CN103965360A - Ny-eso-1抗原及其在肿瘤免疫治疗中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种分离的多肽，其具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列；一种分离的多肽，其结构为一穿细胞肽在C-端与一个具有SEQ ID NO：15的氨基酸序列的多肽的N-端链接；一种组合物，包含所述的分离的多肽，及有关药学上可接受的载体；一种组合物，包含所述的分离的多肽，及免疫效应细胞；所述组合物在制备抗肿瘤药物中的应用；以及一种疫苗，该疫苗包含所述的组合物。

Description

NY-ESO-1抗原及其在肿瘤免疫治疗中的应用

技术领域

本发明涉及免疫学，细胞生物学及肿瘤领域。具体地说，本发明涉及提高人和动物对肿瘤的免疫反应的方法，组合物及其应用。

背景技术

肿瘤免疫治疗通过给机体输入具有抗原性的肿瘤疫苗，激发或调动机体的免疫系统而控制和杀伤肿瘤细胞。治疗性肿瘤疫苗刺激机体产生特异性抗肿瘤免疫，以达到治疗肿瘤、预防肿瘤转移和复发的目的。预防性肿瘤疫苗则用于具有遗传易感性的健康人群以控制肿瘤的发生。

肿瘤疫苗向机体输入肿瘤特异性抗原(tumor specific antigen，TSA)或肿瘤相关抗原(tumor associated antigen，TAA)。TSA或TAA来源于自体或异体肿瘤细胞。近来受到广泛研究的一个肿瘤抗原是NY-ESO-1.

NY-ESO-1是由Chen等(1997即参考文献[4]、[5])使用重组cDNA文库血清学分析技术从食管癌cDNA表达文库中筛选出来的一种肿瘤共享抗原。NY-ESO-1基因家族至少拥有3个成员，它们分别是ND-ESO-1、LAGE-1(Lethe等，1998即参考文献[15])和ESO3(Alpen等，2002即参考文献[1])，三者串连定位于Xq28(Chen等，1997即参考文献[4])。

NY-ESO-1在多种组织类型肿瘤中呈不同程度的表达。通过免疫组织化学染色(immuno-histochemistry，IHC)发现，蛋白表达频率最高的是神经母细胞瘤(82％)(Rodolfo等，2003即参考文献[19])、滑膜肉瘤(80％)(Jungbluth等，2001即参考文献[13])、恶性黑色素瘤(46％)(Barrow等，2006即参考文献[2])和卵巢上皮癌(43％)(Odunsi等，2003即参考文献[18])。RT-PCR检测显示，NY-ESO-1的mRNA在前列腺癌、膀胱癌、乳腺癌、多发性骨髓癌和肝细胞癌中有较高表达，但其中许多通过IHC检测时，其表达频率较低。其他报道的表达频率介于20％～40％的肿瘤包括肺癌、食管癌和子宫癌。表达率较低的肿瘤包括结直肠癌、肾癌、白血病和淋巴瘤。这些肿瘤或者不表达NY-ESO-1，或其表达率仅0～20％。

最近的研究表明，如果能够同时激活CD8+T细胞和CD4+T细胞，产生的免疫应答反应会更有效而持久。NY-ESO-1既具有诱导体液免疫应答的能力，也具有激活CD4⁺和CD8⁺T淋巴细胞的能力，是到目前为止被发现的免疫原性最强大的肿瘤特异性抗原。血清NY-ESO-1抗体阳性的患者中超过90％会产生NY-ESO-1特异性细胞毒性T细胞(CTL)(Jager等，2000即参考文献[10])。Jager等(1998即参考文献[11])最早鉴别出一组位于NY-ESO-1氨基酸序列第157-170位的表位多肽(p157-167，p157-165，p155-163)，这些多肽可被人类白细胞抗原(human leucocyte antigen，HLA)-A2分子提呈，从而诱导出特异性的CTL应答。根据这组多肽氨基酸序列合成的多肽，特别是HLA-2限制性的NY-ESO-1b多肽(p157-165，SLLMWITQC)，是目前多个肿瘤免疫试验中最常使用的多肽疫苗。另外，还发现此区域包含一个能被HLA-A2提呈的9肽隐蔽表位(p159-167)，它在以11肽p159-167为疫苗免疫患者后才能为CD8⁺T细胞所识别(Gnjatic等，2002即参考文献[8]；Held等，2004即参考文献[9])以及一个HLA-DP4限制性表位p157-170(Zeng等，2002即参考文献[24])。

目前，NY-ESO-1衍生多肽已被用于多种表达NY-ESO-1的肿瘤(包括恶性黑色素瘤、非小细胞性肺癌、卵巢癌、乳腺癌、膀胱癌、胃癌、神经鞘瘤、平滑肌肉瘤等)的免疫治疗临床试验，证明NY-ESO-1多肽疫苗可诱导出强大的特异性体液及细胞免疫应答，除了注射部位的轻度红肿、疼痛外，尚未发生由NY-ESO-1多肽疫苗所致的其他不良反应(Jager等，2000即参考文献[10]；Gnjatic等，2002即参考文献[8]；Jager等，2000即参考文献[12])。此外，针对NY-ESO-1抗原产生自发性免疫应答的患者，也未发生自身免疫疾病(Shackleton等，1999即参考文献[23])。

然而，如何通过操作抗原及其运载系统去打破自身免疫耐受，利用NY-ESO-1诱导出强而持久的抗肿瘤免疫能力，仍然是肿瘤免疫治疗的主要挑战。

NY-ESO-1作为一个基于肿瘤抗原某表位的多肽疫苗，容易被体内的蛋白酶降解，半衰期短，不易被抗原呈递细胞(APC)摄取，且难以进入APC胞内MHC-I类抗原呈递途径，故不能有效激发Th1、CTL保护性免疫应答，表现为弱免疫原性。

采用穿细胞肽(cell penetrating peptide，CPP)可以将抗原肽(包括自身抗原和肿瘤抗原)导入成熟的树状细胞(DC)内，可以使DC能有更多的时间来进一步将导入的肽加工处理，并通过新合成的MHC-I类分子递呈给T细胞，从而延长DC加工和递呈肽的时间(王荣福，CN02808227)。Batchu等(2005，参考文献[26])使用TAT-NY-ESO-1融合蛋白刺激树突状细胞，发现此融合蛋白能够有效进人胞浆，且经该融合蛋白处理过的树突状细胞相比使用NY-ESO-1蛋白刺激的细胞能更有效地诱导CTL介导的抗癌免疫反应，前者诱导产生的CTL细胞是后者的20倍之多(Zeng等，2006即参考文献[25])。

已从蛋白质中鉴定和筛选出几种CPPs，其中包括人类免疫缺陷病毒(HIV)的Tat蛋白(Frankel和Pabo，1988即参考文献[7])，单纯疱疹病毒的VP22蛋白(Elliott和O′Hare，1997即参考文献[27]；Phelan等，1998即参考文献[28])和成纤维细胞的生长因子(Lin等，1995即参考文献[29]；Rojas等，1998即参考文献[20])。Tat肽和穿膜序列(MTS)已在体内外将蛋白导入细胞内(Fawell等，1994即参考文献[6]；Kim等，1997即参考文献[14]；Schwarze等，1999即参考文献[21]；Lindgren等，2000即参考文献[16]；Caron等，2001即参考文献[3])。

作为治疗用的多肽抗原，理论上讲在不影响其效果的前提下，其序列长度是越短越好，以便降低生产成本和更易控制质量。然而，对于一个较短的多肽抗原，其抗原性，尤其是其作为疫苗的实际效果，很难预测。哪怕轻微的氨基酸序列变化，部有可能导致其抗原表位发生变化。简单地将某个多肽可以与CPP相连接，获得的融合体的作为一个抗原肽实际的效果，更是必须试验证明。

发明内容

为了克服本领域现有技术的缺陷，采用穿细胞肽与一具有SEQ ID NO：15的氨基酸序列的肿瘤抗原相连接，获得一种性能优异的肿瘤抗原。

在本发明的一个实施方案中，给出了一个分离的多肽，其氨基酸序列为YGRKKRRQRRRSLLMWITQCFLPV(SEQ ID NO：1)。

在本发明的一个实施方案中，给出了一种分离的多肽，其结构为一穿细胞肽在C-端与一个具有SEQ ID NO：15的氨基酸序列的多肽的N-端链接。在本发明的一个实施方案中，其中穿细胞肽具有SEQ ID NO：2-14的氨基酸序列。

在本发明的一个实施方案中，给出了一种组合物，包含如上述的分离的多肽，及有关药学上可接受的载体。

在本发明的一个实施方案中，给出了一种组合物，包含上述的分离的多肽，及一合适的免疫效应细胞。在本发明的一个实施方案中，其所述免疫效应细胞是树状细胞、B细胞、巨噬细胞和成纤维细胞。在本发明的一个实施方案中，其中所述免疫效应细胞是成熟的树状细胞。

本发明在另一个实施方案中，还给出了上述组合物在制备抗肿瘤药物中的应用。这些肿瘤可以是滑膜肉瘤、恶性黑色素瘤、和卵巢上皮癌、前列腺癌、膀胱癌、乳腺癌、多发性骨髓癌、肝细胞癌、肺癌、食管癌和子宫癌。

本发明在另一个实施方案中，还给出了一种包含上述组合物的疫苗。该疫苗可以是预防性肿瘤疫苗，也可以是治疗性肿瘤疫苗。

本发明人经过多次试验，意想不到的发现，用穿膜肽(例如YGRKKRRQRRR(SEQ ID NO：4))连接NY-ESO-1部分肽段(p157-169)，所获得的抗原不仅具有HLA-A2限制性的表位(MHC-I类表位)，还有HLA-DP4限制性的表位(MHC-II类表位)，其不仅能对HLA-A2阳性人群产生免疫反应，激活特异性CD8⁺T细胞，也能对HLA-DP4阳性人群产生免疫反应，激活特异性CD4⁺T细胞。而且，穿膜肽不仅没有影响NY-ESO-1的抗原性，还可以有效延长其在抗原呈递细胞中的存留时间，明显提高特异性CD8+T细胞的比例，并可以更有效地激活HLA-DP4阳性患者CD4+T细胞，在临床上具有良好的效果。

由于在不同人种和地区人群HLA抗原分子分布存在较大差异，所以与现有技术中以NY-ESO-1为基础的肿瘤疫苗相比，本发明的药物有更大的适用人群。

本发明的一个方面是一种分离的多肽，其结构为一合适的穿细胞肽在C-端与NY-ESO-1第157-169位的氨基酸片段SLLMWITQCFLPV(SEQ ID NO：15)的N-端链接。

本发明的一个方面是一个通过化学合成的方法，将穿膜肽序列YGRKKRRQRRR(SEQ IDNO：4)与NY-ESO-1p157-169连接成一个24氨基酸的多肽，其可以同时被HLA-A2分子(HLA-I类)和HLA-DP4分子(HLA-II类)提呈，分别激活CD8+T细胞和CD4+T细胞。

本发明的一个实施方案包括使用上述多肽直接作为一个抗肿瘤疫苗，包含SEQ ID NO：1所代表的肽和一个药学上可接受的载体。本发明的上述多肽作为一个肿瘤疫苗优点是：(1)连接了穿膜肽，容易进入抗原提呈细胞内被提呈，也可以保护多肽不被蛋白酶降解；(2)可以同时被HLA-A2分子(HLA-I类)和HLA-DP4分子(HLA-II类)提呈，分别激活CD8+T细胞和CD4+T细胞，可针对HLA-A2和HLA-DP4两种表型的人群，HLA-DP4表型人群分布可高达70％。(3)可以产生持久的免疫反应效应；(4)由于是化学合成，易于纯化及保持无菌。

在本发明的另一个特定的实施方案中，提供了一种包含免疫效应细胞，SEQ ID NO：1所代表的肽，以及制药学上可接受的载体的疫苗。

这里的免疫效应细胞可以是抗原负载的，其抗原可以是通过穿细胞肽来导入细胞内的。本领域技术人员可以用以下两种方法之一来常规制备抗原负载的树状细胞：(1)小片段肽也称抗原性肽，可以直接负载到抗原递呈细胞表面(Mehta-Damani等，1994即参考文献[30])。(2)将完整的蛋白和蛋白颗粒与抗原递呈细胞共同温育，这些蛋白质最终会被抗原递呈细胞消化并递呈到其表面。

免疫效应细胞指任何有能力在动物体内诱导T细胞反应，并能摄取和更好地递呈抗原的细胞。在特定的实施方案中，所说的免疫效应细胞是成熟的树状细胞、B细胞、巨噬细胞和成纤维细胞。在另一个特定的实施方案中，所说的免疫效应细胞是成熟的树状细胞或B细胞。在另一个特定的实施方案中，所说的免疫效应细胞是成熟的树状细胞。树状细胞是在淋巴组织和非淋巴组织中的形态相似的多样性群体的一种。这类细胞有独特的形态学特征，细胞表面有高表达的MHC II类分子(Steinman等，1991即参考文献[22])。

树状细胞的表面很特殊，它有一些树突状的突起。CDI+，CD4+，CD86+，或HLA-DR+是树状细胞表面的特征性标记。树状细胞有很强的激活MHC-限制性T细胞的能力，并能有效的在原位递呈抗原给T细胞。在T细胞发育和耐受中树状细胞递呈的是自身抗原，而在免疫反应中树状细胞递呈的是异体抗原。成熟的树状细胞指高表达MHC II类分子，CD80，和CD86的树状细胞。未成熟的树状细胞指低表达MHC II类分子，CD80，和CD86但能有效摄取抗原的树状细胞。

在本发明的另一个特定的实施方案中，提供了一种提高动物抗疾病免疫力的方法，该方法包括给动物施用本发明的疫苗。在特定的实施方案中，所说的疫苗包含成熟的树状细胞。在特定的实施方案中，所说的动物有CD4+和CD8+T细胞。在另一特定的实施方案中，树状细胞是通过注射施用到动物体内的。在另一特定的实施方案中，所说的注射是静脉注射，腹腔内注射或皮下注射。在另一特定的实施方案中，所说的动物是哺乳动物。在另一特定的实施方案中，所说的哺乳动物是人。

在本发明另一特定的实施方案中，提供了一种免疫动物的方法，该方法包括给所说的动物施用至少一次疫苗。

在本发明的另一特定的实施方案中，提供了一种治疗动物疾病的方法，该方法包括给所说动物施用至少一次本发明的肿瘤疫苗。

在另一特定的实施方案中，所说的动物还接受肿瘤治疗，其中所说的治疗是手术治疗，放射治疗，化学治疗或基因治疗。在另一特定的实施方案中，给动物施用本发明的疫苗先于肿瘤治疗。在另一特定的实施方案中，给动物施用本发明的疫苗后于肿瘤治疗。在另一特定的实施方案中，给动物施用本发明的疫苗与肿瘤治疗同时进行。

在本发明另一特定的实施方案中，提供了一种制备针对肿瘤的组合物的方法，该方法包括提供一种包含SEQ ID NO：1所述肽及药学上可接受的载体的疫苗。在另一实施方案中，该方法包括提供一种已经导入SEQ ID NO：1的肽的免疫效应细胞。

本发明的其它目的，特征及优点将在以下的详细描述中体现出来。然而，应该理解下面对本发明的特定部分所选的详细描述和特定的实施例仅仅用于举例说明，因为在本发明的精神和范围内，对于本领域技术人员而言，通过下列详细描述，各种变化和改进是显而易见的。

本发明在方法上及组合物中应用了一个特定的穿细胞肽。细胞穿细胞肽有利于所需抗原导入免疫效应细胞。这项蛋白转导技术上是已知的，在以下文献中已有描述，如Rojas等(1998即参考文献[20])和Schwarze等(1999即参考文献[21])。从HIV1819的TAT和成纤维细胞生长因子等蛋白中，已鉴定出数个CPP(Ludewig等，1999即参考文献[17]；Frankel和Pabo，1988即参考文献[7])。CPP在体内外都能够导入肽或蛋白到多种细胞。这些穿细胞肽(CPP)或其变异体部可以与本发明中的肿瘤抗原(NY-ESO-1p157-169)结合使用。

一些CPP举例如下：

1.AAVLLPVLLAAP(CPPI)(SEQ ID NO：2)

2.PQIKIWFQNRRMKWKK(ANTP)(SEQ ID NO：3)

3.YGRKKRRQRRR(HIV Tat47-57)(SEQ ID NO：4)

4.YARAAARQARA(TAT-PTD-4)(SEQ ID NO：5)

5.YARAARRAARR(TAT-PTD-5)(SEQ ID NO：6)

6.AAVALLPAVLLALLAP(信号肽I)(SEQ ID NO：7)

7.GALFLGWLGAAGSTMGAWSQPKKKRKV(信号肽II)(SEQ ID NO：8)

8.PLSSIFSRIGDP(PRES)(SEQ ID NO：9)

9.GWTLNSAGYLLKINLKALAALAKKIL(Transportan)(SEQ ID NO：10)

10.KLALKLALKALKAALKLA(Amphiphilic model peptide)(SEQ ID NO：11)

11.DAATATRGRSAASRPTERPRAPARSASRPRRPVE(HSVVP22)(SEQ ID NO：12)

12.KETWWETWWTEWSQPKKKRKV(肽载体)(SEQ ID NO：13)

13.KKKKKKGGFLGFWRGENGRKTRSAYERMCNILKGK(CL22)(SEQ ID NO：14)

在此所述的任何组合物均用可包含在试剂盒中。例如，引入SEQ ID NO：1所代表的肽的树状细胞和/或其他试剂的组合物可以包含在试剂盒中。在一个特定的实施方案中，这一组合物可以是疫苗。在另一特定的实施方案中，含有穿细胞肽的肿瘤抗原可以存放在试剂盒中，而树状细胞由另外的途径提供。试剂盒中的某些成分可以以液相或冷冻干燥的形式包装。试剂盒通常将包括至少一支小瓶，试管，培养瓶，瓶子，注射器或其它容器。如果试剂盒含有一种以上的成分，可将能包含第二，三或更多容器以便附加的成分能分别存放。但也可以将几种成分放在一支试剂瓶中。本发明的试剂盒通常可用便以商业上销售的密封容器来包装试剂盒组分。这些容器还可包括将所需的小瓶放入其中的注射或吹制的塑料容器。

试剂盒可以采用单一容器包装，也可以采用不同的容器包装每个成分。各种组合物也可以制备成针剂形式。在这种情况下，注射器，吸液管和/或其他相似的仪器，可以作为存放的容器，以便将试剂应用到身体部位的感染区，注射到动物体内，和/或用于与试剂盒中其它成分混合使用。但该试剂盒的组分也可以是干的药粉。当试剂和/或其他组分以药粉的形式提供时，可用适当的溶剂来配制。可以想象溶剂也可以存放在另外的容器中。试剂盒也可包含第二个容器用以存放无菌的制药上可接受的缓冲剂和/或其他稀释液。

不管容器的数目和/或类型，本发明的试剂盒也可与辅助把最终组合物注射/导入动物体内的器具一起包装。这些器具可以是一种注射器，吸管，镊子和/或任何医用器具。

在使用本发明的免疫治疗组合物治疗肿瘤时，其他标准的治疗方案也可以使用，如放疗和化疗。在一个特定的实施方案中，也可以使用其他的免疫治疗方法。

免疫治疗剂通常是依靠免疫效应细胞和分子识别和破坏肿瘤细胞。在免疫治疗中，肿瘤细胞必须具有能被免疫治疗试剂识别的一些标志，该标志不能出现在大多数的其它细胞上。在许多肿瘤标志中，任何一种均可作为本发明合适的靶分子。

免疫治疗一种特殊的方面就是用免疫刺激分子作为一种试剂，或更好与其它试剂连用，例如细胞因子，如IL-2，IL-4，IL-12，GM-CSF，TNF，IFN-α，β，γ；F42K和其他细胞因子类似物趋化因子，如MIP-1，MIP-1β，MCP-1，RANTES，IL-8；或生长因子如FLT3配体。

一种可用于本发明的一种较为特别的细胞因子是肿瘤坏死因子(TNF)。TNF是一种糖蛋白，能杀死某些肿瘤细胞，激活产生细胞因子，激活巨噬细胞和内皮细胞，促进产生胶原和胶原酶，是一种炎症介质，也是一种引起脓毒性体克的介质，并加速分解代谢，引起发热和嗑睡。一些感染因子通过刺激TNF的产生而导致肿瘤的消退。当TNF在有效剂量下单独使用时，毒性很大。因此理想的方法可以是用低剂量与其他药物联合使用。IFN-Y能增加TNF的免疫抑制作用，因此联合用药时，有潜在危险性。TNF和IFN-α融合物已被发现有增强抗肿瘤活性的能力。

IFN-α是另一种可用于本发明的比较特殊的细胞因子。IFN-α已被用于治疗毛细胞白血病，卡波氏肉瘤，黑色素瘤，一些良性肿瘤，肾细胞癌，卵巢癌，膀胱癌，非何杰金淋巴病，真菌引起的疾病，多发生骨髓瘤，和慢性粒细胞白血病。

为了增加本发明的疫苗治疗的有效性，可以将本发明的疫苗和其他抗肿瘤试剂联合使用。本发明中的免疫疗法也能与化疗，放疗或其他免疫治疗联用。这些抗癌试剂可以通过杀伤肿瘤细胞或阻止肿瘤细胞的增殖，包括诱导癌细胞的凋亡，降低癌细胞的生长速度，减少肿瘤转移的数目和发生，缩小肿瘤的大小，抑制肿瘤的生长，减少对肿瘤细胞的血液供给，促进对肿瘤的免疫反应，预防或阻止癌症的进程，增加患癌病人的寿命。化疗为基础的各种联合治疗剂包括，例如，顺铂(CDDD)、卡铂、甲苄肼、二氯甲基二乙胺、环磷酰胺、喜树碱、异环磷酰胺、苯丙氨酸氮芥、苯丁酸氮芥、白消安、亚硝基脲、放线菌素D、柔毛霉素、阿霉素、博来霉素、普利霉素、依托泊苷(VP16)、三苯氧胺、钙稳锭、雌激素受体结合剂、紫杉醇、Gemcitabine、长春花碱、famesyl-蛋白转移酶抑制剂、反铂、5-氟尿嘧啶、长春新碱、长春碱和氨甲喋呤，或前面所述的任何类似物或衍生物。应用于肿瘤治疗中放射线包括众所周知的γ-射线，X-射线和/或放射性同位素直接送入肿瘤细胞中，也包括如微波和紫外照射。

治疗性外科包括物理性切除或破坏全部或部分肿瘤组织的切除术外，肿瘤切除术是用物理的方法至少去除肿瘤的一部分。除肿瘤切除术外，肿瘤外科治疗还包括激光外科手术，冷冻手术，电外科手术和Microscopically Controlled Surgery(Mohs′Surgery)。值得进一步注意的是，本发明可以和去除表浅肿瘤，癌前组织及肿瘤周围附带的正常组织的外科手术联合使用。

此外，免疫治疗可以选择的在其他试剂治疗之前或之后，间隔可以从几分钟到几星期。治疗时，可以采用各种组合。

其它试剂也可以和本发明联合运用来提高治疗效果。这些试剂包括免疫调节剂及影响细胞表面受体及GAP连接上调表达的试剂，影响细胞静止或分化的试剂，细胞粘附抑制剂，及能增加高度增生的细胞凋亡敏感性的诱导剂。免疫调节剂包括肿瘤坏死因子，α，β，γ-干扰素，白细胞介素-2及其它细胞因子，F42K及其它细胞因子的类似物，MIP，MIP-1β，MIP-1，RANTES及其它的趋化因子。值得进一步重视的是，上调细胞表面受体和其他的配体如FAS/FAS配体，DR4或DR5/TRAIL等可以增强本发明通过建立起自分泌或旁分泌效应诱导高度增生性细胞凋亡的能力。增加GAP连接的数目可以增强细胞内信号转导，从而发挥对周围高度增生细胞群的抗增生作用。在某些情况下，细胞静止或分化试剂能和本发明联合运用，并提高治疗的抗增生效果。细胞粘附抑制剂也可用于提高本发明的疗效，如粘附激酶抑制剂(FAXS)和LOVASTAIN。另外，其它一些用来提高增生细胞对凋亡敏感性的试剂，如抗体C225可于本发明联合应用，从而提高治疗效果。

激素治疗也可与本发明联合使用，或与前面所述的任何方法联合使用。激素可治疗以下一些肿瘤，如乳腺癌，前列腺癌，卵巢癌和子宫颈癌，其效应是降低或阻断一些激素如睾丸酮或雌激素的作用水平。激素治疗通常与至少一种其它肿瘤治疗方案联用，以用来减少肿瘤转移的风险。

激素治疗也可与本发明联合使用，或与前面所述的任何方法联合使用。激素可治疗以下一些肿瘤，如乳腺癌，前列腺癌，卵巢癌和子宫颈癌，其效应是降低或阻断一些激素如睾丸酮或雌激素的作用水平。激素治疗通常与至少一种其它肿瘤治疗方案联用，以用来减少肿瘤转移的风险。

附图说明

下列附图是本说明书的一部分，用于进一步说明本发明的某些方面。参考这些附图，并结合下述特定实施方案的详细描述，可以获得对本发明更好的理解。

图1说明由HLA-A2阳性前列腺癌病人的外周血制备的效应T细胞识别WX001(见实施例)时检测到的IFN-γ点数，明显高于对照多肽。

图2说明从HLA-A2.1转基因小鼠分离的T细胞经WX001刺激后检测到大量的IFN-γ释放(特别是LN实验组)，表明WX001能诱导HLA-A2.1Tg转基因小鼠产生肿瘤特异性T细胞，且T细胞活性为HLA-A2.1特异性。

图3说明从HLA-A2.1转基因小鼠分离的T细胞识别了加WX001的HLA-A2.1阳性293T细胞，但没有识别单独HLA-A2.1阳性293T细胞。

图4说明WX001可被特异性CD4+T细胞和CD8+T细胞识别。

图5说明DCs/WX001免疫转基因小鼠后，与单独注射DCs组比较肿瘤明显变小。

具体实施方式

下列实施例用来说明本发明优选的实施方案。本领域技术人员应当知道，在下列实施例中公开的技术代表了发明人在实施本发明中很好地发挥作用的那些技术，因此被认为用来构成实施本发明的优选模式。然而，由于这些技术的公开，本领域技术人员知道可以对在此公开的特定实施方案作出许多技术上的改变，仍可得到相同或相似的结果，而不偏离本发明的精神和范围。

实施例1：WX001的合成，和实验动物与管理

WX001的合成选择方法为固相合成法合成受试品WX001。国内外常用的方法有Boc/Bzl和Fmoc/tBu两种方法，但由于Boc/Bzl法需要特殊的反应设备，同时使用毒性很大的氟化氢，所以我们确定采用Fmoc/tBu方法。由于WX001的C端为羧基，对于Fmoc/tBu方法，使用的树脂为羟基型HMPA树脂，利用α位保护的门冬氨酸羧基与载体羟基反应形成稳定的酯键而获得开始的载体树脂。以Fmoc-Val-HMPA树脂(100～200目，交联度为1-2％，取代值为0.2～0.6mmol NH/g)为起始原料。产品通过HPLC方法进行纯化。得到WX001白色粉末，2-8℃保存，含量：99.12％，

实验动物与管理：试验动物每组3只，体重20±2g，4-5周龄，实验动物来源于Jaxson转基因中心。动物饲养环境：温度20～25℃，湿度70％，光照明暗时间各12h，饲料为钴⁶⁰辐照的全家营养颗粒饲料，饮水经实验动物反渗透纯水机处理，装入消毒饮水瓶。

实施例2：WX001诱导肿瘤病人外周血产生肿瘤特异性T细胞

目的：采用肿瘤病人的外周血进行体外试验，观察WX001能否诱导产生肿瘤特异性T细胞，确定其有效性。

方法：(1)效应细胞制备：用CD8微磁珠(Miltenyi Biotec)从HLA-A2阳性肿瘤病人的外周血筛选CD8+T细胞，同时通过阴性选择分离制备抗原提呈细胞(APC)。第一天，1×10⁶的APC加WX001(10mg/ml)在5％CO₂、37℃培养2-3小时。APC洗涤后4000rad照射，同1×10⁵CD8+T细胞种植在10％人血清(Valley Biomedical)和RPMI1640(Invitrogen)完全培养基的96孔板。第二天，加入细胞因子(20U/ml的IL-2和10U/ml的IL-7)，效应T细胞制备完成。

(2)ELISPOT测试：稳定表达HLA-A2基因的人肾上皮细胞系293T细胞加入WX001或对照多肽(10mg/ml)，2小时后洗涤。1.5×10⁴效应细胞和5×10⁴的293T接种96孔Multiscreen板(Millipore)，预包被10μg/ml干扰素γ(IFN-γ，Endogen)抗体后培养于含2％人血清的RPMI1640。5％CO₂37℃培养20小时后，移去培养基，用2％胎牛血清(FCS)的PBS加0.005％Tween20洗涤6次，每孔加鼠抗人IFN-γ生物素标记抗体(Endogen)室温作用2小时，2％FCS的PBS加0.005％Tween20洗涤6次，链霉素结合AP(Pierce)室温1小时，2％FCS的PBS加0.02％Tween20洗涤6次，然后与制备好的BCIP/NBT混合物(Pierce)作用10-20分钟。

结果：如图1所示，加WX001时效应T细胞针对293T细胞产生的IFN-γ点数明显高于对照多肽，表明WX001能诱导前列腺癌患者外周血产生肿瘤特异性T细胞。

实施例3：WX001免疫HLA-A2.1转基因小鼠产生了特异性T细胞

目的：WX001通过直接或树突状细胞(DCs)注射HLA-A2.1转基因小鼠后用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测是否产生特异性T细胞。

方法(1)：WX001直接免疫HLA-A2.1Tg转基因小鼠：C57BL/6(B6)小鼠和转基因小鼠足底注射WX001，100mg/只。11天后，免疫小鼠的脾(SC)和淋巴节(LN)取出制备单细胞悬液，细胞(2×10⁵，200ml RPMI1640完全培养基)接种到U-型底96-孔板，加入或不加1mM WX001。18小时后取上清液，采用ELISA试验进行IFN-γ检测。

结果：如图2所示，从HLA-A2.1Tg转基因小鼠分离的T细胞经WX001刺激后检测到大量的IFN-γ释放(特别是淋巴节)，且T细胞活性为HLA-A2.1特异性，而其他实验组没有或检测到极少量IFN-γ释放。说明WX001在转基因小鼠中诱导了T细胞活化，产生了肿瘤特异性T细胞。

方法(2)：WX001通过DCs免疫HLA-A2.1Tg转基因小鼠：来源于HLA-A2.1Tg转基因小鼠的DCs细胞经WX001刺激后，静脉注射至HLA-A2.1Tg转基因小鼠，14天后分离脾和淋巴节，收集细胞用WX001体外刺激5天后作为效应细胞，表达HLA-A2.1分子的293T细胞作为刺激细胞加入或不加WX001，用ELISA试验测定上清液IFN-γ。

结果：如图3所示，加入WX001刺激的HLA-A2.1阳性表达的293T细胞检测到大量的IFN-γ释放，但没有识别未加WX001刺激的HLA-A2.1阳性293T细胞，说明转基因小鼠免疫注射后产生的肿瘤特异性T细胞可以有效识别WX001。

实施例4：WX001可被特异性CD4+T细胞和CD8+T细胞识别

目的：WX001具有HLA-A2和HLA-DP4两个抗原表位，观察WX001是否可以分别被特异性CD4+T细胞和CD8+T细胞识别。

方法：分别从外周血单核细胞中磁珠分选CD4+和CD8+T细胞，CD8-CD4-亚群作为抗原呈递细胞(APC)，5％CO₂37℃条件下，APC经WX001刺激2～3小时。APC洗涤后4000rad照射，分别同1×10⁵CD4+T细胞、CD8+T细胞种植在10％人血清(Valley Biomedical)和RPMI1640(Invitrogen)完全培养基的96孔板。第二天，加入细胞因子(20U/ml的IL-2和10U/ml的IL-7)，特异性CD4+T细胞和CD8+T细胞制备完成。以WX001分别刺激293ECIIDP4(DP4+)和293T(A2+)细胞，ELISA法检测其激活被特异性CD4+T细胞和CD8+T细胞识别后释放IFN-γ的能力。

结果：WX001特异性的CD4+T细胞可特异性地识别WX001刺激过的293ECIIDP4细胞，释放IFN-γ，而不能识别WX001刺激或未刺激的293T细胞，表明此免疫反应是通过HLA-DP4分子提呈的。

WX001特异性的CD8+T细胞可特异性地识别WX001刺激过的293T细胞释放IFN-γ，而不能识别WX001刺激或未刺激的293EC II DP4细胞，表明此免疫反应是通过HLA-A2分子提呈的。

实施例4：体内药效学试验：WX001对接种鼠前列腺癌RM1/NY-ESO-1肿瘤的转基因小鼠产生免疫治疗作用

目的：WX001通过树突状细胞免疫的HLA-A2.1转基因小鼠接种了肿瘤细胞，观察WX001对转基因小鼠身上肿瘤的生长的影响，通过体内试验证明WX001的有效性。

方法：WX001刺激过的DCs免疫接种HLA-A2.1转基因小鼠，DCs不加肽或者不处理做对照。免疫两周后，所有小鼠背脊注射2×10⁵RM1鼠前列腺癌细胞RM1，该细胞表达NY-ESO-1和HLA-A2.1分子。游标卡尺观测肿瘤生长和大小，一周两次。

结果：DCs经WX001刺激后免疫转基因小鼠诱导了免疫反应，明显抑制了肿瘤生长，说明WX001产生了抗肿瘤免疫并抑制肿瘤生长。另外，所有实验术观察到小鼠体重变化和行为异常，提示药物免疫没有毒性。

结论：WX001是化学合成的治疗性抗肿瘤多肽，具有HLA-A2和HLA-DP4两个抗原表位，可以分别被特异性CD4+T细胞和CD8+T细胞识别。在体内外均可有效地诱导免疫反应产生特异性T细胞，可以分别被特异性CD4+T细胞和CD8+T细胞识别。WX001与外周血淋巴细胞作用后，可以明显促进效应细胞干扰素的释放，说明WX001可以诱导肿瘤病人外周血肿瘤特异性T细胞的产生。WX001通过直接或树突状细胞免疫HLA-A2.1转基因小鼠，均可以检测到大量的干扰素释放，表明WX001诱导了T细胞活化，产生了肿瘤特异性T细胞。

动物试验结果证实，WX001通过树突细胞免疫接种了肿瘤的HLA-A2.1转基因小鼠，抑制肿瘤生长的效果明显高于其它试验组。

参考文献

[1]Alpen B，Gure AO，Scanlan MJ，et al.A new member of the NY-ESO-1gene family isubiquitously expressed in somatic tissues and evolutionarily conserved[J].Gene，2002，297(1-2)：141-149.

[2]Barrow C，Browning J，MacGregor D，et al.Tumor antigen expression in melanomavaries according to antigen and stage[J].Clin Cancer Res，2006，12(3Pt1)：764-771.

[3]Caron，N.J.等，Tat-eGFP融合蛋白载入肌肉细胞.分子治疗.3，310-318(2001)

[4]Chen YT， Boyer AD，Viars CS，et al.Genomic cloning and localization of CTAG，agene encoding an autoimmunogenic cancer-testis antigen NY-ESO-1，to human chromosome Xq28[J].Cytogenet Cell Genet，1997，79(3-4)：237-240.

[5]Chen YT，Scanlan MJ，Sahin U，et al.A testicular antigen aberrantly expressed in humancancers detected by autologous antibody screening[J].Proc Natl Acad Sci USA，1997，94(5)：1914-1918.

[6]Fawell，S.等，T-at介导异体蛋白进入细胞.美国国家科学院院刊91，664-668(1994)

[7]Frankel，A.D.&Pabo，C.O.HIV tat蛋白的细胞摄取.细胞55，1189-1193(1988)

[8]Gnjatic S，Jader E，Chen W，et al.CD8(+)T cell responses against a dominant crypticHLA-A2epitope after NY-ESO-1peptide immunization of cancer patients[J].Proc Natl Acad SciUSA，2002，99(18)：11813-11818.

[9]Held G，Matsuo M，Epel M，et al.Dissecting cytotoxic T cell responses towards theNY-ESO-1protein by peptide/MHC specific antibody fragments[J].Eur J Immunol，2004，34(10)：2919-2929.

[10]Jager E，NagataY，Gnjatic S，et al.Monitoring CD8+T cell response to NY-ESO-1：correlation of humoral and cellular immune responses[J].Proc Natl Acad Sci USA，2000，97(9)：4760-4765.

[11]Jager E，Chen YT，Drijfhout JW，et al.Simultaneous humoral and cellular immuneresponse against cencer-testis antigen NYESO-1：definition of human histocompatibility leukocyteantigen(HLA)-A2-binding peptide epitopes[J].J Exp Med，1998，187(2)：265-270.

[12]Jager E，Gnjatic S，Nagata Y，et al.Induction of primary NY-ESO-1immunity：CD8+Tlymphocyte and antibody responses in peptide-vaccinated patients with NY-ESO-1+cancers[J].Proc Natl Acad Sci USA，2000，97(22)：12198-12203.

[13]Jungbluth AA，Antonescu CR，Busam KJ，et al.Monophasic and biphasic synovialsarcomas abundantly express cancer/testis antigen NY-ESO-1but not MAGE-A1or CT7[J]Int JCancer，2001，94(2)：252-256.

[14]Kim，D.T.等，通过连接tat肽将可融性蛋白导入MHC-I类分子途径.免疫学杂志，159，1666-1668(1997)

[15]Lethe B，Lucas S，Michaux L，et al.LAGE-1，a new gene with tumor specificity[J].Int JCancer，1998，76(6)：903-908.

[16]Lindgren，M.，Hallbrink，M.，Prochiantz，A.& Landel，U.穿细胞肽.药理学动态.21，99-103(2000)

[17]Ludewig，B.，Odermatt，B.，Ochsenbein，A.F.，Zinkernagel，R.M.& Hengartner，H.树状细胞在诱导和维持自身免疫病中的作用.免疫学回顾169，45-54(1999)

[18]Odunsi K，Jungbluth AA，Stockert E，et al.NY-ESO-1and LAGE-1cancer-testisantigens are potential targets for immunotherapy in epithelial ovarian cancer[J].Cancer Res，2003，63(18)：6076-6083.

[19]Rodolfo M，Luksch R，Stockert E，et al.Antigen-specific immunity in neuroblastomapatients：antibody and T-cell recognition of NY-ESO-1tumor antigen[J].Cancer Res，2003，63(20)：6948-6955.

[20]Rojas，M.，Donahue，J.P.，Tan，Z.& Lin，Y.Z.有细胞膜穿透性的蛋白质的遗传工程.自然生物工程.16，370-375(1998)

[21]Schwarze，S.R.，Ho，A.，Vocero-Akban，A.& Dowdy，S.F.体内蛋白质传导：将有生物活性的蛋白导入小鼠.科学，285，1569-1572(1999)

[22]Steinman，等，免疫学年评.9：271(1991)

[23]Shackleton MJ，Sturrock S，MacGreogor D，et al.Cancer Immunosurveillance1999[C].New York：Cancer Research Institute，1999：1-9.

[24]Zeng G，Li Y，El-Gamil M，et al.Generation of Ny-ESO-1-specific CD4+and CD8+Tcells by a single peptide with dual MHC class I and class II specificities：a new strategy for vaccinedesign[J].Cancer Res，2002，62(13)：3630-3635.

[25]Zeng G，Aldridge ME，Tian X，et al.Dendritic cell surface calreticulin is a receptor forNY-ESO-1：direct interactions between tumor-associated antigen and the innate immune system[J].J Immunol，2006，177：3582-3589.

[26]Batchu RB，Moreno AM，Szmania SM，et al.Protein transduction of dendritic cells forNY-ESO-1-Based immunotherapy of myeloma.Cancer Res，2005，65：10041-10049.

[27]Elliott，G & O′Hare，P.单纯疱疹病毒结构蛋白在细胞内转移和蛋白质转运中的作用.细胞88，223-233(1997).

[28]Phelan，A.，Elliott，G.& O′Hare，P.用单纯疱疹病毒VP22来导入有功能的P53.自然生物技术.16，440-443(1998).

[29]Lin，Y.Z.，Yao，S.Y.，Veach，R.A.，Torgerson，T.R.& Hawiger，J.具有穿细胞肽和核定位的合成肽能抑制NF-_KB转录因子进入细胞核.生物化学杂志.270，14255-14258(1995).

[30]Mehta-Damani，A.等，1994免疫学杂志153：996-1003.

本说明书中引述的所有文献及所有专利/专利申请都应该视为其全文被本说明书引用。

Claims (11)

1.一种分离的多肽，其具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列。

2.一种分离的多肽，其结构为一穿细胞肽在C-端与一个具有SEQ ID NO：15的氨基酸序列的多肽的N-端链接。

3.如权利要求2所述的分离的多肽，其中穿细胞肽具有SEQ ID NO：2-14的氨基酸序列。

4.一种组合物，包含如权利要求1-3所述的分离的多肽，及有关药学上可接受的载体。

5.一种组合物，包含如权利要求1-3所述的分离的多肽，及免疫效应细胞。

6.如权利要求5所述的组合物，其中所述免疫效应细胞是树状细胞、B细胞、巨噬细胞和成纤维细胞。

7.如权利要求6所述的组合物，其中所述免疫效应细胞是成熟的树状细胞。

8.权利要求1-7所述组合物在制备抗肿瘤药物中的应用。

9.如权利要求8述的应用，其中肿瘤为神经母细胞瘤、滑膜肉瘤、恶性黑色素瘤、和卵巢上皮癌、前列腺癌、膀胱癌、乳腺癌、多发性骨髓癌、肝细胞癌、肺癌、食管癌和子宫癌。

10.如权利要求7所述的应用，其中肿瘤为前列腺癌。

11.一种疫苗，该疫苗包含权利要求3-6中所述的组合物。