CN1309417C - 穿细胞肽在产生抗肿瘤免疫力上的用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及通过施用包含与某一疾病抗原相连的穿细胞肽的免疫效应细胞来增强动物对所说疾病之免疫反应的方法和组合物。在一个特定的实施方案中，所说的免疫效应细胞是树状细胞，其包含与肿瘤免疫治疗所用的抗肿瘤抗原相连的穿细胞肽。

Description

穿细胞肽在产生抗肿瘤免疫力上的用途

[0001]本申请要求2001年2月15日申请的，案号为60/268,687的美国专利申请的优先权。

发明领域

[0002]本发明涉及免疫学，细胞生物学及肿瘤领域。更具体地说，本发明与增强对疾病的免疫力有关。在一个特定的实施方案中，本发明涉及提高动物针对肿瘤之免疫反应的方法和组合物。

发明背景

[0003]T细胞在对肿瘤细胞的免疫监视以及肿瘤消除方面起着很重要的作用。人们已从人和动物的黑色素瘤中成功地发现了许多肿瘤抗原，这有助于我们在分子基础上理解T细胞介导的抗肿瘤免疫，并为开发抗原特异性肿瘤疫苗的新策略奠定基础(Wang和Rosenberg，1999；Boon和Vander Bruggen，1996；Gilboa，1999；Houghton等，2001)。其中，绝大部分的肿瘤抗原是非突变的自身抗原，常诱导出较弱的抗自身T细胞反应(Houghton等，2001)。迄今为止，以这些日益增多的靶抗原为基础的人类肿瘤免疫治疗仅取得有限的成功(Dallal和Lotze，2000)。所以肿瘤疫苗方面的主要挑战是如何通过操作抗原及其运载系统去打破自身免疫耐受，从而诱导出强而持久的抗肿瘤免疫能力。

[0004]改进肽疫苗的方法之一是利用树状细胞(DC，DCs)作为免疫佐剂(Schuler和Steinman，1997；Banchereau和Steinman，1998)。负载肽的成熟的树状细胞已被证明在增强抗肿瘤免疫能力方面是有效的，尽管大多数的研究是用外源抗原或者肽(OVA和βgal)作为免疫靶标的(Celluzzi等，1996；Paglia等，1996；Young和Inaba，1996)。最近，在人和动物上的研究表明，利用抗原肽负载的树状细胞在增加T细胞反应和抑制肿瘤生长方面具有一定的疗效(Nestle等，1998；Thurner等，1999；Bellone等，2000；Schreurs等，2000)，但是这种免疫治疗所引起的肿瘤完全消失或疗效方面还缺乏令人信服的证据(Dallal和Lotze，2000)。目前，尚不清楚DC/肽免疫治疗为何不如人们原先预期的那样有效。其中一种可能是树状细胞表面上MHC-I类分子和肽的复合物的半衰期对T细胞反应方面起决定性作用。通过替换有利的关键性氨基酸残基来增加细胞表面MHC-肽或MHC-肽-TCR复合物的稳定性，与改进体内外的T细胞反应密切相关(Parkhurst等，1996；Rosenberg等，1998；Slansky等，2000)。

[0005]尽管成熟的树状细胞在诱导激发T细胞反应方面更具有潜在能力(Labeur等，1999)，但它们通常失去了有效地摄取细胞外抗原的能力(Banchereau和Steinman，1998)，使得肽负载的树状细胞作为疫苗带有局限性。在制备和注射肽负载的树状细胞期间，肽的分解，MHC-I类分子的迅速替换以及肽从MHC-I类分子上解离出来，可能导致细胞表面MHC-I类分子和肽复合物的半衰期减短，从而导致弱而短暂的T细胞反应(Dallal和Lotze，2000；Cella等，1997；Ludewig等，1999)。

[0006]因此，本发明旨在对本领域长期所需问题进行探讨，提供利用免疫效应细胞(如树状细胞)增强动物免疫的有效方法和组合物，其中，通过延长肽对T细胞的有效递呈来增强免疫反应。

发明概要

[0007]为了克服本领域的缺陷，本发明针对采用穿细胞肽(cellpenetrating peptide，CPP，CPPs)将自身抗原肽导入细胞内的方法和组合物。该方法通过CPP将自身抗原肽导入成熟的树状细胞内，因而使DC能有更多的时间来进一步将导入的肽加工处理，并通过新合成的MHC-I类分子递呈给T细胞，从而延长DC加工和递呈肽的时间。已从蛋白质中鉴定和筛选出几种CPPs，其中包括人类免疫缺陷病毒(HIV)的Tat蛋白(Frankel和Pabo，1988)，单纯疱疹病毒的VP22蛋白(Elliott和O′Hare，1997；Phelan等，1998)和成纤维细胞的生长因子(Lin等，1995；Rojas等，1998)。Tat肽和穿膜序列(MTS)已在体内外将蛋白导入细胞内(Fawell等，1994；Kim等，1997；Schwarze等，1999；Lindgren等，2000；Caron等，2001)。迄今为止，用上述CPPs将肿瘤抗原/肽导入DCs来增强抗肿瘤免疫反应，尚未进行研究。因而，这种方法能够延长肽对T细胞的有效递呈，导致产生强的抗肽免疫，从而增强免疫反应。

[0008]已确认几种来自于蛋白的穿细胞肽，如上面所描述的，CPPs能够在体内外把肽或蛋白导入各种类型的细胞。然而，目前尚不知是否用CPP连接T细胞肽所负载的DC能够产生提高的免疫反应，如抗肿瘤免疫。本发明是一种能产生强且持久的免疫反应的新方法。

[0009]在该方法和组合物中所用的抗原是直接抗某一特异疾病的抗原，如肿瘤，其它的具体形式包括自身免疫病和/或感染性疾病。人和鼠的已被鉴定出能表达在正常的黑色素细胞和黑色素瘤组织。因为来源于人的TRP2蛋白被HLA-A2限制的T细胞表位与来源于小鼠TRP2蛋白的K^b所递呈的T细胞表位完全相同，所以利用鼠源TRP2作为一种自身抗原代表了探讨人肿瘤免疫治疗重要问题的一种理想的抗原。然而，用负载TRP2鼠树状细胞却不能预防肿瘤的继发性生长。令人惊奇的是，用CPP将自身抗原肽导入DC内可延长肽有效递呈给T细胞的时间，从而有利于产生强大的抗肿瘤免疫反应。用CPP共价连接TRP2负载的DC进行免疫小鼠能完全预防随后的肿瘤生长，在小鼠三天的肿瘤模型中能显著抑制肿瘤肺转移。用抗体清除试验研究表明，在抑制肿瘤生长的过程中，CD8+T细胞发挥了重要作用，同时CD4+T细胞也有作用。按照本发明的一方面，用CPP连接自身抗原肽并将其导入细胞代表了一种肿瘤免疫研究和治疗的新方法。

[0010]在本发明的一个实施方案中，给出了一种包含免疫效应细胞和穿细胞肽的组合物。其中所说的穿细胞肽与抗原相连。

[0011]在本发明的另一实施方案中，给出了一种包含免疫效应细胞和穿细胞肽的组合物。其中所说的穿细胞肽与抗体相连。在一个特定的实施方案中，所说的抗原是包含多个T细胞肽的分子。在另一个特定实施方案中，所说的多个T细胞肽来自相同的或不同的肿瘤抗原。在另一个特定的实施方案中，所说的抗原包含至少一种MHC-I类分子限定的肽，至少一种MHC-II类分子限定的肽，或至少一种MHC-I类分子限定肽和至少一种MHC-II类分子限定的肽。在另一个特定的实施方案中，所说的免疫效应细胞是成熟的树状细胞、B细胞、巨噬细胞或成指纤维细胞。在另一个特定的实施方案中，所说的免疫效应细胞是成熟的树状细胞或B细胞。在另一个特定的实施方案中，所说的免疫效应细胞是成熟的树状细胞。在一个特定的实施方案中，所说的抗原是肿瘤抗原。在另一个特定的实施方案中，所说的肿瘤抗原是一种肽。在另一个特定的实施方案中，所说的肿瘤抗原是TRP2。在另一个特定的实施方案中，所说的肿瘤抗原是表1，2，3，4或5中所列的抗原。在另一个特定的实施方案中，所说的穿细胞肽是CPP1，ANTP，信号肽I，信号肽II，PRES，Transportan，两亲型肽，HSV VP22，肽转运体或CL22。在另一个特定的实施方案中，所说的穿细胞肽是CPP1。在另一个特定的实施方案中，所说的穿细胞肽和抗原是通过共价键相连接的。在另一个特定的实施方案中，所说的抗原是存在于免疫细胞囊泡内的。在另一个特定的实施方案中，所说的囊泡是内含体。

[0012]在本发明的另一个特定的实施方案中，提供了一种包含免疫效应细胞和穿细胞肽，以及制药学上可接受的载体的疫苗，其中所说的穿细胞肽与抗原相连。在特定的实施方案中，所说的免疫效应细胞是成熟的树状细胞、B细胞、巨噬细胞和成纤维细胞。在另一个特定的实施方案中，所说的免疫效应细胞是成熟的树状细胞或B细胞。在另一个特定的实施方案中，所说的免疫效应细胞是成熟的树状细胞。

[0013]在本发明的另一特定的实施方案中，提供了一种提高动物抗疾病免疫力的方法，该方法包括给动物施用成熟的树状细胞的步骤。其中所说的细胞包括与疾病抗原相连接的穿细胞肽。其中在所说的施用后，所说的动物免疫于所说的疾病。在特定的实施方案中，所说的动物有CD4+和CD8+T细胞两者。在另一特定的实施方案中，树状细胞是通过注射施用到动物体内的。在另一特定的实施方案中，所说的注射是静脉注射，腹腔内注射或皮下注射。在另一特定的实施方案中，所说的动物是哺乳动物。在另一特定的实施方案中，所说的哺乳动物是人。

[0014]在本发明另一特定的实施方案中，提供了一种免疫动物的方法，该方法包括给所说的动物施用至少一次疫苗，该疫苗包含免疫效应细胞和穿细胞肽，其中所说的穿细胞肽是与抗原相连接的。

[0015]在本发明另一特定的实施方案中，提供了一种治疗动物疾病的方法，该方法包括给所说动物施用含有与疾病抗原相连接的穿细胞肽的免疫效应细胞以及制药学上可以接受的载体的步骤。在特定的实施方案中，所说的免疫效应细胞是成熟的树状细胞、B细胞、巨噬细胞和成纤维细胞。在特定的实施方案中，所说的免疫效应细胞是成熟的树状细胞或B细胞。在另一特定的实施方案中，所说的免疫效应细胞是成熟的树状细胞。在另一特定的实施方案中，所说的穿细胞肽是CPP1，HIV Tat，VP22，MTS或成纤维细胞生长因子。在另一特定的实施方案中，所说的穿细胞肽是CP1。在另一特定的实施方案中，其中所说的疾病是肿瘤，其中所说的抗原是肿瘤抗原。在另一特定的实施方案中，所说的肿瘤抗原是TRP2。在另一特定的实施方案中，所说的肿瘤抗原是表1，2，3，4或5中所列出的一种抗原。在另一特定的实施方案中，所说的动物还接受肿瘤治疗，其中所说的治疗是手术治疗，放射治疗，化学治疗或基因治疗。在另一特定的实施方案中，给动物施用树状细胞先于肿瘤治疗。在另一特定的实施方案中，给动物施用树状细胞后于肿瘤治疗。在另一特定的实施方案中，给动物施用树状细胞与肿瘤治疗同时进行。

[0016]在本发明另一特定的实施方案中，提供了一种制备针对某种疾病之组合物的方法，该方法包括提供免疫效应细胞，提供与所说疾病抗原相连接的穿细胞肽，以及将与抗原相连接的穿细胞肽导入免疫效应细胞，此时，所说的抗原进入细胞。在一个特定的实施方案中，免疫效应细胞是成熟的树状细胞、B细胞、巨噬细胞和成纤维细胞。在特定的实施方案中，所说的免疫效应细胞是成熟的树状细胞或B细胞。在另一特定的实施方案中，所说的免疫效应细胞是成熟的树状细胞。在另一特定的实施方案中，所说的抗原是肿瘤抗原，自身抗原或病毒抗原。

[0017]本发明的其它目的，特征及优点将在以下的详细描述中体现出来。然而，应该理解下面对本发明的特定部分所选的详细描述和特定的实施例仅仅用于举例说明，因为在本发明的精神和范围内，对于本领域技术人员而言，通过下列详细描述，各种变化和改进是显而易见的。

附图简述

[0018]下列附图是本说明书的一部分，用于进一步说明本发明的某些方面。通过参考这些附图，结合本文提供的特定实施方案的详细描述，本发明可以得到更好的理解。

[0019]图1A至1D说明将CPP1-肽导入树状细胞可以延长树状细胞对T细胞的刺激能力。图1A为穿细胞肽(CPP1)，TRP-2及对照肽的序列。图1B是各种肽-FITC和DC共温育后的荧光和相差显微图像(40X)。DC与PBS共温育作对照。图1C是DC与CPP1-TRP2-FITC共温育后的荧光和相差显微图像(60X)，图中显示了代表性例子DC/CPP1-TRP2-FITC。穿膜荧光肽可同时在细胞浆和细胞核内观察到。图1D是在肽负载后的不同时间点，T细胞对负载各种肽的DC的反应(实心圆代表CPP1-TRP2，空心圆代表TRP2，空心三角代表CPP1-βgal。从T细胞释放的GM-CSF由ELISA检测。

[0020]图2A和2B显示用负载CPP1-TRP2的成熟DCs免疫的小鼠所产生的预防性免疫反应。图2A是经负载各标示肽的DC单次静脉注射，两周后静脉注射B16肿瘤细胞后，C57BL/6小鼠中肺转移的数量。该试验重复三次，得到类似的结果。图2B是接受各种治疗的小鼠的肺大体病理图片。

[0021]图3A和3B是对肺部转移及动物存活的比较分析。图3A显示用负载有所说各种肽的成熟或不成熟DC及脾细胞注射，2周后静脉注射B16肿瘤细胞的C57BL/6小鼠中肿瘤肺部转移的数量，给出了肺部转移的平均值SEM。图3B用负载各种肽的成熟DC免疫小鼠两次，中间间隔两周。然后用B16肿瘤细胞激发免疫后的小鼠，并在肿瘤激发后的60天观测动物的存活情况。

[0022]图4说明接种后CD8+T细胞反应的诱导作用。由负载有TRP2，CPP1-TRP2，CPP1-βgal肽的DC免疫后小鼠之脾细胞产生的T细胞的靶细胞识别作用。各组的两种小鼠的脾细胞体外用TRP2重复刺激，并且进行T细胞抗293k^b，负载有293k^b的TRP2，B16肿瘤细胞或MHC-I类匹配的MC38肿瘤细胞试验。T细胞活性由ELISA检测IFN-γ释放来测定。

[0023]图5A和5B说明在抗肿瘤免疫中，CD4+和CD8+T细胞是必不可少的。图5A为用DC/CPP1-TRP2免疫的C57BL/6小鼠。两周后，小鼠在肿瘤激发的前一天用抗-CD4，抗-CD8和对照抗体处理，接着在肿瘤注射后的第一，三和十天接受相应的抗体处理。图中显示了对各组的肺转移计数。用DC/PBS和DC/CPP-βgal免疫的小鼠作为肿瘤注射和特异性的对照组。图5B用DC/CPP1-TRP2免疫B6，CD4KO和CD8KO小鼠，然后用B16肿瘤细胞激发。DC/PBS免疫的B6小鼠作为对照。肿瘤激发后的第14天，计数各组中肿瘤肺转移的数量，并用肺转移均值作图。重复的三次实验得到相同的结果。

[0024]图6A和6B显示用负载有CPP1-TRP2肽的DC治疗B16肿瘤。图6A为给小鼠静脉注射B16肿瘤细胞，并在三天后用负载有所示肽的DC免疫小鼠。疫苗应用的14天后，在双盲的情况下进行各组小鼠肿瘤肺转移计数。取两次不同实验结果的均值。星号表明用wilcoxon等级检验，两组间有显著性差异(P＜0.01)。用DC/CPP1处理过的脾细胞不能减少小鼠肿瘤肺转移的数量。图6B)为另一实验中接受各种不同治疗的小鼠肺的照片。

发明详述

[0025]为保持长久以来的专利法的传统，本专利申请中所用的“一种”可以是一种或一种以上。

[0026]除特别指出外，本发明所采用的技术是分子生物学，微生物学，重组DNA和免疫学的常规技术。在以下文献中详细的解释了上述的常规技术。分子克隆：实验室手册，第二版(1989)，寡核苷酸合成(M.J.Gait Ed.，1984)，动物细胞培养(R.I.Freshney，Ed.，1987)，美学中的方法系列专著(Academic Press，Inc.)；哺乳动物细胞基因转移载体(J.M.Miller和M.P.Calos eds.1987)，实验免疫学手册(D.M.Weir和C.C.Blackwell，Eds)，分子生物学当代方案(F.M.Ausubel，R.brent，R.E.Kingston，D.D.Moore，J.G.Siedman，J.A.Smith，和K.Struhl，eds.，1987)，免疫学当代方案(J.E.Coligan，A.M.Kruisbeek，D.H.Margulies，E.M.Shevach和W.Strober，eds.，1991)；免疫学年评和一些专辑，如免疫学进展。在这里所提及的专利，专利申请和论文均列入本文的参考文献中。

1.定义

[0027]抗原是任何与疾病如肿瘤，自身免疫性疾病和感染性疾病有关的，能引起免疫反应的肽。其中的一些例子包括肿瘤抗原，自身抗原和病毒抗原。

[0028]肿瘤排斥抗原或肿瘤相关抗原是能在动物中引起抗肿瘤免疫反应的一类抗原。在一特定的实施方案中，抗原是在肿瘤细胞表面的，是肿瘤细胞特有的而不存在于相应的正常细胞表面。在一个特定的实施方案中，抗肿瘤抗原是一种在正常和肿瘤细胞中表达的肿瘤相关抗原，但这些抗原在正常细胞上被隐藏起来，而在恶性肿瘤细胞显现出来或作为癌基因的产物超量表达。

[0029]穿细胞肽是那些在体内和/或体外能将另外的肽和蛋白导入细胞内的肽。在一个特定的实施方案中，这里的所指细胞是免疫效应细胞。在另一特定的实施方案中，这些细胞为树状细胞。在一个特定的实施方案中，穿细胞肽是CPP1，HIV tat，VP22，MTS或成纤维细胞生长因子。

[0030]树状细胞是在淋巴组织和非淋巴组织中的形态相似的多样性群体的一种。这类细胞有独特的形态学特征，细胞表面有高表达的MHC II类分子(Steinman等，1991)。众所周知，这些细胞可以从多种组织中分离得到。而且本领域技术人员可以用以下两种方法之一来常规制备抗原负载的树状细胞：(1)小片段肽也称抗原性肽，可以直接负载到抗原递呈细胞表面(Mehta-Damani等，1994)。(2)将完整的蛋白和蛋白颗粒与抗原递呈细胞共同温育，这些蛋白质最终会被抗原递呈细胞消化并递呈到其表面。

[0031]树状细胞的表面很特殊，它有一些树突状的突起。CD1⁺，CD4⁺，CD86⁺，或HLA-DR⁺是树状细胞表面的特征性标记。树状细胞有很强的激活MHC-限制性T细胞的能力，并能有效的在原位递呈抗原给T细胞。在T细胞发育和耐受中树状细胞递呈的是自身抗原，而在免疫反应中树状细胞递呈的是异体抗原。

[0032]由于树状细胞能有效递呈抗原，人们对体外应用树状细胞作为肿瘤和感染性疾病疫苗的佐剂产生了越来越浓厚的兴趣(见Romani等，1994)。由于外周血中树状细胞的比例很低，淋巴组织的来源有限以及树状细胞的终末分化，这些一直限制了树状细胞作为免疫刺激剂的应用。树状细胞来源于CD34⁺骨髓和外周血祖细胞和外周血单个核细胞。细胞因子GM-CSF(Sargramonustim，Leukine.RTM.，Immunex Corporation，Seattle，Wash)，TNF-α，c-kit配体(也称干细胞因子(SCF)，铁因子(SF)，浆细胞生长因子(MGF))和白介素-4可以增加树状细胞的增殖和成熟。人们已发现Flt3-L有在体外和体内刺激产生大量有功能的成熟的树状细胞的能力(美国专利申请号08/539,142，1995年10月4日申请)。

[0033]免疫效应细胞指任何有能力在动物体内诱导T细胞反应，并能摄取和更好地递呈抗原的细胞。这里的抗原是通过穿细胞肽来导入细胞内的。

[0034]成熟的树状细胞指高表达MHC II类分子，CD80，和CD86的树状细胞。未成熟的树状细胞指低表达MHC II类分子，CD80，和CD86但能有效摄取抗原的树状细胞。

[0035]肽是由共价键连接的氨基酸所组成的小分子。

[0036]自身抗原是肿瘤和组织特异性正常细胞所表达的肿瘤抗原中而来的非突变肽。在一个特定的实施方案中，其中所说的肽一般是由9到15个氨基酸所组成的。

II.本发明

[0037]用负载来源于各种肿瘤抗原肽的树状细胞作为疫苗在肿瘤治疗方面有很大的潜力，但是目前为止，仅取得有限的成果。本发明是通过使用穿细胞肽来延长DC表面MHC-I类分子限制性的自身肽的递呈时间，从而达到增强T细胞反应的一种新的策略。在一个特定的实施方案中，负载CPP1共价连接的TRP2肽的DC能完全保持激发T细胞的能力。相比之下，负载TRP2肽的DC刺激T细胞的能力在24小时内急剧下降。用负载CPP-TRP2的DC所免疫的小鼠完全能抑制肿瘤细胞生长，并且在3天的肿瘤模型中能显著抑制肿瘤的肺转移。但是，仅仅负载TRP2肽的DC所免疫的小鼠则不能抑制肿瘤细胞生长和肿瘤肺转移。此外，我们还发现CD4+和CD8+T细胞对有效的抗肿瘤免疫都是必需的。这些结果表明这种新的方法可以广泛应用于增强DC-肽疫苗来治疗各种肿瘤的有效性，并且可以延伸至其它疾病的治疗。因而，这个方法能够延长对肽有效的递呈给T细胞，导致产生强大的抗肽免疫，从而增强免疫反应。一些来自蛋白的穿细胞肽已被确认，如上面所描述，CPPS能够在体内外把肽或蛋白导入各种类型的细胞。然而，目前尚不知是否用CPP连接T细胞肽所负载的DC能够产生提高的免疫反应，如抗肿瘤免疫。本发明是一种能产生强且持久的免疫反应的新方法。

[0038]在本发明的一个特定的实施方案中，我们在动物肿瘤模型中应用了TRP2(SVYDFFVWL；SEQ ID NO：2)和12-mer CPP1(AAVLLPVLLAAP；SEQ ID NO：1)。人HLA-A2限制的TRP2T细胞表位和鼠的一种TRP2表位相同。CPP1可以有效地将TRP2肽导入成熟的树状细胞，并在较长时间内维持树状细胞递呈MHC限制的肽给抗原特异性T细胞的能力。用TRP2共价连接的CPP1肽所负载的树状细胞免疫小鼠，从而导致对B16肿瘤的完全免疫，并抑制继生肿瘤的生长。CD4⁺和CD8+T细胞都是抗肿瘤免疫需要的。

III.穿细胞肽

[0039]本发明在方法上及组合物中应用了穿细胞肽。细胞穿细胞肽有利于所需抗原导入免疫效应细胞。这项蛋白转导技术在技术上是已知的，在以下文献中已有描述，如Rojas等(1998)和Schwarze等(1999)，这些文献本文一并参考的目录中。

[0040]从HIV18 19的TAT和成纤维细胞生长因子等蛋白中，已鉴定出数个CPP(Ludewig等，1999；Frankel和Pabo，1988)。CPP在体内外都能够导入肽或蛋白到多种细胞。

[0041]一些CPP举例如下：

1.AAVLLPVLLAAP(CPP1)(SEQ ID NO：1)

2.RQIKIWFQNRRMKWKK(ANTP)(SEQ ID NO：3)

3.YGRKKRRQRRR(HI V Tat 47-57)(SEQ ID NO：4)

4.YARAAARQARA(TAT-PTD-4)(SEQ ID NO：5)

5.YARAARRAARR(TAT-PTD-5)(SEQ ID NO：6)

6.AAVALLPAVLLALLAP(信号肽I)(SEQ ID NO：7)

7.GALFLGWLGAAGSTMGAWSQPKKKRKV(信号肽II)(SEQ ID NO：8)

8.PLSSIFSRIGDP(PRES)(SEQ ID NO：9)

9.GWTLNSAGYLLKINLKALAALAKKIL(Transportan)(SEQ ID NO：10)

10.KLALKLALKALKAALKLA(Amphiphilic model peptide)(SEQ ID NO：11)

11.DAATATRGRSAASRPTERPRAPARSASRPRRPVE (HSVVP22)(SEQ ID NO：12)

12.KETWWETWWTEWSQPKKKRKV(肽载体)(SEQ ID NO：13)

13.KKKKKKGGFLGFWRGENGRKTRSAYERMCNILKGK(CL22)(SEQ ID NO：14)

IV.肿瘤抗原

[0042]在本发明中，“肿瘤抗原”一词是在特定类型肿瘤中共有的抗原。本发明中的肿瘤抗原是肿瘤的一部分或从其衍生出来的，这些肿瘤包括但不局限于原发和转移的黑色素瘤，胸腺瘤，淋巴瘤，肉瘤，肺癌，肝癌，非何杰金氏淋巴瘤，何杰金氏淋巴瘤，白血病，子宫癌，子宫颈癌，膀胱癌，肾癌和腺癌如乳腺癌，前列腺癌，卵巢癌，胰腺癌等。在某些情况下，本发明中的肿瘤抗原包含一种或多种肿瘤抗原表位，并可被来源于哺乳类肿瘤的肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)所免疫识别。

[0043]恶性肿瘤所表达的许多蛋白都可用作免疫攻击的靶抗原。这些抗原分子包括但并不限于组织特异性抗原如黑色素瘤的MART-1，苏氨酸氧化酶和GP100，以及前列腺癌的前列腺酸性磷酸酶(PAP)和前列腺特异性抗原(PSA)。其它的靶抗原分子属于转化相关分子的成员，如癌基因HER-2/Neu/ErbB-2。另一组靶抗原属于肿瘤胚胎抗原，如癌胚抗原(CEA)。B细胞淋巴瘤的肿瘤特异性独特性免疫球蛋白是一种因肿瘤个体而异，真正具有肿瘤特异性的抗原。在B细胞型淋巴瘤中，B细胞分化抗原如CD19，CD20和CD37是其它的候选靶抗原。其中的一些抗原(CEA，HER-2，CD19，CD20，独特性免疫球蛋白)已被用作单克隆抗体被动免疫治疗的靶抗原，并取得了一定效果。

[0044]因此，组织特异性肿瘤抗原包括但不限于前列腺酸性磷酸酶(PAP，与前列腺癌相关)，Melan-A/MART-1(与黑色素瘤相关：Coulie等，1994，J.Exp.Med.180：35，Hawakami等，1994，PNAS 91：3515，Baker等，1994，J.Exp.Med.179：1005)，苏氨酸氧化酶/albino(与黑色素瘤相关；Kawakami等，1994，J.Exp.Med.)以及CD19，CD20和CD37(与淋巴瘤相关)。

[0045]与此相似，癌基因表达产生的，特定肿瘤类型所共有的一些抗原肽已被确认。在本发明中，这些肽将以肽复合物的形式来有效地刺激T细胞与表达这些抗原的肿瘤反应。癌基因产生的肽抗原包括但不限于与人类乳腺和妇科肿瘤相关的HER-2/neu(Beckmann等，1992，Eur.J.Cancer 28：322)和与胰腺癌相关的癌胚抗原(CEA)。

[0046]肿瘤抗原和具有抗原性的肿瘤表位可以从如原始临床标本，细胞系等自然渠道分离和纯化而来。肿瘤抗原和具有抗原性的肿瘤表位也可以通过现已知的化学合成和重组DNA技术获得。这些化学合成的技术在以下的文献中已描述Steward等，(1969)；Bodansky等，(1976)；Meienhofer(1983)；和Schroder等，(1965)

[0047]此外在Renkivist等的文章(2001)中，描述了大量已知的抗原。以下的表格列出了一些来自肿瘤抗原的T细胞表位，并仅被T细胞(包括辅助性CD4+和杀伤性CD8+细胞)识别。尽管以下没有列出类似物或人工修饰的表位，但本领域技术人员可以通过现有的标准方法知道如何得到和合成。其它一些通过抗体和Serex技术筛选的抗原(见Sahin(1997)，Chen(2000))可以在Ludwing学院的肿瘤研究的数据库中查到。本领域技术人员很容易的在网络找到该数据库。

[0048]以下表格来自Renkvist等的文章(2001)

                              表1.HLA-I类分子限制的肿瘤/睾丸抗原

                   所有这些抗原都表达在正常的睾丸的精细胞中。偶尔MAGA-3，

                   MAGE-4，GAGE基因也表达在胎盘中(De Backer等，1999；Cox等，

               1994)。Ny-ESO-1抗原表达在正常的卵巢细胞中(Chen等，1997)。

基因	HLA等位基因	肽表位	作者	肿瘤中的组织分布a
					MAGE-A1MAGE-A1MAGE-A1MAGE-A1MAGE-A1-A2-A3-A6MAGE-A1MAGE-A1MAGE-A1MAGE-A1	A1A3A24A28B37B53Cw2Cw3Cw16	EADPTGHSYSLFRAVITKNYKHCFPEIEVYDGREHSAREPVTKAEMLDPARYEFLWSAFPTTI NFSAYGEPRKLSAYGEPRKL	Traversari等1992Chaux等1999a Fujie等1999Chaux等1999aTanzarella等1999Chaux等1999aChaux等1999aChaux等1999avan derBruggen等1994b	黑色素瘤，乳腺癌，小细胞肺癌(De Plaen等，1999)De Smet等1994，Vander Bruggen等1994a；肉瘤，非小细胞肺癌(DePlaen等，1999)De Smet等，1994；甲状腺髓癌Vander Bruggen等1994a；结肠癌(De Plaen等1999)；喉癌(De Smet等1994)黑色素瘤，结肠癌和乳腺癌，小细胞肺癌(De Plaen等1999，De Smet等1994van  der  Bruggen  等1994a)，肉瘤，非小细胞肺癌(De Plaen，1999，De Smet 1994)，鼻咽癌，小细胞支气管癌(van derBruggen等1994a)，喉癌(De Smet等，1994)，白血病(De Plaen等1994)黑色素瘤，乳腺癌，小细胞肺癌(De Plaen等1999，De Smet等1994，Vanden Eynde等，1999a)，肉瘤，非小细胞肺癌(DePlaen等1999，De Smet等1994)甲状腺髓癌(vander Bruggen等1994a)，喉癌(Lurquin等1997)，白血病(De Plaen等1999a)

MAGE-A2MAGE-A2MAGE-A2MAGE-A3MAGE-A3MAGE-A3MAGE-A3MAGE-A3MAGE-A3MAGE-A4MAGE-A6MAGE-A10MAGE-A12BAGEDAM-6-10

A2A224A1A2A24A24B44B52A2A34A2Cw7Cw16A2

KMVELVHFLYLQVFGIEVEYLQLVFGIEADIPIGHLYFLWGPRALVTFPDLESEFIMPKAGLLIMEVDPIGHLYWQYFFPVIFGVYDGREHTVMVKISGGPRGLYDGMEHLVRIGHLYILAARAVFLALFLWGPRAYA

Visseren等1997Visseren等1997Tahara等1999Gaugler等1994van derBruggen等1994aOsio等1999Tanaka等1997Hermann等1996Fleischhauer等1996Russo等2000Duffour等1999Zorn和Hercent1999bHuang等1999Panelli等2000Heidecker等2000Boer等1995Fleischhauer等1998

黑色素瘤，结肠和乳腺癌，小细胞肺癌(De Plaen等1999De Smet等1994，Van der Bruggen等1994a)，肉瘤，非小细胞肺癌(De Plaen等，1999De Smet等，1994)，甲状腺髓癌(Van der Bruggen等1994a)，喉癌(Lurquin等1997)白血病(De Plaen等1999)黑色素瘤，结肠癌和乳腺癌，小细胞肺癌(De Plaen等1999，van der Bruggen等1994a)，鼻咽癌(Chen等1997)，支气管小细胞癌，甲状腺髓癌，膀胱癌，肉瘤小细胞肺癌，非小细胞肺癌(van der Bruggen等1994a)，白血病(De Smet等1994)黑色素瘤，非小细胞肺癌，肉瘤，食管癌，结肠和乳腺癌(De Plaen等1999)黑色素瘤，非小细胞肺癌，结肠癌，白血病(De Plaen等，1999)未确定黑色素瘤，骨髓瘤，脑瘤，肉瘤，白血病，小细胞肺癌，非小细胞肺癌，鼻咽癌，膀胱癌，肺癌，食道癌，乳腺癌，前列腺癌，结肠癌(DePlaen等1994)黑色素瘤，膀胱和乳腺癌，小细胞鼻咽癌，非小细胞肺癌，肉瘤黑色素瘤，皮肤癌，乳腺癌，卵巢癌(Lurquin等1997)，肺癌(Dabovic等1995，Lurquin等1997)精原细胞癌(Dabovic等1995)

GAGE-1-2-8GAGE-1-4-56-7BNA88-ANY-ESO-1NY-ESO-1a(CAG-3)

Cw6A29B13A2A2A2A31

YRPRPRRPYYYWPRPRRYMTQGQHFLQKVSLLMWITQCFLSLLMWITQCQLSLLMWITASGPGGGAPR

Van den Eynde等1995，De Backer等1999De Backer等1999Moreau-Auberey等2000Jager等1998Jager等1998Jager等1998Wang等1999

黑色素瘤，肉瘤，非小细胞肺癌，小细胞肺癌，间皮瘤，肉瘤，精原细胞瘤，白血病，淋巴瘤，鼻咽癌，膀胱癌，食道癌，乳腺癌，结肠癌，前列腺癌黑色素瘤，鼻咽癌，白血病，食管癌，肺癌，膀胱癌黑色素瘤黑色素瘤，肉瘤，B淋巴瘤，肝癌，鼻咽癌，胆囊癌，肺癌，前列腺癌，卵巢癌，甲状腺和乳腺癌(Chen等1997)

^a当与最早报道的所述表位序列的文献不符时，其在肿瘤中的组织分布见给出的

参考文献

[0049]以下表格来自Renkivist等的文章(2001)。

              表2.HLA-I类分子限制的黑色素细胞分化抗原

    这些抗原只在正常和同系肿瘤细胞(即黑色素细胞，皮肤，视网膜，

           外周神经节)中或在正常前列腺细胞中表达。

基因	HLA等位基因	肽表位	作者
				MART-1/Melan-AaMCIRGp100PSAPSMTRP-1(or gp75)	A2A2A2B45B45A2A2A2A2A2A2A2A2A2A2A2A2A3A3A3A3A24Cw8A1A2A2A1A1A1A2A2A24B44A31A2A2A31A33Cw8	ACCGIGILTVEAAGIGILTVILTVILGVLAEEAAGIGILAEEAAGIGILTTILLGIFFLFLALIICNAKTWGQYWQVAMLGTHTMEVM LGTHTMEVSLADTNSLAVITDQVPFSVLLDGTATLRLYLEPGPVTAVLYRYGSFSVRLMKQDFSVFLPRIFCSCLIYRRRLMKALN FPGSQKS LIYRRRLMKALLAVGATKVYFFLPDHLSNDGPTLVSHSFPHPLYFLTPKKLQCVVISNDVCAQVHSTNGVTRIYKCDICTDEYSSYVIPIGTYYMDGTMSQVMLLAVLYCLAFLPWHRLFSETWRDIDFMSLQRQFLRSVYDFFVWLTLDSQVMSLLLGPGRPYRANDPIFVVL	Coulier等1994Kawakami等1994aSchneider等1998Castelli等1995Schneider等1998Schneider等1998Salazar-Onfray等1997Salazar-Onfray等1997Bakker等1995Tsai等1997Tsai等1997Tsai等1997Kawakami等1995Kawakami等1994bCox等1994Kawakami等1995Kawakami等1998Kawakami等1998Kawakami等1998Kawashima等1998Kawashima等1998Skipper等1996Robbins等1997Gastelli等1999Corman等1998Correale等1997Correale等1997Corman等1998Kittlesen等1998Kawakami等1998Wlfel等1994Wlfel等1994Wlfel等1994Kang等1995Brichard等1996Wang等1996bParkhurst等1998Noppen等2000Wang等1996aWang等1998aCastelli等1999

^a两个研究小组同时独立地发现了这个基因，并分别给它取了两个不同的名字：

MART-1和Melan-A

[0050]以下表格来自Renkivist等的文章(2001)。

                    表3.HLA-I类分子限制的普遍表达的抗原

基因	HLA等位基因	肽表位	组织分布		参考文献
						肿瘤	正常组织
			ART-4CAMELCEACEACyp-BHER2/neuHER2/neuHER2/neuHER2/neu	A24A2A2A3A24A2A2A2A2				AFLRHAALDYPSLSATDMLMAQEALAFYLSGANLNL(CAP-1)aHLFGYSWYKKFHRVIKDFDFMIQGGDFKIFGSLAFLIISAWGILRLLQETELVWLGWFGIILHNGAYSLYMIMVKCWMI	小细胞癌，小细胞肺癌，鼻咽癌，白血病，肺癌，食道癌，胃癌子宫颈癌，子宫内膜癌，卵巢癌，乳腺癌黑色素瘤黑色素瘤结肠癌，直肠癌，胰癌，胃癌，乳腺癌和肺癌肺腺癌，T细胞白血病，淋巴肉瘤，胆囊癌，膀胱癌，小细胞食道癌黑色素瘤，卵巢癌，乳腺癌黑色素瘤，卵巢癌，胰腺癌黑色素瘤，卵巢癌，胃癌，胰腺癌和乳腺癌黑色素瘤，卵巢癌，胃癌，胰腺癌和乳腺癌	睾丸，胎盘，胎儿肝脏睾丸，胎盘，心脏，骨骼肌，胰睾丸，胎盘，心脏，骨骼肌，胰胃肠道和胚胎组织在正常组织中广泛表达上皮细胞上皮细胞上皮细胞上皮细胞	Kawano等2000Aarnoudse等1999Tsang等1995Kawashima等1999Gomi等1999Risk等1995Peoples等1995Kono等1998Rongeun等1999

HER2/neuHTERRHARTICEMUCIMUCIMUC2PRAMEP15

A3A2A2B7A11A2A2A24A24

VLRENTSPKILAKFLHWLILAKFLHWLRLVDDFLLVSPRWWPTCLSTAPPAHGVSTAPPVHNVLLNQLQVNLMLWGWREHVLYVDSLFFLAYGLDFYIL

黑色素瘤，卵巢癌，胃癌，胰腺癌和乳腺癌肺癌，卵巢癌，多样性骨髓瘤，肉瘤，急性白血病，非何杰金氏淋巴瘤肺癌，前列腺癌，卵巢癌，多样性骨髓瘤，黑色素瘤，肉瘤，急性白血病，非何杰金氏淋巴瘤肾细胞癌乳腺癌，卵巢癌，多样性骨髓瘤，B细胞瘤乳腺癌，卵巢癌，多样性骨髓瘤，B细胞瘤卵巢癌，胰腺癌，乳腺癌，粘癌，结肠癌黑色素瘤，鼻咽癌，小细胞肺癌，非小细胞肺癌，肾细胞癌，肾上腺癌，肉瘤，白血病黑色素瘤

上皮细胞造血干细胞，造血祖细胞，精原细胞，基底角质细胞，胶原细胞和某些分化中的上皮细胞外周B细胞，精原细胞，胸腺细胞，CD34阳性祖细胞，造血干细胞肾，结肠，小肠，肝，心，松果体，肾上腺无无结肠，小肠，气管，宫颈，胆囊睾丸，子宫内膜，卵巢，肾上腺，肾，脑，皮睾丸，脾脏，胸腺，肝，肾，肾上腺组织，肺组织，视网膜睾丸，肾，心，皮，脑，卵巢，肝，肺，淋巴细胞，胸腺，成纤维细胞

Kawashima等1999Vonderheide等1999Miner等2000Ronsin等1999Domenech等1995Brossart等1999Bohm等1998Ikeda等1997Robbins等1995

RU1RU2SART-1SART-1SART-3WTI

B51RU2A24A*26A24A2

VPYGSFKHVLPRWPPPQLEYRGFTQDFKGSGKMKTEVYDYNCHVDLAYIDFEMKIRMFPNAPYL

黑色素瘤，肾癌，膀胱癌黑色素瘤，肉瘤，白血病，脑瘤，食管癌，鼻咽癌，肾癌，结肠癌，胸腺癌，乳腺癌，膀胱癌，前列腺癌，肺癌食管癌，鼻咽癌，小细胞肺癌，肺腺癌，子宫癌食管癌，鼻咽癌，小细胞肺癌，肺腺癌，子宫癌鼻咽癌，小细胞肺癌，肺腺癌，白血病，黑色素瘤胃癌，结肠癌，肺癌，乳腺癌，卵巢癌，子宫癌，甲状腺癌，肝细胞癌，白血病(包括急性髓性白血病，急性淋巴性白血病，和慢性髓性白血病)

睾丸，肾脏，肝，子宫，胆囊睾丸，肾脏，肝，子宫，胆囊睾丸，胎儿肝睾丸，胎儿肝淋巴细胞，成纤维细胞，睾丸，胎儿肝肾，卵巢，睾丸，脾

Morel等2000Van denEynde等1999Kikuchi等1999Sshichijo等1998Yang等1999Oka等2000

^aCAP-1是这一肽的另一个名字

^b当与最早报道的所述表位序列的文献不符时，其在肿瘤中的组织分布见给出的

参考文献

^c端粒酶在大部分的人肿瘤中表达：此处所列的是容易为细胞毒性T淋巴细胞所裂解的

^d所有的上皮组织都表达类粘液素高度糖基化分子

[0051]以下表格来自Renkivist等的文章(2001)。

                    表4.HLA-I类分子限制的肿瘤特异性抗原包括特有的(CDK-4，MUM-2，β-CATENIN，HLA-A2-R170，ELF2，MYOSIN-M，CASPASE-8，KIAA0205，HSP70-2M)

                 和共有的(CAMEL，TRP2/INT2，GNT-V，G250)抗原。

基因	HLA等位基因	肽表位	组织分布		参考文献
						肿瘤	正常组织
			AFPB-Catenin/mCaspase-8/mCDK-4/mELF2MGnT-VG250HSP70-2MHA-A*0201 RI701	A2A24A2A2A68A2A2A2A2				GVALQTMKQSYLDSGIHFFPSDSWCYFACDPHSGHFVETVSEQSNVVLPDVFIRC(V)aHLSTAFARVSLFEGIDIYCVEWLRIYLENGK	肝细胞肿瘤黑色素瘤鼻咽癌黑色素瘤小细胞肺癌黑色素瘤，脑瘤，肉瘤肾细胞癌，结肠癌，卵巢癌，子宫颈癌肾细胞癌，黑色素瘤神经胶质瘤肾细胞癌	胎儿肝脏无无无无乳腺和脑(低水平表达)无无无	Butterfield等1999Robbins等1996Mandruzzato等1997Wofel等1995Hogan等1998Guilloux等1996Vissers等1991Gaudin等1999Brandleetal等1996

HST-2KIAA0205MUM-1MUM-2MUM-2MUM-3MyasinlmRAGESART-2TRP-2/INT2707-AP

A31B44*03B44B44Cw6A28A3B7A24A68A2

YSWMDISCWIAEPINIQTVEEKLIWLFSELFRSGLDYFRSGLDSYVEAFIQPITRKINKNPKYKSPSSNRIRNTDYSARWNEIAYDFLYNYLSYTRLFLILEVISCKLIKRRVAALARDA

胃图章细胞瘤         无膀胱癌               无黑色素瘤             无黑色素瘤             无黑色素瘤             无黑色素瘤             无黑色素瘤             无黑色素瘤，肉瘤，     仅在视网膜间皮瘤鼻咽癌，膀胱癌肾癌，结肠与乳腺癌鼻咽癌，肺小细胞     无癌，肺腺癌，肾细胞癌脑瘤，食道癌与子宫癌黑色素瘤             无黑色素瘤             无b

Suzuki等1999Gueguen等1998Coulie等1995Coulie等1995Chiari等1999Baurain等2000Zorn and Hercend，1999aGaugler等1996Nakao等2000Lupetti等1998Morioka等1995

^aVLPDVFIRC(V)＝能够被CTLs识别的九肽和十肽两者

^b该抗原在正常细胞中不表达，但由于睾丸组织中(表达)尚未检验，因此还需要进一步的信息以确定该抗原属于哪一种类型

[0052]以下表格来自Renkivist等的文章(2001)。

                           表5.HLA-II类分子限制的抗原

基因	HLA等位基因	肽表位	组织分布		参考文献
						肿瘤	正常组织
			Amexin 11Gp100MAGE-1，-2，-3，-6MAGE-3MAGE-3MART-I/MeIan-AMUCINY-ESO-I	DRB*0401DRBI*0401DRB*1301DRB*1302DR*11-1DRB*1301DRB*1302DRBI*0401DR3DRB4*0101				DVPKWISIMTERSVPHWNRQLYPE-WTEAQRLDLLKYRARIP VTKAETSYVKVLHHM-VKISGAELVHFLLLK-YRARRNGYRALMDKS-LHVGTQCALTRRPGSTAPPAHGVTVLLKEFTVSG	黑色素瘤黑色素瘤黑色素瘤，肺癌和乳腺癌，小细胞鼻咽癌黑色素瘤，肺癌和乳腺癌，小细胞鼻咽癌黑色素瘤肺癌和乳腺癌，小细胞鼻咽癌黑色素瘤乳腺和卵巢癌多样性骨髓瘤，B细胞淋巴瘤黑色素瘤B细胞淋巴瘤肝癌(Chen等，1997)肉瘤，鼻咽癌，膀胱癌，前列腺癌，卵巢癌，甲状腺和乳腺癌	未验证黑素细胞睾丸，胎盘睾丸，胎盘睾丸，胎盘黑素细胞无a睾丸	Li等1998Li等1998Manici等1999Chaux等1999aChaux等1999bZarour等2000Hitbold等1998Zeng等2000

NY-ESO-IPSATyrosinaseTyrosinaseTyrosinase	DRB4*0101-0103DR4DRB 1*0401DRB 1*1501DRB1*0405	PLPVPGVLLK-EFTVSNGI-VLLKEFTVSG-NILTIRLT AADHRQLQL-SISSCLQQLILLGRMSLFM-PEDTGSLFHPEDTGQVFQQVFQVSHSFPHPLYDNDLMLLRLSEPAELTKKLQCVQLHVISMGVLQGITSMGSEPCAQNILLSNAPLGPQFPDYSYLQDSDPD-SFQDRH RPLQEVYP-EANAPIGHNREEIWRDIDFAHE	B-淋巴瘤，黑色素瘤，肉瘤，肝癌，鼻咽癌(Chen等1997)b膀胱癌，肺癌，前列腺癌，卵巢癌，甲状腺癌，乳腺癌黑色素瘤黑色素瘤黑色素瘤黑色素瘤	睾丸黑素细胞黑素细胞黑素细胞黑素细胞	Jauger等2000Corman等1998Topalian等1994Topalian等1996Kobayashi等1998aKobayashi等1998b
						变异蛋白抗原表位
HPV-E7CDC27/mTPI/m	DR*0401DR*0407DRB1*0401DRB1*0101	LFMDTLSFVCPLCLFMDSLNFVCPWCFSWAMDLDPKGAGELIGILNAAKVPAD	宫颈癌黑色素瘤黑色素瘤	无无无	Hhn等1999Wang等1999aPieper等1999

^a所有上皮组织都高水平地表达糖基化粘液素，而肿瘤细胞常表达具有正常蛋白序列的低糖基化粘液素

^b当与最早报道的所述表位序列的文献不符时，其在肿瘤中的组织分布见给出的参考文献

V.体外培养树状细胞

[0053]在美国专利5,199,942中描述了体外扩增造血干和祖细胞的步骤，该文献本文一并参考。现已知其它一些适用的方法。简述如下，体外培养和扩增包括(1)收集来自于病人外周血或骨髓的CD34⁺造血干和祖细胞：(2)体外扩增这些细胞。除在美国专利5,199,942中描述的细胞生长因子外，其它因子如flt3-L，IL-1，IL-3，c-kit配体也可以使用。

[0054]在骨髓中表达CD34的干细胞或组细胞仅占单个核细胞的1％到3％。CD34⁺干细胞或祖细胞在外周血中的数目低于骨髓中数目约10到100倍。细胞因子如flt3-L可以用于体内动员或增加树状细胞的数目。增加病人体内树状细胞的数目能有利于病人体内已存的抗原，如疾病抗原，肿瘤抗原，细菌或病毒抗原被树状细胞递呈给T绍胞。另外，为达到免疫目的，细胞因子也可以在注射抗原之前，同时或之后应用于病人。

[0055]应用已知的分离步骤收集外周血细胞(参见Bishop等，1994)。简言之，用常规的设备如V50分离仪(Haemonetics，Braintree，Mass)来收集外周血祖细胞和干细胞应。常规操作为每次4小时，每周不少于5次，直到收集6.5×10⁸的单个核细胞/kg。细胞悬浮于标准的培养液中，然后离心去除红细胞和中性粒细胞。吸出处于两相界面见的细胞(白细胞层)，并悬浮于HBSS中。悬浮的细胞主要是单个核细胞以及相当一部分的早期干细胞的混合物。

[0056]现已知一些能将CD34⁺造血干细胞或祖细胞从细胞群中鉴别和分选出来的技术。例如，单克隆抗体(或其它特异性细胞结合蛋白)可以用来结合干细胞或祖细胞上的一些标志蛋白或细胞表面抗原蛋白。目前已知的一些造血干细胞的标志或表面抗原(如flt-3，CD34，My-10和Thy-1)，可用于作为特异性结合蛋白(美国专利申请号08/539,142，1995年10月4日申请)。

[0057]一种方法是先将抗体或结合蛋白固定在如玻璃珠，培养瓶，磁珠或合适的层析柱树脂的表面上，然后让细胞接触其表面。造血干细胞会结合在其表面。另一种方法是将结合蛋白与细胞共同温育，然后抗体-细胞复合体会结合在对其有亲和力的表面上。不需要的细胞和细胞成分会被去除，从而得到相对较纯的干细胞群。特异性细胞结合蛋白也可以标记上荧光物质，如发色基团(chromophore)或荧光基团(fluorophore)，被标记的细胞可以根据不同的荧光加以分捡。优选地是同时用免疫亲和吸附柱来分离细胞。

[0058]免疫亲和吸附柱可以用任何形式，但最常见的是填充的反应床。该反应床由具有均匀包被底物能力的多孔材料组成。具有较高的表面积容积比的多孔材料可以允许细胞混合物通过大的接触面积而不阻碍细胞流出反应床。底物应该通过自己的特性或附加一种化学结构能高效的结合细胞结合蛋白一部分。常见的底物包括亲和素和链亲和素，也可以用其它的一些常规底物。

[0059]一种有效的方法是将所要分离的能够识别细胞表面抗原的单克隆抗体通常修饰加上生物素。由于生物素可以结合亲和素，因此可以使单克隆抗体可逆性的粘附在亲和柱上(见Berenson等，1986)。通过清洗，可以去除没有粘附的物质，最终目标细胞可以通过常规方法洗脱下来。在上述的免疫亲和层析柱中，是用生物素标记的抗CD34的单克隆抗体连接到亲和素包被的亲和柱上作为一种例子，正如WO93/08268中所述的。

[0060]另一种筛选静止干细胞的方法是应用抗代谢物如5-氟尿密啶或烷基化试剂4-羟基环磷酰胺(4-HC)诱导分裂和已定向分化的细胞死亡。非静止的细胞在加入生长因子后会被刺激增殖和分化，而对干细胞无效。因此非干细胞更易被5-FU或4-HC杀死(见Berardi等，1995)。

[0061]分离的干细胞先冷藏在可控温冷冻冰箱中如(Cryo Med，.Mt.Clemens，Mich.)，然后储存在液氮的气态层并应用二甲亚砜。作为细胞冻存保护剂。现有各种生长和培养树状细胞的培养液，包括含血清或无血清的培养液。可用的培养液有RMPI，TC199，DMEM，Iscoves DMEM，Fisher’s，alpha培养液，NCTC，F-10，Leibovitz’s L-15，MEM和McCoy’s。

[0062]培养液中特定的营养物质包括血清白蛋白，转铁素，脂质，胆固醇和一些还原剂如2-巯基乙醇，单硫代甘油，丙酮酸，丁酸和皮质激素如氢化可的松2-半琥珀酸盐。更具体地，标准培养液还包括能量来源，维生素和细胞支持的有机成分，用以稳定培养液的酸碱度的缓冲液如HEPES或Tris，和一些无机盐。在已被列入参考文献的WO95/00632中，有一些无血清的细胞培养液的描述。

[0063]本文和美国专利申请08/539,142中均介绍了培养CD34+细胞的合适细胞因子。采用树状细胞的特征性标记，如CD1a，HLADR，CD80和/或CD86，进一步用流式细胞仪或相近的方法纯化这些细胞。培养的树状细胞与抗原如肿瘤抗原或来源于致病或机会性致病生物的抗原共同温育，树状细胞将对这些抗原进行加工处理。然后用一定量的CD40结合蛋白将树状细胞激活。另一种方法，用编码抗原的基因转导树状细胞，然后用一定量的CD40结合蛋白激活抗原递呈的树状细胞。

VI.鉴定T细胞表位

[0064]为寻找能被CD4+或CD8+T细胞识别的T细胞表位，可以根据某一种基因预测的氨基酸序列来合成一系列相互重迭的肽(如9-13肽链)。T细胞能识别与MHCI或II类分子相结合的肽。因此，这些人工合成的肽将被负载到MHC匹配的抗原递呈细胞如EBV转化的B细胞或树状细胞上，以检测其刺激T细胞分泌细胞因子的能力。一旦找到阳性肽，紧接着合成一系列N和C端切除的肽，以确定能刺激T细胞所需的最短肽。

VII.试剂盒

[0065]在此所述的任何组合物均可用于包含在试剂盒中。在无数的例子中，包含载有穿细胞肽和相关抗原如肿瘤抗原的树状细胞和/或其他试剂的组合物可以包含在试剂盒中。在一个特定的实施方案中，这一组合物可以是疫苗。在另一特定的实施方案中，穿细胞肽和/或肿瘤抗原可以存放于试剂盒中，而树状细胞由另外的途径提供，比如可用试剂盒组分治疗的病人得到树状细胞。因此，这些试剂盒将树状细胞，穿细胞肽，和/或抗原包装在合适的盒子里。在一个特定的实施方案中，这一试剂盒将因疾病而调整，即所含抗原是疾病特异性的。在某些情况下，试剂盒是为治疗肿瘤的，其抗原将是与特定肿瘤相关的。

[0066]试剂盒可以包含适量分装的树状细胞和/或与本发明的组合物相关的成分，无论标记与否，均可用于制作检测分析所用的标准曲线。试剂盒中的某些成分可以以液相或冷冻干燥的形式包装。试剂盒通常将包括至少一支小瓶，试管，培养瓶，瓶子，注射器或其它容器，最好是分装。如果试剂盒含有一种以上的成分，可将能包含第二，三或更多容器以便附加的成分能分别存放。但也可以将几种成分放在一支试剂瓶中。本发明的试剂盒通常可用便以商业上销售的密封容器来包装试剂盒组分。这些容器还可包括将所需的小瓶放入其中的注射或吹制的塑料容器。

[0067]试剂盒通常用合适的容器方式包含制药上可接受的树状细胞，穿细胞肽，和/或抗原的配方。试剂盒可以采用单一容器包装，也可以采用不同的容器包装每个成分。当试剂盒的成分以一种或多种液相溶液提供时，液相溶液为含水溶液，无菌含水溶液是特别优选的。各种组合物也可以制备成针剂形式。在这种情况下，注射器，吸液管和/或其他相似的仪器，可以作为存放的容器，以便将试剂应用到身体部位的感染区，注射到动物体内，和/或用于与试剂盒中其它成分混合使用。但该试剂盒的组分也可以是干的药粉。当试剂和/或其组分以药粉的形式提供时，可用适当的溶剂来配制。可以想象溶剂也可以存放在另外的容器中。试剂盒也可包含第二个容器用以存放无菌的制药上可接受的缓冲剂和/或其他稀释液。

[0068]不管容器的数目和/或类型，本发明的试剂盒也可与辅助把最终组合物注射/导入动物体内的器具一起包装。这些器具可以是一种注射器，吸管，镊子和/或任何医用器具。

VIII.免疫治疗试剂

[0069]本文公开的材料与人类疾病和紊乱，包括肿瘤的免疫治疗显著相关。在使用本发明的免疫治疗组合物治疗肿瘤时，其他标准的治疗方案也可以使用，如放疗和化疗。然而，在一个特定的实施方案中，也可以使用其他的免疫治疗方法。一些肿瘤的免疫治疗法将在下面的章节加以描述，并用本发明的方法加以制备和使用。

[0070]免疫治疗剂通常是依靠免疫效应细胞和分子识别和破坏肿瘤细胞。在免疫治疗中，肿瘤细胞必须具有能被免疫治疗试剂识别的一些标志，该标志不能出现在大多数的其它细胞上。在许多肿瘤标志中，任何一种均可以作为本发明合适的靶分子。

A.免疫刺激物

[0071]免疫治疗一种特殊的方面就是用免疫刺激分子作为一种试剂，或更好与其它试剂连用，所说因子例如细胞因子，如IL-2，IL-4，IL-12，GM-CSF，TNF，IFN-α，β，γ；F42K和其他细胞因子类似物趋化因子，如MIP-1，MIP-1β，MCP-1，RANTES，IL-8；或生长因子如FLT3配体。

[0072]一种可用于本发明的一种较为特别的细胞因子是肿瘤坏死因子(TNF)。TNF是一种糖蛋白，能杀死某些肿瘤细胞，激活产生细胞因子，激活巨噬细胞和内皮细胞，促进产生胶原和胶原酶，是一种炎症介质，也是一种引起脓毒性休克的介质，并加速分解代谢，引起发热和嗜睡。一些感染因子通过刺激TNF的产生而导致肿瘤的消退。当TNF在有效剂量下单独使用时，毒性很大。因此理想的方法可以是用低剂量与其他药物联合使用。IFN-γ能增强TNF的免疫抑制作用，因此联合用药时，有潜在危险性。TNF和IFN-α融合物已被发现有增强抗肿瘤活性的能力。

[0073]IFN-α是另一种可用于本发明的比较特殊的细胞因子。IFN-α已被用于治疗毛细胞白血病，卡波氏肉瘤，黑色素瘤，一些良性肿瘤，肾细胞癌，卵巢癌，膀胱癌，非何杰金淋巴病，真菌引起的疾病，多发性骨髓瘤，和慢性粒细胞白血病。

B.主动免疫治疗

[0074]主动免疫通常采用一种抗原肽，蛋白，或自体的，同种异体的肿瘤细胞内含物或疫苗，并与细菌佐剂联合应用(Ravindranath &Morton，1991；Morton & Ravindranath 1996；Morton等，1992；Mitchell等，1990 Mitchell等，1993)。在用免疫治疗黑色素瘤中，能产生高Ig M抗体反应的病人通常比那些不能或产生较低IgM病人存活长。IgM通常是短暂存在的抗体，但似乎抗神经节苷脂和抗碳水化合物的抗体是例外。

C.过继性免疫治疗

[0075]在过继性免疫治疗中，通常将病人体内循环的淋巴细胞，或肿瘤浸润性淋巴细胞在体外分离出来，用淋巴因子如IL-2加以激活，或导入细胞坏死基因，最后重新输入病人体内(Rosenberg等，1988；1989)。为了达到此目的，人们可将有免疫活性的大量激活的淋巴细胞和含佐剂的肽抗原混合物一起输入动物和病人。激活淋巴细胞将最好是病人早期从血和肿瘤组织中分离的自身细胞，并经体外激活或扩增。这种形式的免疫治疗在肾癌和黑色素瘤病人中得到了一些疗效。

IX.增强免疫反应

[0076]本发明包括能增强免疫反应的方法。该方法包括用一种或多种淋巴细胞与抗原组合物接触的步骤，这里所说的抗原是由免疫细胞如本发明中所用的树状细胞来递呈。在特定的实施方案中，该抗原序列的一部分是SEQ ID NO：1的序列，或其功能等价物。本文使用的“抗原组合物”可以包含一种抗原(例如一种肽)，在某些情况下，抗原组合物包含可与HLA分子锚合的关键氨基酸。

[0077]在一个实施方案中，本发明是一种包含免疫激活剂或核甘酸作为试剂的混合物。免疫刺激剂包括但不限于一种抗原，一种免疫调节剂，一种抗原递呈细胞或一种佐剂。在另一实施方案中，一种或多种因子以任何组合方式共价连接到一种抗原上或一种试剂上。

[0078]增强的免疫反应可以是一种主动的或被动的免疫反应。此外，任何一种可以作为过继性免疫治疗途径的一部分。该途径中可以获得动物(如一种病人)的免疫细胞如树状细胞，B细胞或巨噬细胞，然后负载上连有抗原组合物的试剂。在一个实施方案中，抗原组合物可以是一种免疫刺激剂或编码该刺激剂的核甘酸。在选择该种形式治疗时，该动物(如病人)患有或怀疑患有某种肿瘤。在另一一个实施方案中，增强免疫治疗的方法可与肿瘤疗法，如肿瘤疫苗疗法进行联合使用。

[0079]在一个实施方案中，本发明运用了抗原递呈细胞。通常，抗原递呈细胞可以是通过增强针对抗原(例如肿瘤抗原)的免疫反应(例如从免疫系统的T细胞和B细胞臂)，增强免疫反应以达到本发明的目的任何细胞或者本发明的抗原性组合物。这些细胞能通过在此引用的和已知的技术分离出来。正如一般的技术人员所理解的(参见例如Kuby，1993，本文一并参考)，一种细胞正常能够展示或选择的和MHC II类分子结合，或该复和体能递呈抗原给免疫细胞，就是一种抗原递呈细胞。在某些方面，一种细胞(例如一种APC)可以和其他细胞形成融合细胞。例如和一种能够表达所需抗原的重组细胞或肿瘤细胞融合。将两个或更多细胞融合的方法学已经非常成熟。这些方法以被下列作者所描述(参见Goding，pp65-66，71-74 1986；Campbell，pp.75-83，1984；Kohler和Milstein，1975；Kohler和Milstein，1976，Geffer等，1977)。在一些情况下，一种抗原递呈细胞递呈抗原给免疫细胞，该免疫细胞是CD4+辅助性T细胞。在抗原递呈细胞或其他免疫细胞所表达的一些分子，可以增强或改进对某一抗原的免疫反应。一些分泌和可溶性分子，如细胞因子和佐剂也可提高或增强对某一抗原的免疫反应。这些分子对一种具有专业技术的人来说是众所周知的，本文描述了各种例子。

X.联合治疗

[0080]为了增加本发明的治疗组合物的有效性，可以将这些组合物和其他有效治疗高度增生性疾病试剂如抗肿瘤试剂联合使用。一种抗癌试剂可以对某一器官上肿瘤起负面影响，例如，通过杀伤肿瘤细胞包括诱导癌细胞的凋亡，降低癌细胞的生长速度，减少肿瘤转移的数目和发生，缩小肿瘤的大小，抑制肿瘤的生长，减少对肿瘤细胞的血液供给，促进对肿瘤的免疫反应，预防或阻止癌症的进程，增加患癌病人的寿命。更常见的是，与其他组合物联合使用以杀伤或阻止肿瘤细胞的增殖。这个过程涉及到细胞与表达构建体和试剂或多种因素同时接触。这也可通过将细胞与单一组合物或包含两种试剂的药理学制剂接触，或与两个不同的组合物或制剂同时接触来达到。这里的一种组合物包括表达构建体，而另一组合物包括第二试剂。

A.基因治疗

[0081]目前临床肿瘤学上主要问题是肿瘤细胞耐受化疗和放疗。目前肿瘤研究的目标之一是找到与基因治疗联合来改进化疗和放疗的效率。例如当用逆转录载体系统将HS-TK基因送到脑部肿瘤中时，能成功诱导出对抗病毒试剂GCV的敏感性。除促进凋亡或细胞周期的调节剂外，本发明中该组合物也能与化疗，放疗或免疫治疗联用。

[0082]此外，基因治疗可以选择的在其他试剂治疗之前或之后，间隔可以从几分钟到几星期。其他一些试剂和表达构建体用于细胞的情况下，人们应该注意维持疗程间的药物有效性以达到试剂和表达构建体起到有利的联合效应。在这些例子中，值得重视的是用两种疗法处理细胞时，两个间隔必须在12-24小时，更多选择在6-12小时之间。在一些情况下，需要延长时间达到更显著的治疗效果，在各个处理之间可以间隔几天(2，3，4，5，6，或7天)到几周(1，2，3，4，5，6，7或8周)。

[0083]治疗时，可以采用各种组合，基因治疗是“A”，其他治疗如化疗和放疗是“B”：

A/B/A B/A/B B/B/A A/A/B A/B/B B/A/A A/B/B/B B/A/B/BB/B/B/A B/B/A/B A/A/B/B/A/B/A/B A/B/B/A B/B/A/AB/A/B/A B/A/A/B A/A/A/B B/A/A/A A/B/A/A A/A/B/A

[0084]运用本发明的表达构建体治疗病人将遵循总的化疗的操作规程，同时也要考虑载体的毒性。可以预料如有必要可以重复治疗的疗程。同时还必须注意各种标准治疗及外科治疗可以联合运用到表达的高度增生细胞的治疗中。

B.化学治疗

[0085]肿瘤治疗也包括化疗和放疗为基础的各种联合治疗。联合治疗剂包括，例如，顺铂(CDDD)、卡铂、甲苄肼、二氯甲基二乙胺、环磷酰胺、喜树碱、异环磷酰胺、苯丙氨酸氮芥、苯丁酸氮芥、白消安、亚硝基脲、放线菌素D、柔毛霉素、阿霉素、博来霉素、普利霉素、依托泊苷(VP16)、三苯氧胺、钙稳锭、雌激素受体结合剂、紫杉醇、gemcitabien、长春花碱、famesyl-蛋白转移酶抑制剂、反铂、5-氟尿嘧啶、长春新碱、长春碱和氨甲喋呤，或前面所述的任何类似物或衍生物。

C.放射治疗

[0086]一些其它能导致DNA损伤的因素，已被广泛的应用于肿瘤治疗中，包括众所周知的γ-射线，X-射线和/或放射性同位素直接送入肿瘤细胞中。其他形式的DNA损伤因素也须引起重视，如微波和紫外照射。很可能这些因素导致DNA，DNA前体，DNA的复制和修复，以及染色体的组装和维持的广泛的的损伤。X射线的剂量范围，从每天50-200伦琴持续一段时间(3-4周)，到单剂量2000-6000伦琴。放射性同位素的剂量范围非常宽，并取决于同位素的半衰期，放射发射器的强度和类型，以及肿瘤细胞的摄取量。

[0087]当运用于一种细胞中，“接触”和“暴露”这两个概念本文用来描述将治疗性构建体和一种化疗或放疗试剂被送到靶细胞或者被并列放入靶细胞的过程。为了达到杀死细胞和细胞稳态，两种试剂联合输入细胞，从而有效地杀死细胞和阻止细胞分裂。

D.免疫治疗

[0088]免疫治疗总体来说依赖于运用免疫效应细胞和分子来定向到达靶目标和消灭肿瘤细胞。免疫效应分子例如可以是肿瘤细胞表面上的一种标志物的特异性抗体。抗体本身可以作为治疗的效应分子，或可以召集其他细胞来有效的杀伤细胞。抗体还可以连接一种药物或毒素(化学药物，放射性药物，蓖麻毒素A霍乱毒素，百日咳毒素等).此外，效应剂也可以是带有对肿瘤靶细胞进行直接或间接相互作用的表面分子的淋巴细胞。各种各样的效应细胞包括杀伤性T细胞和NK细胞。

[0089]因而，免疫治疗可以作为联合治疗的一部分，用来联合本发明中的方法和/或组合物。联合治疗的总方法将在下面讨论。通常，肿瘤细胞一定带有一些可以作靶向的标志物，这些标记物通常在大部分其它细胞不出现。现在有许多肿瘤标志物，其中任何一种均可以作为本发明中的靶分子。常见的肿瘤标志物包括肿瘤癌胚抗原，前列腺特异性抗原，泌尿系统肿瘤相关抗原，胚胎抗原，苏氨酸氧化酶，雌激素受体，层粘连蛋白受体，erbB和p155。

E.外科治疗

[0090]大约60％的肿瘤病人将接受不同形式的外科治疗，包括预防性，诊断性或临时性，治疗性或缓解症状的外科等。治疗性外科作为一种肿瘤治疗的手段可以用来联合其它的治疗方法，如本发明的治疗，化疗，放疗，激素治疗，基因治疗和/或其它治疗方法。

[0091]治疗性外科包括物理性切除或破坏全部或部分肿瘤组织的切除术。肿瘤切除术是用物理的方法至少去除肿瘤的一部分。除肿瘤切除术外，肿瘤外科治疗还包括激光外科手术，冷冻手术，电外科手术和Miscopically Controlled Surgery(Mohs’Surgery)。值得进一步注意的是，本发明可以和去除表浅肿瘤，癌前组织及肿瘤周围附带的正常组织的外科手术联合使用。

[0092]在手术切除部分肿瘤细胞，组织或肿瘤后，在体内会形成一些小空腔。可以通过灌注法，直接注射或局部用药等进行抗肿瘤治疗。这些治疗可重复进行，如每隔1，2，3，4，5，6或7天，或每1，2，3，4，5周，或每1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12个月进行治疗。这些治疗也有不同的剂量范围。

F.其它试剂

[0093]值得注意的是，其它试剂也可以和本发明联合运用来提高治疗效果。这些试剂包括免疫调节剂及影响细胞表面受体及GAP连接上调表达的试剂，影响细胞静止或分化的试剂，细胞粘附抑制剂，及能增加高度增生的细胞凋亡敏感性的诱导剂。免疫调节剂包括肿瘤坏死因子，α，β，γ-干扰素，白细胞介素-2及其它细胞因子，F42K及其它细胞因子的类似物，MIP，MIP-1β，MCP-1，RANTES及其它的趋化因子。值得进一步重视的是，上调细胞表面受体和其他的配体如FAS/FAS配体，DR4或DR5/TRAIL等可以增强本发明通过建立起自分泌或旁分泌效应诱导高度增生性细胞凋亡的能力。增加GAP连接的数目可以增强细胞内信号转导，从而发挥对周围高度增生细胞群的抗增生作用。在某些情况下，细胞静止或分化试剂能和本发明联合运用，并提高治疗的抗增生效果。细胞粘附抑制剂也可用于提高本发明的疗效，如粘附激酶抑制剂(FAXS)和LOVASTATIN。另外，其它一些用来提高增生细胞对凋亡敏感性的试剂，如抗体C225可于本发明联合应用，从而提高治疗效果。

[0094]激素治疗也可与本发明联合使用，或与前面所述的任何方法联合使用。激素可治疗以下一些肿瘤，如乳腺癌，前列腺癌，卵巢癌和子宫颈癌，其效应是降低或阻断一些激素如睾丸酮或雌激素的作用水平。激素治疗通常与至少一种其它肿瘤治疗方案联用，以用来减少肿瘤转移的风险。

XI.生物学功能上的等同物

[0095]本发明包括与肽相关的治疗方法和组合物。由于本发明所相关的肽在结构上可以修饰和/或改变，因此生物学功能上的类似物或被修饰的具有相同特性的分子均在本发明的范围内。本领域技术人员可以认识到穿细胞肽生物学功能上的类似物，仍然具有利于其它肽如抗原肽导入细胞。本领域技术人员同样也能认识到生物学功能上自身抗原的类似物在被免疫效应细胞递呈时同样能增强免疫效应。在一个特定的实施方案中，能预防随后出现的疾病或病原体的攻击的一些等同物也包括在内。

A.修饰的肽

[0096]肽中的一些氨基酸可以被其它氨基酸所替代，修饰后的肽并不失去与底物分子，受体等上结合位点的结合能力。由于所谓“保守性”的改变并不破坏其蛋白质的生物功能，因为蛋白质结构的改变不会破坏肽所执行其功能的能力。因此发明者可进行下列肽的序列改变，这些改变仍能实现本发明的目的。

[0097]根据功能的等位性，本领域技术人员能很好地理解，生物学功能上的等同蛋白和/或多聚核甘酸的概念是指一种分子在一定范围内可以改变分子中某一部分，但仍保持其等同的生物学活性。

[0098]氨基酸的替换主要是依据氨基酸侧链结构上的相似性来进行的，如它们的亲水性，疏水性，电荷，大小之类。通过对氨基酸的大小，形状和/或侧链组合物的分析可知精氨酸，赖氨酸和/或组氨酸都带有正电荷；丙氨酸，甘氨酸和/或丝氨酸都具有极相似的大小；苯丙氨酸，色氨酸和/或芳氨酸都具有相似的形状。因而基于上述因素，精氨酸，赖氨酸和/或组氨酸；丙氨酸，甘氨酸和/或丝氨酸；苯丙氨酸，色氨酸和/或苏氨酸本文定义为生物学功能上的等同物。

[0099]为了影响更多数量上的改变，必须考虑氨基酸的疏水性指数。每个氨基酸根据它们的疏水性和/或电荷特性都有一定的疏水指数。异亮氨酸(+4.5)，缬氨酸(+4.2)，亮氨酸(+3.8)，苯丙氨酸(+2.8)，半胱氨酸/胱氨酸(+2.5)，蛋氨酸(+1.9)，丙氨酸(+1.8)，甘氨酸(-0.4)，羌丁氨酸(-0.7)，丝氨酸(-0.8)，色氨酸(-0.9)，苏氨酸(-1.3)，脯氨酸(-1.6)，组氨酸(-3.2)，谷氨酸盐(-3.5)，谷氨酸(-3.5)，天门冬氨酸(-3.5)，天门冬先氨(-3.5)，赖氨酸(-3.9)，和/或精氨酸(-4.5)。

[0100]现已知蛋白质的亲水性指数对其生物学上相互作用的功能有显著影响(本文一并参考)。现也已知一些氨基酸能被其它具有项似亲水性指数和/或分数和/或保持相似生物学活性的其它氨基酸所替代。根据亲水性指数改变氨基酸时，所替换的氨基酸的亲水性指数最好选择在+/-2之内，选择在+/-1范围内更佳，如果在+/-0.5范围内将更好。

[0101]同样，目前也已知根据氨基酸的亲水性可以有效的替换氨基酸，尤其是生物学功能上等同蛋白和/或肽能被制备出来用在免疫学上的及本发明的一些情况中。本文一并参考的美国专利4,554,101中阐明了一种蛋白最局限的平均亲水性是由其相邻氨基酸的亲水性所控制，并和其免疫原性和/或抗原性相关，如和该蛋白的生物学特性相关。

[0102]根据美国专利4,554,101的描述，下列一些氨基酸残基的亲水性已被列出。精氨酸(+3.0)，赖氨酸(+3.0)，天门冬氨酸(+3.0+/-1)，谷氨鲜氨(+3.0+/-1)，丝氨酸(+0.3)，天门冬先氨(+0.2)，谷氨酸(+0.2)，甘氨酸[0]，羌丁氨酸(-0.4)，脯氨酸(-0.5+/-1)，丙氨酸(-0.5)，组氨酸(-0.5)，半光氨酸(-0.1)，蛋氨酸(-1.3)，缬氨酸(-1.5)，亮氨酸(-1.8)，同形亮氨酸(-1.8)，苏氨酸(-2.3)，苯丙氨酸(-2.5)，色氨酸(-3.4)。改变氨基酸必须依据相似的亲水性程度，选用替换的氨基酸其亲水性必需在+/-2范围内，如果在+/-1范围内将更好，和/或控制在+/-0.5范围内为最佳。

B.改变氨基酸

[0103]本发明在许多方面都依赖于肽，这些肽可以包含20种天然氨基酸及对其中某些氨基酸翻译后的修饰。然而，在体外合成肽可以选用修饰后的和/或不常用的氨基酸。下表列举了一些修饰后的和/或不常用的氨基酸，但并不仅限这些。

表6-修饰后的和/或不常用的氨基酸

缩写	氨基酸	缩写	氨基酸
				AadBAadBAlaAbu4AbuAcpAheAib	2-氨基脂肪酸3-氨基脂肪酸beta-丙氨酸，beta-氨基酸2-氨基丁酸4-氨基丁酸，6-氨基羊酸2-氨基肝酸2-氨基异丁酸	EtAsnHylAHyl3Hyp4HypIdeAileMeGly	N-乙基天冬氨酸羟赖氨酸异羟赖氨酸3-羟脯氨酸4-羟脯氨酸异赖氨酸异异亮氨酸N-甲基乙氨酸或肌氨酸

BAibApmDbuDesDpmDprEtGly

3-氨基环己酸2-氨基环己酸2，4-二氨基丁酸赖氨酸2，2′-二氨基环己酸2，3-二氨基丙酸N-乙基乙氨酸

MelleMeLysMeValNvaNleOrn

N-甲基异亮氨酸6-N-甲基赖氨酸N-甲基缬氨酸去甲缬氨酸去甲亮氨酸鸟氨酸

C.模拟物

[0104]除了上文所说的生物功能等同物外，本发明的发明人也考虑合成一些结构上相似物用以模拟本发明的肽或多肽的关键部位。这种可称为肽模拟物的合成物能以本发明中肽一样的方式加以应用，因此是功能上的等同物。

[0105]在Johnson(1993)的文章中描述一些可模拟蛋白质二级和三级结构的模拟物。使用肽模拟物的根据是基于蛋白质的肽骨架的存在主要通过旋转氨基酸侧链，以达到分子相互作用的目的，比如抗原和/或抗原分子。因此可以设计一个肽模拟物，并具有与自然分子一样进行分子的相互作用。

[0106]现已有一些文献描述了生成这些特殊结构如α超螺旋结构的方法，比如在美国专利5,446,128，5,710,245，5,840,833和5,859,184。这些结构使得肽和蛋白质具有热稳定性，提高对蛋白分解的抵抗力。6，7，11，12，13和14环结构已被公布于众。

实施例

[0107]下列实施例用来说明本发明优选的实施方案。本领域技术人员应当知道，在下列实施例中公开的技术代表了发明人在实施本发明中很好地发挥作用的那些技术，因此被认为用来构成实施本发明的优选模式。然而，由于这些技术的公开，本领域技术人员知道可以对在此公开的特定实施方案作出许多技术上的改变，仍可得到相同或相似的结果，而不偏离本发明的精神和范围。

实施例1

实验方案

[0108]细胞系：B16是源于C57BL/6的有色素的小鼠黑色素瘤细胞系。MC-38是腺癌细胞系。293K^b是转染的表达鼠源的MHC-I K^b分子的293细胞系(NCI的Dr.James Yang惠赠)。所有细胞系均培养在37度，5％CO₂条件下，RPMI 1640培养液补充10％热灭活胎牛血清，2mM谷氨酸，100U/ml青霉素，100U/ml链霉素(Biofluids，Rockville，MD)，2.5mg/ml Fungizone(GIBCO BRL，Gaithersburg，MD)。

[0109]肽：本实验所用TRP2是来源于TRP2蛋白的9个氨基酸序列(SVYDEFVWL)。对照H2-K^b限制性肽是β-半乳糖甘酶(gal)(DAPIYTNV)。本实验所用的穿细胞肽是12个氨基酸组合的CPP(AAVLLPVLLAAP)，叫做CPP1。CPP1-TRP2(AAVLLPVLLAAPSVYDEFVWL)和CPP1-β-gal(AAVLLPVLLAAP DAPIYTNV)合成并经HPLC纯化。所有肽均溶于DMSO，然后用PBS稀释至最终浓度。

[0110]树状细胞的制备和分析：小鼠成熟和未成熟的树状细胞是用前面所说方法从C57BL/6骨髓分离得到的(Latbeur等，1999；Specht等，1997)。树状细胞的表形和混合淋巴细胞反应活性按照以前所述的操作方法的分析(Specht等，1997)。简单地说，未成熟的树状细胞在鼠源的GM-CSF条件下制备，毋需转移。松散贴壁的的未成熟的树状细胞在第五天被收集并用于实验。成熟的树状细胞在重组的GM-CSF和1000U/ml IL-4(Peprotech，Rocky Hill，NJ)条件下制备。松散贴壁的的未成熟的树状细胞在第六天被转移至10厘米的培养皿。非贴壁细胞被收集并于37℃用Opti-MEM(GIBCO BRL，Gaithersburg，MD)培养液中用肽处理2小时，PBS洗三次后，用于小鼠注射(3×10⁵细胞/单个小鼠静脉注射)。成熟和未成熟的树状细胞用抗MHC-I和MHC-II分子的抗体和FITC-连接的羊抗鼠IGG2A，抗B7抗体和PE-连接的羊抗人IGG，CD40抗体和PE-连接的羊抗大鼠的和抗CD11c(Pharmingen，San Diego，CA)进行染色。染色的细胞然后用流式细胞仪(FACScan^TM，Becton-Dickinson，San Jose，CA)进行分析。通常，未成熟的树状细胞表现出相对低的MHC-II和共刺激因子，而成熟的树状细胞比未成熟的树状细胞和脾细胞表现较高的MHC-II和共刺激因子，并具有体外刺激异体的T细胞的潜在能力。

[0111]小鼠和肿瘤治疗6-8周雌性C57BL/6(B6)，CD4基因敲除(KO)和CD84基因敲除(KO)小鼠是从国家癌症研究所和Taconic购买，并在贝勒医学院的无病源小鼠饲养中心喂养。在3天肿瘤模型中，所有的小鼠均通过尾静脉注射3×10⁵B16黑色素瘤细胞。3天后，小鼠被静脉注射3×10⁵肽负载的DC。14天后，取出小鼠的肺，双盲相计数肿瘤肺转移的数目。在预防性模型中，DC/肽免疫小鼠的14天后，小鼠被注射B16肿瘤细胞。2星期后，取出小鼠的肺，并计数肿瘤肺转移的数目。在抗体清除实验中，在注射肿瘤的前一天，小鼠被注射500微升含有200微克抗CD4(GK1.5)，抗CD8(2.43)或对照抗体，在肿瘤注射后的1，3，10天继续注射三次抗体。CD4+和CD8+清除效果用流式细胞仪分析。

[0112]T细胞抗负载肽DC的活性。成熟的树状细胞用10μM浓度的各种肽在37℃处理2小时，用测试T细胞所用培养液(RPMI1640含5％人AB血清，谷氨酸和120IU IL-2)，清洗3次后，1×10⁵DC/肽同TRP2-特异性CTL 1×10⁵在37℃，5％CO₂条件下共同培养12小时，余下的负载肽的DC离心后重悬于DC培养液。在不同的时间(肽处理后4，18和24小时)，收集上述负载肽的DC，洗一次，与同样数量的CTL被共同培养12小时，然后收集培养上清液并贮存于-20度直至使用。

[0113]细胞因子释放试验：免疫后2周，收集无肿瘤刺激小鼠的脾细胞。脾细胞在培养第一天用TRP2(1μg/ml)在体外重复刺激，细胞培养6天，第三天加入IL-2。T细胞被检测抗TRP2或β-gal肽刺激的293K^b或B16肿瘤的活性。过夜温育后收集上清，并按厂家说明用ELISA检测鼠源的IFN-γ，或GM-CSF(Endogen，Woburg，MA)。

实施例2

负载TRP2-自身肽的DC不能产生有效的抗肿瘤免疫

[0114]在以前的研究中，尽管TRP2肽的特异性细胞毒性T细胞(CTL)可以从用TRP2肽和不完全佐剂(IFA)免疫小鼠的脾脏细胞经体外培养后产生(Zeh等，1999)，但是用TRP2肽配合IFA，DNA，编码小鼠TRP2的腺病毒或疫苗病毒免疫的小鼠不能对B16肿瘤产生预防性的或治疗性的免疫力(Schreurs等，2000；Zeh等，1999；Overwijk等，1999；Bowne等，1999)。

[0115]用模型肽负载的成熟DC来检测对B16肿瘤细胞的免疫反应的增强。一次性静脉注射3×10⁵个负载TRP2自身肽的DC免疫C57BL/6(B6)小鼠，2周后，给已免疫小鼠注射致死剂量(3×10⁵)的B16肿瘤细胞，2周后取出小鼠的肺并计数肿瘤的肺转移数目。负载TRP2肽DC与DC本身或负载对照肽DC免疫的小鼠相比，几乎未见到保护性免疫的提高。

实施例3

CPP1以及其在导入TRP2肽到DC以延长抗原递呈的应用

[0116]为克服肽从DC上解离的问题，TRP2肽被导入至成熟的DC。MTS(AAVLLPVLLAAP)融合蛋白已表明可以迅速而有效的进入完整的细胞(Rojas等，1998)。MTS被称作穿细胞肽1(CPP1)，具体地说，当共价结合于一种自身肽，它具有两个功能1)促进自身肽进入成熟的DC，和2)保护自身肽在体外负载时不被蛋白酶降解。一旦进入成熟的DC后，已进入细胞与CPP1连接的自身肽经加工并被新合成的MHC-I分子递呈给T细胞。因此，在某些情况下，这种方法能延长成熟DC递呈自身肽的时间和在体内的肽的密度，从而产生较强的抗肿瘤免疫反应。几种肽包括CPP1-TRP2，CPP1-β-gal，TRP2和不相关肽(IR)-TRP2(图1A)可用化学方法合成。

[0117]为了检测这些肽能否进入成熟DC，我们将它们的N端标记上荧光素，并同成熟DC一起温育。CPP1-TRP2肽可以有效地进入细胞，而其它的肽未能进入成熟DC(图1B)。而且，我们还发现CPP1-TRP2肽进入并积聚在胞核和胞浆中。根据细胞中的分布，进入肽位于囊泡如内含体中，而不是游离于胞浆中(图1C)。

[0118]为了检验CPP1-TRP2是否能延长递呈MHC/肽复合物给T细胞，用TRP2，CPP1-TRP2和CPP-βgal(对照肽)在37℃下负载成熟DC两小时。洗过后，有些肽负载后的DC立即与TRP2特异性的T细胞混合(0小时)，并温育12小时。其他肽负载后的DC在此后不同的时间与T细胞混合，如4，18和24小时。所有细胞上清液都在温育12小时后收集并作ELISA测定。DC/TRP2和DC/CPP1-TRP2组的T细胞活性在负载0小时几乎相等，而DC/CPP-1βgal组未能刺激T细胞(图1D)，这意味着T细胞对TRP2肽是专一性的。然而，负载后4小时，DC/TRP2组的T细胞释放GM-CSF的能力降低了40％。18和24小时后，该组T细胞活性丧失了超过90％。与此相反，负载后4小时后，DC/CPP1-TRP2组的T细胞释放GM-CSF的能力略有提高。更重要的是，DC/CPP1-TRP2几乎完全保持了24小时内递呈MHC/TRP2复合物给T细胞的能力(图1D)。因而，肿瘤抗原肽进入DC能增强其递呈MHC/肽给T细胞的能力。

实施例4

用CPP1-TRP2负载的DC免疫小鼠对B16肿瘤生长有抑制作用

[0119]为检测CPP1-TRP2负载的成熟DC能否产生针对B16肿瘤的强有力的免疫保护，一次静脉注射不同负载肽的DC到小鼠体内。两周后，用3×10⁵的B16肿瘤细胞注射免疫后的小鼠。肿瘤注射后两周，取出小鼠肺脏并计数其中的肿瘤肺转移的数目。所有DC/CPP1-TRP2免疫过的小鼠均未见肿瘤肺转移，而用DC或DC/对照肽免疫的小鼠的肿瘤肺转移的数目超过100(图2A)。值得注意的是，DC/TRP2免疫没有起到保护作用。该实验重复了三次，得到类似结果。图2B所示为每组的代表性的肺大体病理图片。可见，对B16肿瘤模型，将肽导入细胞来延长DC递呈抗原的方法能显著增强抗肿瘤效应。

实施例5

CPP1-TRP2负载成熟DC是增强免疫所必需的

[0120]为检测CPP1-TRP2负载的未成熟DC和脾细胞能否诱导出抗肿瘤免疫力，将TRP2，CPP1-TRP2，TRP2加CPP1，或CPP1-βgal负载到未成熟DC，成熟DC以及脾细胞并注入小鼠。肽负载的脾细胞和未成熟DC均未能抑制B16肿瘤的生长(图3A)。相反，CPP1-TRP2负载的成熟DC有效地抑制B16肿瘤细胞生长，而TRP2或其他对照肽负载的DC则未能产生抗肿瘤效应。这些结果表明，成熟DC和CPP1-TRP2对於诱导抗B16肿瘤效应是缺一不可的。肽负载的未成熟DC和脾细胞均不能产生有效的免疫反应。这些结果与其它类似的研究一致，说明在T细胞抗肿瘤效应的诱导上，成熟的DC是比为未成熟DC和脾细胞更好的APC(Labeur等，1999；Winzler等，1997)。

[0121]一次性DCs/CPP1-TRP2免疫小鼠完全抑制了B16肿瘤的生长，而DCs/TRP2则不能(图2A，2B)。为了检测多次注射能否增强T细胞的反应，我们发现至少注射DCs/TRP2两次以上，才能产生较弱的保护性免疫，5只小鼠中的2只抑制了B16肿瘤的生长。为了进一步比较DCs/CPP1-TRP2或DCs/TRP2所诱导的保护性免疫能延长小鼠在注射B16肿瘤后的生存时间，用DCs/PBS，DCs/CPP1-βgal，DCs/TRP2和DCs/CPP1-TRP2注射小鼠两次。两周后，给免疫后的小鼠注射B16肿瘤，然后观测其生存情况。如图3B所示，DCs/TRP2组的生存时间较之DCs/PBS或DCs/CPP1-βgal组略有延长。相比之下，DCs/CPP1-TRP2则可延长小鼠生存最少至肿瘤注射后60天。这些结果表明，DCs/CPP1-TRP2疫苗能诱导强有力的保护性免疫，并能显著延长动物的生存时间。另一方面，DC/TRP2需多次注射才能产生部分保护性免疫，而且只能略微延长小鼠的生存时间。这与其他研究组所得到的结果是一致(Bellone等，2000；Schreurs等，2000)。

实施例6

免疫产生的CD8+T细胞反应

[0122]为检测负载肽的DC免疫的小鼠能否产生TRP2特异性的CD8+T细胞，以及体外检测到的T细胞活性是否和体内的抗肿瘤活性相关，我们从不同负载肽的DC所免疫的小鼠中分离脾细胞，并用TRP2进行体外刺激，然后用负载了TRP2的293K^b细胞或B16肿瘤细胞作为靶细胞来检测T细胞的活性。用DC/TRP2或DC/CPP1-TRP2免疫小鼠所生成的CD8+T细胞可以识别肽负载的靶细胞和B16肿瘤细胞，但不能识别MHC I类相匹配的MC38肿瘤细胞或293K^b细胞(图4)。这些CD8+T细胞也可以杀伤B16肿瘤细胞，但不能杀伤MC38肿瘤细胞。作为对照，用对照肽(CPP1-βgal)负载的DC免疫的小鼠均不能产生TRP2特异性的CTLs。

[00123]这些结果说明用DC/TRP2或DC/CPP1-TRP2免疫小鼠可以产生TRP2特异性的CD8+T细胞，但体外检测的T细胞活性与图2所显示得体内抗肿瘤免疫力没有相关性。以前的研究表明用IFA中的肽和裸露DNA能诱导出CD8+T细胞的反应，但这些T细胞不能产生体内的保护性免疫力(Bellone等，2000；Zeh等，1999)。而且，多次用DC/TRP2(SVYDFFVWL9-mer)或TRP2(VYDFFVWL 8-mer)免疫可产生类似的CTL活性，但由高亲和力Kb结合肽(SVYDFFVWL9-mer)产生的体内的保护性免疫力高于TRP2(VYDFFVWL 8-mer)(Schreurs等，2000)。这表明延长肽在细胞表明递呈的时间可以改善体内免疫反应。其他的动物模型和病人的临床实验均得到了相似的结果(Thumer等，1999；Rosenberg等，1998；Srivastava，2000)。由于TRP2是自身抗原，与MHC-肽复合物有高亲和力的T细胞在体内可以会因中心和外周耐受而被清除。为了诱导出有效的抗肿瘤免疫，延长DC细胞递呈抗原的时间是必要的。将肽导入到DC内的方法不仅可以通过内源途径对合成的肽进行自然加工处理，也可以延长DC细胞递呈抗原的时间从而增强刺激T细胞的能力。这些效应的联合可以改善体内抗肿瘤的T细胞反应，但不能反映体外检测的T细胞活性。目前这一机制还不清楚。对这一现象现有几种可能的解释。T细胞在体内的去向(肿瘤组织对脾脏细胞或外周单个核细胞)和用肽体外在特定的条件下刺激T细胞凋亡是导致体内外抗肿瘤活性不同的原因(Rosenberg等，1998；Suhurbier等，1993)。最后其它的效应细胞如CD4+T细胞在某些情况下可以解释为何DC/CPP1-TRP2能有效的诱导强的抗肿瘤免疫活力。

实施例7

CD4+和CD8+T均为保护性免疫反应所必需的

[0124]为验证CD4+T细胞是否为体内保护性免疫反应所必需的，在用DC/CPP1-TRP2肽免疫小鼠前用CD4或CD8分子和对照抗体来清除CD4+或CD8+T细胞。在注射B16肿瘤细胞前将这些抗体注射到动物的腹腔，并在肿瘤注射后的1，3，10天连续三次注射。用DC/CPP1-TRP2免疫的小鼠能产生抗肿瘤的反应。用对照抗体注射的小鼠抗肿瘤免疫反应保持不变。但是用抗CD8抗体清除CD8+T细胞后的小鼠，其抗肿瘤的免疫反应显著下降(图5A)，清除CD4+T细胞后的小鼠，其抗肿瘤免疫能力也受到影响。

[0125]为进一步研究CD4+T细胞的作用，用DC/CPP1-TRP2肽负载的DC免疫野生型，CD4基因敲除和CD8基因敲除的B6小鼠。用DC/PBS和DC/CPP1-βgal免疫的野生型B6小鼠不能抑制肿瘤的生长，但用DC/CPP1-TRP2免疫的小鼠能完全抑制肿瘤的生长(图5B)。然而，用DC/CPP1-TRP2免疫的CD4基因敲除和CD8基因敲除的B6小鼠仍不能抑制B16肿瘤的生长。与应用同种疫苗的野生型小鼠相比，这两组小鼠的肿瘤肺转移的数目增加。这些结果表明CD4+和CD8+T细胞均为保护性免疫反应所必需的。

[0126]可以假设CPP1-TRP2(21mer)能够诱导肽特异性的CD4+T细胞，而TRP2(9-mer)则不能。然而，CPP1-TRP2特异性或TRP2特异性的T细胞均不能被检测到。CD4+T细胞已被证明是诱导体内对TRP1和TPR2的抗肿瘤效应所必需的(Houghton等，2001)，但目前对他们直接参与以及其确切的机制目前尚不清楚。最近的研究表明，肿瘤特异性和肿瘤非特异性(不相关)T细胞辅助肽可以对诱导CTL免疫反应起到作用(Casares等，2001)。CD4+T细胞在抗肿瘤免疫中的重要作用已被人们广泛接受(Wang，2001；Greenberg，1991；Pardoll和Tapolaian，1998；Hung等，1998；Toes等，1998；Specht等，1997)。

实施例8

CPP1-TRP2负载的DC诱导的治疗性抗肿瘤免疫

[0127]为检测CPP1-TRP2负载的DC免疫能否产生足够强的免疫反应，从而抑制已经存在的B16肿瘤。给小鼠注射B16肿瘤(3×10⁵个细胞每只小鼠)的3天后，一次静脉注射不同肽负载的DC。14天后，取出肺脏并计数肿瘤的肺转移数目。DCs/TRP2，DCs或对照肽均未见疗效(图6A)，然而，DC/CPP1-TRP2组肿瘤的肺转移数目却显著减少了(P＜0.01)。有趣的是，CPP1-TRP2负载的脾细胞也未能抑制肿瘤生长。这说明有效的免疫需要成熟DC和CPP-TRP2相结合。12个氨基酸的序列CPP1，TRP2，或IR-TRP2负载的DC亦未能诱导出任何抗肿瘤反应，表明CPP1和TRP2间的连接也是能使TRP2肽导入DC并产生强有力的抗肿瘤免疫反应所必需的。DC/CPP1-TRP2疫苗诱导出的超强抗肿瘤效应已被在另外的独立实验中得到重复(图6B)。

[0128]这些结果显示，单次注射DC/TRP2(图6)在3日肿瘤模型中所诱导的微弱免疫不足以抑制肿瘤的肺转移，即使多次免疫也无效。相反，用CPP1-TRP2负载的DC单次免疫即可完全抑制肿瘤的肺转移，并保护小鼠不受随后的肿瘤注射的影响(图2)，而且能抑制已存在的肿瘤生长(图6)。这是首次在抗原性很差的B16肿瘤的动物模型上显示DC/CPP1-TRP2免疫可产生强有力的抗肿瘤效应。鉴于许多MHC-I型限制性T细胞肽已被从癌细胞和病毒中鉴定出来，用穿细胞肽将这些T细胞肽导入DC的方法，可以会在增强抗肿瘤反应以及自身免疫和感染性疾病中得到广泛的应用。

参考文献

[0129]本文所提及的所有专利和论文是本发明所属技术领域技术人员水平的一种尺度。正如每篇单独特别说明的文献被列入参考文献一样，本文所提及的所有专利及论文也同等程度地一并列入参考文献中。

专利

美国专利5,440,013

美国专利5,618,914

美国专利5,670,155

美国专利5,446,128

美国专利5,710,245

美国专利5,840,833

美国专利5,859,184

美国专利5,929,237

美国专利5,475,085

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Claims (41)

1.一种包含免疫效应细胞和穿细胞肽的组合物，其中所说的穿细胞肽是CCP1、信号肽I、信号肽II、PRES、Transportan、双亲型肽、HSV VP22、肽载体或CL22，并且穿细胞肽与抗原相连。

2.权利要求1的组合物，其中所说的抗原是肿瘤排斥抗原或肿瘤相关抗原。

3.权利要求1的组合物，其中所说的抗原是包含多个T细胞表位的分子。

4.权利要求3的组合物，其中所说的多个T细胞表位来源于同一肿瘤抗原或不同的肿瘤抗原。

5.权利要求1的组合物，其中所说的抗原包含至少一种MHC-I类限制性肽、至少一种MHC-II类限制性肽，或者至少一种MHC-I类限制性肽和至少一种MHC-II类限制性肽。

6.权利要求1的组合物，其中所说的免疫效应细胞是成熟的树状细胞、B细胞、巨噬细胞或成纤维细胞。

7.权利要求1的组合物，其中所说的免疫效应细胞是成熟的树状细胞或B细胞。

8.权利要求1的组合物，其中所说的免疫效应细胞是成熟的树状细胞。

9.权利要求1的组合物，其中所说的抗原是肿瘤抗原。

10.权利要求9的组合物，其中所说的肿瘤抗原是肽。

11.权利要求9的组合物，其中所说的肿瘤抗原是TRP2。

12.权利要求9的组合物，其中所说的肿瘤抗原是表1，表2，表3，表4或表5中的一种抗原。

13.权利要求1的组合物，其中所说的穿细胞肽是CCP1。

14.权利要求1的组合物，其中所说的穿细胞肽与抗原的连接方式是共价键。

15.权利要求1的组合物，其中所说的抗原存在于所说的免疫效应细胞的囊泡内。

16.权利要求15的组合物，其中所说的囊泡是一种内含体。

17.一种包含免疫效应细胞和穿细胞肽的组合物，其中所说的穿细胞肽与抗体相连。

18.一种疫苗，该疫苗包含权利要求1的组合物以及制药上可接受的载体，并且所说的穿细胞肽与抗原相连。

19.权利要求18的疫苗，其中所说的免疫效应细胞是成熟的树状细胞、B细胞、巨噬细胞或成纤维细胞。

20.权利要求18的疫苗，其中所说的免疫效应细胞是成熟的树状细胞和B细胞。

21.权利要求18的疫苗，其中所说的免疫效应细胞是成熟的树状细胞。

22.权利要求21的疫苗在制备增强动物对疾病的免疫力的药物中的应用。

23.权利要求22的应用，其中所说的动物含有CD4+和CD8+T细胞两者。

24.权利要求22的应用，是将所说的疫苗制备成注射液。

25.权利要求24的应用，其中所说的注射液是适用于静脉注射、腹腔内注射或皮下注射。

26.权利要求22的应用，其中所说的动物是哺乳动物。

27.权利要求22的应用，其中所说的动物是人。

28.权利要求18的疫苗在制备增强动物对疾病的免疫力的药物中的应用。

29.权利要求18的疫苗在制备治疗动物疾病的药物中的应用。

30.权利要求29的应用，其中所说的免疫效应细胞是成熟的树状细胞、B细胞、巨噬细胞或成纤维细胞。

31.权利要求29的应用，其中所说的免疫效应细胞是成熟的树状细胞或B细胞。

32.权利要求29的应用，其中所说的免疫效应细胞是成熟的树状细胞。

33.权利要求29的应用，其中所说的穿细胞肽是CCP1、HIV tat、VP22、MTS或成纤维细胞生长因子。

34.权利要求29的应用，其中所说的穿细胞肽是CCP1。

35.权利要求29的应用，其中所说的疾病是肿瘤，其中所说的抗原是肿瘤抗原。

36.权利要求35的应用，其中所说的肿瘤抗原是TRP2。

37.权利要求35的应用，其中所说的肿瘤抗原是表1，表2，表3，表4或表5中的任一种抗原。

38.一种制备针对某种疾病之组合物的方法，该方法包括提供免疫效应细胞，提供与所说疾病抗原相连接的权利要求1所述的穿细胞肽，以及将与所说抗原相连接的穿细胞肽导入免疫效应细胞，其中所说的抗原进入细胞。

39.权利要求38的方法，其中所说的免疫效应细胞是成熟的树状细胞、B细胞、巨噬细胞或成纤维细胞。

40.权利要求38的方法，其中所说的免疫效应细胞是成熟的树状细胞。

41.权利要求38的方法，其中所说的抗原是肿瘤抗原、自身抗原或病毒抗原。

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