이식 유전자 발현을 생산하였다 (6).

시험관 내(in vitro) 및 생체 내에서 세포로의 상이한 거대 분자의 전달을 위한 단백질 전좌(translocation) 도메인 (PTD)-융합 단백질의 사용에 있어서 커다란 진보가 있었다. PTD는 큰 분자에 대하여 전달 벡터의 역할을 하는 짧은 펩타이드의 군을 말한다. 일반적으로는, PTD는 생리학적 pH에서 순(net) 양전하를 가진 짧은, 수용성 및 부분적 소수성, 및/또는 다염기 펩타이드 (많아도 30-35개의 아미노산 잔기)로 정의된다. PTD는 임의의 키랄 수용체를 사용하지 않고 상당한 막 손상을 일으키지 않으면서 생체 내 및 시험관 내에서 낮은 마이크로몰 농도로 세포막에 침투할 수 있다. 게다가, 이러한 펩타이드는 고효율 및 저독성으로 정전기에 의해 또는 공유 결합된 생물학적 활성물, 예컨대 약물을 내재화시킬 수 있다. 이러한 새로운 펩타이드 종류는 인간 면역결핍 바이러스 1형 (HIV-1) 암호화된 TAT 펩타이드 및 몇 년 후 발견된 양친매성 드로소필라 안테나페디아(Drosophila Antennapedia) 호메오도메인-유래된 16 아미노산 침투 펩타이드 (pAntp)의 발견 이후, 1980년대 후반에 소개되었다.

PTD는 물질을 혈액-뇌 장벽(blood-brain barrier)을 가로질러 뇌로 전달하거나 핵, 미토콘드리아 및 라이소좀과 같이, 특정 세포 내 국소 부위를 표적화할 수도 있다. 활성 효소를 세포로 전달하는 능력은 효소 대체 요법 (ERT)을 개발하는데 기여하였으며, 이로 인해 결핍 또는 부재 효소가 PTD 전달 시스템에 기초하여 인공적으로 제조되고, 정제되어 환자에게 정기적으로 제공된다.

최근에, 미토콘드리아로의 효소 또는 단백질의 전달을 위한 융합 단백질이 보고되었다 (7, 8). 이전에 보고된 이러한 전달 시스템은 세포질 막 및 미토콘드리아 막 둘 다를 통한 수송을 촉진하며, 미토콘드리아 효소에 융합된 단백질 전달 도메인 (PTD)을 포함하는 융합 단백질을 기반으로 한다. 이 융합 단백질은 단백질 전달 도메인과 미토콘드리아 효소 또는 단백질 사이에 존재하는 미토콘드리아 표적화 서열 (MTS)을 더 포함할 수도 있다. 이러한 구조체는 일반적으로는 미토콘드리아 장애의 치료 또는 완화에 적합한 것으로 기술되어 있다 (8).

이에 더하여, WO 2014/170896은 PTD, MTS 및 인간 미토콘드리아 단백질을 포함하는 융합 단백질을 개시하고 있으며 여기서 MTS는 융합 단백질 구조에 존재하는 인간 미토콘드리아 단백질과 이종 기원이다. 이러한 구조체는 또한 미토콘드리아 장애의 치료 또는 완화에 적합한 것으로 기술되어 있다 (9).

본 발명은 메틸말로닐 CoA 뮤타아제와 관련된 장애의 치료를 위한 단백질 대체 요법에 관한 조성물 및 방법을 제공한다.

본원에서 개시된 주제를 더 잘 이해하고 실제로 어떻게 수행될 수 있는지를 예시하기 위해서, 구체예들은 이제 첨부된 도면을 참고하여 단지 비-제한적인 예의 방식으로 기술될 것이다.
도 1은 다양한 메틸말로닐 CoA 뮤타아제-기반 (TAT-MTS-MCM) 융합 단백질의 개략도이다. 약어: TAT, 트랜스 전사 활성 인자; MTS, 미토콘드리아 전좌 서열; MCM, mut, 메틸말로닐 CoA 뮤타아제; cs, 시트레이트 신타아제; lad, 리포아미드 데하이드로게나아제; Δ, MTS 없음; 화살표는 Tev 부위를 가리킨다; MBP, 말토오스 결합 단백질.
도 2는 표시된 다양한 박테리아 숙주에서 융합 단백질 TAT-MTSmcm-MCM (도 2A), TAT-MTScs-MCM (도 2B), TAT-MTSlad-MCM (도 2C), 및 TAT-ΔMTS-MCM (도 2D)의 비유도 (un), IPTG 유도 (in), 전체 세포 추출물 (WCE) 및 가용성 분획 (sol)의 발현의 나트륨 도데실 설페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 (SDS PAGE) 분석을 도시한다.
도 3은 codon+ 및 rosseta 박테리아 숙주에서 비유도 (un), IPTG 유도 (in), 전체 세포 추출물 (WCE) 및 가용성 분획 (sol)의 융합 단백질 구조체 TAT-MTSmcm-MCM (도 3A), TAT-MTScs-MCM (도 3B), TAT-MTSlad-MCM (도 3C) 및 TAT-ΔMTS-MCM (도 3D)의 발현의 SDS PAGE 분석을 도시한다. 구조체 TAT-MTSmcm-MCM (도 3A와 같음)에 대한, 항-His 항체를 이용한 웨스턴 블롯 분석은 도 3E에서 도시되고 구조체 TAT-MTScs-MCM (도 3B와 같음)에 대한 것은 도 3F에서 도시된다.
도 4는 Ni-킬레이트화 컬럼 친화도 크로마토그래피를 사용한 융합 단백질 구조체 TAT-MTSmcm-MCM (도 4A), TAT-MTScs-MCM (도 4B), TAT-MTSlad-MCM (도 4C) 및 TAT-ΔMTS-MCM (도 4D)의 정제의 SDS PAGE 분석을 도시한다. 약어: M, 마커; wce, 전체 세포 추출물; pre-run, 정제 컬럼에 로딩하기 전; fl, 통과액.
도 5는 표시된 TAT-MTS-MCM 융합 단백질 구조체의 특성화를 위해 SDS PAGE 분석 (도 5A) 및 항-MCM 항체를 사용한 웨스턴 블롯 분석 (도 5B)을 도시한다. 약어: HTallMUT, His-TAT-MTSmcm-MCM; HTcsMUT, His-TAT-MTScs-MCM; HTladMUT, His-TAT-MTSlad-MCM; HTΔMUT, His-TAT-ΔMTS-MCM; 및 MBPMUT, His-MBP-TAT-MTSmcm-MCM.
도 6은 세포 및 그것의 미토콘드리아로의 TAT-MTS-MCM 융합 단백질 구조체의 내재화의 웨스턴 블롯 분석을 도시한다. 도 6A는 항-MCM 항체를 사용하여, 24시간 동안 표시된 양의 TAT-MTScs-MCM 융합 단백질과 함께 인큐베이션된 673 섬유아세포의 전체 세포 추출물의 웨스턴 블롯 분석을 도시한다. 항-His 항체를 사용하여, 3시간 동안 TAT-MTScs-MCM 또는 TAT-MTSmcm-MCM과 함께 인큐베이션된 673 섬유아세포로부터 분리된 미토콘드리아의 웨스턴 블롯 분석은 도 6B에서 도시되고 항-MCM 항체를 이용한 것은 도 6C에서 도시된다. 도 6D는 항-MCM 항체를 사용하여, 3시간 동안 다양한 융합 단백질 구조체와 함께 인큐베이션된 673 섬유아세포로부터 분리된 미토콘드리아의 웨스턴 블롯 분석이다. 융합 단백질 구조체 His-TAT-MTScs-MCM은 대조군으로서 우측 레인에서 도시된다. 약어: Mito, 미토콘드리아; Mito 대조군, 융합 단백질 구조체 없이 인큐베이션된 미토콘드리아; HTallMUT, His-TAT-MTSmcm-MCM; HTcsMUT, His-TAT-MTScs-MCM; HTladMUT, His-TAT-MTSlad-MCM; HTΔMUT, His-TAT-ΔMTS-MCM; 및 M, 마커.
도 7은 TAT-MTS-MCM 융합 단백질 구조체와 함께 인큐베이션된 환자의 세포에서 상대적인 ATP 수준의 막대 그래프를 도시한다. 도 7A-도 7C는 각각의 융합 단백질 구조체 중 하나와 함께 인큐베이션된 346 (도 7A), GM01673 (도 7B) 및 GM00050 (도 7C) 섬유아세포의 ATP 수준을 도시한다. 섬유아세포는 48시간 동안 무-글루코오스 배지에서 성장하였고 (15x10³개 세포) 1 μg의 각각의 융합 단백질 구조체와 함께 6시간 동안 인큐베이션된 다음 총 세포 ATP에 대하여 분석되었다. 결과는 평균 ± SEM, n=3, *p<0.05를 나타낸다. 약어: TAT-MTSmbp-MCM, His-MBP-TAT-MTSmcm-MCM.
도 8은 TAT-MTS-MCM 융합 단백질 구조체와 함께 인큐베이션된 환자의 세포에서 상대적인 막 전위 (TMRE/MTG)를 나타내는 막대 그래프이다. 48시간 동안 무-글루코오스 배지에서 성장한 GM01673 섬유아세포 (15x10³개의 세포)의 미토콘드리아 막 전위는 표시된 융합 단백질 구조체 1.5 μg과 함께 6시간 동안 인큐베이션되었다. 인큐베이션 기간 (1시간)이 끝나기 전에, 200 nM MitoTracker Green FM을 추가하였다. 이에 더하여, 인큐베이션 기간이 끝나기 전 30분에 대조군으로서 20 μM FCCP를 추가하였고 인큐베이션 기간이 끝나기 전 20분에 200 nM TMRE를 추가하였다. 결과는 평균 n=2를 나타낸다. 약어: Control, 융합 단백질 구조체의 부재 하에서 인큐베이션된 세포; TMRE, 테트라메틸로다민 에틸 에스터; MTG, MitoTracker Green; 및 FCCP, 카보닐 시아니드-4-(트라이플루오로메톡시)페닐하이드라존.
도 9는 TAT-MTS-MCM 융합 단백질 구조체와 함께 인큐베이션된 환자의 세포의 상대적인 산소 소모량 막대 그래프로 도시한다. 무-글루코오스 배지에서 48시간 동안 성장하고 (15x10³개의 세포) 다양한 융합 단백질 1 μg과 함께 6시간 동안 인큐베이션된 GM01673 섬유아세포의 산소 소모량. 산소 소모량은 Seahorse Extracellular Flux (XF) Analyzer를 사용하여 결정되었다. 결과는 평균 ± SEM, n=3, *p<0.05를 나타낸다. 약어: TAT-MTSmbp-MCM, His-MBP-TAT-MTSmcm-MCM; Control, 단백질 구조체의 부재 하에서 인큐베이션된 세포.
도 10은 TAT-MTS-MCM 융합 단백질이 MMA 환자의 세포의 세포 생존률을 증가시킨다는 것을 도시한다. 무-글루코오스 배지에서 24 h 동안 성장한 GM01673 (A), GM00050 (B) 및 346 (C) 환자 섬유아세포의 세포 생존 수준. 15x10³개의 세포는 다양한 융합 단백질 1.5 μg과 함께 72h 동안 인큐베이션된 다음 세포 생존률에 대하여 분석되었다. 결과는 평균 ± SEM, n=3, *p<0.05를 나타낸다.
도 11은 TAT-MTS-MCM 융합 단백질이 MMA 환자의 세포에서 MMA 수준을 감소시킨다는 것을 도시한다. 무-글루코오스 배지에서 24 h 동안 성장한 2x10⁶개의 GM01673 섬유아세포의 MMA ELISA 분석. 그 후, 세포는 0.75 또는 1.5 μg의 TAT-MTScs-MCM과 함께 48h 동안 인큐베이션된 다음 총 세포 MMA 수준에 대하여 분석되었다. 결과는 평균 ± SEM, n=4, *p<0.05를 나타낸다.
도 12는 TAT-MTS-MCM 융합 단백질이 MCM (-/-) HepG2 세포로부터의 알부민 및 요소 분비를 증가시킨다는 것을 도시한다. 도 12A-B는 성장 배지에서 분비된 알부민 수준을 도시한다. MCM 단백질 발현을 상실한 것으로 확인된 5x10⁵개의 HepG2 MCM (-/-) 세포 (A)는 OXPHOS 의존 배지에서 24h 동안 성장하였다. 그 후, 세포는 1.5 μg TAT-MTScs-MCM와 함께 24 (도 12B) 또는 48h (도 12C) 동안 인큐베이션되었고, 성장 배지가 수거되었고 500g로 5분 동안 원심분리되었다. 알부민 수준은 항-알부민 항체를 사용한 웨스턴 블롯 분석에 의해 결정되었다. 성장 배지의 동일한 앨리쿼트가 로딩되었다. 도 12D는 B&C의 Quantitate 데이터를 도시한다. 도 12E는 성장 배지에서 분비된 요소 수준을 도시한다. 5x10⁵개의 HepG2 MCM (-/-) 세포는 1.5 μg TAT-MTScs-MCM이 공급된 완전 배지에서 24h 동안 성장하였다. 그 후, 세포는 1.5 μg TAT-MTScs-MCM이 추가된 OXPHOS 의존 배지에서 24h 동안 인큐베이션되었다. 이어서 성장 배지가 수거되었고 14000g로 5분 동안 원심분리되었고, 나머지 세포는 용해되었다. 요소 수준은 Cobas 분석기로 결정되었다. 결과는 평균 ± SEM, n=3, *p<0.05를 나타낸다.
도 13은 마우스 조직으로의 TAT-LAD의 전달을 도시한다. TAT-MTScs-MCM이 C57BL 마우스에 주사되었다. 상이한 시점에, 마우스가 살해되고, 뇌, 간, 및 심장이 제거되었다. 조직 용해물이 제조되어 항 메틸 말로닐 Co-A 뮤타아제 및 항-β 액틴 항체을 사용한 웨스턴 블롯 분석으로 분석되었다.

본 명세서는 메틸말로닐 CoA 뮤타아제 (MCM) 융합 단백질 구조체의 구조에 기초한다. 이러한 구조체는 단백질 전달 도메인 (TAT 전달 시스템) 및 미토콘드리아 전좌 서열을 포함하고 MCM의 결핍 또는 결함이 있는 MCM과 연관성이 있는 질환 또는 장애의 효소 대체 요법 (ERT)에서의 사용에 적합하다.

도 1에서 개략적으로 도시된 바와 같이, 다양한 MCM 융합 단백질이 제조되었으며, 미토콘드리아 전좌 서열 (MTS)은 다양하다. 사용된 MTS는 메틸말로닐 CoA 뮤타아제의 고유한 MTS 또는 상이한 미토콘드리아 폴리펩타이드 (이종 기원 폴리펩타이드), 시트레이트 신타아제 (cs) 및 리포아미드 데하이드로게나아제 (lad)의 MTS였다. 하기 도시된 바와 같이, 본원에서 기술된 바와 같이 제조된 모든 융합 MCM 단백질 구조체는 미토콘드리아로 내재화되고 그것들의 활성에 필요한 분열을 거치는 것으로 나타났다.

그러므로 양태들 중 하나에 의해 본 명세서는 트랜스 전사 활성 인자 (transactivator of transcription; TAT) 도메인의 HIV-1^, 기능적 인간 메틸말로닐 조효소 A 뮤타아제 (MCM) 및 상기 TAT 도메인과 상기 기능적 인간 MCM 사이에 위치한 인간 미토콘드리아 표적화 서열 (MTS)을 포함하는 융합 단백질을 제공한다.

용어 " 인간 메틸말로닐 조효소 A 뮤타아제 ( MCM ) "는 숙시닐-CoA로의 메틸말로닐-CoA의 아이소머화를 촉진하는 효소를 말하고 핵심 대사 경로에 수반된다. 그것은 기능하기 위해 비타민 B12-유래된 보결 분자단(prosthetic group), 아데노실코발라민 (일반적으로 AdoCbl으로도 불림)을 필요로 한다. MCM은 핵 MUT 유전자에 의해 암호화되고, 염색체 6p21에 위치한 35 kb에 걸쳐 13개 엑손으로 이루어진다. 인간 MCM 전구체는 32개의 아미노산의 N-말단 미토콘드리아 표적화 서열 (MTS) 및 두 개의 기능적 도메인, (β/α) 8 배럴 (잔기 88-422) 기질-결합 부위 및 C-말단 (βα)5 B12-결합 도메인 (잔기 578-750)을 함유한다. 미토콘드리아에 진입하고 선도 서열이 제거된 다음, 두 개의 동일한 서브유닛이 기능적인 효소를 형성한다 (10).

본원에서 사용된 바와 같이 MCM의 맥락에서 용어 "기능적"은 미토콘드리아에 진입 및 그 안에서 분열시 생물학적 활성을 나타낼 수 있는, 본 명세서에 기술된 구조체에 포함된 임의의 MCM 폴리펩타이드를 말한다. 다양한 융합 단백질 구조체에 대한 MCM의 생물학적 활성은 업계에 공지된 임의의 방법에 따라, 제한되는 것은 아니지만, 예를 들어, 본원에서 기술된 바와 같이 결정될 수 있다.

일부 특정 구체예에서, 기능적 인간 메틸말로닐 조효소 A 뮤타아제 (MCM)는 단백질의 전장 아미노산 서열을 말한다.

상기 및 그 밖의 구체예에서, 인간 메틸말로닐 조효소 A 뮤타아제 (MCM)는 "성숙한" 단백질이며, 즉, 미토콘드리아 표적화 서열 (MTS)이 없는 단백질을 말한다. 추가의 특정 구체예에서 MCM은 본원에서 정의된 바와 같이 서열 번호: 8로 표시된 아미노산 서열을 갖는다.

추가의 구체예에서, 기능적 인간 메틸말로닐 조효소 A 뮤타아제 (MCM)는 상기 단백질의 돌연변이된 유도체이며, MCM의 고유한 아미노산 잔기 중 하나 이상이 결실되거나, 또 다른 아미노산 잔기로 대체되거나 또는 변형되는 한편 단백질의 미토콘드리아는 기능적으로 유지된다.

어떠한 이론에도 결부되지 않으면서, 모든 구체예에서, 현재 개시된 주제에 따르면 기능적 인간 메틸말로닐 조효소 A 뮤타아제 (MCM)는 미토콘드리아로 진입시 융합 단백질 구조체로부터 분열되고 성숙하고, 적절하게 폴딩된 활성 상태로 그 안에 존재한다. 일부 구체예에서, MTS의 분열시, 기능적 인간 MCM 유닛은 활성 폴리펩타이드 다이머로 회합한다.

현재 개시된 주제에 따르면 융합 단백질은 당업자에게 공지된 임의의 방법에 의해 제조될 수 있다. 예로서, 본원에서 정의된 융합 단백질은 하기 예시된 바와 같이, 표준 분자 생물학 및 클로닝 기술에 의해, 융합 단백질 구조체를 암호화하는 관련된 핵산 서열을 업계에 공지된 임의의 적절한 발현 벡터로 클로닝하고, 발현 벡터로 세포를 형질전환시켜 형질전환된 세포를 성장시키고 수확하여 융합 단백질 구조체를 제조하여 제조될 수 있다. 본원에서 정의된 융합 단백질 구조체는 당업자에게 널리 공지된 방법에 의해 정제될 수도 있다.

본 발명의 맥락에서 용어 " 융합 단백질 "은 대부분 (반드시 그런 것은 아니지만) 펩타이드 결합에 의해 서로 연결된 아미노산의 서열에 관한 것이다. 본 명세서의 융합 단백질에 따르면 용어 "융합된"은 적어도 세 개의 상이한 기원의 아미노산 서열, 즉, TAT 도메인, 미토콘드리아 표적화 도메인 (MTS)의 서열 및 기능적 MCM이 공유 결합에 의해 직접적으로 또는 아미노산 서열을 결합 (가교, 컨쥬게이션, 공유 결합)시키는 아미노산 링커를 통해 서로 결합된다는 사실을 말한다. 융합은 화학적 컨쥬게이션에 의해, 예컨대 펩타이드를 컨쥬게이션시키는데 사용된 최신 방법론을 사용하여 이루어질 수도 있다.

용어 " 아미노산 잔기 "는 본원에서 사용된 바와 같이 자연 발생 및 합성 아미노산, 뿐만 아니라 자연 발생 아미노산과 유사한 방식으로 기능할 수 있는 아미노산 유사체 및 아미노산 모방체를 말한다. 자연 발생 아미노산은 유전 암호에 의해 암호화된 것들, 뿐만 아니라 추후 변형되는 상기 아미노산들, 예를 들어, 하이드록시프롤린, γ-카르복시글루타메이트, 및 O-포스포세린이다. "아미노산 유사체 및 아미노산 모방체"는 자연 발생 아미노산과 같은 근본적인 화학 구조를 가진 화합물을 말한다. 이러한 유사체는 변형된 R 기 또는 변형된 펩타이드 백본을 갖지만, 자연 발생 아미노산과 같은 기본적인 화학 구조를 가지고 있다. 아미노산은 본원에서 일반적으로 알려져 있는 세 글자 기호 또는 IUPAC-IUB 생화학 명명법 위원회(Biochemical Nomenclature Commission)에 의해 권장되는 한 글자 기호로 불릴 수도 있다.

아미노산 잔기는 다양한 기에 대한 화학적 성질에 따라, 그 중에서도, 수반된 잔기의 극성, 전하, 가용성, 소수성, 친수성, 및/또는 양친매성 성질의 유사성을 기반으로 나누어질 수 있다는 것이 업계에 널리 공지되어 있다.

예를 들어, 비극성 "소수성" 아미노산은 발린 (V), 아이소류신 (I), 류신 (L), 메티오닌 (M), 페닐알라닌 (F), 트립토판 (W), 시스테인 (C), 알라닌 (A), 티로신 (Y), 히스티딘 (H), 트레오닌 (T), 세린 (S), 프롤린 (P), 글리신 (G), 아르기닌 (R) 및 리신 (K)으로 구성된 군으로부터 선택되고; "극성" 아미노산은 아르기닌 (R), 리신 (K), 아스파르트산 (D), 글루탐산 (E), 아스파라긴 (N), 글루타민 (Q)으로 구성된 군으로부터 선택되고; "양전하로 대전된" 아미노산은 아르기닌 (R), 리신 (K) 및 히스티딘 (H)으로 구성된 군으로부터 선택되고 "산성" 아미노산은 아스파르트산 (D), 아스파라긴 (N), 글루탐산 (E) 및 글루타민 (Q)으로 구성된 군으로부터 선택된다. "염기성" 아미노산은 pKa보다 낮은 pH 값에서 극성이고 양전하로 대전되고, 매우 친수성인 히스티딘 (H), 리신 (K) 및 아르기닌 (R)으로 구성된 군으로부터 선택된다.

본 명세서는 또한 본원에서 개시된 핵산 서열을 포함하는 DNA 구조체에 관한 것이다. 현재 개시된 주제의 DNA 구조체는 본 발명의 핵산 서열에 작동 가능하게 결합되는 추가적인 요소, 예컨대 프로모터, 조절 및 제어 요소, 번역, 발현 및 그 밖의 신호를 더 포함할 수도 있다.

일부 구체예에서, 본 명세서에 따르는 융합 단백질은 기능적 인간 MCM이 상기 인간 MTS에 대하여 C-말단에 있는 것이다.

미토콘드리아와 관련된 단백질의 대부분 전좌 메커니즘을 통해 세포질에서부터 미토콘드리아로 유입시키는 미토콘드리아 표적화 (또는 전좌) 서열 (MTS)과 합성된다. 미토콘드리아에 진입하면, MTS가 인식되고 분열되어, 적절하게 처리되고, 필요한 경우에는, 미토콘드리아 효소 복합체로 조립된다.

따라서, 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 " 미토콘드리아 표적화 서열 ", " MTS " 또는 " 미토콘드리아 전좌 서열 "은 미토콘드리아로의 단백질, 펩타이드, 아미노산 서열, 또는 이것들에 부착되는 화합물, 및 이것들의 임의의 생물학적 활성 단편의 수송을 유발할 수 있는 아미노산 서열을 말한다. 기능적 인간 메틸말로닐 조효소 A 뮤타아제 (MCM)에 대하여 N-말단에 있는, 현재 개시된 주제에 따르는 융합 단백질 구조체에서 사용되는 MTS는 전형적으로 길이가 약 15 내지 약 40개의 아미노산이며, 약 3 내지 약 5개의 비연속적 염기성 아미노산 (아르기닌/리신) 잔기를 포함하고, 종종 여러 개의 세린/트레오닌 잔기를 갖지만 산성 아미노산 (아스파르테이트/글루타메이트) 잔기는 없다. 분자 구조에서, 이들 MTS는 효율적인 미토콘드리아 수송에 필수적인 강염기성 양친매성 α-나선을 형성할 수 있다.

본원에서 하기 상세히 설명된 바와 같이, 다양한 TAT-MTS-MCM 융합 단백질 구조체가 온전한 세포 내에서 미토콘드리아에 도달할 수 있는 능력을 테스트하기 위해서, 메틸말로닐-CoA 뮤타아제 (MCM) 단백질을 암호화하는 유전자의 돌연변이를 가지고 있는 환자의 섬유아세포는 본원에서 기술된 바와 같이 제조된 다양한 TAT-MTS-MCM 융합 단백질 구조체, 즉, MCM의 고유한 MTS를 가지고 있는 TAT-MTSmcm 및 MCM에 대하여 이종 기원인 MTS, 즉, 각각 시트레이트 신타아제 (cs) 및 리포아미드 데하이드로게나아제 (lad)의 MTS를 가지고 있는 TAT-MTScs-MCM 및 TAT-MTSlad-MCM의 존재 하에서 인큐베이션되었다.

놀랍게도, 하기 기술된 바와 같이 제조된 모든 TAT-MTS-MCM 융합 단백질 구조체는, 예를 들어, 도 6C에서 입증된 바와 같이, 미토콘드리아로 성공적으로 내재화되고 처리되었다.

그러므로 일부 구체예에서는, 본 명세서에 따르는 융합 단백질은 인간 MTS이 인간 MCM의 MTS (즉, MCM의 고유한 MTS)이거나 또는 상기 인간 MCM에 대하여 이종 기원 (즉, 상이한 미토콘드리아 단백질/효소의 MTS)인 것이다.

특정 구체예에서, 본 명세서에 따르는 융합 단백질은 인간 MTS가 인간 메틸말로닐 조효소 A 뮤타아제 MTS인 것이며, 서열 번호: 5로 표시된 아미노산 서열을 갖는다.

추가의 구체예에서, 본 명세서에 따르는 융합 단백질은 서열 번호: 18 또는 서열 번호: 19로 표시된 아미노산 서열을 가지고 있으며, 이것들은 둘 다 MCM의 MTS를 포함한다.

상기 언급된 바와 같이 MCM에 대하여 이종 기원인 MTS를 가지고 있는 융합 단백질 구조체, 즉, 각각 시트레이트 신타아제 (cs) 및 리포아미드 데하이드로게나아제 (lad)의 MTS를 포함하는 TAT-MTScs-MCM 및 TAT-MTSlad-MCM은 또한 미토콘드리아로 내재화되고 그 안에서 분열되는 것으로 나타났다.

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 " 이종 기원 "은, 본 명세서에 다르는 기능적 인간 메틸말로닐 조효소 A 뮤타아제 (MCM)에 융합된 MTS를 언급할 때, 또 다른 (별개의) 미토콘드리아 단백질 또는 효소로부터 얻어진 MTS, 즉, MCM의 자연 발생 MTS가 아닌 MTS (제한되는 것은 아니지만, 예를 들어, 시트레이트 신타아제의 MTS 또는 리포아미드 데하이드로게나아제의 MTS)를 의미하는 것으로 받아들여져야 한다.

따라서 일부 구체예에서 본 명세서에 따르는 융합 단백질은 인간 MTS이 서열 번호: 4로 표시된 아미노산 서열을 가지고 있는 인간 미토콘드리아 시트레이트 신타아제 MTS, 또는 서열 번호: 6로 표시된 아미노산 서열을 가지고 있는 인간 리포아미드 데하이드로게나아제 MTS인 것이다.

특정 구체예에서, 본 명세서에 따르는 융합 단백질은 인간 MTS이 서열 번호: 4로 표시된 아미노산 서열을 가진 인간 시트레이트 신타아제 MTS인 것이다.

일부 구체예에서 본 명세서에 의해 제공되는 융합 단백질은 서열 번호: 8로 표시된 아미노산 서열을 가진 기능적 인간 MCM에 결합된, 서열 번호: 3로 표시된 아미노산 서열을 가진 HIV-1 트랜스 전사 활성 인자 (TAT) 도메인 및 서열 번호: 4로 표시된 아미노산 서열을 가진 인간 미토콘드리아 시트레이트 신타아제 MTS를 포함하며, 상기 MTS는 상기 TAT 도메인과 상기 기능적 인간 MCM 사이에 위치하고, 상기 MCM은 상기 MTS에 대하여 C-말단에 있다.

특정 구체예에서, 인간 미토콘드리아 시트레이트 신타아제 MTS를 포함하는 본 명세서에 따르는 융합 단백질은 서열 번호: 16 또는 서열 번호: 17로 표시된 아미노산 서열의 것이다.

다른 특정 구체예에서 본 명세서에 따르는 융합 단백질은 인간 MTS가 인간 리포아미드 데하이드로게나아제 MTS이며, 서열 번호: 6으로 표시된 아미노산 서열을 갖는 것이다.

일부 구체예에서 본 명세서에 의해 제공된 융합 단백질은 서열 번호: 3으로 표시된 아미노산 서열을 가진 기능적 인간 MCM에 결합된, 서열 번호: 3으로 표시된 아미노산 서열을 가진 HIV-1 트랜스 전사 활성 인자 (TAT) 도메인 및 서열 번호: 6으로 표시된 아미노산 서열을 가진 인간 미토콘드리아 리포아미드 데하이드로게나아제 MTS를 포함하며, 상기 MTS는 상기 TAT 도메인과 상기 기능적 인간 MCM 사이에 위치하고, 상기 MCM은 상기 MTS에 대하여 C-말단에 있다.

특정 구체예에서, 본 명세서에 따르는 융합 단백질은 서열 번호: 20 또는 서열 번호: 21으로 표시된 아미노산 서열을 가지고 있다.

일부 구체예에서 본 명세서에 따르는 융합 단백질은 적어도 하나의 링커를 더 포함한다. 적어도 하나의 링커는 융합 단백질 구조체의 상이한 도메인에 공유 결합한다.

본 명세서의 맥락에서 용어 " 링커 "는 상이한 융합 단백질 도메인 사이에 위치하고 그것들과 함께 공유 결합된 약 4 내지 약 20개의 아미노산 잔기의 아미노산 서열을 의미한다. 예를 들어, 본 발명에 따르는 링커는 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개의 아미노산 길이일 수도 있다. 링커는 인접한 단백질 도메인이 서로에 관하여 자유롭게 이동할 수 있도록 종종 플렉시블(flexible) 아미노산 잔기, 제한되는 것은 아니지만, 예를 들어, 글리신 및 세린으로 이루어진다. 용어 "링커"는 "스페이서"와 교체 가능하게 사용될 수 있다.

단백질의 다양한 도메인의 적절한 폴딩을 가능하게 하는 링커의 디자인은 업계에 널리 공지되어 있다. 본 명세서에 따르는 링커의 비-구속적인 예는 아미노산 서열 MGSS (서열 번호: 9로 표시됨), SSGLVPRGSHM (서열 번호: 10으로 표시됨), GSDPNSSS (서열 번호: 11로 표시됨), GSDP (서열 번호: 12로 표시됨), GSDPM (서열 번호: 13으로 표시됨), GSS, NGIE (서열 번호: 14로 표시됨), NI 중 어느 것도 될 수 있다.

본 발명의 맥락에서 융합 단백질은 또한, 하기 예시된 융합 단백질의 경우와 같이, 선택적으로 N-말단에서 적어도 하나의 메티오닌 (M) 잔기를 포함할 수도 있다. 메티오닌은 TAT 도메인에 대하여 N-말단에 위치한다.

융합은 또한 근본적으로 모든 결합이 펩타이드 결합이 되도록 재조합 기술에 의해, 즉, 전체 융합 단백질을 암호화하는 (모든 세그먼트를 암호화함) 핵산 서열의 구성에 의해 달성될 수도 있다.

본원에서 기술된 단백질 구조체의 정제를 촉진하기 위해서, 본 명세서에 따르는 융합 단백질 구조체는 또한 N-말단 태그 (예를 들어, 하기 예시된 His 태그, 몇 가지 예를 들면, 글루타티온 S-트랜스퍼라아제 (GST), 말토오스-결합 단백질 (MBP), FLAG 옥타펩타이드)를 포함할 수도 있으며, 최종 융합 구조체에서는 제거되거나 유지될 수도 있다. 이러한 태그는 일반적으로 미토콘드리아로 진입시 TAT 및 MTS 서열과 함께 융합 단백질로부터 분열된다.

따라서 일부 구체예에서 본 명세서에 따르는 융합 단백질은 적어도 하나의 정제 태그 (정제를 촉진하기 위해, 예를 들어, His 태그 또는 말토오스-결합 단백질 (MBP) 태그)를 더 포함한다.

정제 태그는 또한 정제 태그 근처의 적절한 부위에 프로테아제 분열 부위를 삽입함으로써 본 명세서에 따르는 융합 단백질 구조체로부터 분열될 수도 있다. 그러므로 일부 구체예에서 본 명세서에 따르는 융합 단백질은 적어도 하나의 프로테아제 분열 부위를 더 포함한다.

예를 들어, 서열 번호: 16으로 표시된 융합 단백질 구조체 TAT-MTScs-MCM은 N 말단에서 C 말단 방향으로 아미노산 서열 MGSS (서열 번호: 9로 표시됨)를 가진 링커, 히스티딘 태그 (아미노산 서열 HHHHHH를 가짐, 서열 번호: 1로 표시됨), 아미노산 서열 SSGLVPRGSHM (서열 번호: 10으로 표시됨)을 가진 추가적인 링커, TAT 도메인 (아미노산 서열 RKKRRQRRR을 가짐, 서열 번호: 3으로 표시됨), 아미노산 서열 GSDP (서열 번호: 12로 표시됨)를 가진 추가의 링커, 시트레이트 신타아제 (서열 번호: 4로 표시됨)의 MTS, GSS의 아미노산 서열을 가진 MCM과 MTS 사이에 위치하는 추가적인 링커 및 MCM 단백질 (서열 번호: 8로 표시됨)을 포함한다.

그러므로 일부 구체예에서 본 명세서에 따르는 융합 단백질은 MTS가 링커를 통해 상기 기능적 MCM 및/또는 상기 TAT에 결합된 것이다.

상기 언급된 바와 같이, 본원에서 정의된 융합 단백질 구조체는 또한 HIV-1 트랜스 전사 활성 인자 (TAT) 도메인을 포함한다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 " HIV-1 트랜스 전사 활성 인자 (TAT) " 도메인은 HIV-1에서 tat 유전자에 의해 암호화된 단백질의 일부를 말하며, 이것은 HIV-1 Tat 단백질의 11-아미노산 아르기닌- 및 리신-풍부 부분이다. 일부 구체예에서 TAT는 본원에서 기술된 바와 같이 서열 번호: 2에서 제시된 아미노산 서열 YGRKKRRQRRR을 가지고 있다.

현재 개시된 주제는 또한 상기 정의된 TAT 도메인의 임의의 단편을 포함한다. 예를 들어, 현재 개시된 주제에 따르는 TAT 도메인은 아미노산 서열 YGRKKRRQRRR (서열 번호: 2)을 가진 HIV-1 Tat 단백질의 약 3 내지 약 11 (예를 들어, 4-11, 5-11, 6-11, 7-11, 8-11, 9, 10 또는 11)의 순차적 아미노산 잔기를 포함할 수도 있다.

일부 구체예에서, 상기 정의된 TAT 도메인의 단편은 HIV-1 Tat 단백질의 9개의 순차적 아미노산 잔기를 포함하며, RKKRRQRRR의 아미노산 서열을 갖고, 하기 예시된 융합 단백질 구조체의 제조에 사용된 서열 번호:3에서 제시된 바와 같다.

따라서, 현재 개시된 주제의 상기 및 다른 구체예에서, 융합 단백질은 N-말단에서 TAT 도메인 및 C-말단에서 기능적 MCM을 포함하며, 둘 다 상기 TAT 도메인과 상기 기능적 MCM 사이에 위치한 MTS에 공유 결합 (융합)된다. 다시 말하면, 본 명세서는, 도 1에서 개략적으로 도시된 바와 같이, 기능적 MCM의 N-말단에 융합된 MTS의 N-말단에 융합된 N-말단 TAT를 포함하는 단백질 구조체를 제공한다.

양태들 중 또 다른 하나에 의해 본 명세서는 본원에서 정의된 바와 같이 생리학적으로 허용 가능한 담체 및 활성 성분으로서 융합 단백질을 포함하는 조성물을 제공한다.

양태들 중 또 다른 하나에 의해 본 명세서는 본원에서 정의된 바와 같이 약학적으로 허용 가능한 담체 및 활성 성분으로서 융합 단백질을 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.

본원에서 정의된 바와 같이 " 조성물 "은 일반적으로 완충제, 삼투압 농도를 조정하는 작용제, 및 선택적으로, 업계에 공지된 하나 이상의 약학적으로 (또는 생리학적으로) 허용 가능한 담체, 희석제, 첨가제 및 부형제를 포함한다. 추가의 활성 성분이 또한 조성물에 포함될 수 있다. 약학적으로 허용 가능한 담체는, 예를 들어, 물, 에탄올, 폴리올 (예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 및 액체 폴리에틸렌 글리콜, 등), 이것들의 적합한 혼합물, 및 식물성 오일을 함유하는 용매 또는 분산매일 수도 있다. 각각의 담체는 경우에 따라 다른 성분들과 호환 가능하고 환자에게 유해하지 않다는 의미에서 생리학적으로 또는 약학적으로 허용 가능해야 한다.

첨가제는 프로테아제 억제자, 예를 들어 페닐메탄설포닐플루오라이드 또는 페닐메틸설포닐 플루오라이드 (PMSF), 나파모스타트 메실레이트, 4-(2-아미노에틸)벤젠설포닐 플루오라이드 하이드로클로라이드 (AEBSF), 베스타틴, 펩스타틴 A, E-64, 류펩틴, 1, 10-페난트롤린 및 업계에 공지된 임의의 다른 프로테아제 억제자 중 적어도 하나일 수 있지만 이에 제한되는 것은 아니다.

현재 개시된 주제의 " 약학적 조성물 "은 상기 기술된 조성물이며, 업계에 공지된 약학적으로 허용 가능한 담체, 희석제, 보조제 및/또는 부형제 및/또는 첨가제를 포함한다.

하기 기술된 바와 같이, 본원에서 기술된 바와 같이 제조된 다양한 미토콘드리아-표적화된 MCM 융합 단백질 구조체는 미토콘드리아로 내재화되고 활성 형태로 분열된다. 이것은 시험관 내에서 융합 단백질 구조체가 MMA 환자로부터 얻어진 GM01673 세포의 미토콘드리아에서 산화적 인산화 (OXPHOS)에 의해 생산된 ATP에 영향을 미칠 수 있는 능력을 통해 입증되었다. 도 7B에서 도시된 바와 같이, 다양한 융합 단백질 구조체로 처리시 ATP 수준의 15-25%의 증가가 관찰되는 한편, 융합 단백질 구조체 TAT-MTScs-MCM이 가장 큰 증가를 유도하였다. 이에 더하여, 도 9에서 도시된 바와 같이, 미토콘드리아 표적화된 MCM 융합 단백질 구조체는 GM01673 섬유아세포에서 미토콘드리아에 의한 산소 소모량에 영향을 미치는 것으로 나타났으며, 이것은 미토콘드리아 활성의 추가적인 마커이다 (도 9).

게다가, 미토콘드리아 표적화된 MCM 융합 단백질 구조체는 또한 메틸말론산혈증 (MMA) 환자의 GM01673 세포에서 세포 생존률에 영향을 미치는 것으로 나타났다. 도 10에서 도시된 바와 같이, TAT-MTScs-MCM (27%) 및 TAT-MTSlad-MCM (24%) 융합 단백질 구조체를 가진 GM01673 섬유아세포에서 대조군에 비해 세포 생존률의 큰 향상이 관찰되었다.

그러므로 또 다른 양태에 의해서, 본 명세서는 본원에서 정의된 바와 같이 MCM의 결핍 또는 결함이 있는 MCM과 연관성이 있는 질환 또는 장애를 치료하거나 완화하는 약학적 조성물을 제공한다.

업계에 공지되고 본원에서 사용된 바와 같이 용어 " MCM의 결핍 또는 결함이 있는 MCM과 연관성이 있는 질환 또는 장애 "는 MCM이 결핍되거나 결함이 있는 MCM을 가진 대상체에 영향을 미치는 임의의 질환, 장애, 병태 또는 질병을 말한다. MCM의 결핍 또는 결함이 있는 MCM은, 제한되는 것은 아니지만, MCM을 암호화하는 MUT 유전자의 돌연변이로부터 발생할 수도 있다.

용어 " MCM의 결핍 또는 결함이 있는 MCM과 연관성이 있는 질환 또는 장애 "는, 예를 들어, 메틸말론산혈증 (MMA)을 포함한다.

상기 및 다른 구체예에서 본원에서 정의된 바와 같이 MCM의 결핍 또는 결함이 있는 MCM과 연관성이 있는 질환 또는 장애는 메틸말론산혈증 (MMA)이다.

용어 " 메틸말론산혈증 " (MMA)는 업계에 공지되고 본원에서 사용된 바와 같이 숙시닐-CoA로의 메틸말로닐-CoA의 아이소머화를 촉진하고 보조인자로서 코발라민 (B12)을 필요로 하는 미토콘드리아 효소 메틸말로닐 CoA 뮤타아제 (MCM)의 돌연변이로부터 발생하는 상염색체 열성 유전병을 말한다. 그러므로 MCM 또는 아데노실코발라민의 결핍은 메틸말론산혈증을 유발한다.

MMA는 고립 메틸말론산혈증 (OMIM 251000)과 메틸말론산혈증 및 호모시스틴뇨증, OMIM 277400을 포함한다.

그러므로 본 명세서의 일부 구체예에서 MMA는 고립 MMA, OMIM 251000이다. 업계에 공지되고 본원에서 정의된 바와 같이 mut-형 MMA (OMIM 251000)로도 알려져 있는 " 고립 메틸말론산혈증 "은 상염색체 열성 장애이며, 일반적으로는 대사성 산증(metabolic acidosis) 및 고암모니아혈증(hyperammonemia)으로 나타난다. 코발라민에 대한 증상의 시작 시점 및 생체 내 반응이 질환 과정 및 생존의 가장 강력한 예측 변수이다. 유전자형-표현형 연관성은, 특히, MCM을 암호화하는 MUT 유전자에서, 동형 접합성 및 화합물 이형 접합성 돌연변이 둘 다의 혼합 및 풍부합으로 인해 제한되었다 (11). 고립 메틸말론산혈증 (OMIM 251000)이라고도 불리는 mut-형 MMA는 또한 핵 MUT 유전자에 의해 암호화되는 MCM 아포효소의 결합에 의해 유발된다.

보통 초기 유아기에 나타나는 MMAML 효과는 경증에서부터 생명을 위협하는 정도까지 다양하다. 영향을 받은 유아는 구토, 탈수증, 약한 근긴장도 (근긴장 저하증), 발달 지체, 과도한 피로 (무기력증), 비대해진 간 (간 비대증), 및 체중 증가 및 예상 속도로의 성장에 실패 (성장 장애)를 경험할 수 있다. 장기 합병증은 수유 문제, 지적 장애, 만성 신장 질환, 및 췌장의 염증 (췌장염)을 포함할 수 있다. 치료하지 않으면, 이 장애는 때때로 혼수상태 및 사망으로 이어질 수도 있다.

비타민 B-12 (하이드록소코발라민) 비-반응성 MMA 환자에 대한 최근의 관리 접근법은 프로피온산 생성 아미노산의 식이 제한, 영양 보충 관리 및 경계 모니터링을 포함한다. 간 또는 조합된 간/신장 이식은 가장 심각한 임상 소견을 받은 것들을 치료하는데 사용되었다.

MMA에 걸린 환자, 심지어 간 이식을 받은 환자들은 진행성 신장 기능 장애에 걸릴 수 있으며, 결국 신장 이식을 필요로 할 수도 있다. 환자 집단, 심지어는 집중 치료된 환자 집단에서 볼 수 있는 질환 소견은 안정성을 증가시키고 신부전으로부터 보호하기 위해 새로운 요법, 이상적으로는 간과 신장 둘 다를 표적화할 수 있는 요법의 필요성을 입증한다.

본 명세서는 MCM의 결핍 또는 결함이 있는 MCM과 연관성이 있는 질환 또는 장애의 치료 또는 완화 방법에서 사용을 위한 본원에서 정의된 융합 단백질 또는 약학적 조성물을 더 제공한다.

또한 본 명세서는 필요로 하는 대상체에서 MCM의 결핍 또는 결함이 있는 MCM과 연관성이 있는 질환 또는 장애를 치료하거나 완화하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 상기 대상체에게 본 명세서에 따르는 융합 단백질 또는 본 명세서에 따르는 약학적 조성물의 치료적 유효량을 투여하여, MCM의 결핍 또는 결함이 있는 MCM과 연관성이 있는 질환 또는 장애를 치료하거나 완화하는 단계를 포함한다.

용어 " 치료하다 ", " 치료 ", " 완화하는 " 또는 이러한 형태들은 본원에서 정의된 바와 같이 필요로 하는 대상체에서 질환 또는 병태, 즉 MCM의 결핍 또는 결함이 있는 MCM과 연관성이 있는 질환 또는 병태, 예를 들어, 메틸말론산혈증 (MMA)의 악화를 예방 또는 저지하거나 이것들을 완화 또는 치유하는 것을 의미한다.

용어 "치료하다", "치료하는" 또는 "완화하는"은 의도의 맥락에서 질환을 유발하는 돌연변이된 유전학을 변화시키지 않기 때문에, 질환(들)의 완전한 치유를 나타내는 것은 아니다. 이 용어는 질환과 관련된 원치않는 증상 중 적어도 하나를 완화하거나, 대상체의 삶의 질을 개선하거나, 질환에 의해 유발된 치사율을 감소시키거나, 또는 (치료가 충분히 일찍 투여된 경우) 미토콘드리아 장애의 완전한 소견을 주로 에너지 수요가 높은 장기 및 조직에 발생하기 전에 예방하는 것을 말한다.

다시 말하면, 본 명세서는 필요로 하는 대상체에서 결함이 있는, 결핍된 또는 비-기능적 인간 MCM의 활성을 적어도 부분적으로 대체하기 위해 본원에서 정의된 융합 단백질 또는 약학적 조성물 또는 상기 융합 단백질 또는 약학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.

그러므로 또 다른 양태에 의해 본 명세서는 필요로 하는 대상체에서 결함이 있는, 결핍된 또는 비-기능적 인간 MCM의 활성을 적어도 부분적으로 대체하는 방법을 제공하며, 상기 대상체에게 본원에서 정의된 융합 단백질 또는 약학적 조성물의 치료적 유효량을 투여하는 단계를 포함한다.

용어 " 대체하는 "은 본원에서 사용된 바와 같이 결함이 있는 또는 비-기능적 MCM의 대체, 교체, 그것 대신에 사용, 또는 그것에 대한 대안으로서의 사용을 의미한다.

일부 구체예에서 기능적 인간 MCM 단백질은 필요로 하는 대상체에서 결함이 있는, 결핍된 또는 비-기능적 인간 MCM의 활성을 적어도 부분적으로 대체한다. 특정 구체예에서, 기능적 인간 MCM 단백질은 필요로 하는 대상체에서 결함이 없는 인간 MCM의 적어도 5 퍼센트, 적어도 10 퍼센트, 적어도 20 퍼센트, 적어도 30 퍼센트, 적어도 40 퍼센트, 적어도 50 퍼센트, 적어도 60 퍼센트, 적어도 70 퍼센트, 적어도 80 퍼센트, 적어도 90 퍼센트 또는 최대 100 퍼센트의 활성을 제공한다.

본 명세서는 기능적 인간 메틸말로닐 조효소 A 뮤타아제 (MCM) 단백질을 필요로 하는 대상체의 미토콘드리아로 도입하는 방법을 더 제공하며, 상기 방법은 상기 대상체에게 본 명세서에 따르는 융합 단백질 또는 약학적 조성물의 치료적 유효량을 투여하여, 기능적 인간 MCM 단백질을 상기 대상체의 미토콘드리아로 도입하는 단계를 포함한다.

치료적 조성물 (또는 제제) 또는 약학적 조성물은 당업자에 의해 결정된 바와 같이 임의의 통상적인 경로 및 투약량으로 투여될 수 있다. 투여는 정맥내, 복강내, 근육내 및 척추강내 투여 중 어느 하나로 이루어질 수 있다. 경구 투여가 또한 고려된다.

특정 구체예에서, 융합 단백질 또는 약학적 조성물은 본원에서 정의된 바와 같이 상기 대상체에 정맥내로 투여된다.

용어 본원에서 정의된 목적을 위한 본 명세서에 따르는 융합 펩타이드의 " 치료적 유효량 " (또는 양들)은 의학적 병태를 치유하거나 적어도 저지하거나 또는 적어도 완화하기 위해 업계에 공지된 바와 같은 고려사항들에 의해 결정된다.

일부 구체예에서 치료적 유효량은 각각의 환자에 대하여 개별적으로 MCM의 환자 기저 단백질 활성에 기초하여 결정될 수도 있다. 환자의 기저 단백질 활성 또는 단백질 활성 수준은 업계에 공지된 임의의 방법을 사용하여 차례로 결정될 수 있다.

일부 구체예에서 본 명세서에 따르는 방법은 상기 대상체에게 추가적인 치료제를 투여하는 단계를 더 포함한다.

용어 " 추가적인 치료제 "는 MCM의 결핍 또는 결함이 있는 MCM과 연관성이 있는 질환 또는 장애 (예를 들어, MMA 장애(들))의 맥락에서 당업자에게 공지된 관리 요법의 임의의 기준이며, 예를 들면, 프로피온산 생성 아미노산의 식이 제한 및 영양 보충 관리가 있다.

용어 " 대상체 "는 본원에서 사용된 바와 같이 본원에서 정의된 치료제, 또는 본 발명의 임의의 약학적 조성물의 투여가 요구되는 임의의 온혈 동물, 예를 들어, 래트, 마우스, 개, 고양이, 기니피그, 영장류 및 인간, 즉, MCM의 결핍 또는 결함이 있는 MCM과 연관성이 있는 질환 또는 장애 (예를 들어, MMA)에 걸린 것으로 진단된 대상체를 의미한다.

용어 "약"은 본원에서 사용된 바와 같이 연속 범위를 구성하는 정수값, 및, 적용 가능한 경우에는, 비-정수값을 포함하는 편차 범위라고 불리는 값보다 최대 1%, 더 구체적으로는 5%, 더 구체적으로는 10%, 더 구체적으로는 15%, 및 어떤 경우에는 최대 20% 더 높거나 낮게 벗어날 수 있는 값을 나타낸다.

명확성을 위해 별도의 구체예의 맥락에서 기술된 현재 개시된 주제의 어떤 특징들은 또한 단일 구체예에서 조합하여 제공될 수도 있다는 것을 알 수 있다. 반대로, 간결성을 위해 단일 구체예의 맥락에서 기술된 본 발명의 다양한 특징들은 또한 별도로 또는 임의의 적합한 부분 조합으로 또는 본 발명의 임의의 다른 기술된 구체예에서 적합한 것으로 제공될 수 있다. 다양한 구체예의 맥락에서 기술된 어떤 특징들은 구체예가 상기 요소들 없이 실시 불가능하지 않는 한 상기 구체예들의 필수적인 특징들로 간주되지 않는다.

개시되고 기술된 바와 같이, 본 발명은 본원에서 개시된 특정 예, 공정 단계, 및 재료에 제한되지 않으며, 이러한 공정 단계 및 재료는 어느 정도 다를 수도 있다는 것을 이해해야 한다. 또한 본원에서 사용된 용어는 단지 특정 구체예를 기술할 목적을 위해서만 사용되며 본 발명의 범위가 첨부된 청구항 및 그 동등물에 의해서만 제한되기 때문에 제한하려는 의도가 아님을 이해해야 한다.

본 명세서 및 첨부된 청구항에서 사용된 바와 같이, 단수형 "하나(a)", "하나(an) 및 "그(the)"는 문맥상 분명하게 달리 지시되지 않는 한 복수의 지시대상을 포함한다.

본 명세서 및 이어지는 청구항 전반에 걸쳐, 문맥상 달리 요구되지 않는 한, 단어 "포함하다(comprise)", 및 "포함하다(comprises)" 및 "포함하는(comprising)"과 같은 변형은 언급된 정수나 단계 또는 정수나 단계의 군을 포함하지만 임의의 다른 정수나 단계 또는 정수나 단계의 군을 제외하지 않는다는 것을 이해해야 할 것이다.

달리 정의되지 않으면, 본원에서 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 관련되어 있는 분야의 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 바와 같은 의미를 갖는다. 다음 용어들은 본원에서 기술된 바와 같이 본 발명의 목적을 위해 정의된다.

다음 실시예는 본 발명의 양태들을 수행하는데 있어서 본 발명자들에 의해 이용되는 기술들을 나타낸다. 이 기술들은 본 발명의 실시에 바람직한 구체예의 예인 한편, 당업자는 본 명세서를 고려하여 본 발명의 사상 및 의도된 범위에서 벗어나지 않으면서 많은 변형이 이루어질 수 있음을 인식하고 있다는 것을 알아야 한다.

실시예

추가의 상세한 설명 없이, 당업자는 전술한 기술내용을 사용하여 본 발명을 최대한으로 활용할 수 있다고 믿어진다. 그러므로, 다음 바람직한 특정 구체예들은 단지 예시적이며, 어떤 방법으로도 청구된 본 발명을 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다.

본원에서는 구체적으로 기술되지 않았지만 업계에 공지된 표준 분자 생물학 프로토콜은 일반적으로는 근본적으로 Sambrook & Russell, 2001을 따른다.

실시예 1: 일반적인 방법

세포 배양

메틸말론산혈증 (MMA) 환자의 섬유아세포 (GM01673, GM00050)를 Coriell Cell Repositories (Camden, NJ)에서 얻어서 권장 배지 (10% 하이클론 FBS, 2 mM L-글루타민, 100 U/mL 페니실린, 및 100 μg/mL 스트렙토마이신으로 보충된 MEM eagle RPMI 배지, Biological Industries, Beit Ha'emek, Israel)에서 성장시켰다. 346 섬유아세포를 Department of Genetic and Metabolic Diseases, Hadassah medical center에서 얻어서 상기와 같은 배지에서 성장시켰다. 모든 세포주를 37℃에서 5% CO₂의 가습 대기 하에서 성장시켰다.

플라스미드 구조

융합 단백질 구조체의 아미노산 서열 및 그 구성요소

서열 번호:	아미노산 서열	설명
1	HHHHHH	His 태그
2	YGRKKRRQRRR	TAT
3	RKKRRQRRR	TAT 단편
4	ALLTAAARLLGTKNASCLVLAARHAS	시트레이트 신타아제의 MTS (MTScs)
5	MLRAKNQLFLLSPHYLRQVKESSGSRLIQQRL	메틸말로닐 CoA 뮤타아제의 MTS (MTSmcm)
6	QSWSRVYCSLAKRGHFNRISHGLQGLSAVPLRTYA	리포아미드 데하이드로게나아제의 MTS (MTSlad)
7	MKIEEGKLVIWINGDKGYNGLAEVGKKFEKDTGIKVTVEHPDKLEEKFPQVAATGDGPDIIFWAHDRFGGYAQSGLLAEITPDKAFQDKLYPFTWDAVRYNGKLIAYPIAVEALSLIYNKDLLPNPPKTWEEIPALDKELKAKGKSALMFNLQEPYFTWPLIAADGGYAFKYENGKYDIKDVGVDNAGAKAGLTFLVDLIKNKHMNADTDYSIAEAAFNKGETAMTINGPWAWSNIDTSKVNYGVTVLPTFKGQPSKPFVGVLSAGINAASPNKELAKEFLENYLLTDEGLEAVNKDKPLGAVALKSYEEELAKDPRIAATMENAQKGEIMPNIPQMSAFWYAVRTAVINAASGRQTVDEALKDAQT	MBP
8	LHQQQPLHPEWAALAKKQLKGKNPEDLIWHTPEGISIKPLYSKRDTMDLPEELPGVKPFTRGPYPTMYTFRPWTIRQYAGFSTVEESNKFYKDNIKAG QQGLSVAFDLATHRGYDSDNPRVRGDVGMA GVAIDTVEDTKILFDGIPLEKMSVSMTMNGAVIPVLANFIVTGEEQGVPKEKLTGTIQNDILKEFMVRNTYIFPPEPSMKIIADIFEYTAKHMPKFNSISISGYHMQEAGADAILELAYTLADGLEYSRTGLQAGLTIDEFAPRLSFFWGIGMNFYMEIAKMRAGRRLWA HLIEKMFQPKNSKSLLLRAHCQTSGWSLTEQDPYNNIVRTAIEAMAAVFGGTQSLHTNSFDEALGLPTVKSARIARNTQIIIQEESGIPKVADPWGGSYM MECLTNDVYDAALKLINEIEEMGGMAKAVAEGIPKLRIEECAARRQARIDSGSEVIVGVNKYQLEKEDAVEVLAIDNTSVRNRQIEKLKKIKSSRDQALAERCLAALTECAASGDGNILALAVDASRARCTVGEITDALKKVFGEHKANDRMVSGAYRQEFGESKEITSAIKRVHKFMEREGRRPRLLVAKMGQDGHDRGAKVIATGFADLGFDVDIGPLFQTPREVAQQAVDADVHAVGISTLAAGHKTLVPELIKELNSLGRPDILVMCGGVIPPQDYEFLFEVGVSNVFGPGTRIPK AAVQVLDDIEKCLEKKQQSV	메틸말로닐 CoA 뮤타아제 (MCM)
9	MGSS	링커 1
10	SSGLVPRGSHM	링커 2
11	GSDPNSSS	링커 3
12	GSDP	링커 4
13	GSDPM	링커 5
N/A	GSS	링커 6
14	NGIE	링커 7
N/A	NI	링커 8
15	ENLYFQS	TEV 부위
16	MGSSHHHHHHSSGLVPRGSHMRKKRRQRRRGSDPALLTAAARLLGTKNASCLVLAARHASGSSLHQQQPLHPEWAALAKKQLKGKNPEDLIWHTPEGISIKPLYSKRDTMDLPEELPGVKPFTRGPYPTMYTFRPWTIRQYAGFSTVEESNKFYKDNIKAGQQGLSVAFDLATHRGYDSDNPRVRGDVGMAGVAIDTVEDTKILFDGIPLEKMSVSMTMNGAVIPVLANFIVTGEEQGVPKEKLTGTIQNDILKEFMVRNTYIFPPEPSMKIIADIFEYTAKHMPKFNSISISGYHMQEAGADAILELAYTLADGLEYSRTGLQAGLTIDEFAPRLSFFWGIGMNFYMEIAKMRAGRRLWAHLIEKMFQPKNSKSLLLRAHCQTSGWSLTEQDPYNNIVRTAIEAMAAVFGGTQSLHTNSFDEALGLPTVKSARIARNTQIIIQEESGIPKVADPWGGSYMMECLTNDVYDAALKLINEIEEMGGMAKAVAEGIPKLRIEECAARRQARIDSGSEVIVGVNKYQLEKEDAVEVLAIDNTSVRNRQIEKLKKIKSSRDQALAERCLAALTECAASGDGNILALAVDASRARCTVGEITDALKKVFGEHKANDRMVSGAYRQEFGESKEITSAIKRVHKFMEREGRRPRLLVAKMGQDGHDRGAKVIATGFADLGFDVDIGPLFQTPREVAQQAVDADVHAVGISTLAAGHKTLVPELIKELNSLGRPDILVMCGGVIPPQDYEFLFEVGVSNVFGPGTRIPKAAVQVLDDIEKCLEKKQQSV	TAT-MTScs-MCM
17	MGSSHHHHHHSSGLVPRGSHMRKKRRQRRRGSDPALLTAAARLLGTKNASCLVLAARHASLHQQQPLHPEWAALAKKQLKGKNPEDLIWHTPEGISIKPLYSKRDTMDLPEELPGVKPFTRGPYPTMYTFRPWTIRQYAGFSTVEESNKFYKDNIKAGQQGLSVAFDLATHRGYDSDNPRVRGDVGMAGVAIDTVEDTKILFDGIPLEKMSVSMTMNGAVIPVLANFIVTGEEQGVPKEKLTGTIQNDILKEFMVRNTYIFPPEPSMKIIADIFEYTAKHMPKFNSISISGYHMQEAGADAILELAYTLADGLEYSRTGLQAGLTIDEFAPRLSFFWGIGMNFYMEIAKMRAGRRLWAHLIEKMFQPKNSKSLLLRAHCQTSGWSLTEQDPYNNIVRTAIEAMAAVFGGTQSLHTNSFDEALGLPTVKSARIARNTQIIIQEESGIPKVADPWGGSYMMECLTNDVYDAALKLINEIEEMGGMAKAVAEGIPKLRIEECAARRQARIDSGSEVIVGVNKYQLEKEDAVEVLAIDNTSVRNRQIEKLKKIKSSRDQALAERCLAALTECAASGDGNILALAVDASRARCTVGEITDALKKVFGEHKANDRMVSGAYRQEFGESKEITSAIKRVHKFMEREGRRPRLLVAKMGQDGHDRGAKVIATGFADLGFDVDIGPLFQTPREVAQQAVDADVHAVGISTLAAGHKTLVPELIKELNSLGRPDILVMCGGVIPPQDYEFLFEVGVSNVFGPGTRIPKAAVQVLDDIEKCLEKKQQSV	TAT-MTScs-MCM 변이체
18	MGSSHHHHHHSSGLVPRGSHMRKKRRQRRRGSDPNSSSLRAKNQLFLLSPHYLRQVKESSGSRLIQQRLLHQQQPLHPEWAALAKKQLKGKNPEDLIWHTPEGISIKPLYSKRDTMDLPEELPGVKPFTRGPYPTMYTFRPWTIRQYAGFSTVEESNKFYKDNIKAGQQGLSVAFDLATHRGYDSDNPRVRGDVGMAGVAIDTVEDTKILFDGIPLEKMSVSMTMNGAVIPVLANFIVTGEEQGVPKEKLTGTIQNDILKEFMVRNTYIFPPEPSMKIIADIFEYTAKHMPKFNSISISGYHMQEAGADAILELAYTLADGLEYSRTGLQAGLTIDEFAPRLSFFWGIGMNFYMEIAKMRAGRRLWAHLIEKMFQPKNSKSLLLRAHCQTSGWSLTEQDPYNNIVRTAIEAMAAVFGGTQSLHTNSFDEALGLPTVKSARIARNTQIIIQEESGIPKVADPWGGSYMMECLTNDVYDAALKLINEIEEMGGMAKAVAEGIPKLRIEECAARRQARIDSGSEVIVGVNKYQLEKEDAVEVLAIDNTSVRNRQIEKLKKIKSSRDQALAERCLAALTECAASGDGNILALAVDASRARCTVGEITDALKKVFGEHKANDRMVSGAYRQEFGESKEITSAIKRVHKFMEREGRRPRLLVAKMGQDGHDRGAKVIATGFADLGFDVDIGPLFQTPREVAQQAVDADVHAVGISTLAAGHKTLVPELIKELNSLGRPDILVMCGGVIPPQDYEFLFEVGVSNVFGPGTRIPKAAVQVLDDIEKCLEKKQQSV	TAT-MTSmcm-MCM
19	MGSSHHHHHHSSGLVPRGSHMRKKRRQRRRGSDPMLRAKNQLFLLSPHYLRQVKESSGSRLIQQRLLHQQQPLHPEWAALAKKQLKGKNPEDLIWHTPEGISIKPLYSKRDTMDLPEELPGVKPFTRGPYPTMYTFRPWTIRQYAGFSTVEESNKFYKDNIKAGQQGLSVAFDLATHRGYDSDNPRVRGDVGMAGVAIDTVEDTKILFDGIPLEKMSVSMTMNGAVIPVLANFIVTGEEQGVPKEKLTGTIQNDILKEFMVRNTYIFPPEPSMKIIADIFEYTAKHMPKFNSISISGYHMQEAGADAILELAYTLADGLEYSRTGLQAGLTIDEFAPRLSFFWGIGMNFYMEIAKMRAGRRLWAHLIEKMFQPKNSKSLLLRAHCQTSGWSLTEQDPYNNIVRTAIEAMAAVFGGTQSLHTNSFDEALGLPTVKSARIARNTQIIIQEESGIPKVADPWGGSYMMECLTNDVYDAALKLINEIEEMGGMAKAVAEGIPKLRIEECAARRQARIDSGSEVIVGVNKYQLEKEDAVEVLAIDNTSVRNRQIEKLKKIKSSRDQALAERCLAALTECAASGDGNILALAVDASRARCTVGEITDALKKVFGEHKANDRMVSGAYRQEFGESKEITSAIKRVHKFMEREGRRPRLLVAKMGQDGHDRGAKVIATGFADLGFDVDIGPLFQTPREVAQQAVDADVHAVGISTLAAGHKTLVPELIKELNSLGRPDILVMCGGVIPPQDYEFLFEVGVSNVFGPGTRIPKAAVQVLDDIE KCLEKKQQSV	TAT-MTSmcm-MCM 변이체
20	MGSSHHHHHHSSGLVPRGSHMRKKRRQRRRGSDPQSWSRVYCSLAKRGHFNRISHGLQGLSAVPLRTYAGSSLHQQQPLHPEWAALAKKQLKGKNPEDLIWHTPEGISIKPLYSKRDTMDLPEELPGVKPFTRGPYPTMYTFRPWTIRQYAGFSTVEESNKFYKDNIKAGQQGLSVAFDLATHRGYDSDNPRVRGDVGMAGVAIDTVEDTKILFDGIPLEKMSVSMTMNGAVIPVLANFIVTGEEQGVPKEKLTGTIQNDILKEFMVRNTYIFPPEPSMKIIADIFEYTAKHMPKFNSISISGYHMQEAGADAILELAYTLADGLEYSRTGLQAGLTIDEFAPRLSFFWGIGMNFYMEIAKMRAGRRLWAHLIEKMFQPKNSKSLLLRAHCQTSGWSLTEQDPYNNIVRTAIEAMAAVFGGTQSLHTNSFDEALGLPTVKSARIARNTQIIIQEESGIPKVADPWGGSYMMECLTNDVYDAALKLINEIEEMGGMAKAVAEGIPKLRIEECAARRQARIDSGSEVIVGVNKYQLEKEDAVEVLAIDNTSVRNRQIEKLKKIKSSRDQALAERCLAALTECAASGDGNILALAVDASRARCTVGEITDALKKVFGEHKANDRMVSGAYRQEFGESKEITSAIKRVHKFMEREGRRPRLLVAKMGQDGHDRGAKVIATGFADLGFDVDIGPLFQTPREVAQQAVDADVHAVGISTLAAGHKTLVPELIKELNSLGRPDILVMCGGVIPPQDYEFLFEVGVSNVFGPGTRIPKAAVQVLDDIEKCLEKKQQSV	TAT-MTSlad-MCM
21	MGSSHHHHHHSSGLVPRGSHMRKKRRQRRRGSDPQSWSRVYCSLAKRGHFNRISHGLQGLSAVPLRTYALHQQQPLHPEWAALAKKQLKGKNPEDLIWHTPEGISIKPLYSKRDTMDLPEELPGVKPFTRGPYPTMYTFRPWTIRQYAGFSTVEESNKFYKDNIKAGQQGLSVAFDLATHRGYDSDNPRVRGDVGMAGVAIDTVEDTKILFDGIPLEKMSVSMTMNGAVIPVLANFIVTGEEQGVPKEKLTGTIQNDILKEFMVRNTYIFPPEPSMKIIADIFEYTAKHMPKFNSISISGYHMQEAGADAILELAYTLADGLEYSRTGLQAGLTIDEFAPRLSFFWGIGMNFYMEIAKMRAGRRLWAHLIEKMFQPKNSKSLLLRAHCQTSGWSLTEQDPYNNIVRTAIEAMAAVFGGTQSLHTNSFDEALGLPTVKSARIARNTQIIIQEESGIPKVADPWGGSYMMECLTNDVYDAALKLINEIEEMGGMAKAVAEGIPKLRIEECAARRQARIDSGSEVIVGVNKYQLEKEDAVEVLAIDNTSVRNRQIEKLKKIKSSRDQALAERCLAALTECAASGDGNILALAVDASRARCTVGEITDALKKVFGEHKANDRMVSGAYRQEFGESKEITSAIKRVHKFMEREGRRPRLLVAKMGQDGHDRGAKVIATGFADLGFDVDIGPLFQTPREVAQQAVDADVHAVGISTLAAGHKTLVPELIKELNSLGRPDILVMCGGVIPPQDYEFLFEVGVSNVFGPGTRIPKAAVQVLDDIE KCLEKKQQSV	TAT-MTSlad-MCM 변이체
22	MGSSHHHHHHGSSMKIEEGKLVIWINGDKGYNGLAEVGKKFEKDTGIKVTVEHPDKLEEKFPQVAATGDGPDIIFWAHDRFGGYAQSGLLAEITPDKAFQDKLYPFTWDAVRYNGKLIAYPIAVEALSLIYNKDLLPNPPKTWEEIPALDKELKAKGKSALMFNLQEPYFTWPLIAADGGYAFKYENGKYDIKDVGVDNAGAKAGLTFLVDLIKNKHMNADTDYSIAEAAFNKGETAMTINGPWAWSNIDTSKVNYGVTVLPTFKGQPSKPFVGVLSAGINAASPNKELAKEFLENYLLTDEGLEAVNKDKPLGAVALKSYEEELAKDPRIAATMENAQKGEIMPNIPQMSAFWYAVRTAVINAASGRQTVDEALKDAQTNGIEENLYFQSNIRKKRRQRRRGSDPNSSSLRAKNQLFLLSPHYLRQVKESSGSRLIQQRLLHQQQPLHPEWAALAKKQLKGKNPEDLIWHTPEGISIKPLYSKRDTMDLPEELPGVKPFTRGPYPTMYTFRPWTIRQYAGFSTVEESNKFYKDNIKAGQQGLSVAFDLATHRGYDSDNPRVRGDVGMAGVAIDTVEDTKILFDGIPLEKMSVSMTMNGAVIPVLANFIVTGEEQGVPKEKLTGTIQNDILKEFMVRNTYIFPPEPSMKIIADIFEYTAKHMPKFNSISISGYHMQEAGADAILELAYTLADGLEYSRTGLQAGLTIDEFAPRLSFFWGIGMNFYMEIAKMRAGRRLWAHLIEKMFQPKNSKSLLLRAHCQTSGWSLTEQDPYNNIVRTAIEAMAAVFGGTQSLHTNSFDEALGLPTVKSARIARNTQIIIQEESGIPKVADPWGGSYMMECLTNDVYDAALKLINEIEEMGGMAKAVAEGIPKLRIEECAARRQARIDSGSEVIVGVNKYQLEKEDAVEVLAIDNTSVRNRQIEKLKKIKSSRDQALAERCLAALTECAASGDGNILALAVDASRARCTVGEITDALKKVFGEHKANDRMVSGAYRQEFGESKEITSAIKRVHKFMEREGRRPRLLVAKMGQDGHDRGAKVIATGFADLGFDVDIGPLFQTPREVAQQAVDADVHAVGISTLAAGHKTLVPELIKELNSLGRPDILVMCGGVIPPQDYEFLFEVGVSNVFGPGTRIPKAAVQVLDDIEKCLEKKQQSV	MBP-TAT-MTSmcm-MCM
23	MGSSHHHHHHSSGLVPRGSHMRKKRRQRRRGSDPNSSSLHQQQPLHPEWAALAKKQLKGKNPEDLIWHTPEGISIKPLYSKRDTMDLPEELPGVKPFTRGPYPTMYTFRPWTIRQYAGFSTVEESNKFYKDNIKAGQQGLSVAFDLATHRGYDSDNPRVRGDVGMAGVAIDTVEDTKILFDGIPLEKMSVSMTMNGAVIPVLANFIVTGEEQGVPKEKLTGTIQNDILKEFMVRNTYIFPPEPSMKIIADIFEYTAKHMPKFNSISISGYHMQEAGADAILELAYTLADGLEYSRTGLQAGLTIDEFAPRLSFFWGIGMNFYMEIAKMRAGRRLWAHLIEKMFQPKNSKSLLLRAHCQTSGWSLTEQDPYNNIVRTAIEAMAAVFGGTQSLHTNSFDEALGLPTVKSARIARNTQIIIQEESGIPKVADPWGGSYMMECLTNDVYDAALKLINEIEEMGGMAKAVAEGIPKLRIEECAARRQARIDSGSEVIVGVNKYQLEKEDAVEVLAIDNTSVRNRQIEKLKKIKSSRDQALAERCLAALTECAASGDGNILALAVDASRARCTVGEITDALKKVFGEHKANDRMVSGAYRQEFGESKEITSAIKRVHKFMEREGRRPRLLVAKMGQDGHDRGAKVIATGFADLGFDVDIGPLFQTPREVAQQAVDADVHAVGISTLAAGHKTLVPELIKELNSLGRPDILVMCGGVIPPQDYEFLFEVGVSNVFGPGTRIPKAAVQVLDDIEKCLEKKQQSV	TAT-ΔMTS-MCM

단백질 발현

본원에서 상기 기술된 융합 단백질 TAT-MTS-MCM 융합 단백질을 암호화하는 플라스미드로 형질전환된 대장균(E. coli) BL21-CodonPlus (λDE3) 또는 Rosseta 컴피턴트 세포(competent cell)를 37℃에서 카나마이신 (50 μg/ml), 테트라사이클린 (12.5 μg/ml) 및 클로람페니콜 (34 μg/ml)을 함유하는 식염수 락토오스 브로스(broth) (SLB 배지)에서 인큐베이션하였다. 0.2-0.3의 O.D.₆₀₀에서, 0.1% 글리세롤 및 0.1 mM 칼륨 글루타메이트를 배양물에 추가한 다음 이것을 42℃에서 20-30분 동안 열-충격(heat-shock)을 가했으며, 그 후 박테리아를 O.D.₆₀₀가 0.8일 때까지 37℃에서 성장시켰다. 아이소프로필-베타-D-티오갈락토피라노시드 (IPTG, 최종 농도에 대해서는 하기 표 1 참조)를 추가하여 단백질 발현을 유도하였다. 12℃에서 18시간 인큐베이션 후, 세포를 원심분리 (4℃에서 20분 동안 2000 g)에 의해 수확하였다. 하기 표 2는 TAT-MTS-MCM 융합 단백질의 발현 조건을 요약한다.

융합 단백질 구조체의 성장 조건 및 농도

MTS	숙주	IPTG (mM)	성장 조건	최종 단백질 농도 (mg/ml)
MCM	Codon+	0.05	12℃, O.N.	0.73
CS	Codon+	0.05	12℃, O.N.	2.7
LAD	Rosseta	0.05	12℃, O.N.	0.43
ΔMTS	Rosseta	0.05	12℃, O.N.	0.75
MCM, MBP 태그	Rosseta	0.05	12℃, O.N.	0.56

단백질 정제

정제 과정을 위해서, 발현 세포의 4리터 배양물의 박테리아 펠릿을 0.2 mg/ml 라이소자임을 함유하는 결합 버퍼 (25mM TrisHCl pH8.0, 0.2M NaCl, 10% 글리세롤, 5 mM 베타머캅토에탄올, 1 mM 페닐메틸설포닐플루오라이드 (PMSF)) 중에서 Microfluidizer (Microfluidics)를 사용하여 붕괴시켰다. 현탁액을 원심분리 (4℃에서 1h 동안 24,000 g)에 의해 정화시켰고, 이미다졸 (Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA)을 10 mM의 최종 농도로 추가하였다. 융합 단백질을 함유하는 상층액을 사전 평형화된 (결합 버퍼에서) HiTrap Chelating HP 컬럼 (Amersham-Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden)에 로딩하였다. 증가하는 이미다졸 농도의 단계적 추가에 의해 컬럼을 세척하였다. 마지막으로, 표적 단백질을 용출 버퍼 (결합 버퍼, 250 mM 이미다졸)로 용출시켰다. 모든 정제 과정을 FPLC 시스템 AKTA (Amersham-Pharmacia Biotech)를 사용하여 수행하였다. PD-10 탈염 컬럼 (GE Healthcare, Piscataway, NJ, USA)을 사용하여 정제된 단백질을 PBS로 옮김으로써 이미다졸을 제거하였다. 단백질의 앨리쿼트를 사용할 때 까지 -80℃에 냉동시켰다.

단백질 농도의 결정

단백질 농도를 Bradford 방법에 따라, Bradford 시약 및 BSA의 표준 곡선을 사용하여 측정하였다. 단백질 농도를 595 nm의 파장에서 결정하였다.

전기영동에 의한 단백질 분리

다양한 단백질 분획의 샘플 (5-20 μg 단백질/레인)을 12% (w/v) SDS/PAGE 겔에 로딩하였다.

웨스턴 블롯 분석

샘플을 12% SDS-PAGE 겔 상에서 분리하였다. 이어서 단백질을 Immobilon-P 전달 막 (Millipore, Millipore, Bradford, MA, USA)으로 전기 이동시켰다. 웨스턴 블롯 분석을 각각 1:1000 및 1:30,000의 희석 배수로 항-MCM (Abcam, Mass, USA), 또는 항-His (Amersham-Pharmacia Biotech) 항체를 사용하여 수행하여, 관련된 단백질을 확인하였다. 향상된 화학발광 키트 (EZ-ECL, Biological Industries, Beit-Haemek, Israel)를 사용하여 밴드 가시화를 실행하였다.

미토콘드리아의 분리

미토콘드리아를 분별 원심분리를 사용하여 분리하였다. 세포를 버퍼 A (320 mmol/L 수크로오스, 5 mmol/L Tris-HCl, 2 mmol/L EGTA, pH 7.4)에서 균질화하였고 2,000 g로 3분 동안 원심분리하여 핵 및 세포 데브리(debris)를 제거하였다. 얻어진 상층액을 4℃에서 12,000 g로 10분 동안 원심분리하여 미토콘드리아를 펠릿화하였다. 미토콘드리아 펠릿을 버퍼 A로 다시 2회 세척하고 사용하기 전까지 -80℃에서 보관하였다.

세포로의 융합 단백질의 전달

세포를 3개의 T-75 플라스크에서 평판배양하였다. 세포가 90% 밀집도에 도달했을 때, 배지를 다양한 기간 동안 0.02-0.05 μg/μl (최종 농도) TAT-MTS-MCM 융합 단백질 구조체를 함유하는 신선한 배지로 대체하였다. 인큐베이션 후, 세포를 포스페이트-완충된 식염수 (PBS)로 세척하고, 트립신 처리하고, 펠릿화하여 사용할 때까지 -80℃에서 보관하였다. 펠릿을 1 mmol/L PMSF를 함유하는 세포 용해 버퍼 (Promega)에서 재현탁시키고, 얼음 위에서 10분 동안 놔둔 다음 15,000 g로 10분 동안 원심분리하였다. 상층액을 웨스턴 블롯으로 분석하였다.

ATP 수준의 측정

세포를 DMEM (D-글루코오스, 나트륨 피루베이트 및 L-글루타민 없음), 투석된 10% 검증된 소 태아 혈청 (FBS) Dialyzed, 2 mM L-글루타민, 100 U/mL 페니실린, 및 100 μg/mL, (Biological Industries, Beit Ha'emek, Israel), MCM의 필수 보조인자인 1.25 μM 비타민 B-12 및 5 mM 갈락토오스 (Sigma)를 함유하는 무-글루코오스 배지에서 48시간 동안 배양하였다.

미토콘드리아 ATP 수준을 각각 네 개의 융합 단백질 구조체 1 μg과 함께 인큐베이션한 후 6시간에 결정하였다. ATP 수준을 제조사의 지시에 따라 ATPLite 발광-기반 검정 (Perkin Elmer, Waltham, MA, USA)을 사용하여 측정하였고 대조군 환자 세포, 즉, 융합 단백질 구조체 중 어느 것으로도 처리되지 않은 세포 (PBS가 단독으로 추가됨)에 대한 상대적인 수준으로 표현된다.

미토콘드리아 막 전위

미토콘드리아 함유량 및 미토콘드리아 막 전위를 각각 MitoTracker Green FM (MTG) (Molecular Probes, Eugene, OR, USA) 및 테트라메틸로다민 에틸 에스터 (TMRE) (Abcam, Mass, USA)를 사용하여 추정하였다. MTG를 기존의 배지에 200 nM의 최종 농도로 추가하였고 세포를 37℃, 5% CO₂에서 45분 동안 인큐베이션하였다. TMRE를 연속해서 기존 배지에 200 nM의 최종 농도로 추가하였고 세포를 37℃, 5% CO₂에서 추가로 20분 동안 인큐베이션하였다. 배지를 제거한 다음, MTG에 대하여 PBS로 또는 TMRE에 대해서는 PBS 중의 0.2% BSA로 1회 씻어낸 후, 100 μl PBS로 대체하였다. 플레이트를 37℃, λex 485 nm, λem 528 nm (MTG) 및 λex 485 nm, λem 590 nm (TMRE)에서 판독하였다.

산소 소모량

산소 소모율 (OCR)을 XF24 세포 외 유동 분석기 (Seahorse Biosciences, North Billeric, MA, USA)를 사용하여 측정하였다.

세포 생존률 테스트

세포를 96 웰 플레이트에서 100 μl 무-글루코오스 배지에서 24시간 동안 평판배양하였다 (웰 당 15,000개의 세포). 다음 날, 융합 단백질 1.5μg을 72시간 동안 추가하였다. 미토콘드리아 분리 버퍼 단독을 대조군으로 사용하였다. 세포 생존률을 제조사의 매뉴얼에 따라 CellTiter-Blue® (Promega, Madison, WI) 형광-기반 검정을 사용하여 분석하였다.

실시예 2

TAT-MTS- MCM 융합 단백질 구조체의 구성, 발현 및 정제

메틸말로닐-CoA 뮤타아제 (MCM)에 기초한 융합 단백질로 미토콘드리아를 효율적으로 표적화할 수 있는 가능성을 테스트하기 위해서, 트랜스 전사 활성 인자 (TAT) 도메인 및 다양한 상이한 미토콘드리아 전좌 서열 (MTS)을 포함하는 MCM-기반 융합 단백질 구조체를 상기 상세히 설명된 바와 같이 제조하고 분석하였다.

사용된 MTS는 MCM의 상동성이고, 고유한 MTS, 또는 인간 MCM 단백질을 미토콘드리아로 표적화하기위한 고전적 MTS 서열인 인간, 핵-암호화된 미토콘드리아 단백질의 이종 기원 MTS이다. 사용된 이종 기원 MTS는 리포아미드 데하이드로게나아제의 것 (서열 번호: 6으로 표시된 아미노산 서열을 갖는 "lad" 또는 "LAD"라고도 불림)이고, 각각의 융합 단백질 구조체는 본원에서 "TAT-MTSTlad-MCM"이라고 불리며, 시트레이트 신타아제의 것 (cs, 서열 번호: 4로 표시된 아미노산 서열을 가짐)이고, 각각의 융합 단백질 구조체는 본원에서 "TAT-MTScs-MCM"이라고 불리며, MCM의 고유한 MTS (mcm, 서열 번호: 5로 표시된 아미노산 서열을 가짐)이고, 각각의 융합 단백질 구조체는 본원에서 "TAT-MTSmcmMCM"이라고 불린다.

또한, 본원에서 "TAT-ΔMTS-MCM"이라고 불리는, MTS가 없는 융합 단백질 구조체을 제조하였다.

모든 플라스미드를 암호화 서열의 5'-말단에서 His-태그와 클로닝하여 정제를 용이하게 하고 모든 암호화 서열은 T7 프로모터의 제어 하에 있다.

다양한 융합 단백질 구조체의 개략도는 도 1에서 도시되어 있고 상기 기술된 바와 같이 제조된 다양한 융합 단백질 구조체의 서열은 표 1에서 상세히 설명되어 있다. 표 1에서 나타난 바와 같이, 시트레이트 신타아제 (cs)의 MTS를 포함하는 두 개의 융합 단백질 구조체, "TAT-MTScs-MCM" 및 "TAT-MTScs-MCM 변이체"를 제조하였고 그것들의 아미노산 서열은 각각 서열 번호: 16 및 서열 번호: 17로 표시된다.

서열 번호: 16으로 표시된 융합 단백질 구조체 (TAT-MTScs-MCM)는 N 말단에서 C 말단 방향으로 아미노산 서열 MGSS (서열 번호: 9로 표시됨)를 가진 링커, 히스티딘 태그 (아미노산 서열 HHHHHH를 가짐, 서열 번호: 1로 표시됨), 아미노산 서열 SSGLVPRGSHM (서열 번호: 10으로 표시됨)을 가진 추가적인 링커, TAT 도메인 (아미노산 서열 RKKRRQRRR을 가짐, 서열 번호: 3으로 표시됨), 아미노산 서열 GSDP (서열 번호: 12로 표시됨)를 가진 추가의 링커, 시트레이트 신타아제 (서열 번호: 4로 표시됨)의 MTS, GSS의 아미노산 서열을 가진 MCM과 MTS 사이에 위치한 추가적인 링커 및 MCM 단백질 (서열 번호: 8로 표시됨)을 포함한다.

서열 번호: 17로 표시된 융합 단백질 구조체 (TAT-MTScs-MCM 변이체)는 표 1에서 명백한 바와 같이, 링커 GSS를 포함하지 않으며, 그러므로 이 융합 단백질 구조체의 MTS 및 MCM 단편은 직접적으로 연결된다.

또한 표 1에서 나타난 바와 같이, 메틸말로닐 조효소 A 뮤타아제 (MCM)의 MTS를 포함하는 두 개의 융합 단백질 구조체를 제조하였고 그것들의 아미노산 서열은 서열 번호: 18 및 서열 번호: 19로 표시되고 리포아미드 데하이드로게나아제 (lad)의 MTS를 포함하는 두 개의 융합 단백질 구조체를 제조하였고 그것들의 아미노산 서열은 서열 번호: 20 및 서열 번호: 21로 표시된다.

상기 His 함유 융합 단백질 구조체 외에도, His-Tag가 최종 생성물에서 제거될 수 있는 융합 단백질 구조체를 또한 제조하였고 본원에서 "TAT-MTSmbp-MCM" 또는 MBP-TAT-MTSmcm-MCM이라고 부르며, 이것의 아미노산 서열은 서열 번호: 22로 표시된다. 이 융합 단백질 구조체는 (N 말단에서 C 말단 방향으로) His 및 말토오스 결합 단백질 (MBP) 태그, 이어서 TEV 단백질 분열 부위, TAT 도메인, MCM의 고유한 MTS 및 MCM을 포함한다.

MTS가 없는 융합 단백질 구조체를 또한 제조하였고 본원에서 "His-TAT-ΔMTS-MCM"이라고 부르며, 이것의 아미노산 서열은 서열 번호: 23으로 표시된다. 클론을 제한 효소 및 시퀀싱 분석으로 확인한다.

융합 단백질 구조체의 발현을 대장균 숙주에서 수행하였다. 발현 숙주 및 발현 조건을 숙주 (BL21, BL21 코돈 플러스, Rosseta 및 HMS로부터 선택됨), 유도 물질 (IPTG)의 농도 및 유도 기간의 길이 및 조건 (즉, 온도, 화학 물질의 추가, 등, 상기 표 1에서 나타난 바와 같음)을 포함한 여러 파라미터를 변경함으로써 각각의 TAT 융합 단백질 구조체에 대하여 개별적으로 보정하였다.

Codon+ 박테리아 세포를 융합 단백질 구조체 TAT-MTScs-MCM 및 TAT-MTSmcmMCM의 발현을 위해 선택하는 한편, rosseta 박테리아 세포를 융합 단백질 구조체 TAT-MTSTlad-MCM 및 TAT-ΔMTS-MCM에 대하여 선택하였으며, 도 2에서 도시된 바와 같이 이들 세포에서의 발현이 가장 효율적인 것으로 나타났기 때문이다.

발현시, 상기 기술된 바와 같이, 박테리아 세포를 붕괴시키고 세포 소분획물을 제조하여, 가용성 및 불용성 분획을 분리하였다. 도 3에서 도시된 바와 같이, 융합 단백질이 발현되는지 및 어떤 세포 이하의 분획에서 축적되는지를 검사하기 위해 전체 세포 박테리아 (wce), 가용성 분획 (sol), 및 불용성 분획에 대하여 SDS-PAGE 겔 상에서 분석을 수행하였다. 목표는 추후 정제를 위해 발현되는 박테리아의 가용성 소분획물에서 높은 발현 수준의 상이한 TAT-융합 단백질을 얻는 것이었다. 상이한 TAT-융합 단백질 구조체는 또한 도 3E 및 도 3F에서 도시된 바와 같이 항-His 항체를 사용한 웨스턴 블롯에 의해 특징지어 진다.

그 다음에, 다양한 융합 단백질 구조체를 상기 기술된 바와 같이 친화도 크로마토그래피를 사용하여 고도로 정제하였다. 도 4A-도 4D에서 입증된 바와 같이, 각각 상이한 MTS 서열을 포함하는 각각의 융합 단백질 구조체의 가용성 분획을 Ni-킬레이트화 컬럼에 로딩한 후 이어서, 증가하는 농도의 이미다졸로의 다회수 세척 단계를 거쳐 마지막으로 고농도의 이미다졸로 용출하였다.

융합 단백질을 특징짓기 위해서, 용출된 단백질을 SDS-PAGE 및 항-MCM 항체를 사용한 웨스턴 블롯 분석에 의해 분석하였다. 도 5A 및 도 5B에서 도시된 바와 같이, 정제된 융합 단백질 구조체는 예상된 크기 (대략 87 kDa)에서 주요 밴드를 나타냈다. 네 개의 융합단백질 구조 중에서 약간의 크기 변화를 관찰하였으며, 사용된 다양한 MTS 폴리펩타이드의 길이의 차이로부터 발생한다.

실시예 3

TAT-MTS- MCM 융합 단백질 구조체의 내재화 및 처리

온전한 세포 내에서 다양한 TAT-MTS-MCM 융합 단백질 구조체가 미토콘드리아에 도달할 수 있는 능력을 테스트하기 위해서, CoA 뮤타아제 (MCM) 단백질을 암호화하는 유전자에서 종결 코돈의 돌연변이를 가지고 있는 환자 673 섬유아세포를 먼저 다양한 농도의 TAT-MTScs-MCM (서열 번호: 16으로 표시된 아미노산을 가짐)와 함께 24시간 동안 배양하였고 세포 내재화 (전체 세포 용해물로)를 웨스턴 블롯 분석으로 결정하였다. 도 6A에서 도시된 바와 같이, TAT-MTScs-MCM은 성공적으로 세포로 내재화되었다.

추가적인 융합 단백질 구조체가 미토콘드리아로 내재화하는 능력을 또한 하기 상세히 설명된 바와 같이 검사하였다. 환자 673 섬유아세포를 다양한 융합 단백질 구조체의 존재 하에서 인큐베이션한 후, 미토콘드리아를 사이토졸로부터 분리하기 위해 세포 이하의 분획을 제조하였다. 이어서 미토콘드리아 샘플을 항-His 항체 (도 6B) 및 항-MCM 항체 (도 6C 및 도 6D)를 사용한 웨스턴 블롯에 의해 MCM-기반 융합 단백질 구조체의 존재에 대하여 분석하였다.

도 6에서 도시된 바와 같이, 웨스턴 블롯 분석은 미토콘드리아 내에서 융합 단백질 구조체의 내재화를 확인하였다.

더욱이, 항-MCM 항체 (도 6C 및 도 6D)를 사용하여 TAT-MTScs-MCM, TAT-MTSlad-MCM 뿐만 아니라 TAT-MTSmcm-MCM 융합 단백질 구조체가 처리되었음을 입증하였으며, 특이적 항체 (도 6C, 처리된 단백질로 표시됨)와 반응하는, 크기가 더 작은 추가적인 생성물의 출현에 의해 명백한 바와 같다.

하지만, TAT-ΔMTS-MCM 융합 단백질 구조체는 MTS가 없지만, 아마도 생물학적 막의 교차를 허용하는 TAT 서열로 인해 미토콘드리아에 도달하는 것은, 도 6D에서 명백한 바와 같이, 단지 어떠한 처리도 되지 않은 융합 단백질 구조체였다.

실시예 4

미토콘드리아 ATP 생산에 대한 미토콘드리아 표적화된 MCM의 효과

미토콘드리아-표적화된 MCM 융합 단백질 구조체가 미토콘드리아에서 산화적 인산화 (OXPHOS)에 의해 생산된 ATP에 영향을 미칠 수 있는지를 결정하기 위해서, GM01673, GM00050 및 346 섬유아세포를 에너지 공급원으로서 투석된 혈청, 및 MCM의 필수 보조인자인 1.25 μM 비타민 B-12가 보충된 무-글루코오스, OXPHOS 의존 배지에서 48시간 동안 배양하였다.

10 μg/ml (100 μl 부피)의 각각의 미토콘드리아 표적화된 MCM 융합 단백질 구조체 (즉, 각각 서열 번호: 18, 서열 번호: 22, 서열 번호: 25, 서열 번호: 24 및 서열 번호: 20으로 표시된 TAT-MTScs-MCM, TAT-MTSTlad-MCM, TAT-ΔMTS-MCM, TAT-MTSmbp-MCM 및 TAT-MTSmcmMCM)와 함께 인큐베이션한 후 6시간에 미토콘드리아 ATP 수준을 결정하였다.

도 7에서 도시된 바와 같이, 모든 융합 단백질 구조체를 가진 346 세포에서 ATP 수준의 14-21%의 유의한 향상이 관찰되는 한편 (도 7A), TAT-MTScs-MCM 및 TAT-ΔMTS-MCM이 가장 크게 증가시켰다.

GM01673 섬유아세포 (도 7B)에서 다양한 융합 단백질 구조체로의 처리시 ATP 수준의 15-25%의 증가가 관찰되는 한편, 융합 단백질 구조체 TAT-MTScs-MCM이 가장 크게 증가시켰다. 흥미롭게도, 융합 단백질 구조체 TAT-ΔMTS-MCM은 이들 세포에서 대조군에 비해 ATP 수준에 영향을 미치지 않았으며, 그 처리가 MCM 활성에 중요하다는 것을 나타낸다. GM00050 섬유아세포는 대조군에 비해 ATP 수준의 유의한 변화를 보이지 않았다 (도 7C).

실시예 5

미토콘드리아 막 전위에 대한 미토콘드리아 표적화된 MCM 융합 단백질 구조체의 효과

미토콘드리아 표적화된 MCM이 미토콘드리아 막 전위에 영향을 미칠 수 있는지를 결정하기 위해서, GM01673 섬유아세포를 에너지원으로서 투석된 혈청으로 보충된 무-글루코오스, OXPHOS 의존 배지에서 24시간 동안 배양하였고 1.25 μM 비타민 B-12를 추가하였다. 15 μg/ml (100 μl 부피)의 미토콘드리아 표적화된 MCM 융합 단백질 구조체 (각각 서열 번호: 16 및 서열 번호: 18로 표시된 TAT-MTScs-MCM 및 TATmcmMCM)와 함께 인큐베이션한 후 6시간에 미토콘드리아 막 전위를 결정하였다.

상기 기술된 바와 같이, 인큐베이션 시간이 끝나기 전 1시간에 (즉, 5시간 후) MitoTracker Green FM을 최종 농도 200 nM로 배지에 추가하였다. 이어서, 인큐베이션 시간이 끝나기 전 30분에 FCCP (20 μM)를 대조군으로 추가하였고 인큐베이션 시간이 끝나기 전 20분에 TMRE를 200 nM로 추가하였다. TMRE 웰을 0.2% BSA로 보충된 PBS로 1회 세척하였고 추가의 100 μl에 현탁시켰다. MTG 웰을 추가의 100 μl로 세척하고 그것에 현탁시켰다. TMRE/MTG 비율을 상기 기술된 바와 같이 측정하였다.

도 8에서 도시된 바와 같이, 두 융합 단백질 구조체는 미토콘드리아 막 전위를 변화시켰으며, 구조체 TAT-MTScs-MCM (51%)이 미토콘드리아 막 전위를 TATmcmMCM (40%)보다 약간 더 크게 변화시켰다.

실시예 6

산소 소모량에 대한 미토콘드리아 표적화된 MCM 융합 단백질 구조체의 효과

미토콘드리아 표적화된 MCM 융합 단백질 구조체가, 미토콘드리아 활성의 추가적인 마커인, 미토콘드리아에 의한 산소 소모량에 영향을 미칠 수 있는지를 결정하기 위해서, GM01673 섬유아세포를 에너지원으로서 투석된 혈청 및 1.25 μM 비타민 B-12로 보충된 무-글루코오스, OXPHOS 의존 배지에서 48시간 동안 배양하였다.

10 μg/ml (100 μl 부피)의 각각의 미토콘드리아 표적화된 MCM 융합 단백질 구조체와 함께 인큐베이션한 후 6시간에 Seahorse Extracellular Flux (XF) Analyzer를 사용하여 산소 소모량을 결정하였다. 도 9에서 도시된 바와 같이, 다양한 융합 단백질 구조체로의 처리시 산소 소모량에서 50-102% (대조군에 비해)의 유의한 향상을 관찰하였다. TAT-MTScs-MCM이 산소 소모량을 가장 크게 증가시키는 한편, TAT-ΔMTS-MCM은 감소된 활성을 보여주었다.

실시예 7

세포 생존률에 대한 미토콘드리아 표적화된 MCM 융합 단백질의 효과

MMA 환자 세포로의 TAT-MTS-MCM 융합 단백질의 전달이 세포 생존률에 영향을 미칠 수 있는지를 결정하기 위해서, GM01673, GM00050 또는 346 환자 섬유아세포를 OXPHOS 의존 배지에서 24h 동안 배양하였다. 15 μg/ml의 각각의 융합 단백질과 함께 인큐베이션한 후 72h에 세포 생존률을 결정하였다. 도 10에서 도시된 바와 같이, 모든 융합 단백질로 GM01673 (도 10A)에서 13-30%, GM00050 (도 10B)에서 11-36% 및 346 (도 10C) 섬유아세포에서 12-22%의 유의한 세포 생존률 증가를 관찰하였다. 또한 TAT-MTScs-MCM 융합 단백질로의 처리가 세포 생존률을 가장 크게 개선한 반면 (27%), TAT-MTSΔ-MCM 처리는 미처리 대조군 세포와 비교하여 GM01673 세포에서 감소된 활성을 나타냈다.

실시예 8

MMA 수준에 대한 미토콘드리아 표적화된 MCM 융합 단백질의 효과.

MMA 병리학의 주요 증상은 높아진 MMA 수준이며, 이것은 다중시스템 병리학적 효과를 설명할 수 있다 [12, 13]. MMA 환자 세포로의 TAT-MTS-MCM 융합 단백질의 전달이 MMA 수준을 감소시킬 수 있는지를 결정하기 위해서, GM01673 환자 섬유아세포를 OXPHOS 의존 배지에서 24h 동안 배양하였다. 7.5 또는 15 μg/ml의 TAT-MTScs-MCM과 함께 인큐베이션한 후 48h에 ELIZA 키트를 사용하여 전체 세포 용해물 내 메틸말론산 수준을 결정하였다. 도 11에서 도시된 바와 같이 15 μg/ml의 TAT-MTScs-MCM으로 처리 후 MMA 수준의 유의한 25% 감소를 관찰하였다.

흥미롭게도, 아데노-관련 바이러스 혈청형 8 벡터 (AAV8)를 사용하는 유전자 요법에 기초한 다른 보고된 처리들은 [14] 또한 MMA의 수준이 예상된 바와 같이 완전히 감소되지 않았음을 나타낸다 (~40% 감소가 관찰됨) [15]. 이것은 AAV8이 신생 마우스에 전달되더라도 및 심지어는 바이러스의 재투여 후에도 일정하다 [16]. 그러므로, 미토콘드리아는 처리 시점에 이미 비가역적으로 손상될 수도 있다. 따라서, 더 앞선 단계에서, 예를 들어, 임신 중에 처리를 공급하는 것이 고려되어야 한다.

실시예 9

간 분비에 대한 TAT-MTS- MCM 융합 단백질의 효과

TAT-MTS-MCM 융합 단백질의 효과를 모두 MMA 환자로부터 얻어진 섬유아세포의 배양물에서 테스트하였다. 하지만, MMA 병리학에서 영향을 받는 주요 장기가 간이기 때문에 [16], 발명자들은 MMA 간 병리학을 모방하기 위해 MCM 발현이 없는 간 세포주를 생산하는 것을 목표로 하였다. 최근에, Erlich et al은 미토콘드리아 기능이 비만 세포로부터 매개자의 분비에 필수적임을 보여주었다 [17]. 그러므로, 발명자들의 가설은 MCM 돌연변이된 간 세포의 분비가 손상될 수 있다는 것이었다. 이 가설을 확인하기 위해, 발명자들은 CRISPR 기술을 사용하여, 알부민 분비에 대하여 승인된 모델인 HepG2 세포로부터 MUT 유전자를 넉아웃시켰다 [18]. MUT 유전자의 결실을 항-MCM 항체로의 웨스턴 블롯 분석으로 확인하였다 (도 12A). MCM 단백질 수준은 HepG2 MCM (-/-) 세포에서는 검출되지 않았다. 그 다음에, 알부민 수준을 대조군과 비교하여 15 μg/ml의 TAT-MTScs-MCM으로 24h (도 12B) 또는 48h (도 12C) 동안 처리된 HepG2 mut(-/-) 세포 (OXPHOS 배지)의 성장 배지에서 웨스턴 블롯 분석으로 결정하였다 도 12B-C에서 도시된 바와 같이, TAT-MTScs-MCM 처리 후 분비된 알부민 수준이 증가하였다 (24h 동안 21%, 48h 동안 69%). 이에 더하여, 요소가 간 세포로부터 분비된다는 것이 잘 확립되어 있다. 그러므로, 성장 배지 내 요소의 수준을 또한 TAT-MTScs-MCM 융합 단백질로 48h 처리 후 Covas 분석으로 결정하였다 (샘플을 용해된 세포의 단백질 농도에 대하여 표준화하였다). 도 12C에서 도시된 바와 같이 분비된 요소의 수준은 TAT-MTScs-MCM으로 처리한 후 29%만큼 증가하였다. 결론으로서 간 세포에서 MCM 활성을 회복시키는 것은 간의 주요 기능, 예컨대 알부민 및 요소 분비에 영향을 미칠 수도 있다. 또한, 발명자들은 간으로부터 매개자의 분비에서 미토콘드리아 기능 및 MCM 활성의 역할을 시사한다.

실시예 9

TAT-MTS- MCM 융합 단백질은 임신한 마우스 생체 내에서 태반을 통과한다.

많은 상이한 세포 및 조직 유형을 통과할 수 있는 TAT의 능력을 고려해볼 때, 발명자들은 TAT-MTS-MCM이 태반을 통과할 수 있을 것으로 가정하였다. 발명자들은 마우스 모델에서, 추후 인간 처리에 결정적인 요건인, TAT-MTS-MCM 단백질이 태반을 통과하여 배아로 전달하는 능력 및 효능을 테스트하였다.

메틸 말로닐 Co-뮤타아제의 마우스 모델에서 출생시 사망이 관찰되었기 때문에, 발명자들은 임신 마지막 주에 처리시 W.T C57BL 마우스를 3회 주사하였고, 항-메틸 말로닐 Co-A 뮤타아제 및 항-β 액틴 항체를 사용한 웨스턴 블롯에 의해 여러 조직에서 효소의 존재를 검사하였다. 발명자들은

가장 높은 에너지를 요구하고, 일반적으로 미토콘드리아 장애에서 가장 크게 영향을 받는 세 개의 주요 장기 - 간, 심장 (근육), 및 뇌를 이용하여 작업하는 것을 선택하였다. 도 13 A-D에서 알 수 있는 바와 같이, TAT-MTScs-MCM 단백질의 양은 대조군 마우스와 비교하여 처리된 마우스의 신생 새끼들의 심장 (A), 뿐만 아니라 간 (B)에서 훨씬 더 높았지만, 가장 중요하게는, 뇌 (A)에서 훨씬 더 높았으며, 조직으로의 TAT-MTScs-MCM의 전달시, TAT-MTScs-MCM의 양이 대조군보다 처리된 뇌 모체에서 더 높다는 것을 입증한다.

발명자들은 또한 MUT/액틴 비율을 측정하였고 알 수 있는 바와 같이 단백질의 양은 대조군 마우스와 비교하여 처리된 마우스의 조직에서 더 높았다.

참고문헌

현재 개시된 주제에 대한 백그라운드로서 관련된 것으로 간주되는 참고문헌이 하기 나열된다:

본원에서 상기 참고문헌의 인정은 이것들이 어떠한 방식으로도 현재 개시된 주제의 특허 가능성과 관련이 있음을 의미하는 것으로 추정되어서는 안 된다.

SEQUENCE LISTING <110> GREIF, Hagar FELDMAN, Anat <120> METHYLMALONYL COENZYME A MUTASE (MCM) FUSION CONSTRUCTS FOR THE TREATMENT OF DISORDERS ASSOCIATED WITH MCM DEFICIENCY <130> BIOB-008/001WO 322146-2121 <150> US 62/321,359 <151> 2016-04-12 <160> 23 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 1 His His His His His His 1 5 <210> 2 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 2 Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg 1 5 10 <210> 3 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 3 Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg 1 5 <210> 4 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 4 Ala Leu Leu Thr Ala Ala Ala Arg Leu Leu Gly Thr Lys Asn Ala Ser 1 5 10 15 Cys Leu Val Leu Ala Ala Arg His Ala Ser 20 25 <210> 5 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 5 Met Leu Arg Ala Lys Asn Gln Leu Phe Leu Leu Ser Pro His Tyr Leu 1 5 10 15 Arg Gln Val Lys Glu Ser Ser Gly Ser Arg Leu Ile Gln Gln Arg Leu 20 25 30 <210> 6 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 6 Gln Ser Trp Ser Arg Val Tyr Cys Ser Leu Ala Lys Arg Gly His Phe 1 5 10 15 Asn Arg Ile Ser His Gly Leu Gln Gly Leu Ser Ala Val Pro Leu Arg 20 25 30 Thr Tyr Ala 35 <210> 7 <211> 367 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 7 Met Lys Ile Glu Glu Gly Lys Leu Val Ile Trp Ile Asn Gly Asp Lys 1 5 10 15 Gly Tyr Asn Gly Leu Ala Glu Val Gly Lys Lys Phe Glu Lys Asp Thr 20 25 30 Gly Ile Lys Val Thr Val Glu His Pro Asp Lys Leu Glu Glu Lys Phe 35 40 45 Pro Gln Val Ala Ala Thr Gly Asp Gly Pro Asp Ile Ile Phe Trp Ala 50 55 60 His Asp Arg Phe Gly Gly Tyr Ala Gln Ser Gly Leu Leu Ala Glu Ile 65 70 75 80 Thr Pro Asp Lys Ala Phe Gln Asp Lys Leu Tyr Pro Phe Thr Trp Asp 85 90 95 Ala Val Arg Tyr Asn Gly Lys Leu Ile Ala Tyr Pro Ile Ala Val Glu 100 105 110 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Lys Phe 115 120 125 Tyr Lys Asp Asn Ile Lys Ala Gly Gln Gln Gly Leu Ser Val Ala Phe 130 135 140 Asp Leu Ala Thr His Arg Gly Tyr Asp Ser Asp Asn Pro Arg Val Arg 145 150 155 160 Gly Asp Val Gly Met Ala Gly Val Ala Ile Asp Thr Val Glu Asp Thr 165 170 175 Lys Ile Leu Phe Asp Gly Ile Pro Leu Glu Lys Met Ser Val Ser Met 180 185 190 Thr Met Asn Gly Ala Val Ile Pro Val Leu Ala Asn Phe Ile Val Thr 195 200 205 Gly Glu Glu Gln Gly Val Pro Lys Glu Lys Leu Thr Gly Thr Ile Gln 210 215 220 Asn Asp Ile Leu Lys Glu Phe Met Val Arg Asn Thr Tyr Ile Phe Pro 225 230 235 240 Pro Glu Pro Ser Met Lys Ile Ile Ala Asp Ile Phe Glu Tyr Thr Ala 245 250 255 Lys His Met Pro Lys Phe Asn Ser Ile Ser Ile Ser Gly Tyr His Met 260 265 270 Gln Glu Ala Gly Ala Asp Ala Ile Leu Glu Leu Ala Tyr Thr Leu Ala 275 280 285 Asp Gly Leu Glu Tyr Ser Arg Thr Gly Leu Gln Ala Gly Leu Thr Ile 290 295 300 Asp Glu Phe Ala Pro Arg Leu Ser Phe Phe Trp Gly Ile Gly Met Asn 305 310 315 320 Phe Tyr Met Glu Ile Ala Lys Met Arg Ala Gly Arg Arg Leu 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Lys 740 745 750 Gln Gln Ser Val 755

Claims (32)

1. HIV-1 트랜스 전사 활성 인자 (TAT) 도메인, 기능적 인간 메틸말로닐 조효소 A 뮤타아제 (MCM) 및 상기 TAT 도메인과 상기 기능적 인간 MCM 사이에 위치한 인간 미토콘드리아 표적화 서열 (MTS)을 포함하는 융합 단백질.
2. 제1 항에 있어서, 상기 기능적 인간 MCM은 상기 인간 MTS에 대하여 C-말단에 있는 것을 특징으로 하는 융합 단백질.
3. 제1 항 또는 제2 항에 있어서, 상기 인간 MTS는 인간 MCM의 MTS이거나 또는 상기 인간 MCM에 대하여 이종 기원인 것을 특징으로 하는 융합 단백질.
4. 제1 항 또는 제2 항에 있어서, 상기 인간 MTS는 서열 번호: 4로 표시된 아미노산 서열을 가진 인간 미토콘드리아 시트레이트 신타아제 MTS, 또는 서열 번호: 6으로 표시된 아미노산 서열을 가진 인간 리포아미드 데하이드로게나아제 MTS인 것을 특징으로 하는 융합 단백질.
5. 제4 항에 있어서, 상기 인간 MTS는 서열 번호: 4로 표시된 아미노산 서열을 가진 인간 시트레이트 신타아제 MTS인 것을 특징으로 하는 융합 단백질.
6. 제1 항 또는 제2 항에 있어서, 상기 인간 MTS는 서열 번호: 5로 표시된 아미노산 서열을 가진 인간 메틸말로닐 조효소 A 뮤타아제 MTS인 것을 특징으로 하는 융합 단백질.
7. 제1 항 내지 제6 항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 링커를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 융합 단백질.
8. 제1 항 내지 제7 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 MTS는 링커를 통해 상기 기능적 MCM 및/또는 상기 TAT에 결합되는 것을 특징으로 하는 융합 단백질.
9. 제1 항 내지 제8 항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 정제 태그를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 융합 단백질.
10. 제1 항 내지 제9 항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 프로테아제 분열 부위를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 융합 단백질.
11. 서열 번호: 8로 표시된 아미노산 서열을 가진 기능적 인간 MCM 및 서열 번호: 4로 표시된 아미노산 서열을 가진 인간 미토콘드리아 시트레이트 신타아제에 결합된, 서열 번호: 3으로 표시된 아미노산 서열을 가진 HIV-1 트랜스 전사 활성 인자 (TAT) 도메인을 포함하는 융합 단백질로서, 상기 MTS는 상기 TAT 도메인과 상기 기능적 인간 MCM 사이에 위치하고, 상기 MCM은 상기 MTS에 대하여 C-말단에 있는 융합 단백질.
12. 제11 항에 있어서, 서열 번호: 16 또는 서열 번호: 17로 표시된 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 융합 단백질.
13. 서열 번호: 3으로 표시된 아미노산 서열을 가진 기능적 인간 MCM 및 서열 번호: 6으로 표시된 아미노산 서열을 가진 인간 미토콘드리아 리포아미드 데하이드로게나아제 MTS에 결합된, 서열 번호: 3으로 표시된 아미노산 서열을 가진 HIV-1 트랜스 전사 활성 인자 (TAT) 도메인을 포함하는 융합 단백질로서, 상기 MTS는 상기 TAT 도메인과 상기 기능적 인간 MCM 사이에 위치하고, 상기 MCM은 상기 MTS에 대하여 C-말단에 있는 것을 특징으로 하는 융합 단백질.
14. 제13 항에 있어서, 서열 번호: 20 또는 서열 번호: 21로 표시된 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 융합 단백질.
15. 생리학적으로 허용 가능한 담체 및 활성 성분으로서 제1 항 내지 제14 항 중 어느 한 항의 융합 단백질을 포함하는 조성물.
16. 약학적으로 허용 가능한 담체 및 활성 성분으로서 제1 항 내지 제14 항 중 어느 한 항의 융합 단백질을 포함하는 약학적 조성물.
17. 제16 항에 있어서, MCM의 결핍 또는 결함이 있는 MCM과 연관성이 있는 질환 또는 장애를 치료하거나 완화하기 위한 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
18. 제16 항에 있어서, 메틸말론산혈증 (MMA)을 치료하거나 완화하기 위한 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
19. MCM의 결핍 또는 결함이 있는 MCM과 연관성이 있는 질환 또는 장애의 치료 또는 완화 방법에서 사용을 위한 제1 항 내지 제14 항 중 어느 한 항의 융합 단백질 또는 제16 항의 약학적 조성물.
20. 제19항에 있어서, 상기 질환 또는 장애는 MMA인 것을 특징으로 하는 융합 단백질 또는 약학적 조성물.
21. 제20 항에 있어서, 상기 MMA는 고립 MMA (OMIM 251000) 또는 메틸말론산혈증 및 호모시스틴뇨증 (OMIM 277400)인 것을 특징으로 하는 융합 단백질 또는 약학적 조성물.
22. 제16 항에 있어서, 필요로 하는 대상체에서 결함이 있는, 결핍된 또는 비-기능적 인간 MCM의 활성을 적어도 부분적으로 대체하는 방법에서 사용을 위한 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
23. 필요로 하는 대상체에서 MCM의 결핍 또는 결함이 있는 MCM과 연관성이 있는 질환 또는 장애를 치료하거나 완화하는 방법으로서, 상기 방법은 제1 항 내지 제14 항 중 어느 한 항의 융합 단백질 또는 제16 항의 약학적 조성물의 치료적 유효량을 상기 대상체에게 투여하여, MCM의 결핍 또는 결함이 있는 MCM과 연관성이 있는 질환 또는 장애를 치료하거나 완화하는 단계를 포함하는 방법.
24. 필요로 하는 대상체에서 MMA를 치료하거나 완화하는 방법으로서, 상기 방법은 상기 대상체에게 제1 항 내지 제14 항 중 어느 한 항의 융합 단백질 또는 제16 항의 약학적 조성물의 치료적 유효량을 투여하여, 메틸말론산혈증 (MMA)을 치료하거나 완화하는 단계를 포함하는 방법.
25. 제23 항 또는 제24 항에 있어서, 상기 MMA는 고립 MMA (OMIM 251000) 또는 메틸말론산혈증 및 호모시스틴뇨증 (OMIM 277400)인 것을 특징으로 하는 방법.
26. 제23 항 내지 제25 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 상기 대상체에게 추가적인 치료제를 투여하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
27. 제26 항에 있어서, 상기 추가적인 치료제는
    
28. 제23 항 내지 제27 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 융합 단백질 또는 상기 약학적 조성물은 상기 대상체에게 정맥내로 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
29. 필요로 하는 대상체의 미토콘드리아로 기능적 인간 메틸말로닐 조효소 A 뮤타아제 (MCM) 단백질을 도입하는 방법으로서, 상기 방법은 상기 대상체에게 제1 항 내지 제14 항 중 어느 한 항의 융합 단백질 또는 제16 항의 약학적 조성물의 치료적 유효량을 투여하여, 상기 대상체의 미토콘드리아로 기능적 인간 MCM 단백질을 도입하는 단계를 포함하는 방법.
30. 제29 항에 있어서, 상기 기능적 인간 MCM 단백질은 필요로 하는 대상체에서 결함이 있는, 결핍된 또는 비-기능적 인간 MCM의 활성을 적어도 부분적으로 대체하는 것을 특징으로 하는 방법.
31. 제30 항에 있어서, 상기 기능적 인간 MCM 단백질은 필요로 하는 대상체에서 결함이 없는 인간 MCM의 활성의 적어도 5 퍼센트, 적어도 10 퍼센트, 적어도 20 퍼센트, 적어도 30 퍼센트, 적어도 40 퍼센트, 적어도 50 퍼센트, 적어도 60 퍼센트, 적어도 70 퍼센트, 적어도 80 퍼센트, 적어도 90 퍼센트 또는 최대 100 퍼센트를 제공하는 것을 특징으로 하는 방법.
32. 필요로 하는 대상체에서 결함이 있는, 결핍된 또는 비-기능적 인간 MCM의 활성을 적어도 부분적으로 대체하는 방법으로서, 상기 대상체에게 제1 항 내지 제14 항 중 어느 한 항의 융합 단백질 또는 제16 항의 약학적 조성물의 치료적 유효량을 투여하는 단계를 포함하는 방법.
    

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