JP6781403B2 - ペプチド混合物 - Google Patents

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Description

本発明は、免疫応答を惹起するＲＡＳタンパク質のペプチドを含むペプチド混合物、免疫応答を惹起するＲＡＳタンパク質のペプチド、並びにＭＨＣ分子上に提示された場合にかかるペプチドに対して特異的なＴ細胞を含むＴ細胞混合物及びＴ細胞製剤を提供する。また、本発明は、かかるペプチド混合物、並びにＴ細胞混合物及び製剤を含む医薬配合物、癌の予防及び／又は治療のためのかかるペプチド混合物、ペプチド、並びにＴ細胞の混合物及び製剤の使用、並びに癌の治療に対してペプチド混合物、ペプチド、Ｔ細胞混合物、及びＴ細胞製剤を選択する方法に関する。
癌発病の遺伝学的背景は、癌原遺伝子、癌遺伝子、及び腫瘍抑制遺伝子の改変である。癌原遺伝子は、癌遺伝子になる可能性のある細胞の正常な遺伝子である。全ての癌遺伝子はタンパク質をコードし、それによって機能する。ほとんどの場合、癌遺伝子は、シグナル伝達経路の構成要素であることが示されている。癌遺伝子は、点突然変異又は転座によって癌原遺伝子から自然に発生することにより、突然変異を持つ細胞の癌化状態をもたらす。癌は、癌遺伝子及び腫瘍抑制細胞における幾つかの変異事象を含む多段階のプロセスにより発症する。
その最も単純な形態では、癌原遺伝子における単一の塩基置換が、コードされるタンパク質の１つのアミノ酸の相違を引き起こす場合がある。
マウスの腫瘍を含む実験モデルでは、細胞内の「自己」タンパク質における点突然変異が、正常なペプチドとは単一のアミノ酸が異なるペプチドからなる腫瘍拒絶抗原をもたらす場合があることが示されている。腫瘍細胞表面における主要組織適合性（ＭＨＣ）分子との関連でこれらのペプチドを認識するＴ細胞は、腫瘍細胞を殺傷することができ、そのようにして宿主から腫瘍を拒絶する（非特許文献１）。
過去３０年間で、ヒト腫瘍抗原に対する抗体の分析に対して特別な努力がなされてきた。かかる抗体を診断及び治療の両方の目的で、例えば抗癌剤と組み合せて使用可能であることが示唆されている。１つの問題は、抗体が腫瘍細胞表面に露出される腫瘍抗原にしか結合することができないことである。この理由のため、身体の免疫系に基づく癌治療をもたらすための努力は、予想されていたほど成功していない。
抗体は、典型的には未変性の立体構造の遊離型抗原を認識し、抗原表面に露出されるほとんどの任意部位を潜在的に認識することができる。Ｂ細胞によって産生される抗体とは対照的に、Ｔ細胞は、ヒトではＨＬＡ（ヒト白血球抗原）と示されるＭＨＣ分子と関連してのみ、また通常はＭＨＣ分子の溝に適合するペプチドを生じる、そのタンパク質のタンパク質分解断片化からなる適切な抗原処理の後にのみ抗原を認識する。これによりＴ細胞に細胞内タンパク質に由来するペプチドを認識することを可能とする。したがって、ＭＨＣ分子によって腫瘍細胞の表面に提示された場合に、Ｔ細胞は腫瘍細胞のいずれかの部分に由来する異常なペプチドを認識することができる。その後、Ｔ細胞は、異常なペプチドを持つ腫瘍細胞を排除するように活性化され得る。
Ｔ細胞は、様々な機構によって癌の発症及び成長を制御し得る。細胞毒性Ｔ細胞、ＨＬＡクラスＩ制限ＣＤ８＋及びＨＬＡクラスＩＩ制限ＣＤ４＋の両方は、適切な腫瘍抗原を持つ腫瘍細胞を直接殺傷し得る。ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞は、細胞毒性Ｔ細胞応答の誘導及び維持、また同様に抗体応答、並びにマクロファージ及びリンホカイン活性化キラー細胞（ＬＡＫ細胞）の殺傷の誘導に必要である。
多くの癌遺伝子及びそれらのタンパク質生成物が同定されている。さらに、健康な人のＴ細胞レパートリーは、適切なＨＬＡ分子上に提示された場合に、１つのｐ２１ ＲＡＳ癌遺伝子産物に由来する合成ペプチドフラグメントに対する特異性を有するＴ細胞を含むことが示されている。さらに、全ての癌のおよそ２０％がＲＡＳ癌遺伝子における突然変異と関連することが予想される。
混合物中の幾つかのペプチドが免疫優性であるため、他のペプチドのＨＬＡ提示を抑制するというリスクにより、患者のワクチン接種にペプチド混合物を使用することについて大きな懸念がある（非特許文献２）。ｉｎ ｖｉｔｒｏで行われた実験より、様々な変異導入されたＲＡＳペプチドが、関連するＴ細胞に対する提示を担うＨＬＡ分子への結合に対して競合し得ること、また同じ長さであるが異なる突然変異を示すペプチドが異なる程度の効率で別の突然変異を示すペプチドの結合及び認識を阻害し得ることが知られている（非特許文献３及び非特許文献４）。これらの事実より、免疫優性の問題は、変異導入されたＲＡＳペプチドワクチンに関する問題とされている。
特許文献１は、ＲＡＳに関連する癌に対するワクチン及び癌の治療用組成物として用いられる、Ｔ細胞免疫を惹起する合成ペプチド及び癌遺伝子のタンパク質生成物のフラグメントを開示する。上記ペプチドは、癌細胞によって提示される癌遺伝子の活性なフラグメントに対応し、癌遺伝子の突然変異に対応する１又は複数の位置において突然変異を含まなければならない。この文献は、ＲＡＳタンパク質の１２位、１３位及び６１位における突然変異を開示し、具体的には、Ｇ１２Ａ、Ｇ１２Ｖ、Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２Ｓ、Ｇ１２Ｋ、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２Ｒ、Ｑ６１Ｒ、Ｑ６１Ｋ、Ｑ６１Ｌ、Ｑ６１Ｈ、Ｇ１３Ｖ及びＧ１３Ｄの突然変異のみを開示する。さらに、この文献は、ワクチンが、癌遺伝子タンパク質に最も共通して見られる突然変異を有するペプチドの選択を含んでもよいことに言及するが、いかなる具体的な組合せも示唆していない。
特許文献２は、癌ワクチンとして用いられるＴ細胞免疫を惹起する合成ペプチド混合物を考察する。該ペプチド混合物は、ＲＡＳ ｐ２１変異体ペプチドからなり、この文献は具体的にはＧ１２Ａ、Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２Ｒ、Ｇ１２Ｓ、Ｇ１２Ｖ、Ｑ６１Ｈ、Ｑ６１Ｋ、Ｑ６１Ｌ、Ｑ６１Ｒ及びＧ１３Ｄの突然変異のみを開示する。また、この文献は、ペプチドのカクテルによって惹起された免疫応答が単独のペプチドによって惹起されたものよりも著しく高かったことを開示するが、そこに具体的に開示されるもの以外のペプチドの他の組合せが有用である可能性について何ら示唆していない。
特許文献３は、特異的な細胞毒性Ｔ細胞応答（ＣＤ８＋）を誘導することができるペプチドが、ｐ２１ ＲＡＳ癌原遺伝子タンパク質の１２位及び／又は１３位、又は６１位を含む位置を含むｐ２１ ｒａｓ癌原遺伝子タンパク質の８個〜１０個のアミノ酸を含み、１２位、１３位又は６１位にアミノ酸置換を有することを開示する。また、この文献は、上記ペプチドを癌ワクチンとして、また抗癌治療用組成物において使用してもよいことを開示する。しかしながら、特に有用であるとして具体的なペプチド混合物を開示するものではない。
さらに、これらの文献のいずれもがどのようにして特定のペプチドが特定の種類の癌と関連するのかを考察しておらず、多数のペプチドを含む混合物中のペプチドの冗長性の問題を扱ってはいない。
非特許文献５は、合成変異体ＲＡＳペプチドと顆粒球マクロファージコロニー刺激因子とを組み合せてワクチン接種した膵臓の腺癌を有する患者を含む第Ｉ相／第ＩＩ相の試験を開示する。この試験は、単独のペプチドワクチン又は４つの変異体ペプチドの混合物を使用した。該混合ワクチンは、膵臓腺癌に見られる４つの最も一般的なＫ−ＲＡＳ突然変異、すなわちＧ１２Ｖ、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２Ｃ又はＧ１２Ｒの突然変異を有するペプチドで構成された。しかしながら、この文献は、有用な可能性のあるペプチドの他のいかなる組合せも開示しておらず、癌と関連するＲＡＳタンパク質の他のいかなる突然変異も開示せず、どのようにして特定のペプチドが特定の種類の癌と関連するのかを考察していない。
非特許文献６は、合成変異体ＲＡＳペプチドでワクチン接種した膵臓腺癌を有する患者の長期フォローアップを報告する。該ワクチンは、単独のＲＡＳペプチド又は７つのＲＡＳペプチドのカクテルのいずれかからなる。特に、この試験で使用された７つのＲＡＳペプチドは、Ｇ１２Ａ、Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２Ｒ、Ｇ１２Ｓ、Ｇ１２Ｖ又はＧ１３Ｄの突然変異を有した。しかしながら、この文献は、どのようにして特定のペプチドが特定の種類の癌と関連するのかを考察しておらず、有用な可能性のあるペプチドのいかなる他の組合せも開示していない。
非特許文献７は、第１のエンドポイントとして安全性、第２のエンドポイントとしてＲＡＳペプチドの免疫原性を含む、ＲＡＳペプチドのｉｎ ｖｉｖｏ免疫原性の臨床予備実験を報告する。黒色腫の患者を４つのコドン６１の突然変異を有するＮ−ｒａｓペプチド９残基４９〜７３）を用いて皮内に免疫した。８名の患者は陽性ＤＴＨ応答を示した。しかしながら、この文献は、どのようにして特定のペプチドが特定の種類の癌と関連するのかを考察しておらず、有用な可能性のあるペプチドのいかなる他の組合せも開示していない。
非特許文献８は、異なる種類の癌は、特定のＲＡＳアイソフォームの突然変異と結び付けられ、各アイソフォームは独特のコドン突然変異の特徴を有することを開示する。さらに、非特許文献８は、ＲＡＳタンパク質の１２位、１３位及び６１位の各位置において６つの突然変異が生じることによって合計１８の突然変異が起こることを開示する。また、この総説は、ＲＡＳ機能に対するこれらの突然変異の効果、及びＲＡＳアイソフォーム突然変異の差次的なパターンをもたらす可能性のある機構を考察する。しかしながら、この文献は、癌の治療若しくは予防にも、又はワクチン内の免疫優性及び冗長性の問題にも対処していない。さらに、癌に対するワクチン又は治療の開示はなく、この文献は有用な可能性のあるペプチドのいかなる組合せも開示していない。
そのため、更に、より効果的な癌のワクチン及び／又は治療を提供する必要がある。特に、免疫優性及び冗長性の問題を克服し、費用対効果の高い、特定の癌に対して標的化されたワクチン及び／又は治療を提供する必要がある。
国際公開第９２／１４７５６号 国際公開第００／６６１５３号 英国特許第２３２８６８９号
Boon, T. et al, Cell 1989, Vol. 58, p.293-303 Pion S, et al., Blood, 1999 Feb 1; 93(3): p952-62 T. Gedde-Dahl III et al., Human Immunol. 1994, 33, p. 266-274 B. H. Johanssen et al., Scand. J. Immunol., 1994, 33, p. 607-612 Gjertsen et al. (Int. J. Cancer 2001, 92, p.441-450) Weden et al. (Int. J. Cancer 2010, 128(5), p. 1120-1128) Hunger et al. (Exp. Dermatol. 2001, 10: 161-167) Prior et al. (Cancer Res. 2012, 72(10), p. 2457-2467)
本発明は、ここで、ＲＡＳタンパク質の１３位に対応するアミノ酸に点突然変異を有する少なくとも２つのペプチドを含み、各ペプチドが異なる突然変異を有するペプチド混合物がＲＡＳタンパク質の突然変異と関連する癌に対するワクチン及び／又はそれに対する治療として使用され得ることが見出されたため、上で考察される課題に対する解決策を提供する。特に、少なくとも幾つかの本発明のペプチド混合物は、ＲＡＳタンパク質における突然変異と関連する癌の９９％超に対するワクチン及び／又はそれに対する治療として使用可能であることがわかった。本発明のペプチド混合物は、免疫優性の問題を緩和し、医薬組成物内の余剰な有効成分を減少することにより、該ペプチド混合物をより費用対効果の高いワクチン及び／又は治療とする。さらに、本発明は、特定の種類の癌に対して標的化されたワクチン接種及び／又は治療、特定の種類の癌に対して標的化されたペプチドの混合物を選択する方法を可能とする。
したがって、本発明の第１の態様では、ＲＡＳタンパク質のフラグメントに各々対応する第１及び第２のペプチドを含む免疫応答を惹起するのに適したペプチド混合物であって、
上記第１及び第２のペプチドが各々、ＲＡＳタンパク質の１３位を含む少なくとも８個のアミノ酸の領域を含み、
上記第１及び第２のペプチドの上記領域が各々、上記１３位以外において、ＲＡＳタンパク質の対応する領域と同一である、少なくとも６個のアミノ酸残基を独立して有し、
上記第１及び第２のペプチドが各々、上記１３位に対応するアミノ酸に点突然変異を有し、
上記第１のペプチドの点突然変異が上記第２のペプチドの点突然変異と異なる、
ＲＡＳタンパク質のフラグメントに各々対応する第１及び第２のペプチドを含む免疫応答を惹起するのに適したペプチド混合物が提供される。
有利には、上記点突然変異が各々、Ｇ１３Ａ、Ｇ１３Ｃ、Ｇ１３Ｄ、Ｇ１３Ｒ、Ｇ１３Ｓ又はＧ１３Ｖの突然変異から独立して選択される。
上記ペプチド混合物が、ＲＡＳタンパク質の１２位を含む少なくとも８個のアミノ酸の領域を含むＲＡＳタンパク質のフラグメントに対応する少なくとも１つの更なるペプチドであって、該少なくとも１つの更なるペプチドの上記領域の各々が、上記１２位以外において、ＲＡＳタンパク質の対応する領域と同一である、少なくとも６個のアミノ酸残基を独立して有し、ＲＡＳタンパク質の１２位に対応するアミノ酸に点突然変異が存在する、少なくとも１つの更なるペプチド、及び／又はＲＡＳタンパク質の６１位を含む少なくとも８個のアミノ酸の領域を含むＲＡＳタンパク質のフラグメントに対応する少なくとも１つの更なるペプチドであって、該少なくとも１つの更なるペプチドの上記領域の各々が、上記６１位以外において、ＲＡＳタンパク質の対応する領域と同一である、少なくとも６個のアミノ酸残基を独立して有し、ＲＡＳタンパク質の６１位に対応するアミノ酸に点突然変異が存在する、少なくとも１つの更なるペプチドを更に含むのが好ましい。
便利には、上記ＲＡＳタンパク質の１２位に対応するアミノ酸における点突然変異がＧ１２Ａ、Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２Ｒ、Ｇ１２Ｓ又はＧ１２Ｖの突然変異から選択され、及び／又は上記ＲＡＳタンパク質の６１位に対応するアミノ酸における点突然変異がＱ６１Ｅ、Ｑ６１Ｈ、Ｑ６１Ｋ、Ｑ６１Ｌ、Ｑ６１Ｐ又はＱ６１Ｒの突然変異から選択される。
有利には、第１又は第２のペプチドの点突然変異はＧ１３Ｃの突然変異である。
便利には、第１又は第２のペプチドの点突然変異はＧ１３Ｒの突然変異である。
好ましくは、第１又は第２のペプチドの点突然変異はＧ１３Ｄの突然変異である。
便利には、第１又は第２のペプチドの点突然変異はＧ１３Ｖの突然変異である。
有利には、第１及び／又は第２のペプチドの点突然変異はＧ１３Ｃ、Ｇ１３Ｄ、Ｇ１３Ｒ、及びＧ１３Ｖの突然変異から選択される。
好ましくは、上記第１のペプチドがＧ１３Ｃの突然変異を有するペプチドであり、上記第２のペプチドがＧ１３Ｄの突然変異を有するペプチドであり、上記少なくとも１つの更なるペプチドが、
Ｇ１２Ａの突然変異を有するペプチド、
Ｇ１２Ｃの突然変異を有するペプチド、
Ｇ１２Ｄの突然変異を有するペプチド、
Ｇ１２Ｒの突然変異を有するペプチド、
Ｇ１２Ｓの突然変異を有するペプチド、及び、
Ｇ１２Ｖの突然変異を有するペプチド、
を含む。
有利には、上記第１のペプチドがＧ１３Ｒの突然変異を有するペプチドであり、上記第２のペプチドがＧ１３Ｖの突然変異を有するペプチドであり、上記少なくとも１つの更なるペプチドが、
Ｑ６１Ｈの突然変異を有するペプチド、
Ｑ６１Ｋの突然変異を有するペプチド、
Ｑ６１Ｌの突然変異を有するペプチド、及び、
Ｑ６１Ｒの突然変異を有するペプチド、
を含む。
便利には、上記ペプチド混合物は少なくとも第３のペプチドを含む。
第３のペプチドは、ＲＡＳタンパク質の１３位を含む少なくとも８個のアミノ酸の領域を含むＲＡＳタンパク質のフラグメントに対応するペプチドであり、上記第３のペプチドの上記領域は、１３位以外において、ＲＡＳタンパク質の対応する領域と同一である少なくとも６個のアミノ酸残基を有し、第１及び第２のペプチドの点突然変異とは異なるＲＡＳタンパク質の１３位に対応するアミノ酸における点突然変異が存在することが好ましい。
便利には、上記第３のペプチドの点突然変異は、Ｇ１３Ｃ、Ｇ１３Ｄ、Ｇ１３Ｒ及びＧ１３Ｖの突然変異から選択される。
有利には、上記ペプチド混合物は最大８個の異なるペプチドを含む。
便利には、上記ペプチド混合物は更に、各々がＲＡＳタンパク質のフラグメントに対応する第３及び第４のペプチドからなり、
第３及び第４のペプチドが各々、ＲＡＳタンパク質の１３位を含む少なくとも８個のアミノ酸の領域を含み、
第３及び第４のペプチドの上記領域が各々、上記１３位以外において、ＲＡＳタンパク質の対応する領域と同一である、少なくとも６個のアミノ酸残基を独立して有し、
第３及び第４のペプチドが各々、上記１３位に対応するアミノ酸に点突然変異を有し、
上記ペプチドの各々の点突然変異が他のペプチドの点突然変異と異なり、
上記第１のペプチドがＧ１３Ｒの突然変異を有するペプチドであり、
上記第２のペプチドがＧ１３Ａの突然変異を有するペプチドであり、
上記第３のペプチドがＧ１３Ｓの突然変異を有するペプチドであり、
上記第４のペプチドがＧ１３Ｖの突然変異を有するペプチドである。
本発明の第２の態様では、ＲＡＳタンパク質のフラグメントに各々対応する少なくとも５個のペプチドを含む免疫応答を惹起するのに適したペプチド混合物であって、
上記少なくとも５個のペプチドが各々、ＲＡＳタンパク質の少なくとも８個のアミノ酸の領域を含み、かつＲＡＳタンパク質の１３位を含み、
上記少なくとも５個のペプチドの上記領域が各々、上記１３位以外において、ＲＡＳタンパク質の対応する領域と同一である、少なくとも６個のアミノ酸残基を独立して有し、
上記ペプチドが各々、Ｇ１３Ａ、Ｇ１３Ｃ、Ｇ１３Ｄ、Ｇ１３Ｒ、Ｇ１３Ｓ又はＧ１３Ｖの突然変異から選択される、上記１３位に対応するアミノ酸に点突然変異を有し、
各ペプチドの点突然変異が他のペプチドの点突然変異と異なる、
ＲＡＳタンパク質のフラグメントに各々対応する少なくとも５個のペプチドを含む免疫応答を惹起するのに適したペプチド混合物が提供される。
本発明の第３の態様では、ＲＡＳタンパク質のフラグメントに各々対応する６個のペプチドからなる免疫応答を惹起するのに適したペプチド混合物であって、
各ペプチドが、ＲＡＳタンパク質の１２位を含む少なくとも８個のアミノ酸の領域を含み、
上記ペプチドの上記領域が各々、上記１２位以外において、ＲＡＳタンパク質の対応する領域と同一である、少なくとも６個のアミノ酸残基を独立して有し、
上記ペプチドが各々、Ｇ１２Ａ、Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２Ｒ、Ｇ１２Ｓ又はＧ１２Ｖの突然変異から選択される、上記１２位に対応するアミノ酸に点突然変異を有し、
各ペプチドの点突然変異が他のペプチドの点突然変異と異なる、
ＲＡＳタンパク質のフラグメントに各々対応する６個のペプチドからなる免疫応答を惹起するのに適したペプチド混合物が提供される。
本発明の第４の態様では、ＲＡＳタンパク質のフラグメントに各々対応する６個のペプチドからなる免疫応答を惹起するのに適したペプチド混合物であって、
各ペプチドが、ＲＡＳタンパク質の６１位を含む少なくとも８個のアミノ酸の領域を含み、
上記ペプチドの上記領域が各々、上記６１位以外において、ＲＡＳタンパク質の対応する領域と同一である、少なくとも６個のアミノ酸残基を独立して有し、
上記ペプチドが各々、Ｑ６１Ｅ、Ｑ６１Ｈ、Ｑ６１Ｋ、Ｑ６１Ｌ、Ｑ６１Ｐ又はＱ６１Ｒの突然変異から選択される、上記６１位に対応するアミノ酸に点突然変異を有し、
各ペプチドの点突然変異が他のペプチドの点突然変異と異なる、
ＲＡＳタンパク質のフラグメントに各々対応する６個のペプチドからなる免疫応答を惹起するのに適したペプチド混合物が提供される。
本発明の第５の態様では、ＲＡＳタンパク質のフラグメントに各々対応する第１、第２、第３及び第４のペプチドからなる免疫応答を惹起するのに適したペプチド混合物であって、上記第１、第２、及び第３のペプチドが各々、ＲＡＳタンパク質の１２位を含む少なくとも８個のアミノ酸の領域を含み、上記第４のペプチドがＲＡＳタンパク質の１３位を含む少なくとも８個のアミノ酸の領域を含み、上記第１、第２、第３及び第４のペプチドの上記領域が各々、上記１２位又は１３位以外において、ＲＡＳタンパク質の対応する領域と同一である、少なくとも６個のアミノ酸残基をそれぞれ独立して有し、上記第１、第２、第３及び第４のペプチドが各々、上記１２位又は１３位に対応するアミノ酸において点突然変異をそれぞれ有し、
上記第１のペプチドがＧ１２Ａの突然変異を有するペプチドであり、
上記第２のペプチドがＧ１２Ｒの突然変異を有するペプチドであり、
上記第３のペプチドがＧ１２Ｓの突然変異を有するペプチドであり、
上記第４のペプチドがＧ１３Ｃの突然変異を有するペプチドである、
ＲＡＳタンパク質のフラグメントに各々対応する第１、第２、第３及び第４のペプチドからなる免疫応答を惹起するのに適したペプチド混合物が提供される。
有利には、本発明の全ての態様において、１２位、１３位又は６１位を含む上記領域の外側の各ペプチドは、ＲＡＳタンパク質に対して少なくとも７５％の配列同一性を有する。
本発明の第６の態様では、ＲＡＳタンパク質のフラグメントに対応する、ワクチン又は医薬として用いられるペプチドであって、
該ペプチドが、ＲＡＳタンパク質の１３位を含む少なくとも８個のアミノ酸の領域を含み、
上記領域が、上記１３位以外において、ＲＡＳタンパク質の対応する領域と同一である、少なくとも６個のアミノ酸残基を有し、
該ペプチドが、上記１３位に対応するアミノ酸におけるＧ１３Ｃ又はＧ１３Ｒの点突然変異を有する、
ＲＡＳタンパク質のフラグメントに対応する、ワクチン又は医薬として用いられるペプチドが提供される。
本発明の第７の態様では、ＲＡＳタンパク質のフラグメントに対応する、免疫応答を惹起するのに適したペプチドであって、
該ペプチドがＲＡＳタンパク質の１３位を含む少なくとも８個のアミノ酸の領域を含み、
上記領域が、上記１３位以外において、ＲＡＳタンパク質の対応する領域と同一である、少なくとも６個のアミノ酸残基を有し、
該ペプチドが上記１３位に対応するアミノ酸においてＧ１３Ｃ又はＧ１３Ｒの点突然変異を有する、
ＲＡＳタンパク質のフラグメントに対応する、免疫応答を惹起するのに適したペプチドが提供される。
本発明の第８の態様では、ＲＡＳタンパク質のフラグメントに対応する、免疫応答を惹起するのに適したペプチドであって、
該ペプチドがＲＡＳタンパク質の１３位を含む少なくとも８個のアミノ酸の領域を含み、
上記領域が、上記１３位以外において、ＲＡＳタンパク質の対応する領域と同一である、少なくとも６個のアミノ酸残基を有し、
該ペプチドが３０個以下のアミノ酸残基を含み、
該ペプチドが上記１３位に対応するアミノ酸においてＧ１３Ｃ又はＧ１３Ｒの点突然変異を有する、
ＲＡＳタンパク質のフラグメントに対応する、免疫応答を惹起するのに適したペプチドが提供される。
本発明の第９の態様では、ＭＨＣ分子上に提示された場合に、上に記載の第１〜第５の態様のいずれか１つに記載のペプチド混合物の１つにおける各ペプチドに対して特異的なＴ細胞を含むＴ細胞混合物、又は上に記載の本発明の第６の態様に記載の用途のためのペプチドの１つ、若しくは第７若しくは第８の態様に記載のペプチドに対して特異的なＴ細胞を含むＴ細胞製剤が提供される。
本発明の第１０の態様では、上に記載の第１〜第５の態様のいずれかに記載のペプチド混合物、上に記載の第６の態様に記載の用途のためのペプチド、上に記載の第７若しくは第８の態様に記載のペプチド、又は上に記載の第９の態様に記載のＴ細胞混合物若しくはＴ細胞製剤と、薬学的に許容可能な担体、希釈剤及び／又は賦形剤とを含む医薬組成物が提供される。
好ましくは、上記の態様のいずれかに記載のペプチド混合物、ペプチド、用途のためのペプチド、Ｔ細胞混合物、Ｔ細胞製剤、又は医薬組成物は、癌の予防及び／又は治療における使用に対する。
便利には、上記癌は、副腎、自律神経節、胆管、骨、乳房、中枢神経系、子宮頸部、結腸直腸、子宮内膜、造血系、リンパ、腎臓、大腸、肝臓、肺、食道、卵巣、膵臓、前立腺、唾液腺、皮膚、小腸、胃、精巣、胸腺、甲状腺、頭頸部（upper aerodigestive tract）及び尿路の癌、及び／又は悪性黒色腫である。
上記癌は結腸直腸、肺及び／又は膵臓の癌であれば有利である。
上記の態様に記載のペプチド混合物、ペプチド、用途のためのペプチド、Ｔ細胞混合物、Ｔ細胞製剤、又は医薬組成物は、悪性黒色腫の予防及び／又は治療に適している。
本発明の第１１の態様では、上に記載の第１〜第５の態様のいずれか１つに記載のペプチド混合物、第６の態様に記載の使用に対するペプチド、第７若しくは第８の態様に記載のペプチド、第９の態様に記載のＴ細胞混合物若しくはＴ細胞製剤、又は第１０の態様に記載の医薬組成物を投与することを含む、癌を治療又は予防する方法が提供される。
本発明の第１２の態様では、
ｉ）患者から採取された試料に存在するＲＡＳタンパク質の突然変異を同定すること、
ｉｉ）上記試料において同定された少なくとも１つのＲＡＳタンパク質の突然変異に対応する点突然変異を含むペプチドを含む上に記載の第１〜第５の態様のいずれか１つに記載のペプチド混合物を選択すること、又は上記試料において同定された少なくとも１つのＲＡＳタンパク質の突然変異に対応する点突然変異を含む上に記載の第６の態様に記載の用途のためのペプチドを選択すること、又は上記試料において同定された少なくとも１つのＲＡＳタンパク質の突然変異に対応する点突然変異を含む上に記載の第７若しくは第８の態様に記載のペプチドを選択すること、又はＭＨＣ分子上に提示された場合に、上記試料において同定された少なくとも１つのＲＡＳタンパク質の突然変異に対応する点突然変異を含むペプチドに対して特異的なＴ細胞を含む、上に記載の第９の態様に記載のＴ細胞混合物若しくはＴ細胞製剤を選択すること、又は上記試料において同定された少なくとも１つのＲＡＳタンパク質の突然変異に対応する点突然変異を含むペプチド混合物、ワクチン若しくは医薬として用いられるペプチド、若しくはペプチドを含む上に記載の第１０の態様に記載の医薬組成物、若しくはＭＨＣ分子上に提示された場合に、上記試料において同定された少なくとも１つのＲＡＳタンパク質の突然変異に対応する点突然変異を含むペプチドに対して特異的なＴ細胞を含むＴ細胞混合物若しくはＴ細胞製剤を選択すること、及び、
ｉｉｉ）上記ペプチド混合物、用途のためのペプチド、ペプチド、Ｔ細胞混合物、又はＴ細胞製剤を上記患者に投与すること、
を含む方法において用いられる、ペプチド混合物、ワクチン若しくは医薬として用いられるペプチド、ペプチド、Ｔ細胞混合物、Ｔ細胞製剤、又は医薬組成物が提供される。
本発明の第１３の態様では、患者への投与のため、ペプチド混合物、ワクチン若しくは医薬として用いられるペプチド、ペプチド、Ｔ細胞混合物、Ｔ細胞製剤又は医薬組成物を選択する方法であって、
ｉ）患者から採取された試料に存在するＲＡＳタンパク質の突然変異を同定すること、及び、
ｉｉ）上記試料において同定された少なくとも１つのＲＡＳタンパク質の突然変異に対応する点突然変異を含むペプチドを含む上記第１〜第５の態様のいずれか１つに記載のペプチド混合物を選択すること、又は上記第６の態様に記載の用途のためのペプチドを選択すること、又は上記の第７若しくは第８の態様に記載のペプチドを選択すること、又はＭＨＣ分子上に提示された場合に、上記試料において同定された少なくとも１つのＲＡＳタンパク質の突然変異に対応する点突然変異を含むペプチドに対して特異的なＴ細胞を含む、上記の第９の態様に記載のＴ細胞混合物若しくはＴ細胞製剤を選択すること、又は上記試料において同定された少なくとも１つのＲＡＳタンパク質の突然変異に対応する点突然変異を含むペプチド混合物、ワクチン若しくは医薬として用いられるペプチド、若しくはペプチド、若しくはＭＨＣ分子上に提示された場合に、上記試料において同定された少なくとも１つのＲＡＳタンパク質の突然変異に対応する点突然変異を含むペプチドに対して特異的なＴ細胞を含むＴ細胞混合物若しくはＴ細胞製剤を含む上記の第１０の態様に記載の医薬組成物を選択すること、
を含む、患者への投与のため、ペプチド混合物、ワクチン若しくは医薬としての用いられるペプチド、ペプチド、Ｔ細胞混合物、Ｔ細胞製剤又は医薬組成物を選択する方法が提供される。
本発明の第１４の態様では、上記第９の態様に記載のＴ細胞混合物又はＴ細胞製剤の作製のための上記第１〜第５の態様のいずれか１つに記載のペプチド混合物、上記第６の態様に記載の用途のためのペプチド、又は上記の第７若しくは第８の態様に記載のペプチドの使用が提供される。
上に記載のペプチド混合物、使用に対するペプチド、及びペプチドは、一般的に天然環境から単離される。
本明細書で使用される「ペプチド」の用語は、より長いタンパク質のフラグメントである（又はそれに対応する配列を有する）アミノ酸残基のポリマーを指す。また、該用語は、１又は複数のアミノ酸残基が改変残基、又は非天然残基、例えば対応する天然アミノ酸の人工的な化学的模倣物である、アミノ酸ポリマー、また同じく天然アミノ酸ポリマーにも適用される。
２つの配列間のパーセント「同一性」は、デフォルトのパラメーターを使用するＢＬＡＳＴＰアルゴリズムバージョン２．２．２（Altschul, Stephen F., Thomas L. Madden, Alejandro A. Schaeffer, Jinghui Zhang, Zheng Zhang, Webb Miller, and David J. Lipman (1997), "Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs", Nucleic Acids Res. 25:3389-3402）を使用して決定されてもよい。特に、ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、ＵＲＬ http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/を使用してインターネット上でアクセス可能である。
本明細書で使用される「免疫応答」の用語は、或る実施の形態では、細胞表面の主要組織適合性（ＭＨＣ）分子によるペプチドの提示に応じたＴ細胞媒介免疫応答を指し、特に、ペプチドの提示に応じたＴ細胞の活性化を指す。
本明細書で使用される「ＲＡＳタンパク質」の用語は、ｒａｓ癌原遺伝子によってコードされる一群の小さなＧＴＡアーゼタンパク質を指し、ＲＡＳタンパク質の３つのアイソフォームであるＨＲＡＳ、ＫＲＡＳ、及びＮＲＡＳの全てを含む。或る実施の形態では、「ＲＡＳタンパク質」の用語は、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔアクセッション番号Ｐ０１１１２．１に対応するタンパク質を指し、配列番号３３に示される。
本明細書で使用される「ＲＡＳタンパク質の１３位」の用語は、Ｎ末端から数えて、野生型ＲＡＳタンパク質の一次構造を形成するアミノ酸鎖において１３番目のアミノ酸を指す。
本明細書で使用される「ＲＡＳタンパク質の１２位」の用語は、Ｎ末端から数えて、野生型ＲＡＳタンパク質の一次構造を形成するアミノ酸鎖において１２番目のアミノ酸を指す。
本明細書で使用される「ＲＡＳタンパク質の６１位」の用語は、Ｎ末端から数えて、野生型ＲＡＳタンパク質の一次構造を形成するアミノ酸鎖において６１番目のアミノ酸を指す。
本明細書で使用される「１３位に対応するアミノ酸」の用語は、Ｎ末端から数えて、ＲＡＳタンパク質のアミノ酸配列の１３番目のアミノ酸に対応する位置におけるそのペプチドのアミノ酸鎖に位置するＲＡＳタンパク質のペプチド中のアミノ酸を意味する。対応する意味は、「１２位に対応するアミノ酸」と「６１位に対応するアミノ酸」の用語に与えられる。
本明細書で使用される「ペプチド混合物」の用語は、混合されているが化合されていない２以上のペプチドを指す。該混合物は、乾燥粉体、溶液、懸濁物又はコロイドとして存在してもよく、均質であっても不均質であってもよい。
本明細書で使用される「ＲＡＳタンパク質の突然変異」の用語は、被験体から採取された試料に存在するＲＡＳタンパク質中に存在する１又は複数の点突然変異を指す。
本明細書で使用される「点突然変異」の用語は、異なるアミノ酸残基を有するタンパク質生成物のポリペプチド鎖における単一のアミノ酸残基の置換を指す。
例えば、本明細書で使用される「Ｇ１２Ｖの突然変異」の用語は、結果的に野生型ＲＡＳタンパク質の１２位のグリシン（Ｇ）がバリン（Ｖ）で置換されている点突然変異を指す。同様の定義が、Ｇ１３Ｃ、Ｇ１３Ｒ、Ｑ６１Ｈ等の類似する用語に適用される。
本明細書で使用される「医薬組成物」の用語は、意図されるヒト又は動物の被験体に対する治療目的の投与に適した医薬製剤を意味する。
全ての癌に存在するＲＡＳ突然変異の発生率を示すグラフである。 本発明の２つのペプチド混合物（ＴＧ０２及びＴＧ０３）のペプチドに対応する全ての癌における各ＲＡＳ突然変異の発生率を示すグラフである。 本発明の２つのペプチド混合物（ＴＧ０２及びＴＧ０３）のペプチドに対応する肺癌における各ＲＡＳ突然変異の発生率を示すグラフである。 本発明の２つのペプチド混合物（ＴＧ０２及びＴＧ０３）のペプチドに対応する結腸直腸癌における各ＲＡＳ突然変異の発生率を示すグラフである。 本発明の２つのペプチド混合物（ＴＧ０２及びＴＧ０３）のペプチドに対応する悪性黒色腫における各ＲＡＳ突然変異の発生率を示すグラフである。 健康なドナーにおけるＧ１３Ｃの突然変異を有するＲＡＳペプチド（配列番号１９）とＧ１３Ｒの突然変異を有するＲＡＳペプチド（配列番号２７）との混合物による３回のｉｎ ｖｉｔｒｏ刺激に対する増殖性Ｔ細胞応答を示すグラフである。ＡＰＣ：抗原提示細胞（ＰＢＭＣ）、ＣＰＭ：カウント毎分。 健康なドナーにおけるＧ１３Ｃペプチド（配列番号１９）、Ｇ１３Ｄペプチド（配列番号２０）、Ｇ１２Ａペプチド（配列番号２１）、Ｇ１２Ｃペプチド（配列番号２２）、Ｇ１２Ｄペプチド（配列番号２３）、Ｇ１２Ｒペプチド（配列番号２４）、Ｇ１２Ｓペプチド（配列番号２５）、Ｇ１２Ｖペプチド（配列番号２６）、及びＧ１３Ｒペプチド（配列番号２７）からなるＲＡＳペプチド混合物による３回のｉｎ ｖｉｔｒｏ刺激に対する増殖性Ｔ細胞応答を示すグラフである。ＡＰＣ：抗原提示細胞（ＰＢＭＣ）、ＣＰＭ：カウント毎分。 健康なドナーにおけるＴＧ０２＋１３Ｒによる３回のｉｎ ｖｉｔｒｏ刺激の後のＧ１３Ｃ ＲＡＳペプチド（配列番号１９）に対するＴ細胞応答を示すグラフである。ＡＰＣ：抗原提示細胞（ＰＢＭＣ）、ＣＰＭ：カウント毎分。 ＲＡＳペプチド混合物（ＴＧ０２：マウス４番及び７番）及びＴＧ０２＋Ｖｉｓｃｏｇｅｌ（商標）（マウス２４番、２９番及び３０番）でワクチン接種したマウスから採取した脾細胞の増殖応答を示すグラフである。ＣｏｎＡ：コンカナバリンＡ（陽性対照）。
配列表の簡単な説明
配列番号１はＧ１３Ｃの突然変異を有するＲＡＳペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号２はＧ１３Ｒの突然変異を有するＲＡＳペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号３はＧ１３Ｄの突然変異を有するＲＡＳペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号４はＧ１３Ｖの突然変異を有するＲＡＳペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号５はＧ１３Ａの突然変異を有するＲＡＳペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号６はＧ１３Ｓの突然変異を有するＲＡＳペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号７はＧ１２Ａの突然変異を有するＲＡＳペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号８はＧ１２Ｃの突然変異を有するＲＡＳペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号９はＧ１２Ｄの突然変異を有するＲＡＳペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号１０はＧ１２Ｒの突然変異を有するＲＡＳペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号１１はＧ１２Ｓの突然変異を有するＲＡＳペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号１２はＧ１２Ｖの突然変異を有するＲＡＳペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号１３はＱ６１Ｒの突然変異を有するＲＡＳペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号１４はＱ６１Ｋの突然変異を有するＲＡＳペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号１５はＱ６１Ｈの突然変異を有するＲＡＳペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号１６はＱ６１Ｌの突然変異を有するＲＡＳペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号１７はＱ６１Ｅの突然変異を有するＲＡＳペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号１８はＱ６１Ｐの突然変異を有するＲＡＳペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号１９はＧ１３Ｃの突然変異を有するＴＧ０２のＲＡＳペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号２０はＧ１３Ｄの突然変異を有するＴＧ０２のＲＡＳペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号２１はＧ１２Ａの突然変異を有するＴＧ０２のＲＡＳペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号２２はＧ１２Ｃの突然変異を有するＴＧ０２のＲＡＳペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号２３はＧ１２Ｄの突然変異を有するＴＧ０２のＲＡＳペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号２４はＧ１２Ｒの突然変異を有するＴＧ０２のＲＡＳペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号２５はＧ１２Ｓの突然変異を有するＴＧ０２のＲＡＳペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号２６はＧ１２Ｖの突然変異を有するＴＧ０２のＲＡＳペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号２７はＧ１３Ｒの突然変異を有するＴＧ０３のＲＡＳペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号２８はＧ１３Ｖの突然変異を有するＴＧ０３のＲＡＳペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号２９はＱ６１Ｒの突然変異を有するＴＧ０３のＲＡＳペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号３０はＱ６１Ｋの突然変異を有するＴＧ０３のＲＡＳペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号３１はＱ６１Ｈの突然変異を有するＴＧ０３のＲＡＳペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号３２はＱ６１Ｌの突然変異を有するＴＧ０３のＲＡＳペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号３３は野生型ＲＡＳタンパク質の全長アミノ酸配列を示す。
発明の詳細な説明
本発明は、包括的に言えば、ＲＡＳタンパク質の１３位を含む少なくとも８個のアミノ酸の領域を含むＲＡＳタンパク質の少なくとも第１及び第２のペプチドを含み、該少なくとも第１及び第２のペプチドが各々、１３位に点突然変異を有し、該１３位の突然変異は互いに異なる、ペプチド混合物に関する。
本発明の混合物におけるペプチドは、ＨＲＡＳ、ＫＲＡＳ、又はＮＲＡＳのいずれかのペプチドであってもよい。これらの３つのＲＡＳアイソフォームは全て、ＧＤＰ／ＧＴＰ結合を担う領域、すなわち、癌において突然変異に供される領域の全てにおいて配列同一性を共有する。
或る実施形態では、第１及び第２のペプチドは各々、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１２個、少なくとも１６個、少なくとも１７個、少なくとも１８個、少なくとも２０個、少なくとも２４個、又は少なくとも３０個のアミノ酸を独立して含む。好ましい実施形態では、第１及び第２のペプチドは各々、少なくとも８個のアミノ酸を含む。他の好ましい実施形態では、第１及び第２のペプチドは各々、少なくとも１７個のアミノ酸を含む。
或る実施形態では第１及び第２のペプチドは各々、３０個以下のアミノ酸を独立して有する。例えば、第１及び第２のペプチドは各々、幾つかの実施形態において２８個以下、２６個以下、２４個以下、２２個以下、２０個以下、１８個以下、１７個以下、１６個以下、１４個以下、１２個以下、１０個以下、又は８個以下のアミノ酸を独立して含む。或る実施形態では第１及び第２のペプチドは各々、１７個以下のアミノ酸を含む。
或る実施形態では、第１及び第２のペプチドは各々、ＲＡＳタンパク質と、１３位を含む領域以外の位置において少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３７％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも６６％、少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を独立して有する。或る実施形態では、第１及び第２のペプチドは各々、配列番号１〜配列番号６のうち１つに対して、１３位を含む領域以外の位置において、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも６６％、少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を独立して有する。好ましい実施形態では、第１及び第２のペプチドは各々、配列番号１〜配列番号６のうちの１つに対して、１３位を含む領域以外の位置において、少なくとも９５％の配列同一性を独立して有する。他の実施形態では、第１及び第２のペプチドは各々、配列番号１〜配列番号６のうちの１つに対して、１３位を含む領域以外の位置において、１００％の配列同一性を独立して有する。或る実施形態では、第１のペプチドは、配列番号１〜配列番号６のうちの１つに対して１３位を含む領域以外の位置において或る割合の配列同一性を有し、第２のペプチドは配列番号１〜配列番号６のうちの異なる１つに対して１３位を含む領域以外の位置において異なる割合の配列同一性を有する。他の実施形態では、第１のペプチドは配列番号１〜配列番号６のうちの１つに対して１３位を含む領域以外の位置において或る割合の配列同一性を有し、第２のペプチドは配列番号１〜配列番号６のうちの異なる１つに対して１３位を含む領域以外の位置において同じ割合の配列同一性を有する。全ての実施形態において、第１及び第２のペプチドは各々、免疫応答を惹起することができる。
上記ペプチド混合物において第１及び第２のペプチドは各々、ＲＡＳタンパク質の１３位に点突然変異を有し、第１のペプチド中の点突然変異は第２のペプチド中の点突然変異と異なる。野生型ＲＡＳタンパク質は１３位にグリシン（Ｇ）を含む。そのため、１３位における突然変異は、グリシンから任意の他のアミノ酸への点突然変異であってもよい。しかしながら、Ｇ１３Ａ、Ｇ１３Ｃ、Ｇ１３Ｄ、Ｇ１３Ｒ、Ｇ１３Ｓ、及びＧ１３Ｖの突然変異は、癌と特に関連することがわかっている。そのため、好ましい実施形態では、第１及び第２のペプチドの各々の点突然変異は、独立して、Ｇ１３Ａ、Ｇ１３Ｃ、Ｇ１３Ｄ、Ｇ１３Ｒ、Ｇ１３Ｓ、又はＧ１３Ｖの突然変異のうちの１つである。より好ましい実施形態では、第１及び第２のペプチドのうちの１つの１３位における点突然変異は、独立して、Ｇ１３Ｃ又はＧ１３Ｒの突然変異である。特に好ましい実施形態では、第１又は第２のペプチドのうちの１つの１３位における点突然変異は、Ｇ１３Ｃの突然変異である。他の特に好ましい実施形態では、第１及び第２のペプチドのうちの１つの１３位における点突然変異は、Ｇ１３Ｒの突然変異である。
或る実施形態では、第１又は第２のペプチドの１３位における点突然変異はＧ１３Ｃの突然変異であり、他のペプチドの１３位における点突然変異はＧ１３Ｄの突然変異である。
他の実施形態では、第１又は第２のペプチドの１３位における点突然変異はＧ１３Ｒの突然変異であり、他のペプチドの１３位における点突然変異はＧ１３Ｖの突然変異である。
更なる実施形態では、第１又は第２のペプチドの１３位における点突然変異はＧ１３Ｃの突然変異であり、他のペプチドの１３位における点突然変異はＧ１３Ｒの突然変異である。
本発明の代替的な実施形態では、上記ペプチド混合物は、ＲＡＳタンパク質の１３位を含む少なくとも８個のアミノ酸の領域を含む、少なくともＲＡＳタンパク質の第３のペプチドを含んでもよい。該少なくとも第３のペプチドは、上記第１及び第２のペプチドの１３位の突然変異とは異なるＲＡＳタンパク質の１３位に対応するアミノ酸において点突然変異を有してもよい。該点突然変異は、第１及び第２のペプチドの点突然変異とは独立して、Ｇ１３Ａ、Ｇ１３Ｃ、Ｇ１３Ｄ、Ｇ１３Ｒ、Ｇ１３Ｓ又はＧ１３Ｖの突然変異のうちの１つであってもよい。或る実施形態では、第１のペプチドはＧ１３Ｃの突然変異、第２のペプチドはＧ１３Ｄの突然変異、及び第３のペプチドはＧ１３Ｒの突然変異を有する。
本発明のペプチド混合物は、少なくとも８個のアミノ酸の領域を含む、ＲＡＳタンパク質の少なくとも１つの更なるペプチドを追加的に含んでもよい。或る実施形態では、該少なくとも１つの更なるペプチドの上記領域は、ＲＡＳタンパク質の１２位を含む。他の実施形態では、該少なくとも１つの更なるペプチドの上記領域はＲＡＳタンパク質の６１位を含む。
ペプチド混合物が少なくとも第３のペプチドを含む実施形態では、ペプチドは各々、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１２個、少なくとも１６個、少なくとも１７個、少なくとも１８個、少なくとも２０個、少なくとも２４個、少なくとも３０個のアミノ酸を独立して含む。好ましい実施形態では、ペプチドは各々少なくとも８個のアミノ酸を含む。他の好ましい実施形態では、ペプチドは各々少なくとも１７個のアミノ酸を含む。更なる実施形態では、ペプチドは各々少なくとも１８個のアミノ酸を含む。概して、上記ペプチド混合物中の各ペプチドは、そのペプチド混合物中の１又は複数の他のペプチドの異なる数のアミノ酸を含んでもよい。或る実施形態では、上記ペプチド混合物中の各ペプチドは、３０個以下のアミノ酸を含む。例えば、上記ペプチド混合物中の各ペプチドは、幾つかの実施形態において、２８個以下、２６個以下、２４個以下、２２個以下、２０個以下、１８個以下、１７個以下、１６個以下、１４個以下、１２個以下、１０個以下、又は８個以下のアミノ酸を独立して含む。或る実施形態では、上記ペプチド混合物中の各ペプチドは、１７個以下のアミノ酸を含む。
ペプチド混合物がＲＡＳタンパク質の１２位を含む領域を含む少なくとも１つの更なるペプチドを含む実施形態では、ＲＡＳタンパク質の１２位に対応するアミノ酸は点突然変異を有する。野生型ＲＡＳタンパク質では、１２位のアミノ酸はグリシン（Ｇ）である。そのため、或る実施形態では、１２位の点突然変異は、グリシン以外のアミノ酸であってもよい。或る実施形態では、各突然変異は、独立して、Ｇ１２Ａ、Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２Ｒ、Ｇ１２Ｓ又はＧ１２Ｖの突然変異である。他の実施形態では、上記少なくとも１つの更なるペプチドは、１２位を含む領域以外の位置において、ＲＡＳタンパク質と少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも６６％、少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有する。或る実施形態では、上記少なくとも１つの更なるペプチドは、１２位を含む領域以外の位置において、配列番号７〜配列番号１２及び配列番号２１〜配列番号２６のうちの１つに対して少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも６６％、少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有する。或る実施形態では、ＲＡＳタンパク質の１２位を含む少なくとも８個のアミノ酸の領域を含み、ＲＡＳタンパク質の１２位に対応するアミノ酸に点突然変異を有する、ＲＡＳタンパク質の２以上の更なるペプチドが存在する。かかる実施形態では、１２位の突然変異を有するペプチドは各々異なる点突然変異を有する。
ペプチド混合物がＲＡＳタンパク質の６１位を含む少なくとも８個のアミノ酸の領域を含む少なくとも１つの更なるペプチドを含む実施形態では、ＲＡＳタンパク質の６１位に対応するアミノ酸は点突然変異を有する。野生型ＲＡＳタンパク質では、６１位のアミノ酸はグルタミン（Ｑ）である。そのため、或る実施形態では、６１位の点突然変異は、グルタミン以外のアミノ酸であってもよい。或る実施形態では、点突然変異は、Ｑ６１Ｅ、Ｑ６１Ｈ、Ｑ６１Ｋ、Ｑ６１Ｌ、Ｑ６１Ｐ又はＱ６１Ｒの突然変異である。他の実施形態では、上記少なくとも１つの更なるペプチドは、６１位を含む領域以外の位置において、ＲＡＳタンパク質と少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも６６％、少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有する。或る実施形態では、上記少なくとも１つの更なるペプチドは、６１位を含む領域以外の位置において、配列番号１３〜配列番号１８及び配列番号２９〜配列番号３２のうちの１つに対して少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも６６％、少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有する。或る実施形態では、ＲＡＳタンパク質の６１位を含む少なくとも８個のアミノ酸の領域を含み、ＲＡＳタンパク質の６１位に対応するアミノ酸に点突然変異を有する、ＲＡＳタンパク質の２以上の更なるペプチドが存在する。かかる実施形態では、６１位の突然変異を有するペプチドは各々異なる点突然変異を有する。
或る実施形態では、上記ペプチド混合物は、ＲＡＳタンパク質の１２位又は６１位を含む少なくとも８個のアミノ酸の領域を各々含む、ＲＡＳタンパク質の少なくとも２つのペプチドを更に含む。かかる実施形態では、上記少なくとも２つの更なるペプチドは、ＲＡＳタンパク質の１２位を含む少なくとも８個のアミノ酸の領域を有し、ＲＡＳタンパク質の１２位に対応するアミノ酸に点突然変異を有する少なくとも１つのペプチドと、ＲＡＳタンパク質の６１位を含む少なくとも８個のアミノ酸の領域を含み、ＲＡＳタンパク質の６１位に対応するアミノ酸に点突然変異を有する少なくとも１つのペプチドとを含む。１２位の点突然変異は、Ｇ１２Ａ、Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２Ｒ、Ｇ１２Ｓ又はＧ１２Ｖの突然変異のうちの１つであってもよい。６１位の点突然変異は、Ｑ６１Ｅ、Ｑ６１Ｈ、Ｑ６１Ｋ、Ｑ６１Ｌ、Ｑ６１Ｐ又はＱ６１Ｒの突然変異のうちの１つであってもよい。ＲＡＳタンパク質の１２位を含む少なくとも１つのペプチドは、１２位を含む領域以外の位置において、ＲＡＳタンパク質と少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも６６％、少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、又は少なくとも１００％の配列同一性を有してもよい。或る実施形態では、１２位を含む少なくとも８個のアミノ酸の領域を含む少なくとも１つの更なるペプチドは、配列番号７〜配列番号１２及び配列番号２１〜配列番号２６のうちの１つに対して、１２位を含む領域以外の位置において、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも６６％、少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有する。ＲＡＳタンパク質の６１位を含む少なくとも８個のアミノ酸の領域を含む少なくとも１つのペプチドは、６１位を含む領域以外の位置において、ＲＡＳタンパク質と少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも６６％、少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有してもよい。或る実施形態では、ＲＡＳタンパク質の６１位を含む少なくとも１つの更なるペプチドは、配列番号１３〜配列番号１８及び配列番号２９〜配列番号３２のうちの１つに対して６１位を含む領域以外の位置において少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも６６％、少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有する。上述の突然変異と配列番号の任意の組合せが、本発明のペプチド混合物において想定される。
或る実施形態では、上記ペプチド混合物は、Ｇ１３Ｃの突然変異を有するペプチド、Ｇ１３Ｄの突然変異を有するペプチド、Ｇ１２Ａの突然変異を有するペプチド、Ｇ１２Ｃの突然変異を有するペプチド、Ｇ１２Ｄの突然変異を有するペプチド、Ｇ１２Ｒの突然変異を有するペプチド、Ｇ１２Ｓの突然変異を有するペプチド、及びＧ１２Ｖの突然変異を有するペプチドからなる。かかる実施形態では、上記ペプチド混合物は、配列番号１、配列番号３、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１及び配列番号１２に対して、１２位又は１３位を含む領域以外の位置において、それぞれ独立して、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも６６％、少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有するペプチドからなる。或る実施形態では、上記ペプチド混合物は、配列番号１９〜配列番号２６に対して、１２位又は１３位を含む領域以外の位置においてそれぞれ独立して少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも６６％、少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有するペプチドからなる。配列番号１９〜配列番号２６に対して１００％の配列同一性がある場合には本明細書において、本発明のこの実施形態をＴＧ０２と呼ぶ。表４及び図２は、ＴＧ０２に好ましく存在するペプチドを示す。ＲＡＳの突然変異と関連する癌、肺癌及び結腸直腸癌におけるこれらの突然変異の発生率を図１、図３及び図４にそれぞれ示す。ＴＧ０２によるマウスのワクチン接種の後の脾細胞増殖アッセイの結果を図９に示し、ＴＧ０２が免疫応答の誘導に有効であることを示す。
代替的な実施形態では、上記ペプチド混合物は、Ｇ１３Ｒ突然変異を有するペプチド、Ｇ１３Ｖ突然変異を有するペプチド、Ｑ６１Ｈ突然変異を有するペプチド、Ｑ６１Ｋ突然変異を有するペプチド、Ｑ６１Ｌ突然変異を有するペプチド、及びＱ６１Ｒ突然変異を有するペプチドからなる。かかる実施形態では、上記ペプチド混合物は、１３位及び６１位を含む領域以外の位置において、配列番号２、配列番号４、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５及び配列番号１６に対してそれぞれ少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも６６％、少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を独立して有するペプチドからなる。或る実施形態では、上記ペプチド混合物は、配列番号２７〜配列番号３２に対して、１３位又は６１位を含む領域以外の位置において、それぞれ少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも６６％、少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、又は１００％を独立して有するペプチドからなる。配列番号２７〜３２に対して１００％の配列同一性がある場合には本明細書において、本発明のこの実施形態をＴＧ０３と呼ぶ。表５及び図２はＴＧ０３のペプチドを示す。悪性黒色腫におけるこれらの突然変異の発生率を図５に示す。
他の実施形態では、上記ペプチド混合物は、Ｇ１３Ｃ突然変異を有するペプチド、Ｇ１３Ｄ突然変異を有するペプチド、Ｇ１３Ｒ突然変異を有するペプチド、Ｇ１２Ａ突然変異を有するペプチド、Ｇ１２Ｃ突然変異を有するペプチド、Ｇ１２Ｄ突然変異を有するペプチド、Ｇ１２Ｒ突然変異を有するペプチド、Ｇ１２Ｓ突然変異を有するペプチド、及びＧ１２Ｖ突然変異を有するペプチドからなる。かかる実施形態では、上記ペプチド混合物は、１２位又は１３位を含む領域以外の位置において、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、及び配列番号１２に対してそれぞれ少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも６６％、少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を独立して有するポリペプチドからなる。或る実施形態では、上記ペプチド混合物は、１２位又は１３位を含む領域以外の位置において、配列番号１９〜配列番号２７に対してそれぞれ少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも６６％、少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を独立して有するペプチドからなる。この実施形態のペプチド混合物によるＰＢＭＣのｉｎ ｖｉｔｒｏ刺激の後のＴ細胞増殖アッセイの結果を図７に示し、この混合物によってＴ細胞が刺激されたことを示す。したがって、本発明のペプチド混合物は免疫応答の誘導において有効である。
概して、本発明のペプチドは、１２位、１３位又は６１位を含む８個のアミノ酸領域内に、１２位、１３位又は６１位の残基以外においてそれぞれ、ＲＡＳタンパク質の対応する領域と同一である、少なくとも６個のアミノ酸残基を有する。さらに、概して、本発明のペプチドは、ＲＡＳタンパク質の１２位、１３位、又は６１位を含む領域以外の位置において、配列番号１〜配列番号３２の１つに対してそれぞれ少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも６６％、少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、又は１００％を独立して有する。
或る実施形態では、上記ペプチド混合物は、第１、第２、第３及び第４のペプチドからなり、第１及び第２のペプチドは上記の通りである。第３及び第４のペプチドは各々ＲＡＳタンパク質の１３位を含む少なくとも８個のアミノ酸の領域を含み、第３及び第４のペプチドは各々、１３位を含む領域以外の位置において、ＲＡＳタンパク質と少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも６６％、少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を独立して有する。第３及び第４のペプチドは各々配列番号１〜配列番号６、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２７又は配列番号２８のうちの１つに対して１３位を含む領域以外の位置において、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも６６％、少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を独立して有してもよい。第３及び第４のペプチドは各々ＲＡＳペプチドの１３位に対応するアミノ酸に点突然変異を有し、第１、第２、第３及び第４のペプチドは各々他のペプチドの点突然変異と異なる点突然変異を有する。１つの実施形態では、第１のペプチドはＧ１３Ｒの突然変異を有するペプチドであり、第２のペプチドはＧ１３Ａの突然変異を有するペプチドであり、第３のペプチドはＧ１３Ｓの突然変異を有するペプチドであり、第４のペプチドはＧ１３Ｖの突然変異を有するペプチドである。
或る実施形態では、上記ペプチド混合物には最大８個の異なるペプチドが存在する。或る実施形態では、上記ペプチド混合物には最大９個の異なるペプチドが存在する。他の実施形態では、最大１０個、１２個、１４個、又は１６個の異なるペプチドが存在する。ペプチド混合物がＲＡＳタンパク質の１２位を含む領域を含む少なくとも１つの更なるペプチドを含む実施形態では、該ペプチド混合物は、ＲＡＳペプチドの１２位を含む少なくとも８個のアミノ酸の領域を含み、ＲＡＳタンパク質の１２位に対応する位置に点突然変異を有する、１個、２個、３個、４個、５個又は６個のペプチドを含む。上記ペプチド混合物がＲＡＳタンパク質の６１位を含む少なくとも８個のアミノ酸の領域を含む少なくとも１つの更なるペプチドを含む実施形態では、該ペプチド混合物は、ＲＡＳタンパク質の６１位を含む領域を含み、ＲＡＳタンパク質の６１位に対応するアミノ酸に点突然変異を有する、１個、２個、３個、４個、５個又は６個のペプチドを含み、ここで、上記ペプチドの各々は異なる点突然変異を有する。
或る実施形態では、ＲＡＳペプチドの１３位を含む少なくとも８個のアミノ酸の領域を含むペプチドは、ＲＡＳタンパク質の１位〜３０位の領域を含む。代替的な実施形態では、ＲＡＳタンパク質の１３位を含む少なくとも８個のアミノ酸の領域を含むペプチドは、ＲＡＳタンパク質の５位〜２１位を含む。更なる実施形態では、ＲＡＳタンパク質の１３位に対応するアミノ酸は上記ペプチドのＣ末端にある。更なる実施形態では、ＲＡＳタンパク質の１３位に対応するアミノ酸は上記ペプチドのＮ末端にある。概して、ＲＡＳタンパク質の１３位を含む少なくとも８個のアミノ酸を有する領域は、１３位を含むＲＡＳタンパク質の任意の８個の位置からなってもよい。例えば、１３位を含む少なくとも８個のアミノ酸を有する領域は、ＲＡＳタンパク質の６位〜１３位、７位〜１４位、８位〜１５位、９位〜１６位、１０位〜１７位、１１位〜１８位、１２位〜１９位、又は１３位〜２０位のアミノ酸からなってもよい。
或る実施形態では、ＲＡＳペプチドの１２位を含む少なくとも８個のアミノ酸の領域を含むペプチドは、ＲＡＳタンパク質の１位〜３０位を含む。他の実施形態では、ＲＡＳタンパク質の１２位を含む少なくとも８個のアミノ酸の領域を含むペプチドは、ＲＡＳタンパク質の５位〜２１位を含む。代替的な実施形態では、ＲＡＳタンパク質の１２位に対応するアミノ酸は上記ペプチドのＣ末端にある。更なる実施形態では、ＲＡＳタンパク質の１２位に対応するアミノ酸は上記ペプチドのＮ末端にある。概して、ＲＡＳタンパク質の１２位を含む少なくとも８個のアミノ酸を有する領域は、１２位を含むＲＡＳタンパク質の任意の８個の位置からなってもよい。例えば、１２位を含む少なくとも８個のアミノ酸を有する領域は、ＲＡＳタンパク質の５位〜１２位、６位〜１３位、７位〜１４位、８位〜１５位、９位〜１６位、１０位〜１７位、１１位〜１８位、又は１２位〜１９位のアミノ酸からなってもよい。
或る実施形態では、ＲＡＳペプチドの６１位を含む少なくとも８個のアミノ酸の領域を含むペプチドは、ＲＡＳタンパク質の４７位〜７６位を含む。他の実施形態では、ＲＡＳペプチドの６１位を含む少なくとも８個のアミノ酸の領域を含むペプチドは、ＲＡＳタンパク質の５３位〜６９位を含む。代替的な実施形態では、ＲＡＳタンパク質の６１位に対応するアミノ酸は上記ペプチドのＣ末端にある。更なる実施形態では、ＲＡＳタンパク質の６１位に対応するアミノ酸は上記ペプチドのＮ末端にある。概して、ＲＡＳタンパク質の６１位を含む少なくとも８個のアミノ酸を有する領域は、１３位を含むＲＡＳタンパク質の任意の８個の位置からなってもよい。例えば、６１位を含む少なくとも８個のアミノ酸を有する領域は、ＲＡＳタンパク質の５４位〜６１位、５５位〜６２位、５６位〜６３位、５７位〜６４位、５８位〜６５位、５９位〜６６位、６０位〜６７位、又は６１位〜６８位のアミノ酸からなってもよい。
本発明のペプチド混合物は、同じ割合又は異なる割合で上記ペプチドを含有してもよい。或る実施形態では、第１及び第２のペプチドは同じ割合で上記混合物中に存在し、すなわち、各ペプチドが上記ペプチド混合物のペプチド成分の５０％を占める。他の実施形態では、上記ペプチド混合物において第２のペプチドより多い割合の第１のペプチドが存在する。例えば、第１のペプチドは、上記ペプチド混合物のペプチド成分の少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、又は少なくとも９０％を占めていてもよい。代替的な実施形態では、上記ペプチド混合物において第１のペプチドより多い割合の第２のペプチドが存在する。例えば、第２のペプチドは、上記ペプチド混合物のペプチド成分の少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、又は少なくとも９０％を占めていてもよい。少なくとも１つの更なるペプチドを含む実施形態では、該ペプチドは同じ割合で上記ペプチド混合物のペプチド成分に存在してもよい。他の実施形態では、第１、第２、及び少なくとも１つの更なるペプチドは、互いに異なる割合で存在してもよい。例えば、第１、第２、及び少なくとも１つの更なるペプチドは各々、独立して、上記ペプチド混合物のペプチド成分の少なくとも１％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、又は少なくとも９０％を占めることができる。
代替的な実施形態は、ＲＡＳタンパク質の少なくとも５個のペプチドを含み、その５個のペプチドが各々ＲＡＳタンパク質の１３位を含む少なくとも８個のアミノ酸の領域を備える、ペプチド混合物を含む。少なくとも５個のペプチドの各々が、１３位を含む領域以外の位置において、ＲＡＳタンパク質と少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも６６％、少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を独立して有し、及び／又は配列番号１〜配列番号６、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２７、及び配列番号２８のうちの１つに対して、１３位を含む領域以外の位置において、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも６６％、少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を独立して有する。少なくとも５つのペプチドは各々、Ｇ１３Ａ、Ｇ１３Ｃ、Ｇ１３Ｄ、Ｇ１３Ｒ、Ｇ１３Ｓ又はＧ１３Ｖの突然変異から独立して選択されるＲＡＳタンパク質の１３位に対応するアミノ酸において点突然変異を有し、各ペプチドの点突然変異は他のペプチドの点突然変異と異なる。
別の実施形態では、免疫応答を惹起するのに適したペプチド混合物は、ＲＡＳタンパク質の６個のペプチドからなり、そのペプチドが各々ＲＡＳタンパク質の１２位を含む少なくとも８個のアミノ酸の領域を備える。ペプチドの各々が、１２位を含む領域以外の位置において、ＲＡＳタンパク質と少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも６６％、少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を独立して有し、及び／又は配列番号７〜配列番号１２、及び配列番号２１〜配列番号２６のうちの１つに対して、１２位を含む領域以外の位置において、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも６６％、少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を独立して有する。ペプチドは各々、Ｇ１２Ａ、Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２Ｒ、Ｇ１２Ｓ又はＧ１２Ｖの突然変異から選択されるＲＡＳタンパク質の１２位に対応するアミノ酸において点突然変異を有し、各ペプチドの点突然変異は他のペプチドの点突然変異と異なる。
更なる実施形態では、免疫応答を惹起するのに適したペプチド混合物は、ＲＡＳタンパク質の第１、第２、第３及び第４のペプチドからなり、第１、第２及び第３のペプチドは各々ＲＡＳタンパク質の１２位を含む少なくとも８個のアミノ酸の領域を含み、ＲＡＳタンパク質の第４のペプチドはＲＡＳタンパク質の１３位を含む少なくとも８個のアミノ酸の領域を含む。第１、第２、第３及び第４のペプチドは各々、１２位又は１３位を含む領域以外の位置において、それぞれ独立して、ＲＡＳタンパク質と少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも６６％、少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有し、及び／又はそれぞれ配列番号７〜配列番号１２、配列番号２１〜配列番号２６、配列番号１〜配列番号６、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２７及び配列番号２８のうちの１つに対して、１２位又は１３位を含む領域以外の位置において、それぞれ独立して、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも６６％、少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有する。第１、第２、第３及び第４のペプチドは各々、ＲＡＳタンパク質の上記１２位又は１３位に対応するアミノ酸にそれぞれ点突然変異を有する。或る実施形態では、第１のペプチドはＧ１２Ａの突然変異を有するペプチドであり、第２のペプチドはＧ１２Ｒの突然変異を有するペプチドであり、第３のペプチドはＧ１２Ｓの突然変異を有するペプチドであり、第４のペプチドはＧ１３Ｃの突然変異を有するペプチドである。
本発明の別の態様では、ＲＡＳタンパク質のフラグメントに対応する、免疫応答を惹起するのに適したペプチドが提供される。該ペプチドは、ＲＡＳタンパク質の１３位を含む少なくとも８個のアミノ酸の領域を含み、該少なくとも８個のアミノ酸の領域は、１３位以外において、ＲＡＳタンパク質の対応する領域と同一である、少なくとも６個のアミノ酸残基を有する。上記ペプチドは、Ｇ１３Ｃ又はＧ１３Ｒの突然変異のうちの１つである、ＲＡＳタンパク質の１３位に対応するアミノ酸における点突然変異を有する。或る実施形態では、上記ペプチドは、Ｇ１３Ｃの突然変異を有する。他の実施形態では、上記ペプチドはＧ１３Ｒの突然変異を有する。かかるペプチドによるＴ細胞刺激は、増殖応答を誘導し（図８）、本発明のこの態様によるペプチドが免疫応答を誘導可能であることを示す。或る実施形態では、ＲＡＳタンパク質のフラグメントに対応し、ＲＡＳタンパク質の１３位を含む少なくとも８個のアミノ酸の領域を含むペプチドは、３０個以下のアミノ酸残基を含む。例えば、上記ペプチドは、幾つかの実施形態において、２８個、２６個、２４個、２２個、２０個、１８個、１７個、１６個、１４個、１２個、１０個又は８個以下のアミノ酸を含む。或る実施形態では、上記ペプチドは１７個以下のアミノ酸を含む。
更なる実施形態では、ワクチン又は医薬として用いられるペプチドが提供される。該ペプチドは、ＲＡＳタンパク質のフラグメントに対応し、少なくともＲＡＳタンパク質の１３位を含むアミノ酸の領域を含む。少なくとも８個のアミノ酸の領域は、１３位以外に、ＲＡＳタンパク質の対応する領域と同一の少なくとも６個のアミノ酸残基を有する。ワクチン又は医薬として用いられるペプチドは、Ｇ１３Ｃ又はＧ１３Ｒの突然変異のうちの１つである、ＲＡＳタンパク質の１３位に対応するアミノ酸に点突然変異を有する。
本発明のペプチドは、細胞表面のＭＨＣ ＩＩ分子によって提示されるＲＡＳタンパク質フラグメントに対応するペプチドである。そのため、本発明のペプチドは、ＲＡＳタンパク質の細胞内タンパク質分解より生じ、その後ＨＬＡ分子上に提示されることが可能で、通常、個体がＴ細胞レパートリーにそれに対する反応性Ｔ細胞を有する、タンパク質フラグメントに対応するペプチドである。図６〜図８に示されるように、本発明の実施形態によるペプチド混合物及びペプチドはＴ細胞増殖応答を誘導し、また本発明の実施形態のペプチド混合物によるマウスのワクチン接種は脾細胞の増殖を誘導した（図９）。
本発明の更なる態様では、ＭＨＣ分子上に提示された場合に、上の開示によるペプチド混合物のうちの１つにおける各々のペプチドに対して特異的なＴ細胞を含むＴ細胞混合物、又は上の開示によるペプチドに対して特異的なＴ細胞を含むＴ細胞製剤が提供される。Ｔ細胞混合物又は製剤は、ＲＡＳタンパク質の第１及び第２のペプチド、又はＲＡＳタンパク質のペプチドを含むペプチド混合物を用いて少なくとも１つの反応性Ｔ細胞を刺激することによって製造されてもよい。例えば、１つの実施形態では、Ｔ細胞混合物が複数のＴ細胞を含み、ここで、第１及び第２のＴ細胞がそれぞれＲＡＳタンパク質のフラグメントに対応する第１及び第２のペプチドに特異的であり、各ペプチドがＲＡＳタンパク質の１３位を含む少なくとも８個のアミノ酸の領域を備え、第１及び第２のＴ細胞が各々、上記１３位に対応するペプチドのアミノ酸における点突然変異に対して特異的であり、第１のＴ細胞がそれに対して特異的である点突然変異が第２のＴ細胞がそれに対して特異的である点突然変異と異なる。別の実施形態では、例えば、Ｔ細胞製剤は、ＲＡＳタンパク質のフラグメントに対応するペプチドに特異的な複数のＴ細胞を含み、ここで、該ペプチドはＲＡＳタンパク質の１３位を含む少なくとも８個のアミノ酸の領域を含み、各Ｔ細胞は上記１３位に対応するペプチドのアミノ酸における点突然変異に特異的である。
本発明のペプチド混合物、ペプチド、Ｔ細胞混合物及びＴ細胞製剤は、癌、特にＲＡＳ癌遺伝子における突然変異と関連する癌の治療及び／又は予防のために用いられる。癌として、副腎、自律神経節、胆管、骨、乳房、中枢神経系、子宮頸部、結腸直腸、子宮内膜、造血系、リンパ、腎臓、大腸、肝臓、肺、食道、卵巣、膵臓、前立腺、唾液腺、皮膚、小腸、胃、精巣、胸腺、甲状腺、頭頸部及び尿路の癌、及び悪性黒色腫が挙げられ、また、本発明のペプチド混合物、ペプチド、Ｔ細胞混合物及びＴ細胞製剤を２以上のこれらの種類の癌の予防及び／又は治療に対して使用してもよい。或る実施形態では、第１及び第２のペプチドのうちの１つがＧ１３Ｃの突然変異を有する本発明のペプチド混合物、ペプチドがＧ１３Ｃの突然変異を有する本発明のペプチド、第１及び第２のＴ細胞のうちの１つがＧ１３Ｃの突然変異を有するペプチドに特異的であるＴ細胞混合物、又はＴ細胞がＧ１３Ｃの突然変異を有するペプチドに特異的であるＴ細胞製剤は、癌の予防及び／又は治療のために用いられる。かかる実施形態では、癌は結腸直腸癌、肺癌及び膵臓癌のうちの１又は複数であることが好ましい。別の実施形態では、第１及び第２のペプチドのうちの１つがＧ１３Ｒの突然変異を有する本発明のペプチド混合物、ペプチドがＧ１３Ｒの突然変異を有する本発明のペプチド、第１又は第２のＴ細胞がＧ１３Ｒの突然変異を有するペプチドに特異的であるＴ細胞混合物、又はＴ細胞がＧ１３Ｒの突然変異を有するペプチドに特異的であるＴ細胞製剤を癌の予防及び／又は治療に使用してもよい。かかる実施形態では、癌は悪性黒色腫であることが好ましい。特に、ＴＧ０２と呼ばれるペプチド混合物は、ＲＡＳタンパク質における突然変異と関連する癌の９９％を扱うことから幅広い用途を有し、一方ＴＧ０３と呼ばれるペプチド混合物はＲＡＳタンパク質における突然変異と関連する癌の１４％を扱うことがわかった。したがって、１つの実施形態では、癌の予防及び／又は治療にＴＧ０２を使用してもよい。好ましい実施形態では、癌は肺癌、結腸直腸癌及び膵臓癌のうちの１又は複数である。別の実施形態では、癌の予防又は治療にＴＧ０３を使用してもよい。好ましい実施形態では、癌は悪性黒色腫である。
また、上に記載されるペプチド混合物、ペプチド、Ｔ細胞混合物又はＴ細胞製剤を含む医薬組成物が提供される。また、かかる医薬組成物は、少なくとも１つの薬学的に許容可能な担体、希釈剤及び／又は賦形剤を含んでもよい。或る実施形態では、上記医薬組成物は、１又は複数の追加の有効成分及び／又はアジュバントを更に含んでもよい。幾つかの実施形態では、上記医薬組成物は、同じ疾患の兆候に対して治療的に有効な１又は複数の成分を更に含んでもよい。１つの実施形態では、本発明の医薬組成物は、１又は複数の更なる化学療法剤、１又は複数の抗体、１又は複数の小分子及び／又は１又は複数の免疫賦活剤（例えば、サイトカイン）を更に含んでもよい。或る実施形態では、上記ペプチド混合物又は医薬組成物は、他の形態の免疫療法と組み合せて使用されてもよい。図９に示されるように、本発明の実施形態によるペプチド混合物を用いるワクチン接種は脾細胞の増殖を誘導し、本発明のペプチドが免疫応答を誘導可能であることを示す。
幾つかの種類の癌はＲＡＳタンパク質の幾つかの突然変異と関連することがわかっており、さらに最近では、Ｇ１３Ｃの突然変異が幾つか種類の癌により共通して見出されるのに対し、Ｇ１３Ｒの突然変異は他の種類の癌により共通して見出されるように、Ｇ１３Ｃ及びＧ１３Ｒの突然変異が差次的に癌と関連することがわかった。そのため、幾つかの種類の癌を標的とするためペプチド混合物、ペプチド、Ｔ細胞混合物及びＴ細胞製剤を目的に合わせて作製することができる。したがって、本発明は、ワクチン及び治療が患者の癌の種類により特異的であるという利点を提供する。これは、ワクチン及び／又は治療が有効であることを保証するため必要なペプチド及びＴ細胞がより少ないことを意味し、ワクチン及び／又は治療に含まれる無関係のペプチド及び／又はＴ細胞がより少ないという利点を提供する。同様に、互いに内部で競合する場合があるペプチドがより少ないことから、これは免疫優性の問題も軽減する。さらに、必要なペプチド及び／又はＴ細胞の数の減少は、医薬品及び治療がより安価に製造されることを意味する。
本発明のペプチド混合物、ペプチド又は医薬組成物は、当業者に既知の任意の好適な送達技術によって被験体に投与され得る。例えば、それらの技術のなかでも、上記ペプチド混合物、ペプチド又は医薬組成物を注射により、溶液の形態で、リポソームの形態で、又は乾燥形態で（例えば、被覆粒子等の形態で）被験体に投与してもよい。或る実施形態では、ペプチド混合物、ペプチド又は医薬組成物を、例えば、各ペプチドを１μｇ〜１ｇの量で３日毎に１回、１週間毎に１回、１ヶ月毎に１回、３ヶ月毎に１回、４ヶ月毎に１回又は６ヶ月毎に１回投与してもよい。
本発明のＴ細胞混合物及びＴ細胞製剤は、静脈内の注射及び／又は点滴によって投与されてもよく、例えば、毎月１回、２ヶ月毎に１回、３ヶ月毎に１回、６か月毎に１回又は毎年に１回、１０６〜１０１２の量でペプチド混合物のペプチド又はペプチドに特異的な各Ｔ細胞を投与してもよい。上記用量を２ヶ月〜５ヶ月に亘って毎月１回投与し、その後はより頻度を少なくして投与することが好ましい。
上に言及されるように、異なる種類の癌はＲＡＳタンパク質の異なる突然変異と関連するという知見は、上記ワクチン及び治療を特定の癌に対して標的化可能であることを意味する。そのため、本発明の別の態様では、癌の診断及び適切な治療の選択を含む方法のために用いられるペプチド混合物、ペプチド、Ｔ細胞混合物及び／又はＴ細胞製剤が提供される。上記方法は、ａ）患者から採取された試料に存在するＲＡＳタンパク質の点突然変異を同定する工程、及びｂ）試料において同定されたＲＡＳタンパク質点突然変異の少なくとも１つに対応する点突然変異を含むペプチドを含む上に記載のペプチド混合物を選択する工程、試料において同定されたＲＡＳタンパク質点突然変異の少なくとも１つに対応する点突然変異を含む上に記載のペプチドを選択する工程、試料において同定されたＲＡＳタンパク質点突然変異の少なくとも１つに対応する点突然変異を含むペプチドに特異的なＴ細胞を含む上に記載のＴ細胞混合物を選択する工程、及び／又は試料において同定されたＲＡＳタンパク質点突然変異の少なくとも１つに対応する点突然変異を含むペプチドに特異的なＴ細胞を含む上に記載のＴ細胞製剤を選択する工程を含む。例えば、被験体から採取された試料がＧ１３Ｃの突然変異を有するＲＡＳタンパク質を含有することがわかった場合、Ｇ１３Ｃ突然変異を含む、ペプチドを含むペプチド混合物、ペプチド、及び／又はペプチドに特異的なＴ細胞を含むＴ細胞の混合物及び／又は製剤を選択する。試料が、例えばＧ１３Ｃの突然変異及びＧ１２Ｒの突然変異を含むＲＡＳタンパク質を含有する状況では、Ｇ１３Ｃの突然変異を含むペプチド及びＧ１２Ｒの突然変異を含むペプチドを含むペプチド混合物、及び／又はＧ１３Ｃの突然変異を含むペプチドに特異的なＴ細胞及びＧ１２Ｒの突然変異を含むペプチドに特異的なＴ細胞を含むＴ細胞混合物が選択される。また、上記方法は、選択されたペプチド混合物、ペプチド及び／又はＴ細胞混合物及び／又は製剤を含む医薬組成物を患者に投与する工程を含んでもよい。
本発明の更なる態様では、本明細書に記載されるペプチド混合物、ペプチド、Ｔ細胞混合物及び／又はＴ細胞製剤を含むキットが提供される。上記ペプチド混合物、ペプチド、Ｔ細胞混合物及び／又はＴ細胞製剤は、それ自体がキットに存在してもよく、又は上記ペプチド混合物、ペプチド、Ｔ細胞混合物及び／又はＴ細胞製剤は医薬製剤としてキットに存在してもよい。或る実施形態では、上記ペプチド混合物、ペプチド、Ｔ細胞混合物及び／又はＴ細胞製剤は、例えば、バイアル、瓶、フラスコに包装されてもよく、それらは例えば箱、封筒又は袋に更に包装されてもよい。或る実施形態では、上記キットは、ペプチド及び／又はＴ細胞が使用者によって混合されるようにペプチド及び／又はＴ細胞が別々の容器で提供される、ペプチド混合物及び／又はＴ細胞混合物を含む。
表
実施例１
本実施例では、バフィーコートを４名の正常なヒトドナーから収集し（バフィー１、バフィー２、バフィー３、及びバフィー４）、ｉｎ ｖｉｔｒｏで培養した。ｉｎ ｖｉｔｒｏのＰＢＭＣを単一のＲＡＳペプチド又はＲＡＳペプチドの混合物で刺激し、Ｔ細胞増殖アッセイを行った。結果を図６〜図８に示す。
方法
装置／試薬
HettichのＲｏｔｉｎａ ４２０（半径２１０）又は相当するもの
KOJAIRのＳｉｌｖｅｒｌｉｎｅ Ｂｌｕｅ Ｓｅｒｉｅｓラミナーフローフード又は相当するもの
ＣＯ２インキュベーター、Ｆｏｒｍａ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｍｏｄｅｌ ３１１１又は相当するもの
水浴３７℃
ＫＯＶＡ Ｇｌａｓｓｔｉｃスライド（カタログ番号８７１４４Ｅ、Hycor Biomedical Inc, Garden Grove, USA）
ＴｏｐＣｏｕｎｔマイクロプレートシンチレーションカウンター（Packard Instrument Company, Meriden, USA）
Ｃｅｌｌ Ｈａｒｖｅｓｔｅｒ Ｆｉｌｔｅｒｍａｔｅ １９６採取器（Packard Instrument Company, Meriden, USA）
Ｕｎｉｆｉｌｔｅｒ ＧＦ／Ｃ（カタログ番号６−００５１７４、Nerliens Meszansky, Oslo, Norway）又は相当するもの
Ｍｉｃｒｏｓｃｉｎｔ−０シンチレーション液（カタログ番号６０１３６１１、Nerliens Meszansky, Oslo, Norway）又は相当するもの
Ｔｏｐｓｅａｌ−Ａ（カタログ番号６００５１８５、Nerliens Meszansky, Oslo, Norway）又は相当するもの
３Ｈチミジン（カタログ番号ＡＲＴ１７８−Ｄ、Nerliens Meszansky, Oslo, Norway）又は相当するもの
ＣｅｌｌＧｒｏ ＤＣ培地（カタログ番号００２０８０１−０５００、CellGenix GmbH, Freiburg, Germany）又は相当するもの
ＲＰＭＩ−１６４０（カタログ番号Ｅ１５−８４０、PAA Labs, Linz, Austria）又は相当するもの
ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）（カタログ番号Ｄ５８７９−５００ＭＬ、Sigma-Aldrich Norway AS, Oslo, Norway）又は相当するもの
Ｍｕｃｏｍｙｓｔ（カタログ番号０１９２４９、Meda AS, Asker, Norway）又は相当するもの
組換えヒトインターロイキン−２（ＩＬ−２、Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ（商標））、（Chiron Therapeutics, Emeryville, USA）又は相当するもの
４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）バッファー１Ｍ（カタログ番号Ｓ１１−００１、Fisher Scientific AS, Oslo, Norway）又は相当するもの
ＩＬ−７（カタログ番号２０７−ＩＬ−０２５、R & D Systems Europe Ltd, Abingdon, UK）又は相当するもの
ゲンタマイシン４０ｍｇ／ｍｌ（カタログ番号Sanofi Aventis Norge AS, Lysaker, Norway）又は相当するもの
ヒト血清アルブミン２０％（カタログ番号ＳＷ２Ｇ００１３、Baxter AS, Oslo, Norway）又は相当するもの
２４ウェル組織培養プレート（カタログ番号７３４−１６０５、VWR International AS, Oslo, Norway）又は相当するもの
マイクロプレート９６ウェル、丸底（カタログ番号７３４−１７９７、VWR International AS, Oslo, Norway）又は相当するもの
Ｃ型ブドウ球菌エンテロトキシン（ＳＥＣ−３）（カタログ番号ＣＴ３３３、Toxin Technology Inc, Sarasota, USA）
培養に使用した完全ＣｅｌｌＧｒｏ ＤＣ培地
最終濃度に対して、５００ｍｌのＣｅｌｌＧｒｏ ＤＣ培地に以下を添加した。
ゲンタマイシン５０μｇ／ｍｌ（５００ｍＬの培地に対して６３０μＬの４０ｍｇ／ｍｌストックを添加）
Ｍｕｃｏｍｙｓｔ １．６ｍｇ／ｍｌ（５００ｍＬの培地に対して４ｍＬの２００ｍｇ／ｍｌストックを添加）
ＨＥＰＥＳバッファー０．０１Ｍ（５００ｍＬの培地に対して５ｍｌの１Ｍストックを添加）
手順
ａ． 凍結されたＰＢＭＣの解凍
項５まで室温で処置を行わなければならない。開放下での（in the open）細胞の操作を全てラミナーフローフードにおいて行う。
１． バフィーコート（バフィー１、バフィー２、バフィー３、及びバフィー４）に由来する凍結したＰＢＭＣを含む各バイアルを３７℃の水浴にすばやく移す。
２． 一定間隔（およそ２分〜３分）でバイアルを手作業で振動させ、氷が幾つかあるうちに水浴からバイアルを取り出す。
３． 氷が全て溶けると、１ｍｌのＣｅｌｌＧｒｏ ＤＣ培地の液滴を細胞懸濁物に移す。
４． 上記細胞懸濁物を２０ｍｌのＣｅｌｌＧｒｏ ＤＣ培地を含む５０ｍｌのチューブに移す。
５． 細胞を室温にて５００Ｇで５分間遠心分離する。
６． 細胞を５ｍｌのＣｅｌｌＧｒｏ ＤＣ培地に再懸濁する。
７． Ｂｕｅｒｋｅｒチャンバー又はＫＯＶＡ Ｇｌａｓｓｔｉｃスライドを使用して生存細胞の数を数え、完全ＣｅｌｌＧｒｏ ＤＣ培地（製法を参照されたい）中の細胞濃度を２×１０６細胞／ｍｌに調整する。総細胞数：バフィー１−４５×１０６細胞、バフィー２−２７．５×１０６細胞、バフィー３−４０．５×１０６細胞、及びバフィー４−４０．５×１０６細胞。
ｂ． ＲＡＳペプチド反応性Ｔ細胞の数を増加するためのバルク培養
１． １ｍｌの解凍したＰＢＭＣ（ＤＣ培地中２×１０６細胞／ｍｌ）を２４ウェルプレートの各ウェルに移す。
２． １３Ｃ及び１３Ｒのペプチド各々２０μｌ、又は２０μｌの１３Ｒ及び６０μｌのＴＧ０２−ミックスをウェルに添加して各ペプチドの最終濃度を１０μＭとする。
３． 加湿したインキュベーターにおいて３７℃／５％ＣＯ２で３日間細胞を培養する。
４． ３日目：最終濃度２０ｉＵ／ｍｌの組換えヒトインターロイキン−２（ｒＩＬ−２）（すなわち、１０００ｉＵ／ｍｌのストック溶液から５０μｌ）、及び最終濃度５ｎｇ／ｍｌの組換えヒトＩＬ−７（すなわち、５００μｇ／ｍｌのストック溶液から１０μｌ）を細胞培養物に添加し、３７℃／５％ＣＯ２でインキュベーションを続ける。この工程は細胞が良く成長している場合には任意である。
５． ４日目〜６日目：顕微鏡下で定期的に細胞を確認し、必要に応じて分ける（５００μｌを各ウェルから取り出し、４０ｉＵ／ｍｌのＩＬ−２及びＩＬ−７で補足した新たなＣｅｌｌＧｒｏ ＤＣ培地５００μｌで置換する）。
６． ７日目〜１４日目：細胞を毎日確認し、成長の遅い細胞を含むウェルを合わせる。
ｃ． ｉ）３日間のＴ細胞増殖アッセイ
１． 工程ｂからのバルク培養物においてＴ細胞を採取し、洗浄し、計数する。
２． １ウェル当たり５×１０４個のバルク培養物に由来するＴ細胞を丸底の９６ウェルプレートに移す。
３． １バイアルのＣｅｌｌＧｒｏ ＤＣ培地中の自己ＰＢＭＣ試料を解凍する。ＰＢＭＣに放射線照射し（３０Ｇｙ）、計数し、各ウェルに５×１０４個の細胞を添加し、ＤＣ培地で総容量を２００μｌ／ウェルに調整する。
４． プレートのレイアウトに従って、以下の試料を３連（in triplicates）で作製する。
陰性対照：
Ｔ細胞のみ
各時間点に由来するＴ細胞＋放射線照射したＰＢＭＣ
陽性対照
各時間点に由来するＴ細胞＋放射線照射したＰＢＭＣ＋１μｇ／ｍｌのＳＥＣ−３
試験試料：
各時間点に由来するＴ細胞＋放射線照射したＰＢＭＣ（１０μＭの各ペプチド）：
Ｉ）１３Ｃ＋１３Ｒで刺激したバルク培養物に対して：１３Ｃ＋１３Ｒミックス又は単一のＧ１３Ｃペプチド
ＩＩ）ＴＧ０２＋１３Ｒで刺激したバルク培養物に対して：ＴＧ０２＋１３Ｒ、１３Ｃ＋１３Ｒミックス、又は単一のＧ１３Ｃペプチド
３７℃／５％ＣＯ２で４８時間細胞をインキュベートする。
５． ２０μＬの３Ｈチミジン（３．７×１０４Ｂｑ）を添加する。
６． ３７℃／５％ＣＯ２で１７時間インキュベートする。
７． Ｆｉｌｔｅｒｍａｔｅ １９６採取器を使用してＵｎｉｆｉｌｔｅｒに細胞を採取し、完全に乾燥するまで４５℃でフィルタを乾燥する（通常、１．５時間後に達成されるが、プレートを６０時間後に計数してもよいため、この後の４５℃で放置される時間数は重大ではない）。
８． 接着性のカバー（Ｕｎｉｆｉｌｔｅｒと共に供給される）でＵｎｉｆｉｌｔｅｒの底を覆い、２５μｌのマイクロシンチレーション液を各ウェルに添加する。ＴｏｐＳｅａｌでプレートを覆い、ＴｏｐＣｏｕｎｔ Ｐａｃｋａｒｄマイクロプレートシンチレーションベータカウンターにフィルタを入れる。アッセイウィザードプログラムを入力する。３連でプロトコル／プログラム３Ｈチミジンを選択する。レポート定義及びＡＳＣＩＩファイルアウトプットを入力する。ディレクトリのもとで、データフォルダを選択する（各ユーザーは別々のフォルダを持たなくてはならない）。保存のため実験ファイルに対して名称を選択する。スタッカをオン又はオフにする（２以上のプレートの場合スタッカを使用する）。アッセイプログラムを開始する。
ｉｉ）２度目のバルク培養物の刺激
残りの細胞（１×１０６個〜２×１０６個のＴ細胞／ウェル）を自己ＰＢＭＣ（１００万個／ウェル）及びペプチドミックス（工程ｂに記載される）でもう一度再刺激した。
１． （工程ｂに記載されるように）３７℃／５％ＣＯ２の加湿したインキュベーターで３日間細胞を培養する。
２． １７日目：最終濃度４０ｉＵ／ｍｌの組換えヒトインターロイキン−２及び最終濃度５ｎｇ／ｍｌの組換えヒトＩＬ−７を細胞培養物に添加し、３７℃／５％ＣＯ２でインキュベーションを続ける。顕微鏡下で細胞を定期的に確認し、必要に応じて分ける。
３． １９日目〜２１日目：各ウェルから５００μｌを取り出し、４０ｉＵ／ｍｌのＩＬ−２及びＩＬ−７で補足した新しいＣｅｌｌＧｒｏ ＤＣ培地５００μｌで置換する。
４． ２２日目〜２７日目：（工程ｂのように）細胞を毎日定期的に確認し、成長の遅いＴ細胞を含むウェルを合わせる。
ｄ． ｉ）３日間のＴ細胞増殖アッセイ
１． バルク培養物中のＴ細胞を採取し、洗浄し、計数する。
２． １ウェル当たり５×１０４個のバルク培養物に由来するＴ細胞を丸底の９６ウェルプレートに移す。
３． （工程ｃのｉ）に記載されるように）１バイアルのＣｅｌｌＧｒｏ ＤＣ培地中の自己ＰＢＭＣ試料を解凍する。ＰＢＭＣに放射線照射し（３０Ｇｙ）、計数し、各ウェルに５×１０４個の細胞を添加し、ＤＣ培地で総容量を２００μｌ／ウェルに調整する。
ｉｉ）２７日目〜４２日目：３度目のバルク培養物の刺激
残りの細胞（１００万個〜２００万個のＴ細胞／ウェル）を自己ＰＢＭ（１００万個／ウェル）及びペプチドミックス（工程ｂに記載される）でもう一度再刺激した。
ｅ）３日間のＴ細胞増殖アッセイ
１． バルク培養物中のＴ細胞を採取し、洗浄し、計数する。
２． １ウェル当たり５×１０４個のバルク培養物に由来するＴ細胞を丸底の９６ウェルプレートに移す。
３． （工程ｃのｉ）に記載されるように）１バイアルのＣｅｌｌＧｒｏ ＤＣ培地中の自己ＰＢＭＣ試料を解凍する。ＰＢＭＣに放射線照射し（３０Ｇｙ）、計数し、各ウェルに５×１０４個の細胞を添加し、ＤＣ培地で総容量を２００μｌ／ウェルに調整する。
結果
バルク培養物の３回の刺激の後のペプチド混合物によるＴ細胞増殖アッセイの結果を表１２〜表１４、及び図６〜図８にそれぞれ示す。表１２〜表１４は各複製物に対するカウント毎分（ＣＰＭ）、及び各ドナーに対する平均ＣＰＭを示す。
陽性対照の結果を確認したが、目盛りの関係で図６〜図８には含めていない。示されるように、ペプチド混合物及び単一のペプチドはどちらもＴ細胞増殖を誘導し、該ペプチド及びペプチド混合物はヒトにおいて免疫応答を誘導することができたことを示す。
実施例２
本実施例では、免疫応答を解析するため、ＴＧ０２を用いてマウスに繰り返し皮下ワクチン接種を行った。ワクチン接種の後、脾細胞を採取し、その脾細胞の増殖応答を測定した。結果を図９に示す。
方法
試験物品の特性
名称：ＴＧ０２
製品：ＴＧ０２は等量（重量）の８つの異なるペプチド（１２Ａ、１２Ｃ、１２Ｄ、１２Ｒ、１２Ｓ、１２Ｖ、１３Ｃ、１３Ｄ）からなる。
バッチ番号：１２Ａ：ロット番号１０３４８０４、１２Ｃ：ロット番号１０３４８０３、
１２Ｄ：ロット番号１０３４８０１、１２Ｒ：ロット番号１０３４８０２、
１２Ｓ：ロット番号１０３４８０５、１２Ｖ：ロット番号１０３４８００、
１３Ｃ：ロット番号１０５０４６８、１３Ｄ：ロット番号１０３４８０６。
治療適用：癌
物理状態：粉体
色：白色
純度：１バイアル当たり正味８０ｍｇのペプチド（正味１０ｍｇの各ペプチド）
保存条件：−１５℃〜−２０℃、遮光
使用期限：２０１４年１２月３１日
安全対策：使用者の健康及び安全を保証するには慣例の衛生的な手順で十分であった。
ビヒクル１の特性
名称：ＶｉｓｃｏＧｅｌ
バッチ番号：ＶＧ１４０５６
治療適用：癌
物理状態：ゲル粒子
色：無色
水分含量：９９％
保存条件：２℃〜８℃
使用期限：２０１５年６月１日
安全対策：使用者の健康及び安全を保証するには慣例の衛生的な手順で十分である。
ビヒクル２の特性
本研究で使用されるビヒクル２は、注射用水（aqua ad injectionem）である。供給先から提供される仕様を以下に列挙する。
名称：注射用水
物理状態：液体
保存条件：室温
安全対策：使用者の健康及び安全を保証するには慣例の衛生的な手順で十分であった。
試験物品の作製
５ｍｌの注射用水を１つのＴＧ０２（８０ｍｇ）バイアルに添加し、ゆっくりと回転して（起泡を避ける）、１ｍＬ当たり１６ｍｇのＴＧ０２の均質なストック溶液を得た。群１の動物（表１２を参照されたい）に対して、１ｍＬのＴＧ０２ストック溶液をシリンジで抜き取り、１ｍＬの注射用水と混合して最終濃度８ｍｇ／ｍＬを得た。
群２及び群３の動物（表１２を参照されたい）に対して、１ｍｌのＴＧ０２ストック溶液をシリンジで抜き取り、１ｍＬのＶｉｓｃｏＧｅｌ（商標）と混合して最終濃度８ｍｇ／ｍＬを得た。
試験物品の製剤を、２℃〜８℃で６時間に亘り安定とみなした。
試験系
種／株：健康なＢＡＬＢ／ｃマウス（完全隔離）ＢＡＬＢ／ｃＡｎＮＣｒｌ
供給元：Charles River, 97633 Sulzfeld, Germany
性別：雌
処置期間開始時の年齢：およそ６週齢〜８週齢
動物数：３０（１群当たり動物１０匹）
動物は制御された完全隔離維持繁殖系（ＳＰＦ）由来であった。ドイツ動物福祉法の第９条の２第７項に従い、実験目的で動物を繁殖した。
飼育及び給餌の条件
空調管理された部屋での完全隔離
温度：２２±３℃
相対湿度：５５±１０％
人工光、１２時間明期、１２時間暗期間の配列。
換気：１０回／時間
ラット及びマウスに対してAltrominの１３２４メンテナンスダイエットの自由摂取
およそ２．８のｐＨまで硫黄酸性化した水道水の自由摂取（飲用水、地方自治体の残留物制御、定期的な微生物制御）
動物をAltrominのおがくず（saw fibre）の寝わらでＩＶＣケージ、ＩＩ Ｌ型ポリスルホンケージにおいて１ケージ当たり５匹の動物群で維持する。
食餌、水及び寝わらの証明をBSL BIOSERVICEに提出する。
実験室条件下での適切な順化期間（少なくとも５日）。
動物の割り当て及び識別
投与前に病理学的兆候を示す動物を研究から除外した。代わりに同腹仔からの補足動物を提供した。個々の識別について耳標により各動物に印をつけた。
実験手順
各群１０匹の雌性ＢＡＬＢ／ｃマウスを含む３群で研究を行った。研究の開始を２つの別々の日に行い、それぞれの日に１群当たり５匹の動物を処置した。したがって、上記群をＩ部とＩＩ部に分けた。動物を種々の時間点において皮下で処置した（表１２）。
投与期間の間、毒性の兆候について毎日動物を精密に観察した。最後の投与から４８時間後に動物を安楽死させ、肉眼的に検査して更なる分析のため脾臓を用意した。
用量
全ての群において、首筋及び肩の間に皮下注射によって反復する時間点（表１５）で試験物品を投与した。全ての群に対する適用容量は０．１ｍＬ（０．８０ｍｇのＴＧ０２）であった。
臨床観察
２４日間の全処置期間に亘り、臨床兆候について全ての動物を観察した。
少なくとも１日に１回、好ましくは毎日同じ時間に、投薬後の期待される効果のピーク期間を考慮して、全身の臨床観察を行った。動物の健康状態を記録した。
各動物について、好ましくは毎日同じ時間に投薬後の期待される効果のピーク期間を考慮して、皮膚及び被毛、眼及び粘膜の変化を含む全身の臨床観察を行った。また、呼吸系、循環系、自律神経系及び中枢神経系、並びに身体運動活動（somatomotor activity）及び行動パターンを検査した。アナフィラキシー様反応、麻痺、振戦、痙攣、流涎、下痢、嗜眠（lethargy）、睡眠及び昏睡（coma）の兆候の観察に対して特に注目した。さらに、注射部位にも注目した。
病理学−全体的検死
最後の投与から４８時間後（研究２４日目）に頸椎脱臼により動物を犠牲し、身体の外表面、全ての開口部、並びに頭蓋腔、胸腔及び腹腔、そしてそれらの内容物の注意深い検査を含む詳細な全体的検死に供した。
脾臓細胞の細胞培養及び刺激
全ての動物の脾臓を取り出し、細胞培養培地（１０％ＦＣＳ、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン、２ｍＭのＬ−グルタミン、及び５０μＭのベータ−メルカプトエタノールで補足したＲＰＭＩ １６４０培地）に移し、氷上で保存した。全ての工程を無菌で行い、細胞を氷上で保持した。
セルストレーナーを使用して脾臓細胞に由来する単一の細胞懸濁物を作製した。遠心分離（３５０ｇ、５分間、５±３℃）の後、上清を除去し、細胞ペレットをＡＣＫバッファーに再懸濁して室温で５分間インキュベートした。１０ｍＬの細胞培養培地を添加した。細胞片を沈殿させるため、試料を５分間ベンチトップに放置した。細胞片上の懸濁物を別のチューブに移し、遠心分離（３５０ｇ、５分間、５±３℃）した。上清を除去し、細胞ペレットを１０ｍＬの細胞培養培地に再懸濁した。細胞を計数した後、０．２Mio細胞を９６ウェルプレートに播種した（１ウェル当たり１８０μＬ、１．１×１０６細胞／ｍＬ）。各脾臓について９の複製物を各プレートに蒔いた。
（１）２４時間後のサイトカイン測定のための上清採取用に１プレート（結果を示していない）。
（２）４８時間後のサイトカイン測定のための上清採取用に１プレート（結果を示していない）。
（３）増殖アッセイ用に１プレート。
以下の刺激を行った。
３つの複製物：刺激せず（２０μＬの細胞培養培地の添加）
３つの複製物：１０μＭのＴＧ０２（８つのペプチド、１つのペプチド当たり１０μＭ最終濃度、２０μＬの細胞培養培地中で添加）による刺激
３つの複製物：１μｇ／２００μＬのＣｏｎＡ（コンカナバリンＡ）による刺激（２０μＬの細胞培養培地中１μｇのＣｏｎＡの添加）
３７℃、５％ＣＯ２で２４時間（１）、４８時間（２）、又は５日間（３）のインキュベーション。
残りの細胞を遠心分離（３５０ｇ、５分間、５±３℃）し、１．５ｍＬのチューブに移し、再度遠心分離（３５０ｇ、５分間、５±３℃）し、上清を完全に除去して細胞ペレットを−７０℃以下で凍結した。
（１）２４時間後、対応するプレートを遠心分離（３５０ｇ、室温）し、１５０μＬの上清を採取して、−７０℃以下で凍結した。
（２）４８時間後、対応するプレートを遠心分離（３５０ｇ、室温）し、１５０μＬの上清を採取して−７０℃以下で凍結した。
増殖アッセイ
（３）５日後、１μＣｉ／ウェルの３Ｈチミジンを試料に添加し、それをその後３７℃、５％ＣＯ２で１８時間インキュベートした。その後、プレートを−２０℃以下で凍結した。
プレートを室温で解凍した。採取器を洗い流した後、採取器を使用して試料をフィルタプレートに移し、その後、水を使用する５回の洗浄工程を行った。フィルタプレートを室温で一晩乾燥した。フィルタプレートの底にホイルを貼りつけ、２０μＬのシンチレーション液をそのウェルに添加した。室温での１時間のインキュベーションの後、ＴｏｐＣｏｕｎｔ ＮＸＴを使用して試料を測定し、刺激指数（ＳＩ）を計算した。ＳＩ＝刺激された試料のＣＰＭ／対照試料のＣＰＭ。
結果
表１６及び図９は、脾細胞増殖アッセイの結果を示す。表１６は、各複製物に対するＣＰＭ、及び各マウスに対する平均ＣＰＭを示す。示されるように、ＴＧ０２で刺激された脾細胞は、刺激されていない脾細胞と比較してＣＰＭの増加を示し、ＴＧ０２が免疫応答を誘導したことを示す。

Claims (8)

  1. ＲＡＳタンパク質のフラグメントに各々対応する第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７及び第８のペプチドを含む免疫応答を惹起するのに適したペプチド混合物であって、
    第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７及び第８のペプチドが、
    配列番号１９のアミノ酸配列を含むペプチド、
    配列番号２０のアミノ酸配列を含むペプチド、
    配列番号２１のアミノ酸配列を含むペプチド、
    配列番号２２のアミノ酸配列を含むペプチド、
    配列番号２３のアミノ酸配列を含むペプチド、
    配列番号２４のアミノ酸配列を含むペプチド、
    配列番号２５のアミノ酸配列を含むペプチド、及び
    配列番号２６のアミノ酸配列を含むペプチド
    であり、かつ前記ペプチドがそれぞれ３０個以下のアミノ酸残基を含む、
    ペプチド混合物。
  2. 前記ペプチドがそれぞれ２８、２６、２４、２２、２０又は１８個以下のアミノ酸残基を含む、請求項１に記載のペプチド混合物。
  3. 第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７及び第８のペプチドが、
    配列番号１９のアミノ酸配列のみからなるペプチド、
    配列番号２０のアミノ酸配列のみからなるペプチド、
    配列番号２１のアミノ酸配列のみからなるペプチド、
    配列番号２２のアミノ酸配列のみからなるペプチド、
    配列番号２３のアミノ酸配列のみからなるペプチド、
    配列番号２４のアミノ酸配列のみからなるペプチド、
    配列番号２５のアミノ酸配列のみからなるペプチド、及び
    配列番号２６のアミノ酸配列のみからなるペプチド
    である、請求項１又は２に記載のペプチド混合物。
  4. ＭＨＣ分子上に提示された場合に、請求項３に記載のペプチド混合物における各ペプチドに対して特異的なＴ細胞を含むＴ細胞混合物。
  5. 請求項１〜３のいずれか一項に記載のペプチド混合物、又は請求項４に記載のＴ細胞混合物と、薬学的に許容可能な担体、希釈剤及び賦形剤からなる群より選択される少なくとも一種の成分とを含む医薬組成物。
  6. 患者における癌の予防及び／又は治療のために用いられる医薬であって、
    請求項１〜３のいずれか一項に記載のペプチド混合物、
    請求項４に記載のＴ細胞混合物、又は
    請求項５に記載の医薬組成物
    からなる医薬。
  7. 前記癌が、大腸、肺及び／又は膵臓の癌である、請求項６に記載の医薬。
  8. 前記予防及び／又は治療が、前記患者から採取された試料に存在するＲＡＳタンパク質のアミノ酸変異を同定することを含む、請求項６に記載の医薬。
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