JP2023520508A - ＴＮＦαシグナル伝達は治療の標的とされ得る腫瘍促進性炎症の引き金を引く - Google Patents

ＴＮＦαシグナル伝達は治療の標的とされ得る腫瘍促進性炎症の引き金を引く Download PDF

Info

Publication number
JP2023520508A
JP2023520508A JP2022560191A JP2022560191A JP2023520508A JP 2023520508 A JP2023520508 A JP 2023520508A JP 2022560191 A JP2022560191 A JP 2022560191A JP 2022560191 A JP2022560191 A JP 2022560191A JP 2023520508 A JP2023520508 A JP 2023520508A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
tnf
monocytes
tnfα
cells
etanercept
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP2022560191A
Other languages
English (en)
Inventor
エス． メテリツァ、レオニド
トモロニス、ジュリー
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Baylor College of Medicine
Original Assignee
Baylor College of Medicine
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Baylor College of Medicine filed Critical Baylor College of Medicine
Publication of JP2023520508A publication Critical patent/JP2023520508A/ja
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/177—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • A61K38/1793—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2878—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the NGF-receptor/TNF-receptor superfamily, e.g. CD27, CD30, CD40, CD95
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/13—Amines
    • A61K31/135—Amines having aromatic rings, e.g. ketamine, nortriptyline
    • A61K31/137—Arylalkylamines, e.g. amphetamine, epinephrine, salbutamol, ephedrine or methadone
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/44—Non condensed pyridines; Hydrogenated derivatives thereof
    • A61K31/445—Non condensed piperidines, e.g. piperocaine
    • A61K31/4523—Non condensed piperidines, e.g. piperocaine containing further heterocyclic ring systems
    • A61K31/454—Non condensed piperidines, e.g. piperocaine containing further heterocyclic ring systems containing a five-membered ring with nitrogen as a ring hetero atom, e.g. pimozide, domperidone
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/3955—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against proteinaceous materials, e.g. enzymes, hormones, lymphokines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/525—Tumour necrosis factor [TNF]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
    • C07K16/241—Tumor Necrosis Factors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/54—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the route of administration
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/545—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the dose, timing or administration schedule
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/55—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the host/recipient, e.g. newborn with maternal antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70578—NGF-receptor/TNF-receptor superfamily, e.g. CD27, CD30, CD40, CD95
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding

Abstract

【課題】神経芽細胞腫を含む癌を処置するための組成物、キットおよび方法等を提供する。【解決手段】ＴＮＦＲ２を発現する神経芽腫細胞は、接触依存性のｍＴＮＦαシグナル伝達を介して単球を活性化し、単球によるｓＴＮＦαおよびＩＬ－６の産生をもたらし、それが神経芽腫細胞上のＴＮＦＲ１およびＩＬ－６Ｒに結合して、ＮＦ－κＢおよびＳｔａ３シグナル伝達経路を活性化して腫瘍成長を刺激する。成長する腫瘍は、さらに単球をリクルートし、腫瘍の成長を促進する自己増殖的な炎症を引き起こす。ＴＮＦ阻害剤は、このフィードフォワード信号増幅ループを終了させ、腫瘍の成長を阻害することができる。本開示の実施形態は、それを必要とする対象における神経芽腫の処置のためにＴＮＦ阻害剤を使用する方法を含む。また、本明細書では、癌を有する個体において腫瘍促進性炎症を低減するためにＴＮＦ阻害剤を使用する方法が開示される。【選択図】図１Ａ

Description

本願は、２０２０年４月３日出願の米国仮特許出願第６３／００５０１９号および２０２０年５月２日出願の米国仮特許出願第６３／０１９，２８９号に対する優先権を主張する。この両出願は、その全体が参照により本明細書中に援用される。
連邦支援の研究または開発に関する声明
本発明は、米国国立衛生研究所が授与したＣＡ１１６５４８の政府支援を受けて行われた。米国政府は、本発明における一定の権利を有する。
本開示の実施形態は、少なくとも細胞生物学、分子生物学、生理学、および癌医学を含む医学の分野に関する。
神経芽細胞腫（ＮＢ）は、低分化型で高悪性度の小児固形腫瘍であり、その高リスク症例の半数は、遺伝子変化が特定されていない。このような腫瘍は、予後不良を予測する炎症性遺伝子シグネチャーをもたらすＭ２様マクロファージによって浸潤されることが多いが、この腫瘍形成促進性炎症の開始機構は未定義のままである。そのため、神経芽細胞腫を含む癌に関連する腫瘍形成促進性炎症を阻害する方法に対するニーズが当該分野に存在する。本開示は、神経芽細胞腫を処置するための当該分野における長年にわたるニーズに対して解決策を提供する。
神経芽細胞腫（ＮＢ）は、神経堤を起源とする不均一な小児腫瘍である。神経芽細胞腫は、小児で２番目に一般的な固形腫瘍であり、全小児癌の死亡の１５％の原因となっている（１）。自然退縮から治療抵抗性への進行および死亡まで、この疾患がたどり得る経過の範囲に起因して、処置は依然として、重要な臨床上の難題である（２）。高リスクＮＢは、全診断の約半数を占め；高悪性度で、好ましくない組織像を呈するこれらの症例は、通常、転移性であり、処置が困難である（３）。手術、放射線照射、幹細胞移植を伴う高用量化学療法、レチノイン酸、および抗体ベースの免疫療法をはじめとした集中治療レジメンにもかかわらず、高リスク疾患を有する患者の長期生存率は５０％未満である（４）。
高リスクＮＢ腫瘍のおよそ半数は、ＭＹＣＮおよび／またはＡＬＫ癌遺伝子の増幅を特徴とする（５）。これらの遺伝子異常は、細胞周期の進行に関与する遺伝子の転写を活性化し、細胞分化を誘導する遺伝子を抑制することにより、高度に増殖性の脱分化型腫瘍をもたらす（６，７）。しかしながら、高リスクＮＢ腫瘍の残りの半数では、腫瘍進行の遺伝的ドライバーが明確に定義されていない。高リスクのＭＹＣＮ非増幅型ＮＢ腫瘍は、Ｍ２様腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）を含む免疫細胞によって浸潤されることが多い（８，９）。さらに、単球／ＴＡＭに関連する炎症性遺伝子シグネチャー（ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＩＬ６、ＩＬ６ＲおよびＴＧＦＢ１）をより高レベルで発現している腫瘍を有する患者は、このシグネチャーを有しない患者よりも５年無増悪生存率が悪かったことから、ＮＢの成長にとって好ましい腫瘍微小環境（ＴＭＥ）を促進するＴＡＭの役割が浮き彫りになった（９，１０）。
ＴＡＭは、多くのタイプの固形腫瘍におけるＴＭＥの主要な構成要素である。ＴＡＭは、腫瘍実質部内で血管外遊出および分化する、組織常在性マクロファージおよび／または骨髄由来単球を起源とする。ＮＢを含むほとんどの腫瘍タイプにおいて、ＴＡＭは、成長および転移を促進し、抗腫瘍免疫を阻害する（１１，１２）。ゆえに、ＴＡＭを標的とすることは、癌治療にとって魅力的なストラテジーであり得る（１３）。しかしながら、コロニー刺激因子１レセプター（ＣＳＦ１Ｒ）阻害剤およびモノクローナル抗体などの、ＴＡＭを標的とする試薬の初期の臨床試験は、単剤として癌患者においてわずかな治療活性しかもたらさなかった（１４－１６）。
ＴＡＭおよび／またはその腫瘍促進機能を効果的に中和するためには、ＴＡＭが腫瘍細胞と相互作用する機構を理解することが重要である。以前の研究では、ＮＢ細胞は、単球を刺激してＩＬ－６を産生させることが実証され、それがマウスにおけるＮＢの成長促進に部分的に関与していると示された（９）。しかしながら、ＮＢ細胞が単球／マクロファージと相互作用し、この腫瘍促進性炎症応答を惹起する機構は、不明なままである。
本開示のある特定の実施形態は、ＴＮＦαシグナル伝達によって引き金が引かれ、持続される、ＮＢ細胞と単球／マクロファージとの間の新規の炎症性フィードバックループを説明する。ある特定の実施形態は、ＮＢ細胞が、ＮＢ細胞表面上のＴＮＦＲ２と単球上の膜結合型ＴＮＦα（ｍＴＮＦα）との間の接触依存性の逆シグナル伝達相互作用を通じて単球を活性化することを実証する。この相互作用は、単球において下流のＮＦ－κＢシグナル伝達を開始させ得、ＩＬ－６、Ｇ－ＣＳＦ、ＩＬ－１および可溶性（ｓ）ＴＮＦαをはじめとした腫瘍形成促進性サイトカインの産生をもたらす。次いで、これらのサイトカインは、腫瘍成長および血管新生の増大をもたらすＮＢ細胞の増殖を刺激することによって、フィードバックループを完成させる。ある特定の実施形態では、この炎症促進性シグナル伝達ループは、ＴＮＦαを中和するＦｃ－ＴＮＦＲ２融合タンパク質である、ＦＤＡが承認したエタネルセプトによって完全に無効になり、インビトロおよびインビボにおいて単球／マクロファージ媒介性のＮＢ成長促進の逆転をもたらす。
本開示は、神経芽細胞腫を含む癌を処置するための組成物、キットおよび方法、ならびに神経芽細胞腫に関連する腫瘍促進性炎症を含む腫瘍促進性炎症を低減するための方法に関する。本明細書中に包含されるある特定の方法は、１つ以上の腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）阻害剤の使用を含む。いくつかの実施形態において、１つ以上のＴＮＦ阻害剤が、神経芽細胞腫を処置するために使用される。いくつかの実施形態において、１つ以上のＴＮＦ阻害剤が、腫瘍促進性炎症を低減するために使用される。
本明細書中に包含される任意の方法において使用されるＴＮＦ阻害剤は、当該分野で公知の任意のＴＮＦ阻害剤を含み得る。それらのＴＮＦ阻害剤は、ＴＮＦα（可溶性および／または膜結合型ＴＮＦαを含む）、ＴＮＦＲ１、ＴＮＦＲ２またはそれらの組み合わせを、任意の様式で、直接または間接的に阻害し得る、結合し得る、阻止し得る、かつ／または中和し得る。それらのＴＮＦ阻害剤は、少なくとも１つの小分子、免疫療法、細胞療法、ペプチド、ペプチド誘導体、抗体、融合タンパク質、糖タンパク質、核酸、核酸誘導体またはそれらの組み合わせを含み得る。それらのＴＮＦ阻害剤は、エタネルセプト、インフリキシマブ、セルトリズマブ、ゴリムマブ、アダリムマブまたはそれらの組み合わせを含み得る。
本明細書中に包含されるある特定の実施形態は、個体における腫瘍促進性炎症を低減するための方法に関する。いくつかの実施形態において、腫瘍促進性炎症を低減することにより、癌の成長が阻害されるか、腫瘍サイズが小さくなるか、腫瘍の悪性度が低下するか、血管新生が減少するか、化学療法に対して腫瘍が感作されるか、腫瘍に対するエフェクターリンパ球の有効性が高まるか、またはそれらの組み合わせがもたらされる。腫瘍促進性炎症は、ＩＬ－６および／またはＴＮＦα（可溶性および／または膜結合型ＴＮＦαを含む）ならびに他の炎症促進性サイトカイン、例えば、ＩＬ－１、ＩＬ－４、ＩＬ－８、ＩＬ－１０、ＩＬ－１３、ＩＬ－１７、ＩＬ－３３などの産生および／または発現の増加を含み得る。腫瘍促進性炎症は、ＮＦ－ｋＢシグナル伝達経路の活性化を介して部分的に媒介され得る。その活性は、ＩｋＢａタンパク質の発現レベルと逆相関する。ＩＬ－６、ＴＮＦαおよび／またはＩκＢαの増加または減少は、個体において確立されたベースライン、個体の非腫瘍性位置に見られる濃度、癌を有しない個体に見られる正常な濃度または当該分野で公知の他の正常な濃度を基準とし得る。
本明細書中に包含されるある特定の実施形態は、個体内または個体由来の細胞および／または細胞外液を１つ以上のＴＮＦ阻害剤と接触させることに関する。接触される細胞は、ＩＬ－６および／もしくはＴＮＦαを産生できるかまたはＴＮＦレセプターを発現できる任意の細胞を含む任意の細胞型、例えば、単球および／またはマクロファージであり得る。接触される細胞は、１つ以上のＴＮＦおよび／またはＩＬ－６レセプターを発現している任意の癌細胞を含む癌性の細胞、例えば、神経芽腫細胞であり得る。それらの細胞は、インビトロ、インビボおよび／またはエキソビボで接触され得る。細胞外液は、血液、血漿、血清、間質液、腫瘍間質液またはそれらの組み合わせなどの個体由来の任意の細胞外液を含み得る。細胞外液は、細胞を培養するために使用される培地を含む、細胞培養の流体を含み得る。
前述では、以下に続く詳細な説明をよりよく理解できるように、本開示の特徴および技術的利点をかなり広く概説した。本明細書の請求項の主題を成すさらなる特徴および利点を本明細書の以後で説明する。開示される概念および具体的な実施形態は、本構想の同じ目的を果たすために、他の構造を改変または設計するための基礎として容易に利用され得ることが当業者に認識されるだろう。そのような等価な構成は、添付の請求項に示されているような趣旨および範囲から逸脱しないことも、当業者に理解されるだろう。さらなる目的および利点とともに、構成と実施方法の両方に関して本明細書中に開示される構想に特有であると考えられる新規の特徴は、添付の図面と関連して考慮すると、以下の説明からよりよく理解されるだろう。しかしながら、それらの各図面は、例示目的および説明目的で提供されているに過ぎず、本開示の限度の定義として意図されていないことが明確に理解されるべきである。
本開示の理解をより完全なものにするために、添付の図面と併せて解釈される以下の説明について言及する。
図１Ａは、神経芽細胞腫（ＮＢ）が、接触およびＮＦ－κＢに依存する機構で単球のＩＬ－６産生を誘導することを示している。ＮＢ株の代表的なパネルと単離されたばかりの単球とを、４：１（ＮＢ：単球）の比で２４時間、直接共培養した。共培養上清を、ＥＬＩＳＡによってＩＬ－６レベルについて解析した。 図１Ｂは、神経芽細胞腫（ＮＢ）が、接触およびＮＦ－κＢに依存する機構で単球のＩＬ－６産生を誘導することを示している。２つの異なる単球ドナーを、コントロール培地中、５０％７日間ＮＢ条件培地中（０．２２μｍフィルター滅菌されたもの）、または４：１の比でＮＢと直接、２４時間培養し、サイトカインレベルをＩＬ－６ ＥＬＩＳＡによって測定した。左から右に向かって、バーは、５０％コントロール、５０％条件およびＮＢ共培養物である。 図１Ｃは、神経芽細胞腫（ＮＢ）が、接触およびＮＦ－κＢに依存する機構で単球のＩＬ－６産生を誘導することを示している。ＮＢ単球共培養物を、ＩＫＫ阻害剤ＶＩＩ、ＣＡＳ８７３２２５－４６－８（１２５ｎＭ）またはＶＥＨコントロール（０．１％ＤＭＳＯ）で２４時間処置し、ＩＬ－６レベルをＩＬ－６ ＥＬＩＳＡによって計測した。＊＊＊＊ｐ＜０．０００１；
図２Ａは、ＮＢが機能的なＴＮＦレセプター（ＴＮＦＲ）を発現することを示している。ＮＢ細胞株の代表的なパネルを、フローサイトメトリーによってＴＮＦＲ１およびＴＮＦＲ２の表面発現について解析した。 図２Ｂは、ＮＢが機能的なＴＮＦレセプター（ＴＮＦＲ）を発現することを示している。ＮＢ細胞株を組換えヒトＴＮＦα（ｒｈＴＮＦα）（１０ｎｇ／ｍＬ）で１２時間処置し、細胞内のＩκＢαレベルをＰｈｏｓＦｌｏｗフローサイトメトリーによって測定し、それらのそれぞれの無処置コントロール（１に設定した）に対して正規化した。 図２Ｃは、ＮＢが機能的なＴＮＦレセプター（ＴＮＦＲ）を発現することを示している。ＮＢ細胞株をヒト単球と２４時間培養し、細胞内フローサイトメトリー細胞内ＩκＢαレベルをＰｈｏｓＦｌｏｗフローサイトメトリーによって測定し、それらのそれぞれのＮＢのみコントロール（１に設定した）に対して正規化した。ＣＤ４５およびＧＤ２の表面染色を用いて、単球（ＣＤ４５＋，ＧＤ２－）およびＮＢ（ＣＤ４５－，ＧＤ２低－高）集団を区別した。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１；
図３Ａは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子編集を用いてＴＮＦＲ１およびＴＮＦＲ２を首尾よくノックアウトできることを示している。フレームシフト変異を作り出し、タンパク質合成を破壊するようにデザインされた、欠失のために標的化されたＴＮＦＲＳＦ１Ａ（ＴＮＦＲ１）およびＴＮＦＲＳＦ１Ｂ（ＴＮＦＲ２）のエキソンを示している概略図。 図３Ｂは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子編集を用いてＴＮＦＲ１およびＴＮＦＲ２を首尾よくノックアウトできることを示している。ＮＢ細胞株にｓｇＲＮＡ／Ｃａｓ９ ＲＮＰをエレクトロポレートし、ゲノムＤＮＡに対するＰＣＲを用いて編集の成功を検証した。それぞれＷＴならびに検証済みのホモ接合性およびヘテロ接合性のポジティブコントロールと比べた、欠失領域にわたるＰＣＲが示されている。ＩｍａｇｅＪにおけるバンドのデンシトメトリーを用いて、おおよその編集効率を推定した。 図３Ｃは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子編集を用いてＴＮＦＲ１およびＴＮＦＲ２を首尾よくノックアウトできることを示している。単一細胞クローンを、編集された細胞株から単離し、ホモ接合性のノックアウトをＰＣＲ、配列決定およびフローサイトメトリー（示されている）による表面発現の喪失によって確認した；
図４Ａは、ＮＢ ＴＮＦＲ２が単球の活性化に不可欠であることを示している。ＴＮＦＲ１ ＫＯ、ＴＮＦＲ２ ＫＯおよびＷＴ ＳＫ－ＮＢＥ２細胞株をヒト単球と２４時間培養した。ＧＤ２＋，ＣＤ４５－ＮＢ集団内のＩκＢαの細胞内発現を評価した。 図４Ｂは、ＮＢ ＴＮＦＲ２が単球の活性化に不可欠であることを示している。共培養上清からのＥＬＩＳＡによってＩＬ－６濃度を計測することによって、単球の活性化を評価した。＊＊ｐ＜０．０１；
図５Ａは、単球のｍＴＮＦａが単球の活性化に不可欠であることを実証している。ＮＢと単球との共培養物をＴＮＦ変換酵素阻害剤ＴＡＰＩ（４０μＭ）またはビヒクルコントロール（ＤＭＳＯ，０．２％）で２４時間処置した。ＣＤ４５＋，ＧＤ２－単球集団内のｍＴＦＮａの表面発現を、フローサイトメトリーを用いて行った。ＴＡＰＩは、ビヒクルおよびアイソタイプと比べて右にシフトしている。 図５Ｂは、単球のｍＴＮＦａが単球の活性化に不可欠であることを実証している。共培養上清内のＴＮＦａおよびＩＬ－６のレベルをＥＬＩＳＡによって測定した。 図５Ｃは、単球のｍＴＮＦａが単球の活性化に不可欠であることを実証している。ＣＤ４５＋，ＧＤ２－単球集団における細胞内ＩκＢα発現レベルをＰｈｏｓＦｌｏｗフローサイトメトリーによって測定した。単球のみは、＋ＮＢ＋ビヒクル（ＶＥＨ）および＋ＮＢ＋ＴＡＰＩおよびアイソタイプと比べて右にシフトしている。＊＊ｐ＜０．０１，＊＊＊＊ｐ＜０．０００１；
図６Ａは、研究グレードのＴＮＦ中和抗体が腫瘍促進性炎症を低減することを示している。５つのＮＢ細胞株のパネルを、ＴＮＦ抗体、ＴＮＦＲ１抗体、ＴＮＦＲ２抗体またはマウスＩｇＧ１アイソタイプコントロール抗体の存在下において２４時間、単離されたばかりの単球と共培養した。ＮＢ集団（ＣＤ４５－，ＣＤ５６＋）におけるＩκＢα発現レベルを細胞内ＰｈｏｓＦｌｏｗによって測定した。ＩκＢα ＭＦＩ値をアイソタイプコントロール（破線）に対して正規化し、５つすべての細胞株からの結果を平均した。 図６Ｂは、研究グレードのＴＮＦ中和抗体が腫瘍促進性炎症を低減することを示している。５つのＮＢ細胞株のパネルを、ＴＮＦ抗体、ＴＮＦＲ１抗体、ＴＮＦＲ２抗体またはマウスＩｇＧ１アイソタイプコントロール抗体の存在下において２４時間、単離されたばかりの単球と共培養した。ＣＤ４５＋，ＣＤ５６単球集団における、先に記載されたような、正規化されたＩκＢα発現。 図６Ｃは、研究グレードのＴＮＦ中和抗体が腫瘍促進性炎症を低減することを示している。５つのＮＢ細胞株のパネルを、ＴＮＦ抗体、ＴＮＦＲ１抗体、ＴＮＦＲ２抗体またはマウスＩｇＧ１アイソタイプコントロール抗体の存在下において２４時間、単離されたばかりの単球と共培養した。共培養上清をＥＬＩＳＡによってＩＬ－６レベルについて解析した。サイトカイン産生を、減少の大きさを評価するためにアイソタイプ処置条件に対して正規化し、５つの細胞株にわたってプールした。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１；棒グラフの表示値は、左から右に向かって、凡例の上から下に対応する；
図７Ａは、エタネルセプトがインビトロにおいて腫瘍促進性炎症を妨害することを示している。ＳＫ－Ｎ－ＡＳ細胞株を、単離されたばかりのヒト単球と共培養し、１０μｇ／ｍＬエタネルセプトまたは１０μｇ／ｍＬ ＩｇＧビヒクルコントロールで２４時間処置した。共培養上清中のＴＮＦａおよびＩＬ－６の濃度をＥＬＩＳＡによって測定した。 図７Ｂは、エタネルセプトがインビトロにおいて腫瘍促進性炎症を妨害することを示している。ＳＫ－Ｎ－ＡＳ細胞株を、単離されたばかりのヒト単球と共培養し、１０μｇ／ｍＬエタネルセプトまたは１０μｇ／ｍＬ ＩｇＧビヒクルコントロールで２４時間処置した。ＣＤ１４－ＧＤ２＋ＮＢ（ＳＫ－Ｎ－ＡＳ）集団内の細胞内ＩκＢαレベルをＰｈｏｓＦｌｏｗフローサイトメトリーによって測定した。薬物の効果の大きさを示すために、ＩκＢα ＭＦＩをＮＢ単独に対して正規化した。 図７Ｃは、エタネルセプトがインビトロにおいて腫瘍促進性炎症を妨害することを示している。ＳＫ－Ｎ－ＡＳ細胞株を、単離されたばかりのヒト単球と共培養し、１０μｇ／ｍＬエタネルセプトまたは１０μｇ／ｍＬ ＩｇＧビヒクルコントロールで２４時間処置した。単離されたばかりのＣＤ１４＋ＧＤ２－ヒト単球集団内の細胞内ＩκＢαレベルをＰｈｏｓＦｌｏｗフローサイトメトリーによって測定した。薬物の効果の大きさを示すために、ＩκＢα ＭＦＩをＮＢのみに対して正規化した。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１；
図８Ａは、エタネルセプトがインビトロにおいてＮＢの成長を低減することを実証している。ルシフェラーゼを発現しているＣＨＬＡ－２５５－ｌｕｃおよびＳＫ－ＮＡＳ－ｌｕｃを、１～１６，０００ｐｇ／ｍＬ ｒｈＴＮＦ中で４８時間培養し、それらの細胞の生存率をルミネセンスによって計測した。データを無処置コントロールに対して正規化し、ＴＮＦ濃度のＬｏｇ１０に対する％生存率としてグラフにした。 図８Ｂは、エタネルセプトがインビトロにおいてＮＢの成長を低減することを実証している。ＣＨＬＡ－２５５－ｌｕｃおよびＳＫ－Ｎ－ＡＳ－ｌｕｃを、１０μｇ／ｍＬエタネルセプトまたは１０μｇ／ｍＬ ＩｇＧビヒクルコントロールで処置された、単離されたばかりのヒト単球と７２時間培養した。ＮＢのルミネセンスを用いて、エタネルセプトによる処置後の細胞株の相対的生存率を評価した。＊ｐ＜０．０５、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１；
図９Ａは、エタネルセプト処置が、インビボにおいて単球誘導性の腫瘍成長を無くすことを示している。ルシフェラーゼ標識されたＮＢおよび単離されたばかりのヒト単球をマトリゲルに包埋し、８週齢の雌ＮＳＧマウスの右側腹部の皮下に注射した。腫瘍を週２回、１００μｇのエタネルセプトまたはビヒクルコントロール中のコントロールＩｇＧで処置した。ＩＶＩＳイメージングシステムを用いるルミネセンスイメージングを介して腫瘍成長を間接的に追跡した。 図９Ｂは、エタネルセプト処置が、インビボにおいて単球誘導性の腫瘍成長を無くすことを示している。ルシフェラーゼ標識されたＮＢおよび単離されたばかりのヒト単球をマトリゲルに包埋し、８週齢の雌ＮＳＧマウスの右側腹部の皮下に注射した。腫瘍を週２回、１００μｇのエタネルセプトまたはビヒクルコントロール中のコントロールＩｇＧで処置した。経時的な各群の平均腫瘍ルミネセンス。３週間後、マウスを屠殺し、腫瘍サイズを重量によって直接解析した。下の線が、ＮＢ＋単球＋ＦｃＴＮＦＲであり、上の線が、ＮＢ＋単球＋ＩｇＧである。 図９Ｃは、エタネルセプト処置が、インビボにおいて単球誘導性の腫瘍成長を無くすことを示している。ルシフェラーゼ標識されたＮＢおよび単離されたばかりのヒト単球をマトリゲルに包埋し、８週齢の雌ＮＳＧマウスの右側腹部の皮下に注射した。腫瘍を週２回、１００μｇのエタネルセプトまたはビヒクルコントロール中のコントロールＩｇＧで処置した。各群からの５つの腫瘍の代表的な画像。 図９Ｄは、エタネルセプト処置が、インビボにおいて単球誘導性の腫瘍成長を無くすことを示している。ルシフェラーゼ標識されたＮＢおよび単離されたばかりのヒト単球をマトリゲルに包埋し、８週齢の雌ＮＳＧマウスの右側腹部の皮下に注射した。腫瘍を週２回、１００μｇのエタネルセプトまたはビヒクルコントロール中のコントロールＩｇＧで処置した。重量（単位ｍｇ）のＬｏｇ１０変換後の群ごとの腫瘍の重量。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１；
図１０は、エタネルセプトが、腫瘍促進性炎症を無くすかつ／または妨害することにより、神経芽細胞腫の効果的な免疫療法が可能となることを示している。神経芽細胞腫によるＴＮＦＲ２発現は、単球上のｍＴＮＦａを介して逆シグナル伝達して、ＮＦ－κＢの下流の活性化をもたらす。単球におけるＮＦ－κＢの活性化は、ＮＢにおいて下流のＳＴＡＴ３を活性化するＩＬ－６ならびにＴＮＦＲ１を介してＮＢにおいてＮＦ－κＢを活性化するｓＴＮＦのような腫瘍促進性サイトカインの産生をもたらす。これらの機能は、一緒になって、ＮＢの生存および増殖の増大を促進する。エタネルセプトは、両方のＴＮＦアイソフォームを効果的に中和し、単球のＮＦ－κＢ活性化およびＩＬ－６産生を阻止して、腫瘍成長を低減する；
図１１Ａは、エタネルセプト処置が、インビボにおいて単球誘導性の腫瘍成長を無くすことを実証している。ルシフェラーゼ標識されたＮＢおよび単離されたばかりのヒト単球をマトリゲルに包埋し、８週齢の雌ＮＳＧマウスの右側腹部の皮下に注射した。腫瘍を週２回、１００μｇのエタネルセプトまたはビヒクルコントロール中のコントロールＩｇＧで処置した。ＩＶＩＳイメージングシステムを用いるルミネセンスイメージングを介して腫瘍成長を間接的に追跡した。 図１１Ｂは、エタネルセプト処置が、インビボにおいて単球誘導性の腫瘍成長を無くすことを実証している。ルシフェラーゼ標識されたＮＢおよび単離されたばかりのヒト単球をマトリゲルに包埋し、８週齢の雌ＮＳＧマウスの右側腹部の皮下に注射した。腫瘍を週２回、１００μｇのエタネルセプトまたはビヒクルコントロール中のコントロールＩｇＧで処置した。経時的な各群の平均腫瘍ルミネセンス。ＮＢ＋単球＋ＦｃＴＮＦＲが下の線であり、ＮＢ＋単球＋ＩｇＧが上の線である。 図１１Ｃは、エタネルセプト処置が、インビボにおいて単球誘導性の腫瘍成長を無くすことを実証している。ルシフェラーゼ標識されたＮＢおよび単離されたばかりのヒト単球をマトリゲルに包埋し、８週齢の雌ＮＳＧマウスの右側腹部の皮下に注射した。腫瘍を週２回、１００μｇのエタネルセプトまたはビヒクルコントロール中のコントロールＩｇＧで処置した。２５日目にマウスを屠殺し、腫瘍重量を直接計測した。＊＊＊ｐ＜０．００１；
図１２Ａは、ＮＢが、接触およびＮＦ－κＢに依存する機構で単球のＩＬ－６産生を誘導することを実証している。ＮＢ株の代表的なパネルと単離されたばかりの単球とを、４：１（ＮＢ：単球）の比で２４時間、直接共培養した。共培養上清をＥＬＩＳＡによってＩＬ－６レベルについて解析した。２つ組で行われた２つの独立した実験の代表の平均値±ＳＤ。Ａ＝ＭＹＣＮ増幅型、ＮＡ＝ＭＹＣＮ非増幅型。 図１２Ｂは、ＮＢが、接触およびＮＦ－κＢに依存する機構で単球のＩＬ－６産生を誘導することを実証している。２つの単球ドナーを、コントロール培地（ＣＴＲＬ）中、５０％７日間ＣＨＬＡ－２５５条件培地（ＣＭ）中、または４：１の比（＋ＮＢ）でＣＨＬＡ－２５５と直接、２４時間培養し、サイトカインレベルをＩＬ－６ ＥＬＩＳＡによって測定した。２つ組で行われた２つの独立した実験の代表の平均値±ＳＤ。バーは、左から右に向かって、ＣＴＲＬ、ＣＭおよび＋ＮＢである。 図１２Ｃは、ＮＢが、接触およびＮＦ－κＢに依存する機構で単球のＩＬ－６産生を誘導することを実証している。ＣＨＬＡ－２５５／単球共培養物をＩＫＫ阻害剤ＶＩＩ（ＩＫＫｉ，１２５ｎＭ）またはビヒクルコントロール（Ｖｅｈ．、０．１％ＤＭＳＯ）で２４時間処置し、ＩＬ－６レベルをＩＬ－６ ＥＬＩＳＡによって計測した。２つ組で行われた２つの独立した実験の代表の平均値±ＳＤ。 図１２Ｄは、ＮＢが、接触およびＮＦ－κＢに依存する機構で単球のＩＬ－６産生を誘導することを実証している。（図１２Ｃ）に示された共培養物中のＴＮＦαレベルをＴＮＦα ＥＬＩＳＡによって計測した。 図１２Ｅは、ＮＢが、接触およびＮＦ－κＢに依存する機構で単球のＩＬ－６産生を誘導することを実証している。５つのＮＢ細胞株を、１０μｇ／ｍＬ抗ＴＮＦα抗体またはアイソタイプコントロールで処置された単球と２４時間共培養した。ＩＬ－６レベルをＥＬＩＳＡによって計測し、アイソタイプ処置コントロールに対して正規化した。５つの細胞株の正規化されたＩＬ－６分泌の平均値±ＳＤ、２つ組で行われた２つの実験の代表。 図１２Ｆは、ＮＢが、接触およびＮＦ－κＢに依存する機構で単球のＩＬ－６産生を誘導することを実証している。ＣＤ４５＋ＧＤ２－単球集団における細胞内ＩκＢα発現レベルをＰｈｏｓＦｌｏｗフローサイトメトリーによって測定し、ＩκＢα ＭＦＩをアイソタイプ処置コントロールに対して正規化した。結果は、５つすべての細胞株で平均したもの±ＳＤであり、２つ組で行われた２つの実験の代表である。＊ｐ＜０．０５、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１；
図１３Ａは、単球ｍＴＮＦαが、単球の活性化にとって十分であることを実証している。ＣＨＬＡ－２５５および単球を、ＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍＬ）およびＧｏｌｇｉＳｔｏｐ（１．５μＬ／ｍＬ）の存在下において６時間単独で培養し、ＴＮＦαの細胞内の蓄積をフローサイトメトリーによって計測した。データは、２つ組で行われた２つの実験の代表からのデータである。 図１３Ｂは、単球ｍＴＮＦαが、単球の活性化にとって十分であることを実証している。ＷＴおよびＴＮＦα ＫＯ ＣＨＬＡ－２５５ ＮＢを、単球と２４時間共培養し、上清のＩＬ－６レベルをＩＬ－６ ＥＬＩＳＡによって計測した。６つの検証済みＫＯクローンの平均値±ＳＤ。 図１３Ｃは、単球ｍＴＮＦαが、単球の活性化にとって十分であることを実証している。ＮＢと単球との共培養物を、ＴＮＦ変換酵素阻害剤ＴＡＰＩ（４０μＭ）またはビヒクルコントロール（Ｖｅｈ．、０．２％ＤＭＳＯ）で２４時間処置した。ＣＤ４５＋ＧＤ２－単球集団内のｍＴＮＦαの表面発現を、フローサイトメトリーを用いて行った。ＭＦＩは示されているとおりである。データは、２つ組で行われた２つの実験の代表からのデータである。ＴＡＰＩピークは、ビヒクルおよびアイソタイプと比べて右にシフトしている。 図１３Ｄは、単球ｍＴＮＦαが、単球の活性化にとって十分であることを実証している。共培養上清内のＴＮＦαのレベルをＥＬＩＳＡによって測定した。２つ組で行われた３つの独立した実験からの、サイトカイン産生の倍率変化の平均値±ＳＤ。 図１３Ｅは、単球ｍＴＮＦαが、単球の活性化にとって十分であることを実証している。共培養上清内のＩＬ－６のレベルをＥＬＩＳＡによって測定した。２つ組で行われた３つの独立した実験からの、サイトカイン産生の倍率変化の平均値±ＳＤ。 図１３Ｆは、単球ｍＴＮＦαが、単球の活性化にとって十分であることを実証している。ＣＤ４５＋ＧＤ２－単球集団における細胞内ＩκＢα発現レベルをＰｈｏｓＦｌｏｗフローサイトメトリーによって測定した。データは、２つの独立した実験の代表である。＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１；
図１４Ａは、ＮＢのＴＮＦＲ２発現が単球の活性化に必要とされることを実証している。ＮＢ細胞株の代表的なパネルを、フローサイトメトリーによってＴＮＦＲ１およびＴＮＦＲ２の表面発現（黒線）について解析した。結果は、アイソタイプ（灰色のヒストグラム）からのゲーティング閾値とともに、ＴＮＦＲ陽性のパーセンテージとして示されている。データは、２つ組で行われた２つの実験の代表である。 図１４Ｂは、ＮＢのＴＮＦＲ２発現が単球の活性化に必要とされることを実証している。ＴＮＦＲＳＦ１Ａ ｍＲＮＡ（ＴＮＦＲ１）の発現をｑＲＴ－ＰＣＲによって評価した。ＴＮＦＲＳＦ１ＡのＣ（ｔ）値をＧＡＰＤＨハウスキーピング遺伝子に対して正規化した。２つ組で行われた平均値±ＳＤ。 図１４Ｃは、ＮＢのＴＮＦＲ２発現が単球の活性化に必要とされることを実証している。ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ ｍＲＮＡ（ＴＮＦＲ２）発現をｑＲＴ－ＰＣＲによって評価した。ＴＮＦＲＳＦ１ＢのＣ（ｔ）値をＧＡＰＤＨハウスキーピング遺伝子に対して正規化した。２つ組で行われた平均値±ＳＤ。 図１４Ｄは、ＮＢのＴＮＦＲ２発現が単球の活性化に必要とされることを実証している。ＷＴ、ＴＮＦＲ１およびＴＮＦＲ２ ＫＯ ＳＫ－Ｎ－ＢＥ（２）細胞を、２つの異なるドナーからのヒト単球と２４時間共培養した。上清のＩＬ－６レベルをＥＬＩＳＡによって測定した。単球バックグラウンドの、ＷＴ共培養物に対して正規化された平均ＩＬ－６産生±ＳＤ、２つ組で行われた２つの単球ドナーからの正規化されたデータ。 図１４Ｅは、ＮＢのＴＮＦＲ２発現が単球の活性化に必要とされることを実証している。ＷＴ、ＴＮＦＲ１およびＴＮＦＲ２ ＳＫ－Ｎ－ＢＥ（２）ＫＯクローンを、２つの異なるドナーからのヒト単球と２４時間共培養した。ＣＤ４５－ＧＤ２＋ＮＢ集団における細胞内ＩκＢα発現レベルをＰｈｏｓＦｌｏｗフローサイトメトリーによって測定し、ＩκＢα ＭＦＩをＮＢ単独コントロールに対して正規化した。正規化されたＩκＢα ＭＦＩの平均値±ＳＤ、２つ組で行われた２つの単球ドナーからの正規化されたデータ。＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１；
図１５Ａは、エタネルセプトがインビトロにおいて腫瘍形成促進性シグナル伝達を低減することを実証している。ＣＨＬＡ－２５５を、１０μｇ／ｍＬエタネルセプト（Ｅｔａｎ）またはビヒクルコントロール中のＩｇＧ（Ｃｔｒｌ）の存在下において、単離されたばかりのヒト単球と２４時間培養した。共培養上清内のＴＮＦαレベルをＴＮＦα ＥＬＩＳＡによって測定した。３つ組で行われた２つの単球ドナーからの代表的なデータのＴＮＦα濃度の平均値±ＳＤ。 図１５Ｂは、エタネルセプトがインビトロにおいて腫瘍形成促進性シグナル伝達を低減することを実証している。ＣＨＬＡ－２５５を、１０μｇ／ｍＬエタネルセプト（Ｅｔａｎ）またはビヒクルコントロール中のＩｇＧ（Ｃｔｒｌ）の存在下において、単離されたばかりのヒト単球と２４時間培養した。上清のＩＬ－６レベルをＥＬＩＳＡによって測定した。３つ組で行われた２つの単球ドナーからの代表的なデータのＩＬ－６濃度の平均値±ＳＤ。 図１５Ｃは、エタネルセプトがインビトロにおいて腫瘍形成促進性シグナル伝達を低減することを実証している。ＣＨＬＡ－２５５を、１０μｇ／ｍＬエタネルセプト（Ｅｔａｎ）またはビヒクルコントロール中のＩｇＧ（Ｃｔｒｌ）の存在下において、単離されたばかりのヒト単球と２４時間培養した。ＣＤ１４＋ＧＤ２－単球集団における細胞内ＩκＢα発現レベルをフローサイトメトリーによって測定し、ＩκＢα ＭＦＩを単球のみコントロールに対して正規化した。正規化されたＩκＢα ＭＦＩの平均値±ＳＤ、３つ組で行われた２つの単球ドナーを用いた実験からの代表。 図１５Ｄは、エタネルセプトがインビトロにおいて腫瘍形成促進性シグナル伝達を低減することを実証している。ＣＨＬＡ－２５５を、１０μｇ／ｍＬエタネルセプト（Ｅｔａｎ）またはビヒクルコントロール中のＩｇＧ（Ｃｔｒｌ）の存在下において、単離されたばかりのヒト単球と２４時間培養した。ＣＤ１４－ＧＤ２＋ＮＢ集団における細胞内ＩκＢα発現レベルをフローサイトメトリーによって測定し、ＩκＢα ＭＦＩをＮＢのみコントロールに対して正規化した。正規化されたＩκＢα ＭＦＩの平均値±ＳＤ、３つ組で行われた２つの単球ドナーを用いた実験からの代表。 図１５Ｅは、エタネルセプトがインビトロにおいて腫瘍形成促進性シグナル伝達を低減することを実証している。ＣＨＬＡ－２５５を、１０μｇ／ｍＬエタネルセプト（Ｅｔａｎ）またはビヒクルコントロール中のＩｇＧ（Ｃｔｒｌ）の存在下において、単離されたばかりのヒト単球と２４時間培養した。マルチプレックスＬｕｍｉｎｅｘサイトカインアッセイを共培養上清に対して行った。ヒートマップは、ｐｇ／ｍＬを単位とするサイトカイン濃度のｌｏｇ１０変換平均値を示している。赤色矢印は、２つの単球ドナーにわたって、共培養中で有意にアップレギュレートされ、エタネルセプト処置によって消失したサイトカインを示している。Ｌｕｍｉｎｅｘアッセイを、３つ組で行われた条件に対して２つ組で行った。適切な比較のためのＰ値が図２９に示されている。 図１５Ｆは、エタネルセプトがインビトロにおいて腫瘍形成促進性シグナル伝達を低減することを実証している。ＣＨＬＡ－２５５－ｌｕｃを、１０μｇ／ｍＬ ＥｔａｎまたはＣｔｒｌで処置された、単離されたばかりのヒト単球と７２時間培養した。ＮＢルミネセンスを用いて、細胞株の相対的生存率を評価した。結果は、正規化された平均ルミネセンス±ＳＤであり、１条件あたりｎ＝６の反復。 図１５Ｇは、エタネルセプトがインビトロにおいて腫瘍形成促進性シグナル伝達を低減することを実証している。ＣＨＬＡ－２５５に、ＣｅｌｌＴｒａｃｅ Ｖｉｏｌｅｔ（ＣＴＶ）を１０分間パルスし、次いで、１０μｇ／ｍＬ ＥｔａｎまたはＣｔｒｌの存在下において単球と４日間共培養した。ＣＴＶ染色を用いて、ＮＢ細胞分裂を測定した。複数回の（２＋）分裂を起こしている細胞を、総細胞数についてのパーセンテージとして定量し、ＮＢ（０）およびＣｔｒｌ（１）に対して正規化した。３つ組で行われた２つの単球ドナーからの代表的なデータの、複数回の分裂を起こしている細胞の正規化された平均パーセンテージ±ＳＤが示されている。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１；
図１６Ａは、エタネルセプト処置がＮＢ／単球異種マウスモデルにおいて腫瘍成長を阻害することを実証している。インビボ皮下異種移植モデル。ＣＨＬＡ－２５５－ｌｕｃおよび単離されたばかりのヒト単球をマトリゲルに包埋し、８週齢の雌ＮＳＧマウスの右側腹部の皮下に注射した。マウスに、５ｍｇ／ｋｇ（１００μｇ）エタネルセプト（Ｅｔａｎ）またはビヒクルコントロール中のＩｇＧ（Ｃｔｒｌ）を隔週でre、ｉ．ｐ．注射し、ＩＶＩＳイメージングシステムを用いるルミネセンスイメージングを介して腫瘍成長を間接的に追跡した。 図１６Ｂは、エタネルセプト処置がＮＢ／単球異種マウスモデルにおいて腫瘍成長を阻害することを実証している。放射輝度（光子／秒／ｃｍ２／ステラジアン）で計測された各マウス（ｎ＝１０／群）のルミネセンス読み出し情報。 図１６Ｃは、エタネルセプト処置がＮＢ／単球異種マウスモデルにおいて腫瘍成長を阻害することを実証している。（図１６Ｂ）の１腫瘍あたりの総ルミネセンスの経時的なグラフ表示。 図１６Ｄは、エタネルセプト処置がＮＢ／単球異種マウスモデルにおいて腫瘍成長を阻害することを実証している。経時的な平均腫瘍ルミネセンス、ボンフェローニの多重比較検定を用いる２元配置分散分析（ｎ＝１０／群）。上の線が、ＮＢ／Ｍｏｎ＋Ｃｔｒｌである。 図１６Ｅは、エタネルセプト処置がＮＢ／単球異種マウスモデルにおいて腫瘍成長を阻害することを実証している。２１日目に屠殺した後の各群の代表的な腫瘍。＊＊ｐ＜０．０１；
図１７Ａは、エタネルセプト処置がＮＢの腫瘍微小環境を変化させることを実証している。図１６のマウスから回収された腫瘍をＯＴＣ培地中で瞬間凍結し、薄切片にし、マウスＣＤ３１発現（赤色）およびＤＡＰＩ対比染色（青色）について染色した。示されている結果は、１群あたり５つの腫瘍で、１腫瘍あたり５つの視野（ＦＯＶ）からの代表的な画像である。スケールバー５０μｍ。 図１７Ｂは、エタネルセプト処置がＮＢの腫瘍微小環境を変化させることを実証している。四分位値±範囲を示している箱ひげ図による、１ＦＯＶあたりのＣＤ３１＋領域の総数（Ｃｔｒｌ ｎ＝１５，Ｅｔａｎ ｎ＝２５）。 図１７Ｃは、エタネルセプト処置がＮＢの腫瘍微小環境を変化させることを実証している。１ＦＯＶあたりの、定量された各ＣＤ３１＋面積のサイズ；１ＦＯＶあたりのＣＤ３１＋面積の中央値が示されており、箱ひげ図は四分位値±範囲を示している（Ｃｔｒｌ ｎ＝１５、Ｅｔａｎ ｎ＝２５）。 図１７Ｄは、エタネルセプト処置がＮＢの腫瘍微小環境を変化させることを実証している。１ＦＯＶあたりの各ＣＤ３１＋領域を横切る最長距離（最大Ｆｅｒｅｔ距離）；１ＦＯＶあたりの距離の中央値が示されており、箱ひげ図は四分位値±範囲を示している（Ｃｔｒｌ ｎ＝１５、Ｅｔａｎ ｎ＝２５）。 図１７Ｅは、エタネルセプト処置がＮＢの腫瘍微小環境を変化させることを実証している。真核生物ｍＲＮＡ－ｓｅｑを腫瘍サンプルに対して行い、ＸｅｎｏＦｉｌｔｅｒＲプログラムによってマウス転写物を解析から除外した。発現量の２倍差およびカットオフとしての調整後Ｐ値＜０．０５を用いて、差次的に制御された遺伝子を特定した。 図１７Ｆは、エタネルセプト処置がＮＢの腫瘍微小環境を変化させることを実証している。遺伝子セット濃縮解析（ＧＳＥＡ）は、Ｅｔａｎ処置によってダウンレギュレートされる経路を明らかにし、機能に基づいて分類した（差次的に制御された、Ｐ値＜０．０１の遺伝子が≧５の経路が示されている）；
図１８Ａは、ＭＹＣＮ非増幅型ＮＢ腫瘍においてＴＮＦαシグナル伝達経路が強化されていることを実証している。ステージＩＶ腫瘍のみのＫｏｃａｋ神経芽細胞腫データセット（ｎ＝２１１）を、ＭＹＣＮ増幅の有無に基づく差次的遺伝子発現解析に供した（Ａ＝増幅型、ＮＡ＝非増幅型）。差次的遺伝子発現を表しているＶｏｌｃａｎｏプロットに、示されている経路の遺伝子が赤色で重ねられている。ＮＡ腫瘍において差次的に発現された遺伝子が、破線の軸線の左であり、経路強化に対するＰ値が示されている。Ａ：ｎ＝６５、ＮＡ：ｎ＝１４６。 図１８Ｂは、ＭＹＣＮ非増幅型ＮＢ腫瘍においてＴＮＦαシグナル伝達経路が強化されていることを実証している。Ｓｅｅｇｅｒ ＭＹＣＮ非増幅型データセットを、１０サンプル／群という最小値に設定されたｐ－スキャン法を用いて、遺伝子発現に基づくカプラン・マイヤー生存解析に供した。ＴＮＦα（ＴＮＦ；ｈｉｇｈが上の線である）、ＴＮＦＲ１（ＴＮＦＲＳＦ１Ａ；ｌｏｗが上の線である）およびＴＮＦＲ２（ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ；ｌｏｗが上の線である）に対する無再発生存曲線が示されている。 図１８Ｃは、ＭＹＣＮ非増幅型ＮＢ腫瘍においてＴＮＦαシグナル伝達経路が強化されていることを実証している。ＳｅｅｇｅｒＭＹＣＮ非増幅型神経芽細胞腫データセットを、再発した患者（＊）または進行しなかった患者間の差次的遺伝子解析に供した。ＫＥＧＧ“ＴＮＦ＿Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ＿Ｐａｔｈｗａｙ”の教師なしクラスタリングが、差次的に発現された遺伝子のヒートマップとして表示されている；青色の四角が、進行と高度に相関する異なる遺伝子発現パターンを有する患者のクラスターを示している。無進行生存率との経路全体の関連Ｐ＝８．０×１０－３；
図１９Ａは、ＩＬ－６およびＴＮＦαのサイトカイン産生がカノニカルなＮＦ－κＢシグナル伝達によって制御されることを実証している。ＣＨＬＡ－２５５を、０～１０００ｎＭの範囲の濃度のＩＫＫ阻害剤ＶＩＩ（ＩＫＫｉ）の存在下においてヒト単球と共培養し、ＩＬ－６濃度をＩＬ－６ ＥＬＩＳＡによって測定した。２つ組で行われた平均ＩＬ－６レベル±ＳＤ。 図１９Ｂは、ＩＬ－６およびＴＮＦαのサイトカイン産生がカノニカルなＮＦ－κＢシグナル伝達によって制御されることを実証している。ｌｏｇ１０ ＩＫＫｉ（ｎＭ）に対してプロットされた正規化されたＩＬ－６レベル；非線形回帰（複数の傾き）をデータにあてはめて、ＩＬ－６放出のＩＣ５０を推定した。ＩＣ５０および曲線の適合度に対するＲ２が示されている。 図１９Ｃは、ＩＬ－６およびＴＮＦαのサイトカイン産生がカノニカルなＮＦ－κＢシグナル伝達によって制御されることを実証している。ＣＨＬＡ－２５５を、０～１０００ｎＭの範囲の濃度のＩＫＫ阻害剤ＶＩＩ（ＩＫＫｉ）の存在下においてヒト単球と共培養し、ＴＮＦαレベルをＴＮＦα ＥＬＩＳＡによって測定した。３つ組で行われた平均ＴＮＦレベル±ＳＤ。 図１９Ｄは、ＩＬ－６およびＴＮＦαのサイトカイン産生がカノニカルなＮＦ－κＢシグナル伝達によって制御されることを実証している。ｌｏｇ１０ ＩＫＫｉ（ｎＭ）に対してプロットされた正規化されたＴＮＦαレベル；非線形回帰（複数の傾き）をデータにあてはめて、ＴＮＦα放出のＩＣ５０を推定した。ＩＣ５０および曲線の適合度に対するＲ２が示されている；
図２０Ａは、ＴＮＦ ＫＯクローンの作製および検証を実証している。ＴＮＦ ｍＲＮＡ発現をｑＲＴ－ＰＣＲによって評価した。ＴＮＦ ｃＤＮＡのＣ（ｔ）値を、ＧＡＰＤＨハウスキーピング遺伝子、次いでＣＨＬＡ－２５５細胞株に対して正規化した。２つ組で行われた平均値±ＳＤ。 図２０Ｂは、ＴＮＦ ＫＯクローンの作製および検証を実証している。ＴＮＦ ｃＤＮＡが、ポジティブＵ９３７コントロールにおけるような５１０ｂｐ産物に対応する、図（２０Ａ）からのｑＲＴ－ＰＣＲ産物のゲル電気泳動（ＮＢ株における非特異的なバンドはおそらくｇＤＮＡの混入によるものである）。サンプルを、同じゲルであるが不連続なレーンにおいて泳動した。 図２０Ｃは、ＴＮＦ ＫＯクローンの作製および検証を実証している。機能喪失変異が予測される、第１のエキソンを標的化するＴＮＦに対するＫＯストラテジー。 図２０Ｄは、ＴＮＦ ＫＯクローンの作製および検証を実証している。Ｕ９３７におけるＴＮＦの編集の成功を示しているＰＣＲ；ＷＴ遺伝子座９５４ｂｐ、ＫＯ７２７ｂｐ。Ｌｏｇ２分子量ラダーも示されている。 図２０Ｅは、ＴＮＦ ＫＯクローンの作製および検証を実証している。Ｕ９３７溶解産物、ＣＲＩＳＰＲ編集済みバルク集団、および２つの代表的なＫＯクローンのＴＮＦα ＥＬＩＳＡ。すべてのサンプルを、ＰＭＡ（２０ｎｇ／ｍＬ）およびイオノマイシン（１μｇ／ｍＬ）で刺激して、ＴＮＦα産生を誘導した。 図２０Ｆは、ＴＮＦ ＫＯクローンの作製および検証を実証している。ＣＨＬＡ－２５５ ＮＢにおけるＴＮＦの編集の成功を示しているＰＣＲ；ＷＴ遺伝子座９５４ｂｐ、ＫＯ７２７ｂｐ。Ｌｏｇ２分子量ラダーも示されている。 図２０Ｇは、ＴＮＦ ＫＯクローンの作製および検証を実証している。上流および下流のｓｇＲＮＡ部位を基準としてＷＴとアラインメントされた、３つの代表的なＫＯクローンに対するＳａｎｇｅｒ配列決定；
図２１Ａは、ＮＢにおけるＴＮＦＲ１およびＴＮＦＲ２ ＫＯの作製を実証している。ＴＮＦＲＳＦ１Ａ（ＴＮＦＲ１）およびＴＮＦＲＳＦ１Ｂ（ＴＮＦＲ２）に対するＫＯストラテジー。両方の欠失がＮ末端の細胞外リガンド結合ドメインにおいて生じ、それはナンセンス変異と予測される。 図２１Ｂは、ＮＢにおけるＴＮＦＲ１およびＴＮＦＲ２ ＫＯの作製を実証している。未ソートのバルクのＳＫ－Ｎ－ＡＳ細胞集団におけるＴＮＦＲＳＦ１ＡおよびＴＮＦＲＳＦ１Ｂ遺伝子座の編集の成功を示しているＰＣＲ；ＷＴ ＴＮＦＲＳＦ１Ａ遺伝子座２３４９ｂｐ、ＫＯ１０８５ｂｐ。ＷＴ ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ遺伝子座１５４７ｂｐ、ＫＯ１０８６ｂｐ。Ｌｏｇ２分子ラダーも示されている。サンプルを、同じゲルであるが不連続なレーンにおいて泳動した。 図２１Ｃは、ＮＢにおけるＴＮＦＲ１およびＴＮＦＲ２ ＫＯの作製を実証している。ＴＮＦＲ１およびＴＮＦＲ２ ＫＯの単一クローンを、フローサイトメトリーによって、ＷＴ（赤色のヒストグラム）および適切なネガティブコントロール（灰色のヒストグラム）と比べて、レセプター表面発現について解析した（青色の線）。ＳＫ－Ｎ－ＢＥ（２）における４つの検証済みＫＯクローンからの代表的なデータ；
図２２Ａは、ＴＮＦＲ ＫＯがＮＢにおいて老化および／または分化を誘導することを実証している。ＣＲＩＳＰＲ編集の６週間後の代表的なＳＫ－Ｎ－ＡＳ ＷＴ、ＴＮＦＲ１およびＴＮＦＲ２ ＫＯを、Ｎｉｋｏｎ ＤＳ－Ｆｉ１／Ｅｌｅｍｅｎｔｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅを用いて２０×拡大率で撮像した。スケールバー２０μｍ。 図２２Ｂは、ＴＮＦＲ ＫＯがＮＢにおいて老化および／または分化を誘導することを実証している。ＷＴ、ＴＮＦＲ１ ＫＯおよびＴＮＦＲ２ ＫＯ ＳＫ－Ｎ－ＢＥ（２）細胞におけるニューロン特異的エノラーゼ（エノラーゼ－２、ＮＳＥ）およびハウスキーピングタンパク質ＧＡＰＤＨのウエスタンブロット。サンプルを、同じゲルであるが不連続なウェルにおいて泳動した。 図２２Ｃは、ＴＮＦＲ ＫＯがＮＢにおいて老化および／または分化を誘導することを実証している。ＩｍａｇｅＪ／ＦＩＪＩのゲルアナライザーを用い、ＷＴ ＳＫ－Ｎ－ＢＥ（２）に対して正規化された、ＧＡＰＤＨ発現を基準とするＮＳＥ発現の定量。２つの反復からの正規化された平均ＮＳＥ±ＳＤ。 図２２Ｄは、ＴＮＦＲ ＫＯがＮＢにおいて老化および／または分化を誘導することを実証している。ＷＴ、ＴＮＦＲ１ ＫＯおよびＴＮＦＲ２ ＫＯ ＳＫ－Ｎ－ＢＥ（２）細胞における成長関連タンパク質４３（ＧＡＰ４３）およびハウスキーピングタンパク質ＧＡＰＤＨのウエスタンブロット。サンプルを、同じゲルであるが不連続なウェルにおいて泳動した。 図２２Ｅは、ＴＮＦＲ ＫＯがＮＢにおいて老化および／または分化を誘導することを実証している。ＩｍａｇｅＪ／ＦＩＪＩのゲルアナライザーを用い、ＷＴ ＳＫ－Ｎ－ＢＥ（２）に対して正規化された、ＧＡＰＤＨ発現を基準とするＧＡＰ４３発現の定量。２つの反復からの正規化された平均ＧＡＰ４３±ＳＤ。＊ｐ＜０．０５；
図２３Ａは、ＮＢ ＮＦ－κＢがｓＴＮＦαによって活性化されることを実証している。ＮＢ細胞株を単球と２４時間共培養した。ＣＤ４５－ＧＤ２＋ＮＢ集団における細胞内ＩκＢα発現レベルをＰｈｏｓＦｌｏｗフローサイトメトリーによって測定し、ＩκＢα ＭＦＩをＮＢ単独コントロールに対して正規化した。２つ組で行われた培養物からの正規化された平均ＩκＢα ＭＦＩ±ＳＤ。 図２３Ｂは、ＮＢ ＮＦ－κＢがｓＴＮＦαによって活性化されることを実証している。ＮＢ細胞株を、５ｎｇ／ｍＬのＴＮＦα、ＩＬ－６、ＩＬ－６＋ｓＩＬ－６Ｒα、または３つすべての組み合わせと１２時間培養した。細胞内ＩκＢα発現レベルをＰｈｏｓＦｌｏｗフローサイトメトリーによって測定し、ＩκＢα ＭＦＩをＮＢ無処置（ＰＢＳ）コントロールに対して正規化した。２つ組で行われた培養物からの正規化された平均ＩκＢα ＭＦＩ±ＳＤ。 図２３Ｃは、ＮＢ ＮＦ－κＢがｓＴＮＦαによって活性化されることを実証している。ＮＢ細胞株を、ＴＡＰＩ（４０μＭ）またはＤＭＳＯビヒクルコントロール（Ｖｅｈ．）（０．２％）で処置された単球と２４時間共培養した。ＣＤ４５－ＧＤ２＋ＮＢ集団における細胞内ＩκＢα発現レベルをＰｈｏｓＦｌｏｗフローサイトメトリーによって測定し、ＩκＢα ＭＦＩをＮＢ単独コントロールに対して正規化した。２つ組で行われた共培養物からの正規化された平均ＩκＢα ＭＦＩ±ＳＤ。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１；
図２４Ａは、研究グレードのＴＮＦ中和抗体が腫瘍促進性炎症を低減することを実証している。５つのＮＢ細胞株を、ＴＮＦ抗体、ＴＮＦＲ１抗体、ＴＮＦＲ２抗体またはマウスＩｇＧ１アイソタイプコントロール抗体の存在下において、単離されたばかりの単球と２４時間共培養した。ＣＤ４５－ＧＤ２＋ＮＢ集団における細胞内ＩκＢα発現レベルをＰｈｏｓＦｌｏｗフローサイトメトリーによって測定し、ＩκＢα ＭＦＩをアイソタイプコントロールに対して正規化した。正規化された平均ＩκＢα、および全細胞株にわたる正規化された応答の平均値±ＳＤが示されている（右）。 図２４Ｂは、研究グレードのＴＮＦ中和抗体が腫瘍促進性炎症を低減することを実証している。５つのＮＢ細胞株を、ＴＮＦ抗体、ＴＮＦＲ１抗体、ＴＮＦＲ２抗体またはマウスＩｇＧ１アイソタイプコントロール抗体の存在下において、単離されたばかりの単球と２４時間共培養した。ＣＤ４５＋ＧＤ２－単球集団における細胞内ＩκＢα発現レベルをＰｈｏｓＦｌｏｗフローサイトメトリーによって測定し、ＩκＢα ＭＦＩをアイソタイプコントロールに対して正規化した。正規化された平均ＩκＢα、および全細胞株にわたる正規化された応答の平均値±ＳＤが示されている（右）。 図２４Ｃは、研究グレードのＴＮＦ中和抗体が腫瘍促進性炎症を低減することを実証している。５つのＮＢ細胞株を、ＴＮＦ抗体、ＴＮＦＲ１抗体、ＴＮＦＲ２抗体またはマウスＩｇＧ１アイソタイプコントロール抗体の存在下において、単離されたばかりの単球と２４時間共培養した。共培養上清をＥＬＩＳＡによってＩＬ－６レベルについて解析した。示されているデータは、平均ＩＬ－６、および全細胞株にわたる正規化された平均ＩＬ－６レベル±ＳＤである（右）。図２４のすべての画像において、グラフ内のバーは、左から右に向かって、上から下の重要な読み出し値と一致する。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１；
図２５Ａは、ＴＮＦαシグナル伝達が腫瘍形成促進性炎症を制御することを実証している。ＳＫ－Ｎ－ＡＳと単球との共培養物の上清に対して行われたＬｕｍｉｎｅｘパネル。 図２５Ｂは、ＴＮＦαシグナル伝達が腫瘍形成促進性炎症を制御することを実証している。ＳＫ－Ｎ－ＢＥ（２）と単球との共培養物の上清に対して行われたＬｕｍｉｎｅｘパネル。ヒートマップは、１条件あたりｎ＝３生物学的反復からの平均サイトカインレベルを表しており、ｐｇ／ｍＬを単位とする濃度のｌｏｇ１０として示されている。Ｅｔａｎ＝エタネルセプト、Ｃｔｒｌ＝ＩｇＧコントロール；
図２６Ａは、エタネルセプトがＮＢと単球との相互作用を阻止することを実証している。ＳＫ－Ｎ－ＡＳを、単離されたばかりのヒト単球と超低接着組織培養プレートにおいて培養し、エタネルセプト（Ｅｔａｎ，１０μｇ／ｍＬ）またはコントロールＩｇＧ（Ｃｔｒｌ，１０μｇ／ｍＬ）で２４時間処置した。培養物を、Ｎｉｋｏｎ ＤＳ－Ｆｉ１／Ｅｌｅｍｅｎｔｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅを用いて１０×拡大率で撮像した。スケールバー５０μｍ。 図２６Ｂは、エタネルセプトがＮＢと単球との相互作用を阻止することを実証している。ＣＨＬＡ－２５５を、１２ウェル組織培養プレートにおいて２５％コンフルエンスまで生育し、単離されたばかりのヒト単球で覆った。共培養物を、１０μｇ／ｍＬのエタネルセプト（Ｅｔａｎ）またはＩｇＧコントロール（Ｃｔｒｌ）で４日間処置した。非接着性細胞をＰＢＳで静かに洗浄した後、機械的解離を行って、接着性細胞をはずした。接着性ＣＤ１４＋単球を、３つ組で行われたサンプルからのＮＢを基準として定量した。＊＊＊＊ｐ＜０．０００１；
図２７Ａは、エタネルセプト処置がＳＫ－Ｎ－ＡＳ／単球異種マウスモデルにおいて腫瘍成長を低減することを実証している。ＳＫ－Ｎ－ＡＳ－ｌｕｃおよび単離されたばかりのヒト単球をマトリゲルに包埋し、８週齢の雌ＮＳＧマウスの右側腹部の皮下に注射した。マウスに５ｍｇ／ｋｇ（１００μｇ）のエタネルセプト（Ｅｔａｎ）またはビヒクルコントロール中のＩｇＧ（Ｃｔｒｌ）を週２回、ｉ．ｐ．注射し、ＩＶＩＳイメージングシステムを用いるルミネセンスイメージングを介して腫瘍成長を間接的に追跡した。放射輝度（光子／秒／ｃｍ２／ステラジアン）で計測された代表的なルミネセンス画像（Ｃｔｒｌ ｎ＝７，Ｅｔａｎ ｎ＝１３）。 図２７Ｂは、エタネルセプト処置がＳＫ－Ｎ－ＡＳ／単球異種マウスモデルにおいて腫瘍成長を低減することを実証している。（Ａ）の１腫瘍あたりの総ルミネセンスの経時的なグラフ表示。 図２７Ｃは、エタネルセプト処置がＳＫ－Ｎ－ＡＳ／単球異種マウスモデルにおいて腫瘍成長を低減することを実証している。経時的な平均腫瘍総ルミネセンス、ボンフェローニの多重比較検定を用いる２元配置分散分析（Ｃｔｒｌ ｎ＝７、Ｅｔａｎ ｎ＝１３）；ＮＢ／Ｍｏｎ＋Ｃｔｒｌの線が上の線である。 図２７Ｄは、エタネルセプト処置がＳＫ－Ｎ－ＡＳ／単球異種マウスモデルにおいて腫瘍成長を低減することを実証している。２１日目に屠殺した後の各群の代表的な腫瘍。＊ｐ＜０．０５；
図２８Ａは、エタネルセプト処置がマウスのＴＭＥを変化させることを実証している。真核生物ｍＲＮＡ－ｓｅｑを、腫瘍サンプルのマウス成分に対して行い、ヒト転写物を、ＸｅｎｏＦｉｌｔｅｒＲプログラムによる解析から除外した。発現量の２倍差およびカットオフとしての調整後Ｐ値＜０．０５を用いて、差次的に制御された遺伝子を特定した。 図２８Ｂは、エタネルセプト処置がマウスのＴＭＥを変化させることを実証している。過剰提示遺伝子セット濃縮解析（ＧＳＥＡ）は、ＩｇＧコントロール（Ｃｔｒｌ）と比べて、エタネルセプト（Ｅｔａｎ）処置によるマウスのＴＭＥ内で差次的に制御された経路を明らかにした。列挙されている経路はすべて、≧５つの濃縮遺伝子で重複しておらず、Ｐ＞０．０５である；
図２９は、単球のみコントロール（Ｍｏｎ．）を基準とした、エタネルセプト（Ｅｔａｎ）またはコントロールＩｇＧ（Ｃｔｒｌ）で処置された単球－ＣＨＬＡ－２５５共培養物の上清から得られたｌｕｍｉｎｅｘデータを示している。灰色の陰影は、両方のドナーにおいて共培養中にアップレギュレートされ、Ｅｔａｎ処置によって減少したサイトカインを指摘している。独立した列間でのチューキー補正された多重比較を用いる２元配置分散分析。１条件あたりｎ＝３生物学的反復、ｐ＜０．０５を有意とみなし、赤色の太字フォントによって示した。Ｅｔａｎ＝エタネルセプト、Ｃｔｒｌ＝ＩｇＧコントロール。
Ｉ. 定義
長年の特許法の慣例に従い、特許請求の範囲を含め、本明細書でｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇという単語と一緒に使用される場合、単語「ａ」及び「ａｎ」は、「１つ又は複数」を表す。本開示のいくつかの実施形態は、本開示の１つ以上の要素、方法ステップ、及び／又は方法から構成されてもよいし、本質的に構成されてもよい。本明細書に記載される任意の方法又は組成物は、本明細書に記載される任意の他の方法又は組成物に関して実施することができ、異なる実施形態が組み合わされてもよいことが企図される。
治療された対象に対する未治療の対象における任意の症状、遺伝子、タンパク質、及び／又はバイオマーカーの発現に言及する場合の用語「低減」、「阻害」、「減衰」、「抑制」、「減少」、「防止」及び文法的同等物（「低い」、「小さい」等を含む）又はその対義語（例えば、「増加」、「活性化」等」は、任意の医学的訓練を受けた人員によって臨床的に関連すると認識される任意の量だけ未治療対象における症状よりも治療対象における症状の量及び／又は大きさが低い（又は大きい）ことを意味している。一実施形態では、処置された対象における症状の量及び／又は大きさは、未処置の対象における症状の量及び／又は大きさと少なくとも１０％異なる、少なくとも２５％異なる、少なくとも５０％異なる、少なくとも７５％異なる、及び／又は少なくとも９０％異なる。
本明細書で使用する場合、用語「治療上有効な量」は、「有効量」、「治療上有効な用量」、及び／又は「有効量」と同義であり、それを必要としている個体において当業者が求めている生物学的、美容的又は臨床的反応を誘発する化合物の量を意味する。開示された方法の特定の用途のために投与されるべき適切な有効量は、本明細書に提供されるガイダンスを用いて、当業者によって決定され得る。例えば、有効量は、本明細書に記載されるように、インビトロ及びｉｎ ｖｉｖｏアッセイから外挿することができる。当業者は、治療の経過を通じて個体の状態を監視することができ、投与される本明細書に開示される化合物又は組成物の有効量をそれに応じて調整することができることを認識するであろう。
本明細書で使用する場合、用語「治療」、「処置」、又は「治療する」は、治療される個体又は細胞の自然経過を変更する試みにおける介入を指し、予防のため又は疾患又は状態の病理学的経過の間のいずれでも実施され得る。治療は、例えば、疾患の発生又は再発の防止、症状の緩和、及び疾患の直接的又は間接的な病理学的結果の減少、転移の防止、疾患の進行速度の低下、疾患状態の改善又は緩和、並びに寛解又は予後の改善を含む、様々な所望の結果の１以上を達成するために役立つことがある。
本明細書中で使用される用語「個体」は、いずれの個体でもあり得て、一般に、治療を必要とする個体のことを指す。個体は、ヒト、イヌ、ネコ、ウマ、ブタまたはげっ歯類などの哺乳動物であり得る。個体は、患者、例えば、がん及び／又は炎症に関係する疾患または病状を有するまたは有すると疑われるまたは有するリスクがある患者であり得る。がんに直接または間接的に関連する病状を有するまたは有すると疑われる個体の場合、その病状は、１つ以上のタイプであり得る。個体は、疾患を有する個体であってもよいし、疾患を有すると疑われる被験体であってもよい。個体は、無症候であり得る。個体は、いずれの性別であってもよい。
本明細書で使用する場合、用語「核酸」は、1つ以上の核酸塩基、ヌクレオチド、及び／又はヌクレオシドを含む1つ又は複数の分子を指す。本明細書に包含される核酸は、任意の長さであってよい。核酸は、例えば、DNA、RNA、PNA、またはそれらの組み合わせであり得る。核酸誘導体は、核酸骨格上（リン酸リンカーへの修飾および／またはヌクレオシド糖への修飾を含む）または核酸塩基への任意の化学修飾を有する1つまたは複数の核酸から構成され得る。
本明細書で使用される場合、用語「ペプチド」は、ポリペプチドを含む、1つ以上のアミノ酸を含む1つ以上の分子を指す。本明細書に包含されるペプチドは、任意の長さであってよい。本明細書に包含されるいくつかの実施形態において、用語「ペプチド」は、「タンパク質」、「プロテオグリカン」、「糖タンパク質」、「抗体」、「融合タンパク質」、及び／又は「シグナル伝達ペプチド」と同義であってよい。ペプチド誘導体は、任意の翻訳後修飾を含む任意の化学修飾を有する1つ以上のペプチドから構成され得る。いくつかの実施形態では、化学修飾は、（非限定的な例として）ジスルフィド結合、メチル化、ヒドロキシル化、リン酸化、アセチル化、アシル化、N-グリコシル化、O-グリコシル化、及び／又はO-GlcNacylationを含む。いくつかの実施形態では、ペプチドは、少なくとも1つの非天然アミノ酸を含んでいる。いくつかの実施形態では、ペプチドは、バックボーンに非ペプチド結合を含んでなる。
本明細書で使用する場合、「融合タンパク質」という用語は、タンパク質（またはペプチド）の少なくとも2つのドメインが別々の遺伝子によってコードされているタンパク質（またはペプチド）を指す。いくつかの実施形態では、同じ遺伝子からの、または相同遺伝子からの複数のドメインが存在する。遺伝子は、任意の種からであってよい。いくつかの実施形態では、遺伝子は、同じ種、例えば、ヒトからのものである。いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、同じmRNAから翻訳される。いくつかの実施形態では、融合タンパク質の部分（融合タンパク質のドメインなど）は、別々に翻訳され、翻訳後に連結される。いくつかの実施形態では、融合タンパク質のドメインは、1つ以上の化学修飾、例えば、1つ以上のジスルフィド橋によって連結される。
本明細書中で使用されるとき、用語「腫瘍促進性炎症」とは、腫瘍の進行、成長、転移および／または形質転換を促進する、任意のシグナル伝達事象、サイトカイン放出、サイトカイン、産生、サイトカイン結合および／または逆シグナル伝達のことを指す。腫瘍促進性炎症は、ＴＮＦαおよび／またはＩＬ－６の産生、放出および／または結合を含み得る。腫瘍促進性炎症は、ＮＦ－κＢシグナル伝達を活性化し得る、かつ／またはＩκＢαを減少させ得る。
概要
本開示は、ＴＮＦシグナル伝達に関係する病状を処置するための、方法、システム、組成物およびキットに関し、特に、ＴＮＦαまたはＴＮＦαシグナル伝達の下流のレベルおよび／または活性および／または分泌の減少は、個体にとって治療的に有効である。ＴＮＦａシグナル伝達は、ＴＮＦａ自体が阻害されたとき、および／またはＴＮＦａのレセプターが阻害されたとき、ＴＮＦα（分泌型または膜結合型）、ＩＬ－６を含む１つ以上の炎症分子のレベルが低下するように、かつ／またはＮＦｋＢ活性化が妨げられるように改変され得る。
ＩＩ．ＴＮＦ阻害剤
本開示の実施形態は、任意の種類のＴＮＦ阻害剤（その使用を含む）を包含する。用語「ＴＮＦ阻害剤」は、ＴＮＦαを阻害する１つ以上の阻害剤、およびまた、ＴＮＦαの任意のレセプターを阻害する１つ以上の阻害剤を包含する。具体的な実施形態において、ＴＮＦ阻害剤阻害剤、レセプターＴＮＦＲ１、レセプターＴＮＦＲ２またはその両方。その阻害剤による阻害は、ＴＮＦαおよび／またはＴＮＦαに対するレセプターとの直接の接触が理由であり得るか、またはその阻害剤による阻害は、ＴＮＦαまたはＴＮＦαレセプターではない別の実体との直接の接触による間接的な阻害が理由であり得る。
ＴＮＦαまたはＴＮＦαのレセプターに対する阻害剤は、任意の種類であってよい。具体的な実施形態において、その阻害剤は、小分子、免疫療法、細胞療法、ペプチド、ペプチド誘導体、抗体、融合タンパク質、糖タンパク質、核酸、核酸誘導体またはそれらの組み合わせである。特定の実施形態において、その阻害剤は、抗体を含み、その抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥなどの任意の免疫学的結合剤を含む任意の種類であってよい。その抗体は、抗原結合領域を有する任意の抗体様分子を含み得、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、単一ドメイン抗体（ＤＡＢ）、Ｆｖ、ｓｃＦｖ（一本鎖Ｆｖ）などの抗体フラグメントを含む。その抗体は、ポリクローナルであってもモノクローナルであってもよい。
ＴＮＦ阻害剤には、エタネルセプト、インフリキシマブ、セルトリズマブ、ゴリムマブ、アダリムマブ、サリドマイド、レナリドマイド、ポマリドマイド、キサンチン誘導体（例えば、ペントキシフィリン）、ブプロピオン、５－ＨＴ２Ａアゴニスト幻覚剤（例えば、（Ｒ）－ＤＯＩ、ＴＣＢ－２、ＬＳＤおよびＬＡ－ＳＳ－Ａｚを含む）またはそれらの組み合わせが含まれ得る。いくつかの特定の実施形態において、ＴＮＦ阻害剤は、エタネルセプトである。
エタネルセプトは、ヒトＩｇＧ１のＦｃドメインに融合された可溶型のｐ７５ＴＮＦレセプター（ＴＮＦＲ：Ｆｃ）である。商業的に入手可能なエタネルセプトは、ＥＮＢＲＥＬ（登録商標）（Ｉｍｍｕｎｅｘ Ｉｎｃ．，Ｔｈｏｕｓａｎｄ Ｏａｋｓ，ＣＡ）として知られている。エタネルセプトは、組換えＤＮＡ技術によってチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）哺乳動物細胞発現系において生成される。エタネルセプトは、９３４アミノ酸からなり、およそ１５０キロダルトンという見かけの分子量を有する（Ｐｈｙｓｉｃｉａｎ’ｓ Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ，２００２，Ｍｅｄｉｃａｌ Ｅｃｏｎｏｍｉｃｓ Ｃｏｍｐａｎｙ Ｉｎｃ．）。ＣＨＯ細胞において発現される全長配列を、下記に配列番号２７として示す。しかしながら、この配列の軽微な改変および欠失（最大１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０％またはそれ以上）が可能であり得、それが本開示の方法および組成物の範囲内で使用され得ることが理解されるべきである。

1 Leu‐Pro‐Ala‐Gln‐Val‐Ala‐Phe‐Thr‐Pro‐Tyr‐
11 Ala‐Pro‐Glu‐Pro‐Gly‐Ser‐Thr‐Cys‐Arg‐Leu‐
21 Arg‐Glu‐Tyr‐Tyr‐Asp‐Gln‐Thr‐Ala‐Gln‐Met‐
31 Cys‐Cys‐Ser‐Lys‐Cys‐Ser‐Pro‐Gly‐Gln‐His‐
41 Ala‐Lys‐Val‐Phe‐Cys‐Thr‐Lys‐Thr‐Ser‐Asp‐
51 Thr‐Val‐Cys‐Asp‐Ser‐Cys‐Glu‐Asp‐Ser‐Thr‐
61 Tyr‐Thr‐Gln‐Leu‐Trp‐Asn‐Trp‐Val‐Pro‐Glu‐
71 Cys‐Leu‐Ser‐Cys‐Gly‐Ser‐Arg‐Cys‐Ser‐Ser‐
81 Asp‐Gln‐Val‐Glu‐Thr‐Gln‐Ala‐Cys‐Thr‐Arg‐
91 Glu‐Gln‐Asn‐Arg‐Ile‐Cys‐Thr‐Cys‐Arg‐Pro‐
101 Gly‐Trp‐Tyr‐Cys‐Ala‐Leu‐Ser‐Lys‐GlnGlu‐
111 Gly‐Cys‐Arg‐Leu‐Cys‐Ala‐Pro‐Leu‐Arg‐Lys‐
121 Cys‐Arg‐Pro‐Gly‐Phe‐Gly‐Val‐Ala‐Arg‐Pro‐
131 Gly‐Thr‐Glu‐Thr‐Ser‐Asp‐Val‐Val‐CysLys‐
141 Pro‐Cys‐Ala‐Pro‐Gly‐Thr‐Phe‐Ser‐Asn‐Thr‐
151 Thr‐Ser‐Ser‐Thr‐Asp‐Ile‐Cys‐Arg‐ProHis‐
161 Gln‐Ile‐Cys‐Asn‐Val‐Val‐Ala‐Ile‐Pro‐Gly‐
171 Asn‐Ala‐Ser‐Met‐Asp‐Ala‐Val‐Cys‐Thr‐Ser‐
181 Thr‐Ser‐Pro‐Thr‐Arg‐Ser‐Met‐Ala‐Pro‐Gly‐
191 Ala‐Val‐His‐Leu‐Pro‐Gln‐Pro‐Val‐SerThr‐
201 Arg‐Ser‐Gln‐His‐Thr‐Gln‐Pro‐Thr‐Pro‐Glu‐
211 Pro‐Ser‐Thr‐Ala‐Pro‐Ser‐Thr‐Ser‐Phe‐Leu‐
221 Leu‐Pro‐Met‐Gly‐Pro‐Ser‐Pro‐Pro‐Ala‐Glu‐
231 Gly‐Ser‐Thr‐Gly‐Asp‐Glu‐Pro‐Lys‐Ser‐Cys‐
241 Asp‐Lys‐Thr‐His‐Thr‐Cys‐Pro‐Pro‐Cys‐Pro‐
251 Ala‐Pro‐Glu‐Leu‐Leu‐Gly‐Gly‐Pro‐Ser‐Val‐
261 Phe‐Leu‐Phe‐Pro‐Pro‐Lys‐Pro‐Lys‐Asp‐Thr‐
271 Leu‐Met‐Ile‐Ser‐Arg‐Thr‐Pro‐Glu‐Val‐Thr‐
281 Cys‐Val‐Val‐Val‐Asp‐Val‐Ser‐His‐Glu‐Asp‐
291 Pro‐Glu‐Val‐Lys‐Phe‐Asn‐Trp‐Tyr‐Val‐Asp‐
301 Gly‐Val‐Glu‐Val‐His‐Asn‐Ala‐Lys‐Thr‐Lys‐
311 Pro‐Arg‐Glu‐Glu‐Gln‐Tyr‐Asn‐Ser‐Thr‐Tyr‐
321 Arg‐Val‐Val‐Ser‐Val‐Leu‐Thr‐Val‐Leu‐His‐
331 Gln‐Asp‐Trp‐Leu‐Asn‐Gly‐Lys‐Glu‐Tyr‐Lys‐
341 Cys‐Lys‐Val‐Ser‐Asn‐Lys‐Ala‐Leu‐Pro‐Ala‐
351 Pro‐Ile‐Glu‐Lys‐Thr‐Ile‐Ser‐Lys‐Ala‐Lys‐
361 Gly‐Gln‐Pro‐Arg‐Glu‐Pro‐Gln‐Val‐Tyr‐Thr‐
371 Leu‐Pro‐Pro‐Ser‐Arg‐Glu‐Glu‐Met‐Thr‐Lys‐
381 Asn‐Gln‐Val‐Ser‐Leu‐Thr‐Cys‐Leu‐Val‐Lys‐
391 Gly‐Phe‐Tyr‐Pro‐Ser‐Asp‐Ile‐Ala‐Val‐Glu‐
401 Trp‐Glu‐Ser‐Asn‐Gly‐Gln‐Pro‐Glu‐Asn‐Asn‐
411 Tyr‐Lys‐Thr‐Thr‐Pro‐Pro‐Val‐Leu‐Asp‐Ser‐
421 Asp‐Gly‐Ser‐Phe‐Phe‐Leu‐Tyr‐Ser‐Lys‐Leu‐
431 Thr‐Val‐Asp‐Lys‐Ser‐Arg‐Trp‐Gln‐Gln‐Gly‐
441 Asn‐Val‐Phe‐Ser‐Cys‐Ser‐Val‐Met‐His‐Glu‐
451 Ala‐Leu‐His‐Asn‐His‐Tyr‐Thr‐Gln‐Lys‐Ser‐
461 Leu‐Ser‐Leu‐Ser‐Pro‐Gly‐Lys
ＴＮＦ阻害剤の組み合わせが使用される場合、その組み合わせは、任意の好適な種類であってよい。組み合わせにおけるＴＮＦ阻害剤の比は、少なくとも１：１、１：２、１：５、１：１０、１：２５、１：５０、１：１００、１：１０００などを含む任意の好適な種類であってよい。３つのＴＮＦ阻害剤が使用される場合、その比は、例として、１：１：１、１：２：１、１：１：２、１：２：２、１：５：１、１：１：５、１：５：５、１：１０：１、１：１：１０、１：１０：１０、１：５０：１、１：１：５０、１：５０：５０、１：１００：１、１：１：１００、１：１００：１００、１：１０００：１、１：１：１０００、１：１０００：１０００などであり得る。いくつかの組み合わせにおいて、ＴＮＦαに対する阻害剤は、ＴＮＦαレセプターの阻害剤と組み合わせて使用される。
ＴＮＦ阻害剤は、薬学的に許容され得るキャリアに溶解または分散された有効量のＴＮＦ阻害剤を含む薬学的組成物に含められ得る。句「薬学的にまたは薬理学的に許容され得る」とは、例えばヒトなどの動物に適宜投与されたとき、有害反応、アレルギー反応または他の不都合な反応をもたらさない分子実体および組成物のことを指す。少なくとも１つのＴＮＦ阻害剤を含む薬学的組成物の調製は、本開示に照らせば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，２１ｓｔ Ｅｄ．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ａｎｄ Ｗｉｌｋｉｎｓ，２００５（参照により本明細書中に援用される）によって例証されているように、当業者に公知である。さらに、動物（例えば、ヒト）への投与の場合、調製物は、ＦＤＡ Ｏｆｆｉｃｅ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｔａｎｄａｒｄｓが要求する無菌性、発熱性、一般的な安全性および純度の規格を満たすべきであることが理解される。
本明細書中で使用されるとき、「薬学的に許容され得るキャリア」は、当業者に公知であり得るような、任意のおよびすべての溶媒、分散媒、コーティング、界面活性剤、酸化防止剤、保存剤（例えば、抗菌剤、抗真菌剤）、等張剤、吸収遅延剤、塩、保存剤、薬物、薬物安定剤、ゲル、結合剤、賦形剤、崩壊剤、潤滑剤、甘味剤、香味剤、色素、そのような同様の材料ならびにそれらの組み合わせを含む（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ Ｅｄ．Ｍａｃｋ Ｐｒｉｎｔｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９０，ｐｐ．１２８９－１３２９（参照により本明細書中に援用される）を参照のこと）。任意の従来のキャリアが、活性成分と不適合である場合を除き、薬学的組成物におけるその使用が企図される。
ＴＮＦ阻害剤は、それが固体として投与されるのか、液体またはエアロゾルの形態で投与されるのか、および注射のような投与経路のために滅菌される必要があるのかに応じて、種々のタイプのキャリアを含み得る。本開示の組成物は、静脈内に、皮内に、経皮的に、髄腔内に、動脈内に、腹腔内に、鼻腔内に、膣内に、直腸内に、局所的に（ｔｏｐｉｃａｌｌｙ）、筋肉内に、皮下に、粘膜に、経口的に、局所的に（ｔｏｐｉｃａｌｌｙ）、局所的に（ｌｏｃａｌｌｙ）、吸入（例えば、エアロゾル吸入）、注射、注入、持続注入、標的細胞を直接浸漬する局所灌流、カテーテルを介して、洗浄を介して、クリームとして、脂質組成物（例えば、リポソーム）として、または当業者に公知であり得るような他の方法もしくは前述のものの任意の組み合わせで投与され得る（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ Ｅｄ．Ｍａｃｋ Ｐｒｉｎｔｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９０（参照により本明細書中に援用される）を参照のこと）。
ＴＮＦ阻害剤は、遊離塩基、中性または塩の形態の組成物に製剤化され得る。薬学的に許容され得る塩には、酸付加塩、例えば、タンパク質性組成物の遊離アミノ基と形成される塩、または無機酸（例えば、塩酸またはリン酸）もしくは有機酸（例えば、酢酸、シュウ酸、酒石酸またはマンデル酸）と形成される塩が含まれる。遊離カルボキシル基と形成される塩は、無機塩基、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウムまたは水酸化第二鉄；または有機塩基、例えば、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジンまたはプロカインから得ることもできる。製剤化されたら、溶液は、投与製剤に適合した様式および治療的に有効であるような量で投与される。それらの製剤は、非経口投与用に製剤化されたもの、例えば、注射可能な溶液、または肺への送達用のエアロゾル、または薬物放出カプセルなどの消化性（ａｌｉｍｅｎｔａｒｙ）投与用に製剤化されたものなど、種々の剤形で容易に投与される。
さらに本開示によると、投与に適した組成物は、不活性な希釈剤ありまたはなしで、薬学的に許容され得るキャリア中に提供される。そのキャリアは、同化可能であるべきであり、液体、半固体、すなわちペースト、または固体のキャリアを含む。任意の従来の媒質、作用物質、希釈剤またはキャリアが、レシピエント、またはそれらに含められる組成物の治療有効性にとって有害である場合を除き、本発明の方法の実施において使用するための投与可能な組成物におけるその使用は、適切である。キャリアまたは希釈剤の例としては、脂肪、油、水、生理食塩水、脂質、リポソーム、樹脂、結合剤、充填剤など、またはそれらの組み合わせが挙げられる。その組成物は、１つ以上の構成要素の酸化を遅らせる様々な酸化防止剤も含み得る。さらに、微生物の作用の防止が、パラベン（例えば、メチルパラベン、プロピルパラベン）、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールまたはそれらの組み合わせを含むがこれらに限定されない様々な抗菌剤および抗真菌剤などの保存剤によってもたらされ得る。
本開示によると、上記組成物は、任意の好都合かつ実用的な様式で、すなわち、溶解、懸濁、乳化、混合、被包、吸収などによって、キャリアと組み合わされる。そのような手順は、当業者にとって日常的な手順である。
本開示の具体的な実施形態において、上記組成物は、半固体または固体のキャリアと合わされるか、またはそれらとしっかり混合される。その混合は、粉砕などの任意の好都合な様式で行うことができる。胃での治療活性の喪失、すなわち変性から組成物を守るために、混合プロセスに安定化剤も加えることができる。組成物において使用するための安定剤の例としては、緩衝剤、アミノ酸、例えば、グリシンおよびリジン、炭水化物、例えば、デキストロース、マンノース、ガラクトース、フルクトース、ラクトース、スクロース、マルトース、ソルビトール、マンニトールなどが挙げられる。
さらなる実施形態において、本開示は、ＴＮＦ阻害剤、１つ以上の脂質および水性溶媒を含む薬学的脂質ビヒクル組成物の使用に関することがある。本明細書中で使用されるとき、用語「脂質」は、水に不溶性であり、かつ有機溶媒で抽出可能であることを特徴とする広範な物質のいずれかを含むように定義される。この広範なクラスの化合物は、当業者に周知であり、用語「脂質」が本明細書中で使用されるとき、それは、任意の特定の構造に限定されない。例としては、長鎖脂肪族炭化水素およびそれらの誘導体を含む化合物が挙げられる。脂質は、天然に存在するものであっても、合成のもの（すなわち、人間によってデザインまたは生成されたもの）であってもよい。しかしながら、脂質は、通常、生物学的物質である。生物学的脂質は、当該分野で周知であり、それらとしては、例えば、中性脂肪、リン脂質、ホスホグリセリド、ステロイド、テルペン、リゾ脂質（ｌｙｓｏｌｉｐｉｄｓ）、グリコスフィンゴリピド、糖脂質、スルファチド、エーテル結合型およびエステル結合型の脂肪酸を含む脂質、および重合可能な脂質、ならびにそれらの組み合わせが挙げられる。当然のことながら、当業者が脂質と理解する、本明細書中に明確に記載される化合物以外の化合物も、本発明の組成物および方法に包含される。
当業者であれば、組成物を脂質ビヒクルに分散させるために使用され得る手法の範囲に精通しているだろう。例えば、ＴＮＦ阻害剤は、脂質を含む溶液に分散され得るか、脂質で溶解され得るか、脂質で乳化され得るか、脂質と混合され得るか、脂質と合わされ得るか、脂質に共有結合的に結合され得るか、懸濁液として脂質に含められ得るか、ミセルもしくはリポソームに含められ得るまたはミセルもしくはリポソームと複合体化され得るか、あるいは当業者に公知の任意の手段によって脂質または脂質構造と会合され得る。分散は、リポソームの形成をもたらすこともあるし、もたらさないこともある。
動物患者に投与される本開示の組成物の実際の投与量は、身体的および生理学的な因子、例えば、体重、状態の重症度、処置される疾患のタイプ、以前に行われたまたは同時に行われる治療的介入、患者の特症性、ならびに投与経路によって決定され得る。投与量および投与経路に応じて、好ましい投与量および／または有効量の投与の回数は、被験体の応答に従って変動し得る。いずれにしても、投与の責任者が、組成物中の活性成分の濃度および個々の被験体に適切な用量を決定する。
ある特定の実施形態において、薬学的組成物は、例えば、少なくとも約０．１％の活性な化合物を含み得る。他の実施形態において、活性な化合物は、その単位の重量の約２％～約７５％、または例えば約２５％～約６０％、およびこれらの中で導き出せる任意の範囲を構成し得る。当然ながら、治療的に有用な各組成物中の活性な化合物の量は、その化合物の任意の所与の単位用量において好適な投与量が得られるように調製され得る。溶解度、バイオアベイラビリティ、生物学的半減期、投与経路、生成物の有効期間、ならびに他の薬理学的に考慮すべき事柄などの因子が、そのような薬学的製剤を調製する当業者によって企図されるだろう。したがって、種々の投与量および処置レジメンが望ましい場合がある。
他の非限定的な例において、用量は、１投与あたり約１マイクログラム／ｋｇ／体重、約５マイクログラム／ｋｇ／体重、約１０マイクログラム／ｋｇ／体重、約５０マイクログラム／ｋｇ／体重、約１００マイクログラム／ｋｇ／体重、約２００マイクログラム／ｋｇ／体重、約３５０マイクログラム／ｋｇ／体重、約５００マイクログラム／ｋｇ／体重、約１ミリグラム／ｋｇ／体重、約５ミリグラム／ｋｇ／体重、約１０ミリグラム／ｋｇ／体重、約５０ミリグラム／ｋｇ／体重、約１００ミリグラム／ｋｇ／体重、約２００ミリグラム／ｋｇ／体重、約３５０ミリグラム／ｋｇ／体重、約５００ミリグラム／ｋｇ／体重～約１０００ｍｇ／ｋｇ／体重またはそれ以上、およびこれらの中で導き出せる任意の範囲も含み得る。本明細書中に列挙される数字から導き出せる範囲の非限定的な例では、上に記載された数字に基づいて、約５ｍｇ／ｋｇ／体重～約１００ｍｇ／ｋｇ／体重、約５マイクログラム／ｋｇ／体重～約５００ミリグラム／ｋｇ／体重などの範囲が、投与され得る。
Ａ．消化性組成物および製剤
本開示の特定の実施形態において、ＴＮＦ阻害剤は、消化性経路を介して投与されるように製剤化される。消化性経路には、組成物が消化管と直接接触するすべての可能な投与経路が含まれる。詳細には、本明細書中に開示される薬学的組成物は、経口的に、頬側に、直腸に、または舌下に投与され得る。したがって、これらの組成物は、不活性な希釈剤または同化可能な可食キャリアを用いて製剤化され得るか、または硬シェルもしくは軟シェルのゼラチンカプセルに封入され得るか、または錠剤に圧縮され得るか、または食事の食品に直接組み込まれ得る。
ある特定の実施形態において、活性な化合物は、賦形剤とともに組み込まれ得、経口摂取可能な錠剤、バッカル表、トローチ剤、カプセル剤、エリキシル剤、懸濁剤、シロップ剤、オブラート剤などの形態で使用され得る（Ｍａｔｈｉｏｗｉｔｚ ｅｔ ａｌ．，１９９７；Ｈｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９８；米国特許第５，６４１，５１５号；同第５，５８０，５７９号および同第５，７９２，４５１号（各々の全体が参照により明確に本明細書中に援用される））。錠剤、トローチ剤、丸剤、カプセル剤などは、以下も含み得る：結合剤、例えば、トラガカントゴム、アカシア、コーンスターチ、ゼラチンまたはそれらの組み合わせ；賦形剤、例えば、リン酸二カルシウム、マンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムまたはそれらの組み合わせ；崩壊剤、例えば、コーンスターチ、ジャガイモデンプン、アルギン酸またはそれらの組み合わせ；潤滑剤、例えば、ステアリン酸マグネシウム；甘味剤、例えば、スクロース、ラクトース、サッカリンまたはそれらの組み合わせ；香味剤、例えば ペパーミント、ウインターグリーン油、サクランボ香味料、オレンジ香味料など。投薬単位形態（ｄｏｓａｇｅ ｕｎｉｔ ｆｏｒｍ）が、カプセル剤であるとき、それは、上記のタイプの材料に加えて、液体キャリアも含み得る。様々な他の材料が、コーティングとして、またはその投与単位の物理的形態を改変するために、存在し得る。例えば、錠剤、丸剤またはカプセル剤は、シェラック、糖またはその両方でコーティングされ得る。剤形が、カプセル剤であるとき、それは、上記のタイプの材料に加えて、液体キャリアなどのキャリアも含み得る。ゼラチンカプセル剤、錠剤または丸剤は、腸溶コーティングされ得る。腸溶コーティングは、ｐＨが酸性である胃または上部腸での組成物の変性を防ぐ。例えば、米国特許第５，６２９，００１号を参照のこと。小腸に到達したら、そこの塩基性のｐＨが、コーティングを溶解し、組成物が放出され、特殊化した細胞、例えば、上皮腸細胞およびパイエル板Ｍ細胞によって吸収されるのを可能にする。エリキシル剤のシロップ剤は、活性な化合物、甘味剤としてスクロース、保存剤としてメチルパラベンおよびプロピルパラベン、色素、およびサクランボまたはオレンジフレーバーなどの香味料を含み得る。当然のことながら、任意の投薬単位形態を調製する際に使用されるいずれの材料も、薬学的に純粋、かつ使用される量において実質的に無毒性であるべきである。さらに、活性な化合物は、徐放調製物および徐放製剤に組み込まれ得る。
経口投与の場合、本開示の組成物は、あるいは、含そう薬、歯磨剤、バッカル錠、経口スプレー、または舌下に経口投与される製剤の形態で１つ以上の賦形剤とともに組み込まれ得る。例えば、必要量の活性成分をホウ酸ナトリウム溶液（ドーベル液）などの適切な溶媒中に組み込んでいる含そう薬が調製され得る。あるいは、活性成分は、経口溶液、例えば、ホウ酸ナトリウム、グリセリンおよび炭酸水素カリウムを含む溶液に組み込まれ得るか、または歯磨剤に分散され得るか、または水、結合剤、研磨剤、香味剤、起泡剤および保湿剤を含み得る組成物に治療有効量で加えられ得る。あるいは、組成物は、舌の下に置かれ得るかまたは口内で溶解され得る、錠剤または溶液の形態に形成され得る。
他の消化性投与様式に適したさらなる製剤としては、坐剤が挙げられる。坐剤は、直腸に挿入するための、様々な重量および形状の固形剤形であり、通常、薬用である。挿入後、坐剤は、軟化するか、融解するか、または腔内の流体に溶解する。一般に、坐剤の場合、従来のキャリアとしては、例えば、ポリアルキレングリコール、トリグリセリドまたはそれらの組み合わせが挙げられ得る。ある特定の実施形態において、坐剤は、例えば、活性成分を約０．５％～約１０％、好ましくは、約１％～約２％の範囲内で含む混合物から形成され得る。
Ｂ．非経口組成物および製剤
さらなる実施形態において、ＴＮＦ阻害剤は、非経口経路を介して投与され得る。本明細書中で使用されるとき、用語「非経口」には、消化管を迂回する経路が含まれる。詳細には、本明細書中に開示される薬学的組成物は、例えば、以下に限定されないが、静脈内に、皮内に、筋肉内に、動脈内に、髄腔内に、皮下に、または腹腔内に、投与され得る。米国特許第６，７５３７，５１４号、同第６，６１３，３０８号、同第５，４６６，４６８号、同第５，５４３，１５８号；同第５，６４１，５１５号；および同第５，３９９，３６３号（各々の全体が参照により明確に本明細書中に援用される）。
遊離塩基または薬理学的に許容され得る塩としての活性な化合物の溶液は、ヒドロキシプロピルセルロースなどの界面活性剤と適切に混合された水において調製され得る。分散液は、グリセロール、液体ポリエチレングリコールおよびそれらの混合物ならびに油においても調製され得る。これらの調製物は、通常の貯蔵条件下および使用条件下において、微生物の増殖を防ぐために保存剤を含む。注射可能な使用に適した薬学的形態としては、滅菌された水溶液または分散液、および滅菌された注射可能な溶液または分散液の即時調製用の滅菌された粉末が挙げられる（米国特許５，４６６，４６８号（その全体が参照により明確に本明細書中に援用される））。すべての場合において、その形態は、滅菌されなければならず、容易に注入できる程度に流動性でなければならない。その形態は、製造および貯蔵の条件下で安定でなければならず、細菌および真菌などの微生物の汚染作用から保護されていなければならない。キャリアは、例えば、水、エタノール、ポリオール（すなわち、グリセロール、プロピレングリコールおよび液体ポリエチレングリコールなど）、それらの好適な混合物および／または植物油を含む、溶媒または分散媒であり得る。例えば、レシチンなどのコーティングを使用すること、分散液の場合は必要な粒径を維持すること、および界面活性剤を使用することによって、適切な流動性が維持され得る。微生物の作用の防止は、様々な抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどによってもたらされ得る。多くの場合、等張剤、例えば、糖または塩化ナトリウムを含むことが好ましい。吸収を遅延させる作用物質、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンをそれらの組成物において使用することによって、注射可能な組成物の長期の吸収がもたらされ得る。
水溶液としての非経口投与の場合、例えば、その溶液は、必要であれば、適切に緩衝されるべきであり、液体希釈剤が、まず、十分な食塩水またはグルコースで等張性にされるべきである。これらの特定の水溶液は、特に、静脈内、筋肉内、皮下および腹腔内投与に適している。これに関連して、使用され得る滅菌された水性媒質は、本開示に照らして当業者に公知であるだろう。例えば、１回分の投与量が、等張性ＮａＣｌ溶液に溶解され得、皮下点滴療法の流体に加えられ得るか、または提案される注入部位に注射され得る（例えば、“Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ”１５ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，１０３５－１０３８頁および１５７０－１５８０頁を参照のこと）。必然的に、投与量は、処置される被験体の状態に応じていくらか変動し得る。いずれにしても、投与の責任者が、個々の被験体に適切な用量を決定する。さらに、ヒトに投与する場合、調製物は、ＦＤＡ Ｏｆｆｉｃｅ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓの規格が要求するような、無菌性、発熱性、一般的安全性および純度の規格を満たさなければならない。
滅菌された注射可能な溶液は、必要量の活性な化合物を、必要に応じ、上記で列挙した様々な他の成分とともに、適切な溶媒に組み込んだ後、濾過滅菌することによって調製される。一般に、様々な滅菌済みの活性成分を、基本分散媒および上記で列挙したもののうち必要な他の成分を含む滅菌されたビヒクルに組み込むことによって、分散液が調製される。滅菌された注射可能な溶液を調製するための滅菌された粉末の場合、好ましい調製方法は、真空乾燥および凍結乾燥の手法であり、これらの手法により、活性成分および任意のさらなる所望の成分の粉末が、予め濾過滅菌されたその溶液から得られる。粉末状の組成物は、液体キャリア、例えば、水または生理食塩水と、安定化剤ありまたはなしで、合わせられる。
いくつかの実施形態において、治療有効量のＴＮＦ阻害剤を被験体に投与することによって、神経芽細胞腫の処置を必要とする被験体において神経芽細胞腫を処置するための方法が、本明細書中に開示される。いくつかの実施形態において、ＴＮＦ阻害剤は、エタネルセプトである。いくつかの実施形態において、エタネルセプトは、被験体の皮下に投与される。いくつかの実施形態において、被験体は、ヒト患者であり、いくつかの実施形態において、被験体は、小児患者である。いくつかの実施形態において、エタネルセプトは、２～５００ｍｇ／用量または２～１００ｍｇ／用量または１０～８０ｍｇ／用量の範囲内の用量で週に１回または週に２回、被験体に投与される。いくつかの実施形態において、エタネルセプトは、２５ｍｇ／用量または５０ｍｇ／用量の用量で週に１回または週に２回、投与される。いくつかの実施形態において、エタネルセプトは、０．８ｍｇ／ｋｇの用量で週に１回または週に２回、投与される。
Ｃ．種々雑多な薬学的組成物および製剤
本発明の他の特定の実施形態において、活性な化合物であるＴＮＦ阻害剤は、様々な種々雑多な経路、例えば、局所（すなわち、経皮）投与、粘膜投与（鼻腔内、膣など）および／または吸入を介した投与用に製剤化され得る。
局所投与用の薬学的組成物は、軟膏、ペースト、クリームまたは粉末などの、薬用の用途のために製剤化された活性な化合物を含み得る。軟膏には、局所適用のためのあらゆる油性、吸着、エマルジョンおよび水溶性ベースの組成物が含まれ、クリームおよびローションは、エマルジョン基材のみを含む組成物である。局所的に投与される薬剤は、皮膚を通じた活性成分の吸着を容易にするために浸透促進剤を含み得る。好適な浸透促進剤としては、グリセリン、アルコール、アルキルメチルスルホキシド、ピロリドンおよびルアロカプラムが挙げられる。局所適用のための組成物に使用される可能性のある基剤としては、ポリエチレングリコール、ラノリン、コールドクリームおよびペトロラタム、ならびに他の任意の好適な吸収軟膏基剤、エマルジョン軟膏基剤または水溶性軟膏基剤が挙げられる。局所調製物は、活性成分を保護するためおよび均一な混合物を提供するために、必要であれば、乳化剤、ゲル化剤および抗菌性保存剤も含み得る。本発明の経皮投与は、「パッチ」の使用も含み得る。例えば、パッチは、１つ以上の活性な物質を、決まった時間にわたって所定の速度かつ連続様式で供給し得る。
ある特定の実施形態において、薬学的組成物は、点眼薬、鼻内スプレー、吸入および／または他のエアロゾル送達ビヒクルによって送達され得る。経鼻エアロゾルスプレーを介して組成物を肺に直接送達するための方法は、例えば、米国特許第５，７５６，３５３号および同第５，８０４，２１２号（各々の全体が参照により明確に本明細書中に援用される）に記載されている。同様に、鼻腔内微小粒子樹脂（Ｔａｋｅｎａｇａ ｅｔ ａｌ．，１９９８）およびリゾホスファチジル－グリセロール化合物（米国特許第５，７２５，８７１号（その全体が参照により明確に本明細書中に援用される））を用いた薬物の送達も、薬学分野において周知である。同様に、ポリテトラフルオロエテイレン支持マトリックスの形態での経粘膜薬物送達は、米国特許第５，７８０，０４５号（その全体が参照により明確に本明細書中に援用される）に記載されている。
エアロゾルという用語は、液化ガスまたは加圧ガスの噴射剤中に分散された、液体粒子の微粉化された固体のコロイド系のことを指す。吸入用の本発明の代表的なエアロゾルは、液体噴射剤中または液体噴射剤と好適な溶媒との混合物中の活性成分の懸濁液からなり得る。好適な噴射剤としては、炭化水素および炭化水素エーテルが挙げられる。好適な容器は、噴射剤の圧力要件に従って変化し得る。エアロゾルの投与は、被験体の年齢、体重ならびに症状の重症度および応答に従って変化し得る。
ＩＩＩ．癌の処置および腫瘍促進性炎症の低減
本明細書中に包含されるある特定の実施形態は、個体の癌を処置するための方法に関する。その癌は、任意のタイプであってよく、高レベルの少なくとも１つのＴＮＦＲを発現し、かつ／または高含有量の単球および／もしくは腫瘍関連マクロファージを有する、任意の腫瘍、例えば神経芽細胞腫（ＮＢ）が含まれる。処置される癌が、身体のいくつかの領域に見られる未熟な神経細胞から発生する神経芽細胞腫である場合、その神経芽細胞腫は、神経細胞群が存在する、副腎および副腎周辺、腹部の他の領域、胸部、頚部、または脊椎付近に発生したものであり得る。神経芽細胞腫は、特に小児で発生するので、いくつかの実施形態において、罹患個体は、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１歳または１歳未満である。その個体は、小児または乳児であり得る。その個体は、神経芽細胞腫の家族歴を有する場合もあるし、有しない場合もある。神経芽細胞腫は、リンパ節、骨髄、肝臓、皮膚および／または骨などに転移している場合もあるし、転移していない場合もある。いくつかの実施形態において、神経芽細胞腫は、脊髄圧迫をもたらしている。いくつかの実施形態において、神経芽腫細胞は、他の正常組織を刺激して、腫瘍随伴症候群を引き起こすと呼ばれる、徴候および症状を引き起こすある特定の化合物を分泌し得る。
本開示の実施形態は、癌を有する個体に治療有効量の１つ以上のＴＮＦ阻害剤を投与する工程を含む、癌を処置する方法を含む。それらのＴＮＦ阻害剤は、癌細胞および／または腫瘍微小環境内の細胞においてＴＮＦおよび／または１つ以上のＴＮＦレセプターを阻害し得る。その方法は、１つ以上のＴＮＦ阻害剤の１回以上の投与を包含する。具体的な実施形態において、その癌は、神経芽細胞腫であり、その１つ以上のＴＮＦ阻害剤は、必要とする個体に複数回投与される。具体的な場合において、その個体は、神経芽細胞腫を有する小児であり、ＴＮＦα阻害剤を含む１つ以上のＴＮＦ阻害剤が、その小児に投与される。
特定の実施形態において、癌細胞は、例えば、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）レセプター（ＴＮＦＲ）および／またはＩＬ－６レセプターなどの、１つ以上のサイトカインレセプターを発現する。その癌は、ＴＮＦαおよび／またはＩＬ－６をはじめとしたサイトカインなどの腫瘍促進性炎症によって活性化され得る。それらのサイトカインは、癌細胞上のレセプターに結合し、例えば、ＮＦ－κＢおよび／またはＳｔａｔ３シグナル伝達を含み得るシグナル伝達経路を活性化することがある。それらのサイトカインは、癌細胞においてＩκＢαの発現および／またはレベルを減少させ得る。いくつかの実施形態において、その癌は、単球および／またはマクロファージによって活性化される。ある特定の実施形態において、単球および／またはマクロファージは、ＴＮＦシグナル伝達および／またはＩＬ－６シグナル伝達を介してＮＦ－κＢおよび／またはＳｔａｔ３シグナル伝達を活性化することなどによって、癌細胞の成長を促進する。単球および／またはマクロファージは、その単球および／またはマクロファージの表面上に見られる膜結合型ＴＮＦαを介して癌の成長を活性化および／または促進し得る。いくつかの実施形態において、個体には、任意のＴＮＦ分子および／またはシグナル伝達経路を阻害することができる治療、例えば、少なくとも１つの小分子、免疫療法、細胞療法、ペプチド、ペプチド誘導体、抗体、融合タンパク質、糖タンパク質、核酸、核酸誘導体またはそれらの組み合わせが投与される。個体には、当業者によって決定される治療有効量の治療が投与され得る。いくつかの実施形態において、その治療には、少なくとも１つの融合タンパク質、例えば、人工的に操作された融合タンパク質、および／または抗体が含まれる。いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、少なくとも１つのサイトカイン結合ドメイン、一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）および／または可変領域ドメインを含む。そのようなドメインは、腫瘍促進性炎症に寄与するサイトカイン（例えば、ＴＮＦαおよび／またはＩＬ－６）を含む１つ以上のサイトカインに結合することができる場合がある。いくつかの実施形態において、抗体は、腫瘍促進性炎症に寄与するサイトカイン（例えば、ＴＮＦαおよび／またはＩＬ－６）を含む１つ以上のサイトカインに結合することができる。いくつかの実施形態において、上記治療には、エタネルセプト、インフリキシマブ、セルトリズマブ、ゴリムマブ、アダリムマブまたはそれらの組み合わせが含まれる。
本明細書中に包含される任意の方法の場合、本開示の組成物は、それを必要する個体に任意の好適な様式で投与され得る。例としては、少なくとも、静脈内、皮内、経皮的、髄腔内、動脈内、腹腔内、鼻腔内、膣内、直腸内、局所的（ｔｏｐｉｃａｌｌｙ）、筋肉内、皮下、粘膜、経口的、局所的（ｔｏｐｉｃａｌｌｙ）、局所的（ｌｏｃａｌｌｙ）、吸入（例えば、エアロゾル吸入）、注射、注入、持続注入、標的細胞を直接浸漬する局所灌流、カテーテルを介して、洗浄を介して、クリームとして、脂質組成物（例えば、リポソーム）として、などが挙げられる。
いくつかの実施形態において、１つ以上のＴＮＦ阻害剤は、神経芽細胞腫を処置するための１つ以上の治療と同時または連続的に投与される。神経芽細胞腫を処置するための治療は、当業者に公知であり、それらとしては、腫瘍を除去する手術、放射線療法、化学療法またはそれらの組み合わせが挙げられる。そのような実施形態において、ＴＮＦ阻害剤は、神経芽細胞腫を処置するための治療の前、その治療と同時、および／またはその治療の後に、個体に投与され得る。
いくつかの実施形態では、細胞（本明細書中に包含される任意の癌細胞などの任意の細胞を含む）および／または細胞外液（例えば、血液、血漿、血清、間質液、腫瘍間質液、細胞培養流体またはそれらの組み合わせ）を本明細書中に包含される任意の組成物と接触させることによって、個体における腫瘍促進性炎症が低減される。例えば、可溶性ＴＮＦα、膜結合型ＴＮＦαおよび／またはＩＬ－６などの、１つ以上の炎症性サイトカインの発現、産生および／またはレベルを減少させることによって、腫瘍促進性炎症が低減され得る。腫瘍促進性炎症の低減には、ＩκＢαの発現および／またはレベルの増加（癌細胞におけるものを含む）が含まれ得る。上記接触は、インビトロ、インビボおよび／またはエキソビボで行われ得る。
本開示の実施形態は、ＮＢ細胞を含む癌細胞においてＴＮＦα産生を減少させる方法を含む。そのような場合、癌細胞は、その癌細胞においてＴＮＦα産生を減少させる有効量の１つ以上のＴＮＦ阻害剤に供される。本開示の実施形態は、ＮＢ細胞を含む癌細胞においてＩＬ－６産生を減少させる方法も含む。そのような場合、癌細胞は、その癌細胞においてＩＬ－６産生を減少させる有効量の１つ以上のＴＮＦ阻害剤に供される。
複数のＴＮＦ阻害剤が投与されるとき、それらの異なる阻害剤は、同じ製剤中に存在してもよいし、存在しなくてもよい。それらの異なる阻害剤は、個体に同時に投与されてもよいし、されなくてもよい。第１のＴＮＦ阻害剤が、第２のＴＮＦ阻害剤の前に投与される。第１のＴＮＦ阻害剤が、第２のＴＮＦ阻害剤の前および第２のＴＮＦ阻害剤と同時に投与され得る。ＴＮＦ阻害剤の複数回の投与が行われるとき、後で投与される阻害剤が、最初に投与された阻害剤と同じであるか否かを問わず、投与間の時間は、１～２４時間以内、１～７日間以内、１～４週間以内、１～１２ヶ月間以内またはそれ以上およびそれらの間の任意の部分範囲を含む任意の長さの時間であってよい。いくつかの場合において、ＴＮＦα阻害剤が個体に１回以上投与され、その後、ＴＮＦＲ阻害剤が個体に１回以上投与されるか、またはその逆である。この方針の変更は、癌の再発および／または転移が原因である場合もあれば、そうでない場合もある。
遺伝子破壊
いくつかの実施形態において、個体における癌細胞は、ＴＮＦα、ならびにＴＮＦＲ１および／またはＴＮＦＲ２を含む１つ以上のサイトカインレセプターの発現を低下させるまたは無くす遺伝的改変に対して標的化され得る。その遺伝的改変は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９またはＲＮＡｉなどの当該分野で公知の任意の方法を用いて行われ得る。使用されるｓｇＲＮＡ配列は、ＴＮＦα、ＴＮＦＲ１および／またはＴＮＦＲ２をノックアウトするのに十分な任意の配列であり得、その配列には、例えば、配列番号１～６を標的化するｓｇＲＮＡ配列が含まれる。
配列番号１ ＧＣＣＧＴＧＧＧＴＣＡＧＴＡＴＧＴＧＡＧＡＧＧ
配列番号２ ＧＧＡＧＴＧＡＴＣＧＧＣＣＣＣＣＡＧＡＧＧＧ
配列番号３ ＧＧＡＧＧＡＧＡＣＡＣＣＡＴＣＡＡＧＡＧＡＧＧ
配列番号４ ＧＧＧＧＣＡＣＴＧＧＡＴＧＧＴＧＧＣＡＴＧＧＧ
配列番号５ ＧＧＧＧＣＧＧＧＧＡＣＣＴＧＧＧＣＡＴＣＡＧＧ
配列番号６ ＧＧＣＣＣＡＴＡＣＴＧＣＣＣＡＧＣＣＧＧＴＧＧ
配列番号１～２は、ＴＮＦαをコードする遺伝子に見られる配列を含む。配列番号３～４は、ＴＮＦＲ１をコードする遺伝子に見られる配列を含む。配列番号５～６は、ＴＮＦＲ２をコードする遺伝子に見られる配列を含む。
ｓｇＲＮＡ配列は、Ｔ７プロモーター、ガイド配列およびｇＲＮＡ骨格を含み得る。Ｔ７プロモーターは、ｔｔａａｔａｃｇａｃｔｃａｃｔａｔａ（配列番号２８）の配列を含み得る。ｇＲＮＡ骨格は、ｇｔｔｔｔａｇａｇｃｔａｇａａａｔａｇｃの配列を含み得る。いくつかの実施形態において、ｓｇＲＮＡ配列は、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２またはそれらの組み合わせを含む。
配列番号７ ｔｔａａｔａｃｇａｃｔｃａｃｔａｔａＧＧＣＧＴＧＧＧＴＣＡＧＴＡＴＧＴＧＡＧｇｔｔｔｔａｇａｇｃｔａｇａａａｔａｇｃ
配列番号８ ｔｔａａｔａｃｇａｃｔｃａｃｔａｔａＧＧＡＧＴＧＡＴＣＧＧＣＣＣＣＣＡＧＡｇｔｔｔｔａｇａｇｃｔａｇａａａｔａｇｃ
配列番号９ ｔｔａａｔａｃｇａｃｔｃａｃｔａｔａＧＧＡＧＧＡＧＡＣＡＣＣＡＴＣＡＡＧＡＧｇｔｔｔｔａｇａｇｃｔａｇａａａｔａｇｃ
配列番号１０ ｔｔａａｔａｃｇａｃｔｃａｃｔａｔａＧＧＧＧＣＡＣＴＧＧＡＴＧＧＴＧＧＣＡＴｇｔｔｔｔａｇａｇｃｔａｇａａａｔａｇｃ
配列番号１１ ｔｔａａｔａｃｇａｃｔｃａｃｔａｔａＧＧＧＧＣＧＧＧＧＡＣＣＴＧＧＧＣＡＴＣｇｔｔｔｔａｇａｇｃｔａｇａａａｔａｇｃ
配列番号１２ ｔｔａａｔａｃｇａｃｔｃａｃｔａｔａＧＧＣＣＣＡＴＡＣＴＧＣＣＣＡＧＣＣＧＧｇｔｔｔｔａｇａｇｃｔａｇａａａｔａｇｃ
配列番号７～８は、ＴＮＦαを標的化することができるｓｇＲＮＡ配列を含む。配列番号９～１０は、ＴＮＦＲ１を標的化することができる配列を含む。配列番号１１～１２は、ＴＮＦＲ２を標的化することができる配列を含む。
いくつかの実施形態において、ＴＮＦα、ＴＮＦＲ１およびＴＮＦＲ２（例として）に対する遺伝子破壊は、その遺伝子において破壊をもたらすこと（例えば、ノックアウト、挿入、ミスセンス変異またはフレームシフト変異、例えば、両アレルフレームシフト変異、遺伝子の全部または一部の欠失、例えば、１つ以上のエキソンもしくはゆえに一部分の欠失、および／またはノックイン）によって行われる。例えば、破壊は、遺伝子またはその一部の配列に標的化されるように特異的にデザインされた、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）および転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）などのＤＮＡ結合標的化ヌクレアーゼ、ならびにＣＲＩＳＰＲ会合ヌクレアーゼ（Ｃａｓ）などのＲＮＡガイドヌクレアーゼをはじめとした、配列特異的ヌクレアーゼまたは標的化ヌクレアーゼによってもたらされ得る。
いくつかの実施形態において、破壊は、その遺伝子の発現が後になって回復するような、一過性または可逆的である。他の実施形態において、破壊は、可逆的または一過性でなく、例えば、永続的である。
いくつかの実施形態において、ＴＮＦα、ＴＮＦＲ１および／またはＴＮＦＲ２の遺伝子破壊は、その遺伝子における、通常は標的化様式での、１つ以上の二本鎖切断および／または１つ以上の一本鎖切断の誘導によって行われる。いくつかの実施形態において、二本鎖または一本鎖の切断は、ヌクレアーゼ、例えば、遺伝子標的化ヌクレアーゼなどのエンドヌクレアーゼによって行われる。いくつかの態様において、その切断は、遺伝子のコード領域、例えば、エキソンにおいて誘導される。例えば、いくつかの実施形態において、その誘導は、コード領域、例えば、第１のエキソン、第２のエキソンまたはそれ以降のエキソンのＮ末端部分の近くにおいて生じる。
上記標的細胞には、ガイドＲＮＡおよびＣＲＩＳＰＲ酵素またはＣＲＩＳＰＲ酵素をコードするｍＲＮＡが導入され得る。いくつかの態様において、その細胞には、１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたはそれ以上のガイドＲＮＡが同時に導入される。例えば、その細胞には、第１のエレクトロポレーションの間に１つ、２つまたは３つのガイドＲＮＡが導入され得、次いで、第２のエレクトロポレーションの間に１つ、２つまたは３つのさらなるガイドＲＮＡがさらに導入され得るなど。
いくつかの実施形態において、ＴＮＦα、ＴＮＦＲ１および／またはＴＮＦＲ２の遺伝子破壊は、アンチセンス法（例えば、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、短ヘアピン（ｓｈＲＮＡ）および／またはリボザイム）を用いて達成され、それらを用いることにより、遺伝子の発現が選択的に抑制または阻止される。ｓｉＲＮＡ技術は、遺伝子から転写されるｍＲＮＡのヌクレオチド配列と相同な配列およびそのヌクレオチド配列と相補的な配列を有する二本鎖ＲＮＡ分子を使用するＲＮＡｉである。ｓｉＲＮＡは、一般に、遺伝子から転写されるｍＲＮＡの１つの領域と相同／相補的であるか、または種々の領域と相同／相補的である複数のＲＮＡ分子を含むｓｉＲＮＡであり得る。いくつかの態様において、ｓｉＲＮＡは、ポリシストロニック構築物に含められる。
いくつかの実施形態において、ＴＮＦα、ＴＮＦＲ１および／またはＴＮＦＲ２の破壊は、遺伝子に特異的に結合するかまたはハイブリダイズする、ＤＮＡ標的化分子（例えば、ＤＮＡ結合タンパク質またはＤＮＡ結合核酸）またはそれを含む複合体、化合物もしくは組成物を用いて達成される。いくつかの実施形態において、ＤＮＡ標的化分子は、ＤＮＡ結合ドメイン、例えば、ジンクフィンガータンパク質（ＺＦＰ）のＤＮＡ結合ドメイン、転写活性化因子様タンパク質（ＴＡＬ）のＤＮＡ結合ドメインもしくはＴＡＬエフェクター（ＴＡＬＥ）のＤＮＡ結合ドメイン、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）のＤＮＡ結合ドメイン、またはメガヌクレアーゼのＤＮＡ結合ドメインを含む。ジンクフィンガー、ＴＡＬＥおよびＣＲＩＳＰＲシステムの結合ドメインは、例えば、天然に存在するジンクフィンガーまたはＴＡＬＥタンパク質の認識ヘリックス領域の操作（１つ以上のアミノ酸の変更）を介して、所定のヌクレオチド配列に結合するように操作され得る。操作されたＤＮＡ結合タンパク質（ジンクフィンガーまたはＴＡＬＥ）は、天然に存在しないタンパク質である。デザインに対する合理的基準としては、置換ルールの適用、ならびに既存のＺＦＰおよび／またはＴＡＬＥのデザインおよび結合データの情報を保存しているデータベースにおける情報を処理するためのコンピュータアルゴリズムが挙げられる。
ＴＮＦα、ＴＮＦＲ１および／またはＴＮＦＲ２のＣＲＩＳＰＲ媒介性の破壊の場合、ガイドＲＮＡおよびエンドヌクレアーゼは、細胞または細胞内コンパートメントの内側への送達を可能にする当該分野で公知の任意の手段によって標的細胞に導入され得、使用され得る作用物質／化学物質および／または分子（タンパク質および核酸）としては、非限定的な例として、リポソーム送達手段、高分子キャリア、化学的キャリア、リポプレックス、ポリプレックス、デンドリマー、ナノ粒子、エマルジョン、天然のエンドサイトーシスまたは貪食経路、ならびにエレクトロポレーションなどの物理的な方法が挙げられる。具体的な態様では、エレクトロポレーションを用いて、ガイドＲＮＡおよびエンドヌクレアーゼまたはエンドヌクレアーゼをコードする核酸を導入する。
いくつかの実施形態において、ＴＮＦα、ＴＮＦＲ１および／またはＴＮＦＲ２遺伝子の発現、活性および／または機能の変更は、ＴＮＦα、ＴＮＦＲ１および／またはＴＮＦＲ２の遺伝子を破壊することによって行われる。いくつかの態様において、その遺伝子は、その発現が、遺伝子改変が無い場合の発現または改変をもたらす構成要素の導入が無い場合の発現と比べて、少なくとも１０、２０、３０もしくは４０％または約１０、２０、３０もしくは４０％、通常、少なくとも５０、６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９もしくは１００％または約５０、６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９もしくは１００％低下するように改変される。
いくつかの実施形態において、上記変更は、一過性または可逆的であり、その遺伝子の発現は、所望であれば後になって回復される。他の実施形態において、上記変更は、可逆的または一過性ではなく、例えば、永続的である。
いくつかの実施形態において、遺伝子の変更は、通常は標的化された様式で、その遺伝子において１つ以上の二本鎖切断および／または１つ以上の一本鎖切断を誘導することによって行われる。いくつかの実施形態において、二本鎖または一本鎖の切断は、ヌクレアーゼ、例えば、遺伝子標的化ヌクレアーゼなどのエンドヌクレアーゼによって行われる。いくつかの態様において、切断は、遺伝子のコード領域、例えば、エキソンにおいて誘導される。例えば、いくつかの実施形態において、その誘導は、コード領域、例えば、第１のエキソン、第２のエキソンまたはそれ以降のエキソンのＮ末端部分付近において生じる。
いくつかの態様において、二本鎖または一本鎖の切断は、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）または相同組換え修復（ＨＤＲ）などによる細胞の修復プロセスを介した修復を受ける。いくつかの態様において、この修復プロセスは、エラーが発生しやすく、遺伝子の完全なノックアウトをもたらし得る遺伝子の破壊、例えば、フレームシフト変異、例えば、両アレルのフレームシフト変異をもたらす。例えば、いくつかの態様において、破壊は、欠失、変異および／または挿入を誘導することを含む。いくつかの実施形態では、破壊によって、停止コドンが早期に存在するようになる。いくつかの態様において、挿入、欠失、転座、フレームシフト変異および／または中途での停止コドンが存在することにより、遺伝子の発現、活性および／または機能が妨害される。
いくつかの実施形態において、上記変更は、ＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼ（ＲＧＥＮ）を介した変更など、１つ以上のＤＮＡ結合核酸を用いて行われる。例えば、その変更は、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）およびＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）タンパク質を用いて行われ得る。一般に、「ＣＲＩＳＰＲシステム」とは、ＣＲＩＳＰＲ関連（「Ｃａｓ」）遺伝子（Ｃａｓ遺伝子をコードする配列を含む）、ｔｒａｃｒ（トランス活性化ＣＲＩＳＰＲ）配列（例えば、ｔｒａｃｒＲＮＡまたは活性な部分的ｔｒａｃｒＲＮＡ）、ｔｒａｃｒメイト配列（内在性のＣＲＩＳＰＲシステムの文脈では「直列反復配列」、およびｔｒａｃｒＲＮＡによってプロセシングされた部分的な直列反復配列を包含する）、ガイド配列（内在性のＣＲＩＳＰＲシステムの文脈では「スペーサー」とも称される）、ならびに／またはＣＲＩＳＰＲ遺伝子座由来の他の配列および転写物の発現に関与するかもしくはその活性を指示する転写物および他のエレメントのことを総称する。
ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓヌクレアーゼまたはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼシステムは、ＤＮＡに配列特異的に結合する非コードＲＮＡ分子（ガイド）ＲＮＡ、およびヌクレアーゼ機能（例えば、２つのヌクレアーゼドメイン）を有するＣａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ９）を含み得る。ＣＲＩＳＰＲシステムの１つ以上のエレメントが、Ｉ型、ＩＩ型またはＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムに由来し得、例えば、内在性のＣＲＩＳＰＲシステムを含む特定の生物（例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）に由来し得る。
いくつかの態様において、ＣａｓヌクレアーゼおよびｇＲＮＡ（標的配列に特異的なｃｒＲＮＡと既定のｔｒａｃｒＲＮＡとの融合物を含む）が、細胞に導入される。一般に、ｇＲＮＡの５’末端における標的部位が、相補的な塩基対形成によって、Ｃａｓヌクレアーゼをその標的部位、例えば、遺伝子に標的化する。標的部位は、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列（例えば、通常、ＮＧＧまたはＮＡＧ）のすぐ５’の位置に基づいて選択され得る。この点において、ｇＲＮＡは、標的ＤＮＡ配列に対応するようにガイドＲＮＡの最初の２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１４、１２、１１または１０ヌクレオチドを改変することによって、所望の配列に標的化される。一般に、ＣＲＩＳＰＲシステムは、標的配列の部位においてＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を促進するエレメントを特徴とする。通常、「標的配列」とは、一般に、ガイド配列が相補性を有するようにデザインされる配列のことを指し、標的配列とガイド配列とのハイブリダイゼーションが、ＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を促進する。ハイブリダイゼーションを引き起こし、ＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を促進するのに十分な相補性があれば、完全な相補性は必ずしも必要ない。
ＣＲＩＳＰＲシステムは、標的部位における二本鎖切断（ＤＳＢ）に続いて、本明細書中で論じられるような破壊または変更を誘導し得る。他の実施形態では、「ニッカーゼ」とみなされるＣａｓ９バリアントが、標的部位において一本鎖にニックを入れるために使用される。例えば特異性を改善するために、対のニッカーゼを使用することができ、そのニッカーゼの各々は、配列を標的化する異なるｇＲＮＡの対によって導かれ、ニックが同時に導入されると、５’オーバーハングが導入される。他の実施形態では、遺伝子発現に影響するように、触媒的に不活性なＣａｓ９が、転写抑制因子または転写活性化因子などの異種エフェクタードメインに融合される。
標的配列は、ＤＮＡポリヌクレオチドまたはＲＮＡポリヌクレオチドなどの任意のポリヌクレオチドを含み得る。標的配列は、細胞のオルガネラ内など、細胞の核または細胞質に位置し得る。一般に、標的配列を含む標的化される遺伝子座への組換えのために使用され得る配列または鋳型は、「編集鋳型」または「編集ポリヌクレオチド」または「編集配列」と称される。いくつかの態様では、外来性の鋳型ポリヌクレオチドが、編集鋳型と称されることがある。いくつかの態様において、組換えは、相同組換えである。
通常、内在性のＣＲＩＳＰＲシステムの文脈では、ＣＲＩＳＰＲ複合体（標的配列にハイブリダイズして１つ以上のＣａｓタンパク質と複合体化するガイド配列を含む）の形成によって、標的配列においてまたは標的配列の近くで（例えば、標的配列から１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、５０塩基対以内またはそれ以上以内において）一方または両方の鎖の切断が生じる。野生型ｔｒａｃｒ配列の全部もしくは一部（例えば、野生型ｔｒａｃｒ配列の約２０ヌクレオチド、約２６ヌクレオチド、約３２ヌクレオチド、約４５ヌクレオチド、約４８ヌクレオチド、約５４ヌクレオチド、約６３ヌクレオチド、約６７ヌクレオチド、約８５ヌクレオチドもしくはそれ以上または約２０ヌクレオチド超、約２６ヌクレオチド超、約３２ヌクレオチド超、約４５ヌクレオチド超、約４８ヌクレオチド超、約５４ヌクレオチド超、約６３ヌクレオチド超、約６７ヌクレオチド超、約８５ヌクレオチド超もしくはそれ以上）を含み得るかまたはそれらからなり得るｔｒａｃｒ配列も、ガイド配列に作動可能に連結されたｔｒａｃｒメイト配列の全部または一部へのｔｒａｃｒ配列の少なくとも一部に沿ったハイブリダイゼーションなどによって、ＣＲＩＳＰＲ複合体の一部を形成し得る。ｔｒａｃｒ配列は、ハイブリダイズしてＣＲＩＳＰＲ複合体の形成に参加する、ｔｒａｃｒメイト配列に対して十分な相補性（例えば、最適にアラインメントされたとき、ｔｒａｃｒメイト配列の長さに沿って少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または９９％の配列相補性）を有する。
ＣＲＩＳＰＲシステムの１つ以上のエレメントの発現によって、１つ以上の標的部位においてＣＲＩＳＰＲ複合体の形成が指示されるように、そのＣＲＩＳＰＲシステムのそれらのエレメントの発現を駆動する１つ以上のベクターが細胞に導入され得る。また、構成要素がタンパク質および／またはＲＮＡとして細胞に送達され得る。例えば、Ｃａｓ酵素、ｔｒａｃｒメイト配列に連結されたガイド配列、およびｔｒａｃｒ配列がそれぞれ、別個のベクター上の別個の調節エレメントに作動可能に連結され得る。あるいは、同じまたは異なる調節エレメントから発現されるエレメントの２つ以上が、単一ベクターにおいて組み合わされ得、１つ以上のさらなるベクターが、第１のベクターに含まれていないＣＲＩＳＰＲシステムの任意の構成要素を提供する。そのベクターは、制限エンドヌクレアーゼ認識配列などの１つ以上の挿入部位（「クローニング部位」とも称される）を含み得る。いくつかの実施形態において、１つ以上の挿入部位が、１つ以上のベクターの１つ以上の配列エレメントの上流および／または下流に配置される。複数の異なるガイド配列が使用されるとき、細胞内の異なる複数の対応する標的配列に対してＣＲＩＳＰＲ活性を標的化するために単一の発現構築物が使用され得る。
ベクターは、Ｃａｓタンパク質などのＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする酵素コード配列に作動可能に連結された調節エレメントを含み得る。Ｃａｓタンパク質の非限定的な例としては、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９（Ｃｓｎ１およびＣｓｘ１２としても知られる）、Ｃａｓ１０、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆｌ、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４、それらのホモログまたはそれらの改変バージョンが挙げられる。これらの酵素は公知であり；例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓのＣａｓ９タンパク質のアミノ酸配列は、アクセッション番号Ｑ９９ＺＷ２としてＳｗｉｓｓＰｒｏｔデータベースに見られ得る。
ＣＲＩＳＰＲ酵素は、Ｃａｓ９（例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓまたはＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａ由来のもの）であり得る。いくつかの実施態様では、Ｃａｓ９タンパク質の代わりにＣｐＦ１が使用される。いくつかの実施形態において、酵素は、ハイフィディリティー酵素である。ＣＲＩＳＰＲ酵素は、標的配列内および／または標的配列の相補鎖内などの標的配列の位置での一方または両方の鎖の切断を指示し得る。ベクターは、対応する野生型酵素と比べて変異したＣＲＩＳＰＲ酵素をコードし得、変異したＣＲＩＳＰＲ酵素は、標的配列を含む標的ポリヌクレオチドの一方または両方の鎖を切断する能力を欠く。例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＣａｓ９のＲｕｖＣ Ｉ触媒ドメインにおけるアスパラギン酸からアラニンへの置換（Ｄ１０Ａ）は、Ｃａｓ９を、両方の鎖を切断するヌクレアーゼからニッカーゼ（一本鎖を切断する）に変換する。いくつかの実施形態において、Ｃａｓ９ニッカーゼは、ガイド配列、例えば、そのＤＮＡ標的のセンス鎖およびアンチセンス鎖をそれぞれ標的化する２つのガイド配列と組み合わせて使用され得る。この組み合わせは、両方の鎖にニックを入れること、およびＮＨＥＪまたはＨＤＲを誘導するために使用されることができる。
いくつかの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする酵素コード配列は、真核細胞などの特定の細胞における発現に向けてコドンが最適化される。真核細胞は、特定の生物（例えば、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、イヌまたは非ヒト霊長類を含むがこれらに限定されない哺乳動物）の細胞またはそれらの生物に由来する細胞であり得る。一般に、コドンの最適化とは、天然のアミノ酸配列を維持しつつ、天然の配列の少なくとも１つのコドンをその宿主細胞の遺伝子においてより高頻度にまたは最も高頻度に使用されるコドンで置き換えることによって、目的の宿主細胞において発現が高まるように核酸配列を改変するプロセスのことを指す。様々な種が、特定のアミノ酸のある特定のコドンについて特定のバイアスを示す。コドンバイアス（生物間でのコドン使用頻度の差異）は、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の翻訳効率と相関することが多く、その翻訳効率は、とりわけ、翻訳されるコドンの特性および特定の転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）分子の利用可能性に依存すると考えられている。選択されるｔＲＮＡが細胞内で優勢であることは、通常、ペプチド合成において最も高頻度に使用されるコドンであることを反映する。したがって、コドン最適化に基づいて、遺伝子を所与の生物における最適な遺伝子発現に適応させることができる。
一般に、ガイド配列は、標的ポリヌクレオチド配列とハイブリダイズするのに十分およびその標的配列へのＣＲＩＳＰＲ複合体の配列特異的結合を指示するのに十分な相補性をその標的配列に対して有する任意のポリヌクレオチド配列である。いくつかの実施形態において、ガイド配列と対応する標的配列との相補性の程度は、好適なアラインメントアルゴリズムを用いて最適にアラインメントしたとき、約５０％、約６０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９７％、約９９％もしくはそれ以上、または約５０％超、約６０％超、約７５％超、約８０％超、約８５％超、約９０％超、約９５％超、約９７％超、約９９％超もしくはそれ以上である。
最適なアラインメントは、配列をアラインメントするための任意の好適なアルゴリズムを使用して決定され得る。そのアルゴリズムの非限定的な例としては、Ｓｍｉｔｈ－Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム、Ｂｕｒｒｏｗｓ－Ｗｈｅｅｌｅｒ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍに基づくアルゴリズム（例えば、Ｂｕｒｒｏｗｓ Ｗｈｅｅｌｅｒ Ａｌｉｇｎｅｒ）、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗ、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｘ、ＢＬＡＴ、Ｎｏｖｏａｌｉｇｎ（Ｎｏｖｏｃｒａｆｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＥＬＡＮＤ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）、ＳＯＡＰ（ｓｏａｐ．ｇｅｎｏｍｉｃｓ．ｏｒｇ．ｃｎにおいて利用可能）およびＭａｑ（ｍａｑ．ｓｏｕｒｃｅｆｏｒｇｅ．ｎｅｔにおいて利用可能）が挙げられる。
ＣＲＩＳＰＲ酵素は、１つ以上の異種タンパク質ドメインを含む融合タンパク質の一部であり得る。ＣＲＩＳＰＲ酵素融合タンパク質は、任意のさらなるタンパク質配列、および必要に応じて任意の２つのドメインの間にリンカー配列を含み得る。ＣＲＩＳＰＲ酵素に融合され得るタンパク質ドメインの例としては、エピトープタグ、レポーター遺伝子配列、ならびに以下の活性：メチラーゼ活性、デメチラーゼ活性、転写活性化活性、転写抑制活性、転写終結因子活性、ヒストン修飾活性、ＲＮＡ切断活性および核酸結合活性のうちの１つ以上を有するタンパク質ドメインが挙げられるがこれらに限定されない。エピトープタグの非限定的な例としては、ヒスチジン（Ｈｉｓ）タグ、Ｖ５タグ、ＦＬＡＧタグ、インフルエンザ赤血球凝集素（ＨＡ）タグ、Ｍｙｃタグ、ＶＳＶ－Ｇタグおよびチオレドキシン（Ｔｒｘ）タグが挙げられる。レポーター遺伝子の例としては、グルタチオン－５－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）ベータガラクトシダーゼ、ベータ－グルクロニダーゼ、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ＨｃＲｅｄ、ＤｓＲｅｄ、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、および青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）を含む自己蛍光タンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。ＣＲＩＳＰＲ酵素は、ＤＮＡ分子に結合するかまたは他の細胞分子（マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、Ｓ－タグ、Ｌｅｘ Ａ ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）融合物、ＧＡＬ４Ａ ＤＮＡ結合ドメイン融合物および単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ＢＰ１６タンパク質融合物を含むがこれらに限定されない）に結合するタンパク質またはタンパク質のフラグメントをコードする遺伝子配列に融合され得る。ＣＲＩＳＰＲ酵素を含む融合タンパク質の一部を形成し得るさらなるドメインは、参照により本明細書中に援用される米国特許出願公開第２０１１００５９５０２号に記載されている。
ＩＶ．キット
本明細書中に記載される任意のＴＮＦ阻害剤組成物が、キットに含められ得る。それらのキットは、適切に等分された本開示のＴＮＦ阻害剤を含み得る。キットの構成要素は、水性媒質中にまたは凍結乾燥された形態で、包装され得る。キットの容器手段としては、一般に、構成要素が入れられ得る、好ましくは、適切に等分され得る、少なくとも１つのバイアル、試験管、フラスコ、ボトル、シリンジまたは他の容器手段が挙げられる。２つ以上の構成要素がキットに存在する場合、そのキットは、通常、追加の構成要素が別々に入れられ得る、第２、第３または他のさらなる容器も含む。しかしながら、構成要素の様々な組み合わせが、１つのバイアルに含められてもよい。本開示のキットはまた、典型的には、ＴＮＦ阻害剤を含めるための手段ならびに他の任意の試薬容器を、商業的販売のために厳重に閉じ込められた状態で含む。そのような容器には、所望のバイアルを保持する、射出成形またはブロー成形されたプラスチック容器が含まれ得る。
上記キットの構成要素が、１つおよび／またはそれ以上の液体溶液として提供されるとき、その液体溶液は、水溶液であり、滅菌された水溶液が特に好ましい。上記ＴＮＦ阻害剤組成物はまた、シリンジで投与可能な（ｓｙｒｉｎｇｅａｂｌｅ）組成物に製剤化され得る。その場合、容器手段は、それ自体が、シリンジ、ピペットおよび／もしくは他のこのような装置であってよく、その容器手段から、製剤が、身体の感染領域に適用され得る、動物に注射され得る、かつ／またはそのキットの他の構成要素に適用され得る、かつ／もしくはそのキットの他の構成要素と混合され得る。
しかしながら、上記キットの構成要素は、乾燥粉末として提供されることもある。試薬および／または構成要素が、乾燥粉末として提供されるとき、その粉末は、好適な溶媒を加えることによって再構成され得る。その溶媒も別の容器手段内に提供され得ることが構想される。
容器の数および／またはタイプに関係なく、本開示のキットは、最終的な組成物を注射／投与することおよび／または動物の体内に入れることを支援するための装置も含み得、かつ／またはそのような装置とともに包装され得る。そのような装置は、シリンジ、ピペット、鉗子および／または任意の医学的に承認されたそのような送達ビヒクルであり得る。
以下の実施例は、本開示のある特定の非限定的な態様を実証するために含められる。以下の実施例に開示される手法は、本開示の主題の実施において十分に機能すると本発明者らによって発見された手法であることが、当業者によって認識されるだろう。しかしながら、当業者は、本開示に照らして、開示される具体的な実施形態において多くの変更を行うことができ、本開示の主題の趣旨および範囲から逸脱することなく同様または類似の結果をなおも得ることができることを認識するだろう。
Ｉ．実施例１：一般的な実施形態
臨床成績に関連付けられたＮＢ遺伝子発現データの解析において、ＴＮＦＲ１の高腫瘍発現は、不良な無イベント生存率と強い相関関係を示した（５年ＥＦＳ１５％対７０％）ことから、神経芽細胞腫（ＮＢ）におけるＴＮＦαシグナル伝達の潜在的な重要性が浮き彫りとなった。ＴＮＦαノックアウトヒトＮＢ細胞株を用いたとき、ＮＢ細胞ではなく単球が、インビトロでの共培養中にＴＮＦαを産生することが明らかになった。さらに、ＮＢにおいて、可溶性ＴＮＦαの分泌を防ぐＴＮＦα変換酵素阻害剤、ならびにＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９によって作製されたＴＮＦＲ１およびＴＮＦＲ２のノックアウト（ＫＯ）を用いたとき、ＮＢ由来のＴＮＦＲ２および単球由来のｍＴＮＦαが、公知のＮＢ成長因子である炎症促進性ＩＬ－６の産生につながる単球におけるＮＦ－κＢ経路の活性化に必要であることが見出された。対照的に、ＮＢ由来のＴＮＦＲ１は、ＮＢ細胞においてＮＦ－κＢシグナル伝達の下流の活性化に単球由来のｓＴＮＦαを必要とした。ＴＮＦＲ１またはＴＮＦＲ２ではなくＴＮＦαの中和は、ＮＢ細胞と単球の両方においてＮＦ－κＢの活性化を妨げ、コントロールと比べてＩＬ－６産生を最大６０％低下させた。
本明細書中に包含される実施形態は、ＴＮＦＲ１を発現しているＮＢ細胞が、接触依存性のｍＴＮＦαシグナル伝達を介して単球を活性化し、それにより、ＮＦ－κＢの活性化、ならびにＮＢの進行および治療抵抗性の公知の駆動物質であるＩＬ－６の産生がもたらされることを実証する。これらの知見は、新薬の開発につながるようなＮＢにおける新規の腫瘍促進性炎症機構を明らかにする。
本明細書中に包含される実施形態において、エタネルセプトは、腫瘍促進性炎症を無くし、神経芽細胞腫を含む癌の有効な免疫療法の原動力を提供する。神経芽細胞腫によるＴＮＦＲ２の発現は、単球上のｍＴＮＦαを介して逆方向にシグナル伝達し、ＮＦ－ｋＢの下流の活性化をもたらす。単球におけるＮＦ－ｋＢの活性化は、ＮＢにおいて下流のＳＴＡＴ３を活性化するＩＬ－６ならびにＮＢにおいてＴＮＦＲ１を介してＮＦ－ｋＢを活性化するｓＴＮＦのような、腫瘍促進性サイトカインを産生させる。これらの機能は、一体となって、ＮＢの生存および増殖の増大を促進する。エタネルセプトは、両方のＴＮＦアイソフォームを効果的に中和して、単球のＮＦ－ｋＢ活性化およびＩＬ－６産生を阻止し、腫瘍成長を低減する（図９）。
ＩＩ．実施例２：ＮＢは接触およびＮＦ－ｋＢに依存する機構において単球のＩＬ－６産生を誘導する
ＮＢ細胞株を単球と４：１の比で共培養した。上清の解析により、ＮＢ細胞を単球と共培養したとき、単独で培養されたＮＢ細胞または単球と比べてＩＬ－６産生が有意に増加したことが示された（図１Ａ）。ＮＢ条件培地中で培養された単球は、コントロール培地と比べてＩＬ－６の産生を増加させなかったのに対して、ＮＢ細胞と直接培養された単球は、ＩＬ－６産生を増加させた（図１Ｂ）。ＩＫＫ阻害剤は、ＮＢ－単球共培養物においてＩＬ－６産生を逆転させた（図１Ｃ）。
ＩＩＩ．実施例３：ＮＢは機能的ＴＮＦＲを発現する
試験されたすべてのＮＢ細胞株が、ＴＮＦＲ１とＴＮＦＲ２の両方を発現した（図２Ａ）。ｒｈＴＮＦαで処置されたＮＢ細胞株（図２Ｂ）または単球と共培養されたＮＢ細胞株（図２Ｃ）は、無処置のＮＢ細胞と比べてＩκＢα発現の減少傾向を示した。
ＩＶ．実施例４：ＴＮＦＲ１およびＴＮＦＲ２はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子編集を用いて首尾良くノックアウトできる
ＮＢ細胞のＴＮＦＲ１およびＴＮＦＲ２を、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子編集を用いてノックアウトした。ＴＮＦＲ１をコードする遺伝子からエキソン２～５を除去し、ＴＮＦＲ２をコードする遺伝子からエキソン２を除去した（図３Ａ）。ＰＣＲにより、ＴＮＦＲ１およびＴＮＦＲ２においてそれぞれ９９％および１５％の編集効率が確かめられた（図３Ｂ）。単一のクローンを拡大し、それらのレセプターの発現についてアッセイした。フローサイトメトリーにより、それぞれのクローン細胞集団においてＴＮＦＲ１とＴＮＦＲ２の両方のノックアウトの成功が明らかになった（図３Ｃ）。
Ｖ．実施例５：ＮＢ ＴＮＦＲ２は単球の活性化に不可欠である
ＴＮＦＲ１ノックアウト（ＫＯ）、ＴＮＦＲ２ ＫＯおよび野生型のＮＢ細胞を、単独で培養するか、または単球と共培養した。単球と培養したとき、野生型およびＴＮＦＲ２ ＫＯ細胞ではＩκＢαのレベルが低下したが、ＴＮＦＲ１ ＫＯ細胞は、変化がなかった（図４Ａ）。単球と野生型およびＴＮＦＲ１ ＫＯのＮＢ細胞と共培養物ではＩＬ－６レベルが高かったが、単球とＴＮＦＲ２ ＫＯ ＮＢ細胞との共培養物は、単独で培養された単球で見られたレベルに近いＩＬ－６レベルを示した（図４Ｂ）。
ＶＩ．実施例６：単球ｍＴＮＦａは単球の活性化に不可欠である
ＮＢ細胞と単球との共培養物は、ＴＡＰＩ（膜結合型ＴＮＦαから可溶性ＴＮＦαへの変換を減少させる）とともに培養されたとき、ＩＬ－６レベルによって測定される単球の活性化を、ビヒクルコントロールと比べて増大させた（図５Ａ、図５Ｂ）。ＴＡＰＩは、単球における細胞内のＩκＢα発現に対して効果がなかった（図５Ｃ）。
ＶＩＩ．実施例７：研究グレードのＴＮＦ中和抗体は腫瘍促進性炎症を低減する
ＴＮＦα抗体、ＴＮＦＲ１抗体、ＴＮＦＲ２抗体またはアイソタイプコントロール抗体の存在下におけるＮＢ細胞と単球との共培養物は、ＴＮＦαの阻止により、ＮＢ細胞と単球の両方においてＩκＢαレベルがアイソタイプコントロールと比べて上昇したことを明らかにした（図６Ａ、図６Ｂ）。３つのＴＮＦ抗体がすべて、アイソタイプコントロールと比べてＩＬ－６産生を減少させた（図６Ｃ）。
ＶＩＩＩ．実施例８：エタネルセプトはインビトロにおいて腫瘍促進性炎症を妨害する
単球と共培養され、ＴＮＦ阻害剤であるエタネルセプトで処置されたＮＢ細胞株ＳＫ－Ｎ－ＡＳは、ＩｇＧコントロールと比べてＴＮＦαおよびＩＬ－６のレベルの低下を示した（図７Ａ）。また、エタネルセプトは、単球のＩκＢαレベルを高めるのと同時に、単独で培養されたＮＢ細胞で見られるレベルにまでＩκＢαレベルを回復させた（図７Ｂ、図７Ｃ）。
ＩＸ．実施例９：エタネルセプトはインビトロにおいて単球誘導性のＮＢの成長を減少させる
ＮＢ細胞株ＣＨＬＡ－２５５およびＳＫ－Ｎ－ＡＳを、ルシフェラーゼを発現するように改変した（それぞれＣＨＬＡ－２５５－ｌｕｃおよびＳＫ－Ｎ－ＡＳ－ｌｕｃ）。ＣＨＬＡ－２５５－ｌｕｃは、ｒｈＴＮＦ濃度が上昇しても生存可能なままだったのに対して、ＳＫ－Ｎ－ＡＳ－ｌｕｃの生存率は、ｒｈＴＮＦ濃度の上昇に伴って低下した（図８Ａ）。具体的な実施形態において、それら２つの細胞株の差は、単球の添加を起源とする。ＴＮＦは、生存促進性のシグナル伝達と死滅促進性のシグナル伝達の両方を、同じレセプターを介して誘導できる。ＴＮＦ曲線において、ＣＨＬＡ－２５５は、細胞死を起こさないが、ＳＫ－Ｎ－ＡＳは、細胞死を起こす。これを共培養物に適用すると、単球は、ＮＢと共培養されたとき、ベースラインレベルのＴＮＦおよび高レベルを産生する。ゆえに、ＩｇＧ条件においてそれら２つの株の間に見られる効果は、ＩｇＧではなく、単球の添加およびそれらが産生するサイトカインのせいである。ＣＨＬＡ－２５５では、細胞死が生じないので、それらの細胞は、ベースラインを超えて多く増殖するとみられ、エタネルセプトがこれを低減する。ＳＫ－Ｎ－ＡＳでは、単球によって産生されるＴＮＦが、ＩｇＧ条件において細胞死を引き起こすのにおそらく十分であり、それは、少なくともある特定の実施形態において、エタネルセプトを加えることによってレスキューされる。
エタネルセプトは、ＮＢ細胞に対する単球誘導性のＴＮＦシグナル伝達の効果を逆転させた（図８Ｂ）。
Ｘ．実施例１０：エタネルセプト処置はインビボにおいて単球誘導性の腫瘍成長を無くす
ＮＳＧマウスに、ルシフェラーゼ標識されたＮＢ細胞（ＳＫ－Ｎ－ＡＳ）を、マトリゲルに包埋された単球ありおよびなしで注射した。１００μｇのエタネルセプトまたはＩｇＧコントロールによって週２回処置しながら、腫瘍を成長させた。エタネルセプト処置は、ＩｇＧコントロールと比べて腫瘍の成長を有意に減少させた（図９Ａ～図９Ｃ）。その後の、異なるＮＢ細胞（ＣＨＬＡ－２５５）および異なる単球を用いた研究も、類似の結果を示した（図１１Ａ～図１１Ｃ）。
ＸＩ．実施例１１：ＮＢは細胞接触およびＴＮＦαに依存的な様式で単球を活性化する
以前の研究は、単球をＣＨＬＡ－２５５ ＭＹＣＮ非増幅型ＮＢ細胞と共培養すると、ＩＬ－６を産生するように単球が誘導されることを実証した（９）。この応答が、ＮＢ細胞のＭＹＣＮ増幅状態と関係するかを判定するために、単球を、４つのＭＹＣＮ増幅型（Ａ）ＮＢ細胞株および４つの非増幅型（ＮＡ）ＮＢ細胞株と共培養したところ、すべての株が、ＭＹＣＮの状態を問わずＩＬ－６を産生するように単球を誘導したことが見出された（Ｐ＜０．００１、図１２Ａ）。ＩＬ－６産生を誘発するためにＮＢ細胞と単球とが直接接触しなければならないかを調べるために、２人のドナー由来の単球を、ＣＨＬＡ－２５５ＮＢ細胞との共培養とするか、またはＣＨＬＡ－２５５細胞で１週間条件付けられた培地において単独で培養した。２４時間後、条件培地中の単球は、コントロール培地中で培養された単球よりも有意に多いＩＬ－６を産生しなかった。対照的に、ＣＨＬＡ－２５５細胞と共培養された単球は、ＩＬ－６産生を強くアップレギュレートしたことから、その効果が接触依存性であることが示唆された（Ｐ＜０．０００１、図１２Ｂ）。
単球およびマクロファージにおいて、カノニカルなＮＦ－κＢシグナル伝達経路は、ＩＬ－６産生を誘導する主要な経路である（１７）。ＮＢ－単球共培養物を、カノニカルなＮＦ－κＢシグナル伝達を阻止するＩＫＫ阻害剤ＶＩＩ（ＩＫＫｉ）で処置したところ、単球からのＩＬ－６と可溶性（ｓ）ＴＮＦαの両方の産生の用量依存的消失が観察された（図１２Ｃ、図１２Ｄ、図１９）。これらの結果は、ＮＢ－単球共培養中のこれらのサイトカインの産生におけるカノニカルなＮＦ－κＢシグナル伝達の重要性を浮き彫りにする。ＴＮＦαが、ＮＦ－κＢ経路の主要な活性化因子であることを考えて、次いで、その共培養物における単球の活性化に対するＴＮＦα中和の効果を評価した。抗ＴＮＦα抗体による処置は、アイソタイプ抗体で処置されたコントロールと比べて、単球のＩＬ－６産生を６０％減少させ（図１２Ｅ）、ＩκＢαレベルを３５％上昇させた（図１２Ｆ）。ＩκＢαは、ＮＦ－κＢを細胞質に隔離して、下流のシグナル伝達を阻止する。ゆえに、ＩκＢα発現は、ＮＦ－κＢシグナル伝達の活性と逆相関する（１８）。まとめると、これらのデータは、ＮＢ細胞が、下流のＩＬ－６産生をもたらすかつＴＮＦαを必要とする、単球におけるＮＦ－κＢシグナル伝達を接触依存的様式で活性化することを実証している。
ＸＩＩ．実施例１２：単球のｍＴＮＦαはＮＦ－κＢ活性化および腫瘍形成促進性炎症を媒介する
次に、共培養物内のＴＮＦαの産生に対するＮＢ細胞および単球のそれぞれの寄与を評価した。ＣＨＬＡ－２５５細胞は、ＬＰＳで刺激した後であってもＴＮＦαを発現しないこと（＜０．１％）ことが見出された。逆に、ＬＰＳで刺激された単球の大部分がＴＮＦαを発現し（＞６５％ＴＮＦα＋細胞）、低レベルの基本的発現が観察された（２％ＴＮＦα＋）（図１３Ａ）。
さらに、８つのＮＢ細胞株のパネルが、ｑＲＴ－ＰＣＲによって、ＴＮＦ ｍＲＮＡ発現を示さなかった（図２０Ａ、図２０Ｂ）。これを検証するために、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を用いてＴＮＦαノックアウト（ＫＯ）ＮＢを作製した（図２０Ｃ）。ＫＯ系を検証するために、標準的なＴＮＦαポジティブコントロールである単球性白血病細胞株Ｕ９３７において、ＴＮＦαをコードするＴＮＦ遺伝子の首尾よいＫＯを作製した後、ＣＨＬＡ－２５５ＫＯ単一細胞クローンを作製した（図２０Ｄ～図２０Ｇ）。野生型ＣＨＬＡ－２５５と比べて、ＴＮＦα ＫＯとの単球の共培養は、類似のＩＬ－６産生レベルをもたらしたことから、単球が、これらの共培養物におけるＴＮＦαの起源であることが示唆された（図１３Ｂ）。
ＴＮＦαは、細胞内において２つの異なるアイソフォーム：三量体の膜貫通タンパク質（ｍＴＮＦα）およびＴＮＦα変換酵素（ＴＡＣＥ）によってｍＴＮＦαから切断された可溶性サイトカイン（ｓＴＮＦα）として発現される（１９、２０）。これらのアイソフォームは、異なる細胞機能を発揮し、ＴＭＥにおいて異なるシグナル伝達を調節すると以前に報告されている（２１）。単球におけるＮＦ－κＢ活性化に対する各アイソフォームの寄与を評価するために、共培養物を、ｍＴＮＦαの切断を阻害することによってｓＴＮＦαの形成を阻止するＴＡＣＥ阻害剤ＴＡＰＩで処置した。ＴＡＰＩによる処置により、ｍＴＮＦαに対する表面染色が４０％増加し、ＮＢ－単球共培養上清中のｓＴＮＦαレベルが９０％低下した（図１３Ｃ、図１３Ｄ）。このｓＴＮＦαの減少にもかかわらず、ＴＡＰＩ処置は、ビヒクルコントロールと比べて、共培養上清中のＩＬ－６レベルを有意に上昇させた（Ｐ＝０．０２９２）；さらに、処置された共培養物が、コントロール群と類似の細胞内ＩκＢαレベルを有したので、ＴＡＰＩ処置は、ＮＦ－κＢ活性化に影響しないとみられた（図１３Ｅ、図１３Ｆ）。まとめると、これらの知見は、ｓＴＮＦαではなく単球由来のｍＴＮＦαが、ＮＢ細胞との共培養中に下流のＩＬ－６産生をもたらすＮＦ－κＢシグナル伝達を単球において活性化するのに十分であることを実証している。
ＸＩＩＩ．実施例１３：ＴＮＦＲ１およびＴＮＦＲ２はＮＢ細胞と単球との間の腫瘍形成促進性シグナル伝達ループにおいて別々の役割を果たす
ＴＮＦαは、ＴＮＦαレセプター１および２（ＴＮＦＲ１／２）を介してシグナル伝達し、分泌型が主にＴＮＦＲ１と相互作用し、膜結合型がＴＮＦＲ２と相互作用する。ＴＮＦＲ１および２は、異なるシグナル伝達機構を用い、両方ともが、細胞特異的様式で生存経路および死滅経路を駆動する（２２）。ＮＢ細胞株のパネルにおけるＴＮＦＲ１および２の発現を評価したところ、すべての株が両方のレセプターを発現することが見出され、ＳＫ－Ｎ－ＡＳおよびＳＫ－Ｎ－ＢＥ（２）が、最も高いレベルを発現し（図１４Ａ）；表面発現は、ＴＮＦＲＳＦ１Ａ（ＴＮＦＲ１をコードする）およびＴＮＦＲＳＦ１Ｂ（ＴＮＦＲ２をコードする）ｍＲＮＡの発現とも相関した（図１４Ｂ、図１４Ｃ）。
次に、ＳＫ－Ｎ－ＡＳ、ＣＨＬＡ－２５５（両方ともＭＹＣＮ－ＮＡ）およびＳＫ－Ｎ－ＢＥ（２）（ＭＹＣＮ－Ａ）ＮＢ細胞株において、ＴＮＦＲ１（ＴＮＦＲＳＦ１Ａ ＫＯ）とＴＮＦＲ２（ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ ＫＯ）の両方について単一細胞ＫＯクローンを作製した（図２１Ａ、図２１Ｂ）。ＣＨＬＡ－２５５およびＳＫ－Ｎ－ＡＳ ＴＮＦＲ１／２ＫＯクローンは、評価できるようになる前に分化するとみられた（図２２Ａ）；ＳＫ－Ｎ－ＢＥ（２）ＴＮＦＲ１／２ＫＯクローンは、最小の表現型の変化を示したが（データ示さず）、野生型細胞と比べて高レベルの神経分化マーカー成長関連タンパク質４３（ＧＡＰ４３）およびエノラーゼ－２（ＮＳＥ）を発現した（図２２Ｂ～図２２Ｅ）。これらの知見は、ＴＮＦＲ１およびＴＮＦＲ２が、ＮＢを低分化状態で維持する際に固有の役割を有し得ることを示唆している。
注目すべきことに、ＳＫ－Ｎ－ＢＥ（２）ＫＯクローンの場合、残っているレセプターの発現（ＴＮＦＲ１ ＫＯにおけるＴＮＦＲ２、ＴＮＦＲ２ ＫＯにおけるＴＮＦＲ１）の代償的増加は観察されなかった（図２１Ｃ）。ゆえに、ＮＢ－単球共培養物内のＴＮＦαシグナル伝達における各ＴＮＦＲの役割を明らかにするために、これらのＳＫ－Ｎ－ＢＥ（２）ＴＮＦＲ１／２ＫＯクローンを、単離されたばかりの単球と培養し、２４時間後にＩＬ－６レベルを評価した。ＮＢにおけるＴＮＦＲ２ ＫＯだけが、単球の活性化に影響して、共培養物のＩＬ－６レベルを８０％低下させたことが見出された（図１４Ｄ）。これらの知見は、ＮＢのＴＮＦＲ２が、単球におけるＩＬ－６産生の誘導にとって極めて重要であることを実証しており、これは、ｍＴＮＦαが単球側においてこの誘導を媒介するという観察結果と一致する。
ＮＢ自体に対するＴＮＦＲ１／２ＫＯの影響を測定するために、単球との共培養の後に、ＮＦ－κＢ活性化に対する読み出し情報としてＩκＢα発現レベルを計測した。ＮＢのＮＦ－κＢ活性化は、ＴＮＦＲ２ではなくＴＮＦＲ１をコードする遺伝子がノックアウトされたときだけ、影響されることが見出され、これは、野生型コントロールと比べたときの、単球との共培養後のＩκＢαレベルの相対的上昇によって示される（図１４Ｅ）。いくつかの実施形態において、ＴＮＦＲ発現が最も高いＮＢ細胞株においてより活性であると見出されたＮＢのＮＦ－κＢシグナル伝達をさらに調査するために（図２３Ａ）、この活性化に対するＴＮＦαおよび／またはＩＬ－６の寄与を探求した。ＴＮＦα、ＩＬ－６、ＩＬ－６および分泌型（ｓ）ＩＬ－６Ｒα、または３つすべてで処置されたＮＢ細胞株において、ＴＮＦαは、無処置のコントロールと比べてＩκＢαレベルを低下させた。これは、ＩＬ－６とｓＩＬ－６Ｒαとの組み合わせにおいてより顕著になった（図２３Ｂ）。ＮＢのＮＦ－κＢ活性化におけるＴＮＦＲ１およびＴＮＦαの重要性が確立されたので、この活性化が、特定のＴＮＦαアイソフォームに依存するかを判定した。ｓＴＮＦα産生を阻止するＴＡＰＩで処置されたＮＢ－単球共培養物は、ビヒクルコントロール群と比べて、ＩκＢα発現レベルの有意な上昇を示したことから、ＮＢ細胞においてｓＴＮＦαがＮＦ－κＢシグナル伝達を活性化することが示唆された（図２３Ｃ）。まとめると、これらの結果は、ＴＮＦＲ１を介したｓＴＮＦαシグナル伝達が、単球と共培養されたＮＢにおいて腫瘍形成促進性ＮＦ－κＢ活性化をもたらすことを示唆している。
ＸＩＶ．実施例１４：ＴＮＦαの中和はインビトロにおいて腫瘍促進性炎症を低減する
ここまで提示した結果は、ＮＢのＴＮＦＲ２が単球表面上のｍＴＮＦαの逆向きのシグナル伝達を活性化して、ＮＦ－κＢの活性化ならびにＩＬ－６およびｓＴＮＦαを含む腫瘍形成促進性サイトカインの産生をもたらす機構を説明している。ＮＢのＴＭＥにおいてＴＮＦαシグナル伝達を標的化することの潜在的な治療効果を評価するために、単球と共培養されたＮＢ細胞株のパネルを、研究グレードのＴＮＦα中和抗体、ＴＮＦＲ１中和抗体およびＴＮＦＲ２中和抗体で処置し、ＮＦ－κＢ活性化およびＩＬ－６産生に対する効果を評価した。すべての細胞株で平均すると、ＴＮＦα中和抗体だけが、単球とＮＢの両方においてＩκＢα分解を減少させた（図２４Ａ、図２４Ｂ）。すべての抗体が、ＩＬ－６レベルを低下させたが、ＴＮＦαの中和が、すべての細胞株にわたってＩＬ－６レベルを最も大きく低下させた（４０～７０％の範囲の低下）（図２４Ｃ）。
この機構の臨床的関連を探索するために、両方のＴＮＦαアイソフォームによるシグナル伝達を中和するＦｃ－ＴＮＦＲ２融合タンパク質である、ＦＤＡが承認したエタネルセプト（２３）を使用した。ＮＢ－単球共培養物をエタネルセプトで処置すると、ｓＴＮＦαおよびＩＬ－６の産生がほぼ完全に阻止され、単球およびＮＢにおけるＩκＢα分解がそれぞれ完全および部分的に逆転した（図１５Ａ～図１５Ｄ）。次に、マルチプレックスＬｕｍｉｎｅｘサイトカインアレイを行って、エタネルセプト処置後の共培養物におけるサイトカイン産生の全体的な変化を評価した。ＣＨＬＡ－２５５－単球共培養物では、９つのサイトカイン／ケモカイン（Ｇ－ＣＳＦ、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１α、ＩＬ－１β、ＩＬ－６、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２－ｐ４０、ＩＰ－１０、ＭＩＰ－１β）が、ＮＢ単独または単球単独と比べて誘導されるかまたは有意にアップレギュレートされることが見出された。エタネルセプト処置によって、９つすべてのサイトカイン／ケモカインの誘導／アップレギュレーションが完全に逆転した（図１５Ｅ、図２９）。これらの結果は、さらなるＮＢ細胞株と共培養された複数の単球ドナーにわたって一貫していた（ＳＫ－Ｎ－ＡＳおよびＳＫ－Ｎ－ＢＥ（２）、図２５Ａ、図２５Ｂ）。
特に、エタネルセプト処置は、ＮＢ－単球共培養物において著しい巨視的変化ももたらし、そのような処置がなければ低接着プレートにおいて容易に形成する腫瘍スフェア（ｔｕｍｏｒｓｐｈｅｒｅ）クラスターにまとまるＮＢ／単球の能力を阻止する（図２６Ａ）。さらに、単球を接着性ＮＢ単層の上に播種したとき、エタネルセプトによる処置は、ＮＢ単層へのＣＤ１４＋単球の接着を減少させた（図２６Ｂ）。これは、ＴＮＦαがＮＢと単球との接触依存性の相互作用を媒介するというさらなるエビデンスを提供する。
ＮＢの成長および生存能に対するエタネルセプトの影響をより綿密に調べるために、ＮＢのみのベースラインコントロールを基準とする成長／生存能に対する読み出し情報としてＮＢルミネセンスを用いて、ホタルルシフェラーゼで標識されたＣＨＬＡ－２５５（ＣＨＬＡ－２５５－ｌｕｃ）を、単球と共培養し、エタネルセプトで処置した。コントロールＩｇＧモノクローナル抗体の存在下におけるＮＢ細胞と単球との共培養は、単独で培養されたＮＢ細胞と比べてルミネセンス強度を有意に上昇させた（Ｐ＝０．０００８）；その共培養物にエタネルセプトを加えると、ＮＢ細胞に対する単球の効果が完全に消失した（Ｐ＝０．０４２９、図１５Ｆ）。これがＮＢ細胞の増殖の減少に起因するのかを調べるために、ＣＨＬＡ－２５５細胞にＣｅｌｌＴｒａｃｅ Ｖｉｏｌｅｔ（ＣＴＶ）をパルスし、その細胞をエタネルセプトの存在下において単球と共培養した。これらの条件下において、単球が、複数回の分裂を起こしているＮＢ細胞のパーセンテージの有意な上昇を誘導したことが見出され（４７％～６８％，Ｐ＜０．０００１）、これは、その後、エタネルセプト処置によって５６％低下した（Ｐ＜０．０００１）（図１５Ｇ）。
これらの結果は、エタネルセプトが、ＮＢ細胞と単球との間のｍＴＮＦα／ＴＮＦＲ２シグナル伝達軸を効果的に妨害して、両方の細胞型においてＮＦ－κＢ活性化を妨げることを示している。これは、単球による腫瘍形成促進性サイトカインの産生を減少させ、最終的には、インビトロにおけるＮＢ細胞の増殖の減少をもたらす。
ＸＶ．実施例１５：ＴＮＦαの中和は腫瘍成長を減少させ、ＴＭＥを変化させる
インビボでのエタネルセプトの影響を評価するために、マトリゲルに包埋されたＣＨＬＡ－２５５－ｌｕｃおよび単球を、ＮＳＧマウスの側腹部の皮下に移植し、エタネルセプトまたはＩｇＧビヒクルコントロールで週２回処置した（図１６Ａ）。ルミネセンスの読み出し情報を用いて腫瘍成長を追跡したとき（図１６Ｂ、図１６Ｃ）、エタネルセプト処置によって、腫瘍成長がコントロールと比べて６５％減少したことが見出された（Ｐ＝０．００２４）（図１６Ｄ、図１６Ｅ）。類似の結果が、ＳＫ－Ｎ－ＡＳ－ｌｕｃ／単球異種移植片を移植されたマウスにおいても観察され、ここで、エタネルセプト処置は、腫瘍成長を３０％減少させた（Ｐ＝０．０１０４）（図２７）。重要なことには、処置された腫瘍は、血管の発生を欠くとみられ、側腹部の表面の皮下組織に限定された一方で、コントロール腫瘍は、高度に血管新生性であるとみられ、下にある傍脊椎筋に浸潤した（データ示さず）。
血管新生を定量的に評価するために、内皮細胞を識別するために通常使用されるマーカーであるマウスＣＤ３１の発現を腫瘍実質部内で評価した。腫瘍組織切片におけるＣＤ３１に対する蛍光免疫染色は、ＩｇＧコントロール腫瘍において複雑な脈管構造の形成を示した一方で、エタネルセプトで処置された腫瘍は、ＣＤ３１＋細胞が存在するにもかかわらず、明瞭な血管を形成しなかった（図１７Ａ）。これらの画像の定量により、１視野（ＦＯＶ）あたりのＣＤ３１＋領域の数が似ていることが明らかになった（図１７Ｂ）。しかしながら、エタネルセプトで処置された腫瘍では、コントロール腫瘍よりも、１ＦＯＶあたりのＣＤ３１＋領域の平均面積が有意に小さく（Ｐ＝０．００６８）、ＣＤ３１＋領域の最大直線距離によって推定される血管の長さが有意に短かった（Ｐ＝０．０１９１）（図１７Ｃ、図１７Ｄ）。全体的に、これらの結果は、エタネルセプト処置が腫瘍の血管新生を減少させるという巨視的な観察結果を裏付けた。
次に、図１６Ｅに示されている代表的なエタネルセプト処置腫瘍およびコントロール腫瘍に対して真核生物ｍＲＮＡ－ｓｅｑを行って、エタネルセプト処置に関係するＮＢ腫瘍細胞の遺伝子発現の全体的な変化を評価した。平均して、得られたリードの９３％が、ヒトゲノムにマッピングされ、６％が、マウスゲノムにマッピングされ、１％が、マッピング不可能であり、その後除外された。ＮＢ転写物（ヒト特有）のうち、エタネルセプトで処置された腫瘍において、コントロール腫瘍と比べてアップレギュレートされた遺伝子が１３８個見出され、ダウンレギュレートされた遺伝子が１１７個見出された（図１７Ｅ）。過剰提示遺伝子セット解析は、コントロールと比べてエタネルセプトで処置された腫瘍において、血管新生（ＶＥＧＦシグナル伝達経路、Ｐ＝６．８５×１０－３）、低酸素およびストレス応答（ストレスに対する細胞応答、Ｐ＝３．５６×１０－４；ＨＩＦ－１シグナル伝達経路、Ｐ＝３．９３×１０－３）、ＭＡＰＫシグナル伝達（Ｐ＝１．２６×１０－４）および神経発生（ＲＯＢＯレセプターシグナル伝達、Ｐ＝６．６０×１０－５；軸索ガイダンス、Ｐ＝１．４４×１０－４）に関連する遺伝子の発現減少を明らかにした（図１７Ｆ）。さらに、マウス間質からのシーケンシングリードが、全体的な統計的検出力を低下させたが、差次的遺伝子発現解析は、エタネルセプトで処置された腫瘍が、赤血球、血小板および好中球の浸潤も減少させることを示すことができた（図２８）。全体として、これらの結果は、エタネルセプトが、ＮＢ細胞において腫瘍の血管新生を阻止し、生存促進性のシグナル伝達を阻害することによって、インビボにおいて強力な抗腫瘍活性を示すという観察結果と一致する。
ＸＶＩ．実施例１６：ＴＮＦシグナル伝達はＭＹＣＮ非増幅型ＮＢにおいて高まり、予後不良と相関する
ＮＢと単球との腫瘍形成促進性の相互作用におけるＴＮＦαの重要性を考慮し、ＴＮＦαシグナル伝達を媒介する遺伝子の発現が予後的意義を有するかを問うた。Ｒ２ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ａｎａｌｙｓｉｓ ＆ Ｖｉｓｕａｌｉｚａｔｉｏｎプラットフォーム（ｈｔｔｐ：／／ｒ２．ａｍｃ．ｎｌ）からのデータセットを使用して、まず、炎症性シグナル伝達経路の差次的発現を、ＭＹＣＮ増幅型対非増幅型のステージＩＶ ＮＢ腫瘍において評価した。ＪＡＫ／ＳＴＡＴ、ＮＦ－κＢおよびＴＮＦαシグナル伝達経路がすべて、ＭＹＣＮ非増幅型ＮＢにおいて高度に強化されていたことが見出された（Ｐ＜０．０００１）（図１８Ａ）。カプラン・マイヤー分析を用いると、ＴＮＦＲＳＦ１Ａ（ＴＮＦＲ１）およびＴＮＦＲＳＦ１Ｂ（ＴＮＦＲ２）の高発現が、ステージＩＶのＭＹＣＮ非増幅型ＮＢを有する患者において無再発生存期間の短縮と相関した（Ｐ＝１．１×１０－８およびＰ＝５．６×１０－３，ｎ＝１０２）ことが見出された（図１８Ｂ）。遺伝子発現の教師なしクラスタリングを用いて、ＫＥＧＧ“ＴＮＦ＿Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ＿Ｐａｔｈｗａｙ”において遺伝子の差次的発現を評価し、進行したＭＹＣＮ非増幅型ＮＢ患者と進行しなかった患者とを比較した。無増悪生存期間と有意に相関する（Ｐ＝８．０×１０－３）２つの異なる遺伝子発現クラスターが見られた：高頻度の進行を有する、ＮＦ－κＢシグナル伝達（ＴＮＦＲＳＦ１Ａ、ＮＦＫＢ１、下流のサイトカインなど）を増加させていた患者（１９／２３，８３％）、および低頻度の進行を有するＮＦ－κＢシグナル伝達が低い患者（１／２６、４％）（図１８Ｃ）。全体的に、これらの結果は、特にＭＹＣＮ非増幅型ＮＢを有する患者に対して、ＴＮＦαシグナル伝達の臨床的関連を増強する。
ＸＶＩＩ．実施例１７：ある特定の実施形態において使用された方法の例
細胞培養
ＳＫ－Ｎ－ＡＳ、ＳＫ－Ｎ－ＢＥ２およびＩＭＲ－３２細胞は、ＡＴＣＣから購入し、ＣＨＬＡ－１３６、ＣＨＬＡ－２５５、ＬＡ－Ｎ－１、ＬＡ－Ｎ－５およびＬＡ－Ｎ－６は、以前に記載されたように確立し、維持した（４７）。すべての細胞株を、２０％熱失活ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）および２ｍＭ ＧｌｕｔａＭａｘ（Ｇｉｂｃｏ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）が補充された、抗生物質を含まない、Ｉｓｃｏｖｅ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｄｕｌｂｅｃｃｏ Ｍｅｄｉｕｍ（ＩＭＤＭ）中で維持した。細胞株を、マイコプラズマ汚染について２ヶ月ごとに定期的にチェックした（Ｌｏｎｚａ ＭｙｃｏＡｌｅｒｔ）。
プラスミドおよびレトロウイルス
ｐＬＸＩＮ－Ｌｕｃは、Ａｌｉｃｅ Ｗｏｎｇから寄贈された（Ａｄｄｇｅｎｅプラスミド＃６０６８３）。レトロウイルス上清を生成するために、ＧｅｎｅＪｕｉｃｅ試薬（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｓｉｇｍａ）を用いて２９３Ｔ細胞に３つのプラスミド（ｇａｇ－ｐｏｌをコードするＰｅｇ－Ｐａｍ－ｅ、ＲＤＦ１１４ウイルスエンベロープをコードするＤＲＦおよびルシフェラーゼレトロウイルス構築物を含むｐＬＸＩＮ－ｌｕｃ）をコトランスフェクトした。ウイルス上清を４８時間後に収集し、それをポリブレン（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｓｉｇｍａ）とともに用いて、ＳＫ－Ｎ－ＡＳ、ＳＫ－Ｎ－ＢＥ２およびＣＨＬＡ－２５５に形質導入した。形質導入された細胞株を、Ｇ４１８（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｓｉｇｍａ）で７日間選択して、ＣＨＬＡ－２５５－ｌｕｃ、ＳＫ－Ｎ－ＡＳ－ｌｕｃおよびＳＫ－Ｎ－ＢＥ２－ｌｕｃ株を作製した。
単球の単離
ＰＢＭＣは、Ｇｕｌｆ Ｃｏａｓｔ Ｒｅｇｉｏｎａｌ Ｂｌｏｏｄ Ｃｅｎｔｅｒから購入したバフィーコートから、Ｆｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）密度遠心分離によって単離した。Ｐａｎ Ｍｏｎｏｃｙｔｅ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ，ｈｕｍａｎ（Ｍｉｌｔｎｅｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を製造者のガイドラインに従って使用して、ネガティブ選択によって単球を単離した。ＣＤ１４およびＣＤ３３に対する表面染色によって、単球の純度を評価した。ベースラインの単球活性化およびサイトカイン産生を低減するために、精製された単球を、別段特定されない限り、超低接着（ＵＬＡ）組織培養プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）において、完全単球培地（１０％熱失活された透析済みＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）および２ｍＭ ＧｌｕｔａＭａｘを含むＩＭＤＭ）中で培養した。
共培養実験および処置
単球をＵＬＡプレートにおいて２４時間、野生型またはＴＮＦ、ＴＮＦＲ１、ＴＮＦＲ２ ＫＯ ＮＢ細胞株と直接培養した。単球およびＮＢにおけるＮＦ－ｋＢの活性化を、フローサイトメトリーによって計測し、サイトカイン産生を共培養上清のＥＬＩＳＡによって計測した。ＮＢによる単球活性化の接触依存性を評価するために、単球を、完全単球培地と１：１で混合された７日間のＮＢ条件培地を含むＵＬＡプレートにおいて２４時間培養し、ＩＬ－６の産生について解析した。単球と培養されたＮＢの成長の特長を評価するために、ＮＢ－ｌｕｃ細胞株および単球を、組織培養処理済み白色９６ウェルプレートに播種し（１：１の比）、４日間培養した。ＴＥＣＡＮ Ｓｐａｒｋプレートリーダー（ＴＥＣＡＮ）を用いて、ルミネセンスを計測した。増殖の変化を評価するために、ＮＢにＣｅｌｌＴｒａｃｅ Ｖｉｏｌｅｔ（２μＭ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を１０分間パルスし、１ウェルあたり１００，０００細胞で１２ウェル組織培養処理済みプレートに播種した。単球を、１ウェルあたり１００，０００の密度でＮＢ単層に直接加え、４日間インキュベートした。ＣｅｌｌＴｒａｃｅ Ｖｉｏｌｅｔの発現をフローサイトメトリーによって解析した。
示されている場合、ＮＢと単球との共培養物を、１０μｇ／ｍＬのＴＮＦ経路中和抗体：抗ＴＮＦα（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｃｌｏｎｅ＃１８２５）、抗ＴＮＦＲ１（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｃｌｏｎｅ＃１６８０３）、抗ＴＮＦＲ２（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｃｌｏｎｅ＃２２２１０）またはマウスＩｇＧ１コントロール（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｃｌｏｎｅ＃１１７１１）で１５分間、前処理した。エタネルセプト（Ａｍｇｅｎ）およびヒトＩｇＧコントロール（ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ）を１０μｇ／ｍＬで使用した。ＴＮＦαまたはＮＦ－ｋＢシグナル伝達の小分子阻害剤を、記載の濃度で使用した：ＴＡＰＩ－１（４０μｍ，Ｓｉｇｍａ）およびＩＫＫ阻害剤ＶＩＩ（０～２０μＭ，ＡＰＥｘＢｉｏ）。
ＣＲＩＳＰＲ
ＴＮＦα（ＴＮＦ）、ＴＮＦＲ１（ＴＮＦＲＳＦ１Ａ）およびＴＮＦＲ２（ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ）のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９媒介性ＫＯを、以前に記載されたように（４８）行った。簡潔には、ＴＮＦ、ＴＮＦＲＳＦ１ＡおよびＴＮＦＲＳＦ１Ｂの第１または第２のコーディングエキソンを標的化するシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を、ＣＲＩＳＰＲｓｃａｎを用いてデザインし、予測されるオフターゲット効果が低いものおよびオフターゲット切断頻度決定（ｃｕｔｔｉｎｇ ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ）（ＣＦＤ）スコア（４９，５０）が低いものを選択した。ｓｇＲＮＡ合成に使用したオリゴは、Ｓｉｇｍａに発注した（配列番号１３～２６）。ガイド特異的オリゴ順方向プライマー、ユニバーサル逆方向プライマーおよびｐｘ４５８プラスミドＤＮＡ鋳型からＰＣＲによって生成されたｓｇＤＮＡ中間体からＨｉＦｉ Ｔ７ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＮＥＢ）を用いてｓｇＲＮＡガイドをインビトロで転写した。ｓｇＲＮＡインビトロ反応物を、ＲＮＡ Ｃｌｅａｎ ＆ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ ２５（Ｚｙｍｏ）を用いて濃縮した。Ｃａｓ９（ＰＮＡＢｉｏ）およびｓｇＲＮＡガイドを混合し（２μｇのＣａｓ９、１μｇの各ガイド）、室温で２０分間インキュベートして、リボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体を形成した。Ｎｅｏｎ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を、最適化されたプロトコル（ＣＨＬＡ－２５５ １６００Ｖ，１０ｍｓ，３パルス；ＳＫ－Ｎ－ＡＳ ＆ ＳＫ－Ｎ－ＢＥ（２）１４５０Ｖ，２０ｍｓ，２パルス）で使用して、ＲＮＰをＮＢ細胞株にエレクトロポレートした。細胞を９６ウェル組織培養プレートに１ウェルあたり０．５細胞の密度で播種し、コロニーが目に見えるようになるまで生育した。単一細胞クローンのプレートを、Ｉｎｃｕｃｙｔｅ ｓ３ Ｌｉｖｅ Ｃｅｌｌ Ｉｍａｇｅ ｓｙｓｔｅｍ（Ｅｓｓｅｎｂｉｏ／Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）を用いて画像化し、明らかな単一クローンを含むウェルを拡大し、ゲノム欠失についてジェノタイピングした。ホモ接合性のノックアウトを配列決定し（Ｇｅｎｅｗｉｚ）、機能的ノックアウトを、フローサイトメトリーまたは溶解産物のＥＬＩＳＡを介してタンパク質発現の喪失によって確認した。
フローサイトメトリー
ＮＢおよび単球におけるＴＮＦαの発現を評価するために、まず、細胞をＧｏｌｇｉＳｔｏｐ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）の存在下においてＬＰＳ（５０ｎｇ／ｍＬ）で刺激し、ＣｙｔｏＦｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍ緩衝液（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて固定した。次いで、細胞をＴＮＦα－ＰＥ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で染色した。ＮＢ上および単球上におけるＴＮＦＲ１およびＴＮＦＲ２の発現を評価するために、細胞を、レセプター／抗体プロセシングを防ぐ０．０５％アジ化ナトリウムを含むＦＡＣＳ染色緩衝液においてＴＮＦＲ１－ＢＶ４２１およびＴＮＦＲ２－ＡＰＣ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で染色した。ＮＦ－ｋＢ発現の変化を推定するために、処置された共培養物を、まず、死細胞を対比染色するＺｏｍｂｉｅＶｉｏｌｅｔ（１μＬ／試験，Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＡＰＣ－Ｈ７ ＣＤ４５および／またはＦＩＴＣ－ＣＤ１４で染色して、単球を室温で２０分間標識した。細胞を、３７Ｃにおいて１５分間、Ｐｈｏｓｆｌｏｗ Ｆｉｘ Ｂｕｆｆｅｒ Ｉ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で固定した後、４Ｃにおいて２０分間、氷冷１×Ｐｈｏｓｆｌｏｗ Ｐｅｒｍ Ｂｕｆｆｅｒ ＩＶ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で処理した。次いで、固定し、透過処理した細胞を、室温において３０分間、ＰＥ－ＩκＢα（Ｔｏｔａｌ）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で染色した。増殖の変化を評価するために、ＣｅｌｌＴｒａｃｅ Ｖｉｏｌｅｔをパルスされ、単球と共培養されたＮＢを収集し、まず、４Ｃにおいて３０分間、ＡＰＣ－Ｈ７－ＣＤ１４（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で対比染色した。染色したサンプルを、死細胞を対比染色するための７－ＡＡＤ（１０μＬ／試験，ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を含むＦＡＣＳ染色緩衝液に再懸濁した。すべてのフローサンプルを、ＬＳＲＩＩ ５－レーザーフローサイトメーター（Ｔｅｘａｓ Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｎｔｅｒ Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ Ｃｏｒｅ，Ｈｏｕｓｔｏｎ，ＴＸ）に供し、ＦｌｏｗＪｏ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｔｒｅｅｓｔａｒ）を用いて解析した。
ウエスタンブロット
野生型およびＴＮＦＲ１／２ ＫＯ ＳＫ－Ｎ－ＢＥ（２）細胞を、プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ）が補充されたＲＩＰＡ緩衝液（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）中、氷上で２０分間溶解し、次いで、１４，０００ｒｐｍにおいて２０分間遠心した。清澄にされた溶解産物を新しいチューブに移し、Ｂｉｏ－Ｒａｄタンパク質アッセイ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を用いて濃度を測定した。サンプルを、２－メルカプトエタノールおよびＲＩＰＡ緩衝液を含む４×サンプルローディング緩衝液（ＬＩ－ＣＯＲ）で５０μｇ／４０μＬに希釈した。サンプルを、１００Ｖで６０～９０分間、１２％ＴＧＸゲル（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）において泳動した後、２０％メタノールが補充された１×ｔｒｉｓ－グリシン（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）において１００Ｖで６０分間、０．４５μｍ ＰＶＤＦ膜に湿式転写した。転写後、膜を０．５×Ｏｄｙｓｓｅｙ ＰＢＳブロッキング緩衝液（ＬＩ－ＣＯＲ）において室温で１時間ブロッキングした。１次抗体を、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を含む０．５×Ｏｄｙｓｓｅｙブロッキング緩衝液で以下の濃度に希釈し、４℃で一晩インキュベートした：抗ＧＡＰＤＨ（マウスｍＡｂ＃５１７４，ＣＳＴ，１：１０００）、抗ＧＡＰ４３（ウサギｍＡｂ＃８９４５，ＣＳＴ，１：５００）および抗エノラーゼ－２（ウサギｍＡｂ＃２４３３０，ＣＳＴ，１：５００）。以下の二次抗体を、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を含む０．５×Ｏｄｙｓｓｅｙブロッキング緩衝液で１：５０００希釈し、ＲＴで１時間インキュベートした：ＩＲＤｙｅ－６８０ヤギ抗ウサギＩｇＧおよびＩＲＤｙｅ－８００ヤギ抗マウス（ＬＩ－ＣＯＲ）。近赤外イメージングシステムであるＯｄｙｓｓｅｙ ＣＬｘ Ｉｍａｇｅｒ（ＬＩ－ＣＯＲ）を用いて、膜を撮像した。
サイトカイン解析
単球によって放出された共培養上清内のサイトカインを、Ｈｕｍａｎ ＴＮＦ－ａｌｐｈａ Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ（ＴＮＦα，Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）およびＨｕｍａｎ ＩＬ－６ Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ（ＩＬ－６，Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を製造者のガイドラインに従って使用して検出した。ＴＥＣＡＮ Ｓｐａｒｋプレートリーダー（ＴＥＣＡＮ）を用いてＥＬＩＳＡプレートを読み出した。全体的なサイトカイン制御を、以下のサイトカインを含むカスタムＬｕｍｉｎｅｘパネルを用いて評価した：ＣＸ３ＣＬ１、ＣＸＣＬ１０、ＥＧＦ、ＦＧＦ－２、Ｆｌｔ３Ｌ、Ｇ－ＣＳＦ、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１α、ＩＬ－１β、ＩＬ－１Ｒａ、ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２（ｐ４０）、ＩＬ－１２（ｐ７０）、Ｍ－ＣＳＦ、ＭＣＰ－１、ＭＣＰ－３、ＭＤＣ、ＭＩＰ－１α、ＭＩＰ－１β、ＴＧＦα、ＴＮＦα、ＴＮＦβおよびＶＥＧＦ－Ａ（Ｈｕｍａｎ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｐａｎｅｌ Ａ，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ－Ｓｉｇｍａ）。
ＲＮＡ解析
全ＲＮＡを、ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｃｒｏ Ｐｌｕｓ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて細胞ペレットから単離した。１工程ｃＤＮＡ合成およびｑＲＴ－ＰＣＲを、ＣＦＸ９６ Ｔｏｕｃｈ ＲＴ－ＰＣＲ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（ＢｉｏＲａｄ）とともにＫＡＰＡ ＳＹＢＲ Ｆａｓｔ Ｏｎｅ Ｓｔｅｐ ｑＲＴ－ＰＣＲキット（Ｒｏｃｈｅ）を用いて行った。プライマーは、Ｓｉｇｍａから入手した（配列番号１３～２６）。遺伝子発現の相対的変化を、ハウスキーピング遺伝子ＧＡＰＤＨをコントロールとして用いるΔＣｔ法に基づいて算出した。瞬間凍結した腫瘍検体を３０ｍｇの画分に分け、ＲＬＴ緩衝液（Ｑｉａｇｅｎ）中でインキュベートした。腫瘍を、手動のマイクロチューブホモジナイザー（ＢｉｏＭａｓｈｅｒ，Ｔａｋａｒａ）を用いてホモジナイズし、次いで、ＱｉａＳｈｒｅｄｄｅｒカラム（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて溶解産物を剪断した。ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｃｒｏ Ｐｌｕｓ ＫｉｔをｇＤＮＡ除去カラム（Ｑｉａｇｅｎ）とともに用いて全ＲＮＡを単離した。
３０Ｍの深さおよび１５０個のペアエンドリードを用いる真核生物のｍＲＮＡ配列決定を、Ｎｏｖｏｇｅｎｅ，Ｉｎｃが行った。ＦＡＳＴＱ配列決定ファイルに対する品質管理チェックを、ＦａｓｔＱＣによって行った（ｖ０．１１．２，ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．ｂａｂｒａｈａｍ．ａｃ．ｕｋ／ｐｒｏｊｅｃｔｓ／ｆａｓｔｑｃ／）。次いで、リードを、ｈｉｓａｔ２ ｖ２．１．０（５１）によってヒト参照ゲノム（ＧＲＣｈ３８，Ｅｎｓｅｍｂｌリリースバージョン８４）またはマウス参照ゲノム（ＧＲＣｍ３８，Ｅｎｓｅｍｂｌリリースバージョン８１）と別々にアラインメントした。ＸｅｎｏＦｉｌｔｅＲワークフロー（５２）を用いて、マウスゲノムをヒト転写物とアラインメントして、両方のゲノムにマッピングされたリードを除去したところ、ヒトにユニークなリード（ＮＢ腫瘍細胞に相当する）が得られた。逆のプロセスを、ヒトゲノムを用いてマウス転写物ファイルに対して行うことにより、マウスにユニークなリード（腫瘍微小環境）を特定した。次いで、フィルターにかけられたリードを、ｓｔｒｉｎｇｔｉｅ ｖ１．３．５（５３）を用いる転写物アセンブリおよび定量に供した。次いで、ユニークなヒト転写物およびマウス転写物を、２倍変化の発現差異およびカットオフ閾値としてｐ－ａｄｊ．＜０．０５を用いる差次的遺伝子発現解析（生カウント数に基づくＤＥＳｅｑ２ Ｒ パッケージ）に供した。
インビボ実験
６週齢の雌ＮＯＤ／ＳＣＩＤ／ＩＬ－２Ｒｙヌル（ＮＳＧ）マウスをＴｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから購入し、Ｂａｙｌｏｒ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（ＢＣＭ）の動物実験施設で維持した。８週齢になったら、以前に記載されたように（５４）成長因子低減マトリゲル（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に包埋された、１×１０６個のＣＨＬＡ－２５５－ｌｕｃ（またはＳＫ－Ｎ－ＡＳ－ｌｕｃ）または１×１０６個のＣＨＬＡ－２５５－ｌｕｃと１×１０６個のヒト単球との組み合わせ（またはＳＫ－Ｎ－ＡＳ－ｌｕｃ／単球）をマウスの右側腹部の皮下に注射した。示されている場合、１００μｇ／マウスのエタネルセプト（Ａｍｇｅｎ）またはアイソタイプヒトＩｇＧコントロール（ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ）を、全３週間の実験時間にわたって１週間に２回、マウスにｉ．ｐ．注射した。腫瘍の成長を、週に１回の生物発光イメージング（Ｓｍａｌｌ Ａｎｉｍａｌ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｃｏｒｅ Ｆａｃｉｌｉｔｙ，Ｔｅｘａｓ Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌ）によって間接的に計測した。３週間後、マウスを安楽死させ、ＩＨＣ（腫瘍ＩＨＣを参照のこと）およびＲＮＡ－ｓｅｑ（ＲＮＡ解析を参照のこと）に向けて腫瘍を保存した。
腫瘍ＩＨＣ
インビボ実験から得た腫瘍をＯＴＣ Ｍｅｄｉａ（Ｔｉｓｓｕｅ－Ｔｅｋ，ＶＷＲ）中で瞬間凍結し、５μｍの薄切片の凍結切片にした（Ｔｅｘａｓ Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌ Ｈｉｓｔｏｌｏｇｙ Ｃｏｒｅ，Ｈｏｕｓｔｏｎ，ＴＸ）。サンプルを固定し、氷冷アセトン中、－２０Ｃにおいて１０分間透過処理し、５％正常ヤギ血清（ＣＳＴ）および１％ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ）を含むＴＢＳ中でＲＴにおいて２時間ブロッキングした。ラット抗マウスＣＤ３１ １次抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，クローン３９０）を４Ｃにおいて一晩、染色緩衝液（ＴＢＳ、１％ＮＧＳ、１％ＢＳＡ）で１：１０希釈した。ヤギ抗ラットＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５９４二次抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を染色緩衝液で１：５００希釈し、室温において１時間、スライド上で遮光してインキュベートした。スライドを１μｇ／ｍＬ ＤＡＰＩ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で５分間対比染色し、蛍光マウンティング培地（Ｆｌｕｏｒｏｍｏｕｎｔ Ｇ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてマウントした。腫瘍を、ＢＣＭ Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ ｃｏｒｅ（Ｈｏｕｓｔｏｎ，ＴＸ）において偏りのない様式でＤｅｌｔａＶｉｓｉｏｎ Ｌｉｖｅ Ｈｉｇｈ－Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｄｅｃｏｎｖｏｌｕｔｉｏｎ顕微鏡（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて撮像した。ＦＩＪＩ／ＩｍａｇｅＪソフトウェア（ＮＩＨ）を用いて画像を処理し、解析した。ＣＤ３１＋染色を定量するために、画像を閾値処理し（デフォルト、最小値１８００、最大値無限大）、二進数に変換し、２５μｍ２より小さい領域を除去するＦＩＪＩ／ＩｍａｇｅＪの“Ａｎａｌｙｚｅ Ｐａｒｔｉｃｌｅ”機能を用いて解析した。これらの解析パラメータは、すべてのサンプルおよびＦＯＶにおいて使用した。
計算データ
ヒトＮＢサンプルの解析を、Ｒ２：Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ａｎａｌｙｓｉｓ ａｎｄ Ｖｉｓｕａｌｉｚａｔｉｏｎ Ｐｌａｔｆｏｒｍ（ｈｔｔｐ：／／ｒ２．ａｍｃ．ｎｌ）内の既存のデータベースを用いて行った。“Ｔｕｍｏｒ Ｎｅｕｒｏｂｌａｓｔｏｍａ－Ｋｏｃａｋ－６４９”を用いて、ステージＩＶのＭＹＣＮ－Ａ腫瘍とＭＹＣＮ－ＮＡ腫瘍との間の差次的遺伝子発現経路を解析した。“Ｔｕｍｏｒ Ｎｅｕｒｏｂｌａｓｔｏｍａ ｎｏｎ ＭＹＣＮ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ－Ｓｅｅｇｅｒ－１０２”を、ＴＮＦ（ＴＮＦα）、ＴＮＦＲＳＦ１Ａ（ＴＮＦＲ１）およびＴＮＦＲＳＦ１Ｂ（ＴＮＦＲ２）遺伝子発現のカプラン・マイヤー分析のため、ならびに経路遺伝子の発現をＭＹＣＮ－ＮＡ疾患における生存と相関させるために用いた。ＴＮＦシグナルの伝達および進行を評価するために、まず、データセットを、ｐ＜０．０５および２倍発現量カットオフを用いて、進行していない患者と対比する、進行した患者における差次的遺伝子発現解析に供した。差次的に制御された遺伝子内の遺伝子セット濃縮解析（過剰提示試験）を、連続修正ありの２×２分割表解析を用いて行った。示されるような統計的検定をＲ２内で行い、ｐ＜０．０５を有意とみなした。
統計
統計解析を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ８．０ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ）を用いて行った。別段示されない限り、データの分布は、正規分布と仮定し、パラメトリック解析を行った。群間の比較は、多重比較のために推奨される事後検定補正を行う１元または２元配置分散分析を用いて行った。すべての統計的検定が両側検定であり、０．０５未満のＰ値を統計学的に有意とみなした。
研究の承認
ＩＡＣＵＣが承認したプロトコルＡＮ－５１９４に従ってＢａｙｌｏｒ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅにおいて動物実験を行った。

Figure 2023520508000002
 ＸＶＩＩＩ．実施例１８：腫瘍細胞のＴＮＦＲ２および単球の膜ＴＮＦα
本明細書中に記載されるある特定の実施形態は、ＮＢ細胞が単球を活性化して、腫瘍成長を支える自己持続式の炎症反応を惹起する新規の正のフィードバックループを定義する（図１０）。この機構の中核として、ある特定の実施形態は、ＮＢと単核球細胞との間のクロストークにおいて、分泌型と膜結合型の両方のＴＮＦαシグナル伝達に、予想外の基本的役割があることを実証する。詳細には、ＮＢ細胞のＴＮＦＲ２は、単球上に発現されたｍＴＮＦαを介して逆方向にシグナル伝達して、単球にｓＴＮＦαを産生させ、そのｓＴＮＦαはＮＢ細胞上のＴＮＦＲ１に結合し、生存促進性のＮＦ－κＢシグナル伝達を活性化する。ｓＴＮＦαに加えて、ｍＴＮＦαによって活性化された単球は、ＳＴＡＴ３活性化を介してＮＢの成長を促進すると示された、ＩＬ－６およびＧ－ＣＳＦを含むサイトカインを産生する。説明された機構における新規のＴＮＦＲ２－ＴＮＦα－ＴＮＦＲ１軸の役割と一致して、ＴＮＦαレセプターの発現およびＴＮＦα経路に関連する他の遺伝子の発現が、ＮＢ患者における予後不良を高度に予測することが見出された。重要なことには、ＦＤＡが承認したエタネルセプトでＴＮＦαを標的化すると、インビトロではＮＢ細胞による単球の活性化が阻止され、インビボでは血管新生および腫瘍成長が阻害されることから、本明細書中に包含されるいくつかの実施形態に含まれる潜在的な臨床適用への見込みが示された。
ＮＢ細胞と共培養された単球によるＮＦ－κＢおよびＣＣＬ２０の産生の活性化が、ＴＮＦαを必要とする接触依存性のプロセスであることは以前に報告されていた（２４）ことから、ＮＢと単球は、ｍＴＮＦαを介して相互作用すると示唆される。ここで、ＮＢ細胞と単球との間の細胞間接触が、実際に、単球におけるＮＦ－κＢの活性化および下流のサイトカインの産生に必要とされ、このカスケードが、単球上のｍＴＮＦαとＮＢ細胞上のＴＮＦＲ２との相互作用から始まる、というエビデンスが提供された。この機構の解明は、どのようにしてＮＢ細胞が腫瘍支持的な炎症を惹起するのかを理解する上での極めて重要な手掛かりとなる。興味深いことに、ＮＢ細胞（２４，２５）と単球（２６，２７）の両方が、ｍＴＮＦαを発現すると報告されているのに対し、試験された８つのＮＢ細胞株のいずれもが、ｑＲＴ－ＰＣＲによって検出され得るレベルのＴＮＦ ｍＲＮＡを発現しなかった。この不一致を追究するために、通常使用される抗ｍＴＮＦαモノクローナル抗体（クローン６４０１）を、検証済みのＴＮＦα ＫＯ ＮＢ細胞において試験した；これらの細胞において観察されたポジティブ染色が、この抗体の非特異的な活性を実証した（データ示さず）。さらに、ＴＮＦα ＫＯ ＮＢクローンは、野生型ＮＢと同程度に単球を活性化したことから、ＮＢ細胞ではなく単球が、ＮＢ－単球軸におけるｍＴＮＦαの妥当な供給源であることが示唆される。ＴＮＦα分泌を阻止し、ｍＴＮＦα発現を安定化させるＴＡＣＥ阻害剤で単球を処置した本明細書中の実施形態に包含される実験の結果は、ＮＢ細胞による単球の活性化における単球ｍＴＮＦαの極めて重要な役割をさらに裏付けた。単球におけるｍＴＮＦα媒介性の逆方向シグナル伝達の観察結果と一致して、ｍＴＮＦαアイソフォームは、あまり理解されていない機構を介して、リガンド（順方向シグナル伝達）とレセプター（逆方向シグナル伝達）の両方として機能すると報告されているのに対して、マクロファージおよび骨髄性細胞においてはＴＧＦβシグナル伝達に依存すると考えられている（２８）。腫瘍細胞において、ｍＴＮＦα逆方向シグナル伝達は、恒常的なＮＦ－κＢシグナル伝達を直接もたらし得る（２９，３０）。単球活性化のためのＴＮＦα供給源としてのＮＢを除去したが、ＮＢ細胞が、オートクリン形式で成長を刺激するのに十分な、検出不可能な量のＴＮＦαを産生する可能性が残っている；そのような効果は、いくつかのＮＢ細胞株のＴＮＦＲ１およびＴＮＦＲ２ ＫＯクローンにおいて観察された成長阻害および分化誘導を説明できるだろう。あるいは、この現象は、ＮＢ ＴＮＦαレセプターの自己活性化によって説明できるかもしれないが、これにはさらなる検討が必要だろう。
ＮＢ－単球の相互作用におけるＴＮＦαの必須の役割が、ＮＢ細胞のＴＮＦＲ２を模倣しているがゆえに単球ｍＴＮＦαへの結合についてＮＢ細胞のＴＮＦＲ２と競合するＦｃ－ＴＮＦＲ２融合タンパク質であるエタネルセプトを用いる実験によってさらに証明された。際だったことに、エタネルセプトが、ＮＢ細胞および単球の物理的凝集を阻止し、単球とＮＢ細胞との間の腫瘍形成促進軸を消失させ、炎症性サイトカインの完全なネットワークの形成を遮断することが見出された。エタネルセプトによる処置後の腫瘍スフェア形成の顕著な喪失は、ＴＮＦＲ２が、ＮＢ細胞と単球との相互作用を惹起するという考えをさらに裏付ける。この相互作用によって誘導されるいくつかのサイトカイン（ＩＬ－６、Ｇ－ＣＳＦ、ｓＴＮＦαおよびＩＬ－１βを含む）は、数多くの前臨床ＮＢモデルおよび臨床研究において腫瘍成長を促進すると個別に示されている（３１－３６）。
特に、ＮＢの成長、転移および治療抵抗性の支援におけるＩＬ－６の役割は、広く検討されている（９，３１，３２）。例えば、腫瘍支持的なＴＡＭは、原発性ＮＢ腫瘍においてＩＬ－６の主要な供給源であることが以前に実証されており（９）、ＩＬ－６は、ＳＴＡＴ３およびＥＲＫ１／２シグナル伝達に依存する様式でＮＢ細胞の増殖およびアポトーシス抵抗性を促進することも示されている（３１，３２）。臨床的には、ＮＢ患者の血清中および骨髄中の高レベルのＩＬ－６が、より低い無イベント生存率と関連し（３７）、ＭＹＣＮ非増幅型ＮＢ腫瘍におけるＩＬ－６Ｒの発現は、無イベント生存率と逆相関すると示されている（１０）。しかしながら、ＩＬ－６ ＫＯトランスジェニックＮＢモデルでは、ＩＬ－６が存在しないことが、腫瘍の成長に影響せず、ＳＴＡＴ３活性化もＭＹＣのアップレギュレーションも妨げなかったことから（３８）、ＩＬ－６がＮＢの進行において冗長な役割を果たしていると示唆される。実際に、他のＳＴＡＴ３活性化サイトカインが、ＮＢの成長に寄与すると示されている；例えば、Ｇ－ＣＳＦは、癌幹細胞特性を有するＮＢ細胞を支援することによって、マウス異種移植ＮＢモデルにおいて腫瘍の成長および転移を駆動する（３４，３５）。別の最近の研究は、患者由来の原発腫瘍細胞を含むＮＢ細胞が、ｓＴＮＦαおよびＩＬ－１βを産生するように単球を誘導することを示した（３６）。これらのサイトカインは、次に、ＡＲＧ２（アルギニンを異化して、ＮＢの成長を支持する代謝変化をもたらし、免疫抑制性ＴＭＥに寄与する）を発現するようにＮＢ細胞を誘導する。ＮＢ ＴＮＦＲ２と単球ｍＴＮＦαとの相互作用が、複数の腫瘍促進性サイトカインの産生をもたらす炎症反応の引き金を引き、この反応が、エタネルセプトによる処置によって終結され得るという理解により、高リスクＮＢ患者に対する有望な治療的機会が明らかになる。
治療の概念実証実験は、エタネルセプトが、インビボでも腫瘍成長に影響することを実証した。すなわち、ヒトＮＢ細胞および初代ヒト単球を移植されたＮＳＧマウスは、エタネルセプトで処置されたとき、コントロールマウス由来の腫瘍よりも小さく血管新生の少ない腫瘍を有した。このＴＭＥの破壊は、多くのタイプの癌における腫瘍血管新生、浸潤および転移における、ＴＡＭおよびそれらが産生するサイトカインの役割と一致した（３９，４０）。ＮＢ異種移植片の遺伝子発現解析から、エタネルセプトで処置された腫瘍は、ストレスおよび低酸素に応答する能力が低下していたこと、ならびにＴＮＦα、ＩＬ－６、ＩＬ－１β、および自然免疫反応中に放出される他のサイトカインによって活性化される生存促進性のＭＡＰＫ経路に関連する遺伝子の発現が低下していたことが明らかになった（４１）。ＲＡＳ－ＭＡＰＫ経路も一般に、多くのタイプの癌において機能獲得変異によって影響される（４２）；実際に、この経路における変異は、再発性ＮＢにおいて頻繁に生じることおよび不良な生存率と相関することが最近示された（４３）。これは、腫瘍によって誘導される炎症が、腫瘍進行につながり、生存促進性のＮＦ－κＢおよびＳＴＡＴ３シグナル伝達経路を活性化する、ＴＭＥを創り出すだけでなく、ＮＢ細胞において、細胞に固有の重要な発癌シグナル伝達も増強し得ることを示唆している。ゆえに、エタネルセプトと小分子ＭＥＫ阻害剤との併用は、再発性／抵抗性ＮＢに対する有望な治療的ストラテジーであり得る。免疫抑制性ＴＭＥを破壊することによって、エタネルセプトが、高リスクＮＢに対する現行の標準治療、抗ＧＤ２モノクローナル抗体ジヌツキシマブ（４４）、または現在、初期の臨床試験中であるキメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）－Ｔ細胞もしくはＣＡＲ－ＮＫＴ細胞などの養子細胞療法を含む免疫療法と効果的に併用され得るという可能性もある（４５，４６）。全体的に、腫瘍によって惹起される炎症カスケードの根底にあるこの新規の分子フィードバックループの解明は、高リスクＮＢおよび他のタイプの癌に対する、病態生理学によって推進される新しい治療的ストラテジーのデザインに影響を与えるだろう。
ＸＩＸ．実施例１９：腫瘍原性の炎症の引き金を引く相互作用
一般的な小児癌である神経芽細胞腫（ＮＢ）を有する小児における腫瘍進行および治療抵抗性は、炎症性サイトカインを産生するマクロファージの浸潤と関連することが多い。この１０年間にわたって、いくつかのグループが、マウスＮＢモデルおよび相関する臨床研究において、腫瘍の成長および転移を支持する際の、ＩＬ－６、Ｇ－ＣＳＦ、可溶性（ｓ）ＴＮＦαおよびＩＬ－１βを含む個々の炎症促進性サイトカインの役割を実証した。しかしながら、ＮＢ腫瘍支持的炎症が惹起され、伝播する機構は、依然として不明であり、合理的な治療的介入を妨げている。本明細書中のある特定の実施形態は、ＮＢと単核球細胞との間のクロストークにおけるＴＮＦαに対するこれまで予期されていなかった中心的役割を実証する。詳細には、ＮＢ細胞のＴＮＦＲ２が、単球上に発現された膜（ｍ）ＴＮＦαを介して逆方向にシグナル伝達して、単球にｓＴＮＦαを産生させ、そのｓＴＮＦαがＮＢ細胞上のＴＮＦＲ１に結合し、生存促進性のＮＦ－κＢシグナル伝達を活性化する、新規の正のフィードバックループが特定された。ｍＴＮＦαによって活性化された単球は、ｓＴＮＦαに加えて、ＩＬ－６、Ｇ－ＣＳＦおよびＩＬ－１βを含む複数のサイトカインを産生する。これらの結果は、どのようにしてこれらの異なるエフェクターサイトカインが一致協力して、腫瘍進行を駆動するかを説明する。重要なことには、ＦＤＡが承認したエタネルセプトでｍＴＮＦαとｓＴＮＦαの両方を標的化することにより、ＮＢ細胞による単球の活性化が阻止され、腫瘍原性サイトカインのネットワーク全体が遮断され、インビボにおいて腫瘍成長が阻害されることが見出された。
本明細書中の実施形態は、癌生物学の分野における主要な概念の進歩を説明し得るものであり、これは、腫瘍支持的な炎症が惹起され、伝播する機構、ならびにどのようにしてそれが高リスクＮＢを有する患者における治療の標的となり得るのかを、複雑な細部にわたって明らかにする。多くのタイプの癌における腫瘍の開始、進行および治療抵抗性における炎症性腫瘍微小環境の重要性を考慮すると、本明細書中に包含される方法、組成物、システムおよび実施形態が、多くのタイプの癌において有用である。
本開示およびその利点が詳しく説明されているが、様々な変化、置換および変更が、添付された請求項によって規定されるような設計の精神および範囲から逸脱することなく行われ得ることを理解しなければならない。そのうえ、本出願の範囲は、本明細書に記載されるプロセス、装置、製造、組成物、手段、方法および工程の特定の実施形態に限定されることは意図されない。当業者は本開示から容易に理解するように、本明細書中に記載される対応する実施形態と実質的に同じ機能を果たす、または本明細書中に記載される対応する実施形態と実質的に同じ結果を達成するプロセス、装置、製造、組成物、手段、方法または工程は、現在存在するものであろうと、または後に開発されるものであろうと、本開示に従って利用される場合がある。したがって、添付された請求項は、そのようなプロセス、装置、製造、組成物、手段、方法または工程をその範囲内に含むことが意図される。

Claims (24)

  1. 個体における神経芽腫を治療する方法であって、治療有効量の１つまたは複数の腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）阻害剤を個体に投与することを含む、方法。
  2. ＴＮＦ阻害剤が、少なくとも１つの小分子、免疫療法、細胞療法、ペプチド、ペプチド誘導体、抗体、融合タンパク質、糖タンパク質、核酸、核酸誘導体、またはそれらの組み合わせを含む、請求項１記載の方法。
  3. ＴＮＦ阻害剤が、ＴＮＦα阻害剤、ＴＮＦＲ１阻害剤、ＴＮＦＲ２阻害剤、またはこれらの組み合わせを含む、請求項１または２に記載の方法。
  4. ＴＮＦα阻害剤が、可溶性ＴＮＦα及び／又は膜結合型ＴＮＦαの阻害剤を含む、請求項３に記載の方法。
  5. ＴＮＦ阻害剤が、エタネルセプト、インフリキシマブ、セルトリズマブ、ゴリムマブ、アダリムマブ、サリドマイド、レナリドミド、ポマリドミド、キサンチン誘導体、ブプロピオン、５－ＨＴ２Ａ作動薬幻覚剤、またはこれらの組み合わせを含む請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。
  6. ＴＮＦ阻害剤がエタネルセプトを含む、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。
  7. 投与が、静脈内、皮内、経皮、動脈内、髄腔内、腹腔内、経鼻、膣内、直腸内、局所、筋肉内、皮下、粘膜、口腔内、局所、部分、吸入、注射、点滴、カテーテル経由または洗浄による持続注入である、請求項１～６のいずれか１項に記載の方法。
  8. エタネルセプトが皮下投与される、請求項６に記載の方法。
  9. １つ以上のＴＮＦ阻害剤が、神経芽腫を治療するための療法と同時または順次に投与される、請求項１～８のいずれか１項に記載の方法。
  10. 個体が神経芽腫を有するヒトである、請求項１～９のいずれか１項に記載の方法。
  11. 個体が神経芽腫を有する小児患者である、請求項１０に記載の方法。
  12. 個体における腫瘍促進性炎症を軽減する方法であって、個体からの細胞および／または細胞外液と、治療有効量の１つまたは複数のＴＮＦ阻害剤とを接触させることを含む、前記方法。
  13. ＴＮＦ阻害剤が、少なくとも１つの小分子、免疫療法、細胞療法、ペプチド、ペプチド誘導体、抗体、融合タンパク質、糖タンパク質、核酸、核酸誘導体、またはそれらの組み合わせを含む、請求項１２に記載の方法。
  14. ＴＮＦ阻害剤が、ＴＮＦα阻害剤、ＴＮＦＲ１阻害剤、ＴＮＦＲ２阻害剤、またはそれらの組み合わせを含む、請求項１２または１３に記載の方法。
  15. ＴＮＦα阻害剤が、可溶性ＴＮＦαおよび／または膜結合型ＴＮＦαの阻害剤を含む、請求項１４に記載の方法。
  16. ＴＮＦ阻害剤が、エタネルセプト、インフリキシマブ、セルトリズマブ、ゴリムマブ、アダリムマブ、サリドマイド、レナリドミド、ポマリドミド、キサンチン誘導体、ブプロピオン、５－ＨＴ２Ａ作動薬幻覚剤、またはこれらの組み合わせを含む請求項１２～１５のいずれか１項に記載の方法。
  17. ＴＮＦ阻害剤がエタネルセプトを含む、請求項１２～１６のいずれか１項に記載の方法。
  18. 腫瘍促進性炎症を低減することが、ＩＬ－６、可溶性ＴＮＦα、および／または膜結合型ＴＮＦαを低減すること、および／またはＮＦκＢおよび／またはＳｔａｔ３シグナル伝達をブロックすることを含む、請求項１２～１７のいずれか１項に記載の方法。
  19. 接触が、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｉｎ ｖｉｖｏ、及び／又はｅｘ ｖｉｖｏで起こる、請求項１２～１８のいずれか１項に記載の方法。
  20. 細胞が、ＩＬ－６及び／又はＴＮＦαを産生することができ、及び／又はＴＮＦ及び／又はＩＬ－６レセプターを発現する、請求項１２～１９のいずれか１項に記載の方法。
  21. 細胞が癌性である、請求項１２～２０のいずれか１項に記載の方法。
  22. 細胞が単球及び／又はマクロファージを含む、請求項１２～２０のいずれか１項に記載の方法。
  23. 細胞が神経芽細胞腫細胞である、請求項１２～２１のいずれか１項に記載の方法。
  24. 細胞外液が、血液、血漿、血清、間質液、腫瘍間質液、細胞培養液、またはこれらの組み合わせを含む、請求項１２～２３のいずれか１項に記載の方法。
JP2022560191A 2020-04-03 2021-04-01 ＴＮＦαシグナル伝達は治療の標的とされ得る腫瘍促進性炎症の引き金を引く Pending JP2023520508A (ja)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US202063005019P 2020-04-03 2020-04-03
US63/005,019 2020-04-03
US202063019289P 2020-05-02 2020-05-02
US63/019,289 2020-05-02
PCT/US2021/025398 WO2021202885A1 (en) 2020-04-03 2021-04-01 TNFα SIGNALING TRIGGERS TUMOR-PROMOTING INFLAMMATION THAT CAN BE TARGETED TO THERAPY

Publications (1)

Publication Number Publication Date
JP2023520508A true JP2023520508A (ja) 2023-05-17

Family

ID=77930416

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2022560191A Pending JP2023520508A (ja) 2020-04-03 2021-04-01 ＴＮＦαシグナル伝達は治療の標的とされ得る腫瘍促進性炎症の引き金を引く

Country Status (5)

Country Link
US (1) US20230103554A1 (ja)
EP (1) EP4126017A1 (ja)
JP (1) JP2023520508A (ja)
AU (1) AU2021247185A1 (ja)
WO (1) WO2021202885A1 (ja)

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20030077289A1 (en) * 2001-02-15 2003-04-24 Rong-Fu Wang Use of cell-penetrating peptides to generate antitumor immunity
WO2013040371A2 (en) * 2011-09-16 2013-03-21 Baylor College Of Medicine Targeting the tumor microenvironment using manipulated nkt cells
JP7084881B2 (ja) * 2016-06-22 2022-06-15 アルカームス インコーポレーテッド Ｉｌ－１０の免疫刺激特性および抗炎症特性を調節するための組成物および方法

Also Published As

Publication number Publication date
EP4126017A1 (en) 2023-02-08
WO2021202885A1 (en) 2021-10-07
AU2021247185A1 (en) 2022-11-03
US20230103554A1 (en) 2023-04-06

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Amor et al. Senolytic CAR T cells reverse senescence-associated pathologies
Kersten et al. Spatiotemporal co-dependency between macrophages and exhausted CD8+ T cells in cancer
He et al. Drug delivery to macrophages: a review of targeting drugs and drug carriers to macrophages for inflammatory diseases
US11186825B2 (en) Compositions and methods for evaluating and modulating immune responses by detecting and targeting POU2AF1
EP3368689B1 (en) Composition for modulating immune responses by use of immune cell gene signature
US11180730B2 (en) Compositions and methods for evaluating and modulating immune responses by detecting and targeting GATA3
US20190255107A1 (en) Modulation of novel immune checkpoint targets
US20200016202A1 (en) Modulation of novel immune checkpoint targets
US20190262399A1 (en) Compositions and methods for evaluating and modulating immune responses
Kim et al. The emerging role of eosinophils as multifunctional leukocytes in health and disease
US20200323905A1 (en) Methods and compositions for modulating the immune system
US11564905B2 (en) Compositions and methods for treating allergic inflammatory conditions
US20220387572A1 (en) Renal cell carcinoma (rcc) therapy using genetically engineered t cells targeting cd70
US20230355761A1 (en) Cd70+ solid tumor therapy using genetically engineered t cells targeting cd70
WO2021231648A2 (en) Cancer therapeutics comprising chemokine or its analog
Mitra et al. Hypertonic saline attenuates the cytokine-induced pro-inflammatory signature in primary human lung epithelia
Huangfu et al. The IL-17 family in diseases: From bench to bedside
JP6920786B2 (ja) 免疫ウイルス療法のためのｒｎａウイルス
WO2022046576A1 (en) Pancreatic ductal adenocarcinoma signatures and uses thereof
US20220362299A1 (en) Engineered natural killer cells and methods for using the same in immunotherapy and autophagy inhibiton techniques
JP2023520508A (ja) ＴＮＦαシグナル伝達は治療の標的とされ得る腫瘍促進性炎症の引き金を引く
JP2023504081A (ja) 神経膠芽細胞腫及び他の癌を処置するためのナチュラルキラー細胞免疫療法
US20220265820A1 (en) Tumor immunotherapy using sindbis viral vectors and agonist monoclonal antibodies
US20230226095A1 (en) Methods and compositions for treating coronavirus infectious disease
US20230391868A1 (en) Compositions for and methods of treating cancer

Legal Events

Date Code Title Description
A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20240315