CN102439137A - 具有诱导癌症特异性免疫反应的能力的树突状细胞的制备方法,包含该树突状细胞的用于预防或治疗癌症或者抑制癌症转移的药物组合物及试剂盒(kit) - Google Patents

具有诱导癌症特异性免疫反应的能力的树突状细胞的制备方法,包含该树突状细胞的用于预防或治疗癌症或者抑制癌症转移的药物组合物及试剂盒(kit) Download PDF

Info

Publication number
CN102439137A
CN102439137A CN2009801585170A CN200980158517A CN102439137A CN 102439137 A CN102439137 A CN 102439137A CN 2009801585170 A CN2009801585170 A CN 2009801585170A CN 200980158517 A CN200980158517 A CN 200980158517A CN 102439137 A CN102439137 A CN 102439137A
Authority
CN
China
Prior art keywords
cancer
dendritic cell
mature dendritic
cell
bmdc
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN2009801585170A
Other languages
English (en)
Inventor
裴容洙
闵美璟
成英林
张瑱我
尹仙玉
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
JW Pharmaceutical Corp
Original Assignee
JW Pharmaceutical Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by JW Pharmaceutical Corp filed Critical JW Pharmaceutical Corp
Publication of CN102439137A publication Critical patent/CN102439137A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/14—Blood; Artificial blood
    • A61K35/15—Cells of the myeloid line, e.g. granulocytes, basophils, eosinophils, neutrophils, leucocytes, monocytes, macrophages or mast cells; Myeloid precursor cells; Antigen-presenting cells, e.g. dendritic cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/461—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
    • A61K39/4615—Dendritic cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/462—Cellular immunotherapy characterized by the effect or the function of the cells
    • A61K39/4622—Antigen presenting cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
    • A61K39/4643—Vertebrate antigens
    • A61K39/4644—Cancer antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0639—Dendritic cells, e.g. Langherhans cells in the epidermis

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

本发明涉及一种诱导癌症特异免疫反应的能力显著提高的成熟树突状细胞的制备方法、包括通过用上述方法制备的成熟树突状细胞的用于预防或治疗癌症或者抑制癌症转移的药物组合物，以及包括用上述方法制备的成熟树突状细胞和咪喹莫特的药物试剂盒。因此，可以制备出癌症特异性免疫反应诱导能力显著提高且毒性减弱的安全的成熟树突状细胞。所述成熟的树突状细胞可有效预防或治疗癌症及抑制癌症转移。在给予所述癌症特异性成熟树突状细胞的同时，用于制备所述药物试剂盒的咪喹莫特可以改善癌症免疫治疗、预防或治疗癌症以及抑制癌症转移。

Description

具有诱导癌症特异性免疫反应的能力的树突状细胞的制备方法,包含该树突状细胞的用于预防或治疗癌症或者抑制癌症转移的药物组合物及试剂盒(KIT)
技术领域
本发明涉及一种提高癌症特异性免疫反应的诱导能力的成熟树突状细胞的制备方法，并涉及一种包括基于该方法制备的成熟树突状细胞的用于预防或治疗癌症或者抑制癌症转移的药物组合物，及包括基于该方法制备的成熟树突状细胞和免疫辅助剂的药物试剂盒。
背景技术
目前为止公知的癌症治疗方法中，大部分是手术、抗癌药剂及放射线疗法。但是，这些治疗方法很难根治，并且会出现很多副作用。特别是在转移癌症或者复发癌症当中，大部分都不能做手术，并且会排斥化学治疗剂，因此在治疗上受到限制。
近来，积极研发着利用诸如树突状细胞(Dendritic cells)的免疫细胞的癌症治疗法。树突状细胞通过吞噬作用(phagocytosis)或胞饮作用(pinocytosis)而捕获外部抗原并活化，之后诱导抗原特异性的T细胞活性，并且在捕获外部抗原而活化时，自身的MHC(majorhistocompatibility complex：主要组织相容性复合物)分子或辅助刺激因子(costimulatory factor)的表达增加，从而诱导细胞免疫。树突状细胞诱导细胞免疫的过程如下。被抗原所致敏(sensitization)的树突状细胞，i)因大量表达归巢受体(homing receptor)而移动至下一免疫器官，ii)表达树突状细胞特异性C-C趋化因子(DC-CKI)而聚集非活性状态的初始T细胞(naive T cell)，iii)通过MHC提供的抗原和T细胞受体(TCR)的直接相互作用，传递抗原信息，iv)从而诱导抗原特异性的T细胞的活性。
另外，肝癌是发病率居全球第五位且康复情况并不理想的癌症。目前所使用的疗法主要分为肝切割手术及肝移植等外科疗法及射频消融术(Readiofrequency ablation)、经皮乙醇注射法(percutaneousethanol injection)及动脉化疗栓塞(transarterial chemoembolization)等非外科疗法。上述疗法是根据肝癌的患病时间、肝功能及患者的活动情况而选择。诱发肝细胞癌的原因有诸如HBV、HCV的肝炎病菌、诸如黄曲霉毒素的毒素、乙醇过量吸取及药物滥用等，从地区上来说，在韩国、中国、日本等东南亚国家频发。肝癌的进行过程是，经过20-40年在病菌、乙醇等的作用下患慢性肝炎继而发生肝硬化，并接着患肝癌。这种肝癌在治疗上的问题是，局部复发、肝内复发及转移。为了解决这些问题，开发了全身肝癌治剂，并进行免疫治疗。近来，肝癌治剂的开发主要是以标靶治剂及人源化抗体治剂为中心，在其他癌症中得到许可后扩大适应症的方式进行。就免疫治疗来说，根据国际指导原则，主要就发展性肝癌进行评价。从1990年至今，对肝细胞改正的免疫治疗临床研究分为如下战略(1)。i)通过基于细胞因子的临床试验，诱导免疫细胞的非特异性活化，ii)在基于细胞的临床试验中，使用自体树突状细胞、细胞因子诱导的末梢血液细胞(cytokine induced PBL)、TIL (肿瘤浸润淋巴细胞，tumorinfilterated lymphocyte)等，iii)基于人源化抗体的临床试验，iv)自体肿瘤细胞疫苗(autologous tumor cell vaccine)，v)肽疫苗等。
通常，从前体细胞制作出成熟化树突状细胞疫苗的过程分为如下两大步骤。第一阶段的培养，是用分化诱导物质(细胞因子或其他细胞-分化促进剂)诱导各种血液源的细胞分化为未成熟树突状细胞，并且在培养结束时收获未成熟树突状细胞的步骤。第二阶段的培养，是对上述未成熟树突状细胞进行癌症或病原菌-特异性抗原处理的培养步骤，与抗原一同将树突状细胞成熟化因子添加至培养液中，从而收获成熟的树突状细胞作为获得抗原特异免疫诱导性的疫苗。所述树突状细胞成熟化因子通常是根据临床研究人员的选择而定，但基本上多使用具有特定组成的细胞因子混合物(cytokine cocktail)或非特定组成的单核细胞条件培养液(MCM：monocyte-conditioned medium，3)等。除此之外，也可以在无前体细胞分离过程的情况下，通过经抗原敏化的离体处理(ex vivo conditioning)将树突状细胞直接从人体分离，作为疫苗使用。
在利用树突状细胞的免疫治疗的临床研究中，为了活化癌症特异性免疫反应，主要将肿瘤裂解物(tumor lysate)或癌症特异性抗原等用于树突状细胞的敏化(2)。为了利用抗原蛋白质实现更有效的树突状细胞的成熟，进行了通过细胞表面标靶化方法或膜转位肽(membrane translocating peptide)的融合来克服上述问题的研究(3)。由此，对HIV-1TAT蛋白质的PTD(protein translocatingdomain(蛋白转位结构域)，YGRKKRRQRRR)进行研究(4)。另外，制作了一系列CTP(cytoplasmic transduction peptide，胞质转导肽)候选物质，所述CTP候选物质来源自PTD且具有膜透过性，但因其变更的结构而无法移动到细胞核，并因此残留在细胞质内(WO 2003-097671，5)。
咪喹莫特(1-(2-甲基丙基)-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-4-胺)是作为免疫反应调节剂(immune response modifier)使用的化合物。咪喹莫特的作用机制并未被明确公开，但公开了咪喹莫特结合于干涉病原体识别的细胞表面受体TLR(toll-like receptor，toll样受体)-7而活化免疫细胞(6)。通过TLR-7被咪喹莫特活化的细胞分泌干扰素-α(interferon-α)、白细胞介素(interleukin)-6及TNF(tumor necrosisfactor，肿瘤坏死因子)-α等细胞因子(7)。将咪喹莫特用于皮肤时，可以活化兰氏细胞(Langerhans cells)，这些细胞移动至局部淋巴结，并活化后天性免疫系统。咪喹莫特活化的其他细胞包括自然杀手细胞(natural killer cells)、巨噬细胞(macrophages)及B-淋巴细胞(B-lymphocytes)(8)。据最近的新研究结果，咪喹莫特的抗增殖作用(anti-proliferation effect)是由与免疫系统活化完全不同的其他机制所产生，这种作用可通过增加OGFr(opioid growth factorreceptor，阿片样物质生长因子受体)水平来产生。当以siRNA技术阻断OGFr功能时，则咪喹莫特的抗增殖作用也会消失(9)。因全身使用时会有副作用，咪喹莫特主要以乳剂形式局部给药使用，以Aldara的商标名市售的咪喹莫特5％乳膏于1997年被美国FDA核准作为光化性角化病(actinic keratosis)、表浅性基底细胞癌(superficialbasal cell carcinoma)、外生殖器疣(external genital warts)等的治疗剂，作为治疗用药品使用。
本发明的说明书参照了多篇论文及专利文献，并标注了其引用部分。引用的论文及专利文献的公开内容，全部通过引用的方式纳入本发明的说明书中，用于明确说明本发明所属的技术领域的水平及本发明内容。
发明内容
技术问题
本发明的发明人努力研发用于癌症治疗的树突状细胞治疗剂。结果，确认了存在与肽YGRRARRRRRR融合的癌症特异性抗原蛋白质的情况下，将未成熟树突状细胞成熟化而制备的成熟树突状细胞具有良好的诱导癌症特异性免疫反应的能力，具有预防或治疗癌症及抑制癌症转移的功效，并且还确认了在施用上述成熟树突状细胞治疗剂时，联合使用咪喹莫特(imiquimod)作为免疫辅助剂，则可以大大提高对癌症的免疫治疗以及预防或抑制癌症转移的功效，从而完成了本发明。
由此，本发明的目的在于，提供一种制备具有良好的癌症特异免疫反应诱导能力的成熟树突状细胞的方法。
本发明的另一目的在于，提供一种包括具有癌症特异免疫反应诱导能力的成熟树突状细胞的用于预防或治疗癌症或者抑制癌症转移的药物组合物。
本发明的另一目的在于，提供一种包括具有癌症特异免疫反应诱导能力的成熟树突状细胞及咪喹莫特的用于预防或治疗癌症或者抑制癌症转移的药物试剂盒。
本发明的另一目的在于，提供一种用于预防或治疗癌症或者抑制癌症转移的方法，包括将具有癌症特异免疫反应诱导能力的成熟树突状细胞给予癌症受试者的步骤。
本发明的另一目的在于，提供一种用于预防或治疗癌症或者抑制癌症转移的方法，包括联合使用具有癌症特异免疫反应诱导能力的成熟树突状细胞及咪喹莫特的步骤。
本发明的目的及优点将通过说明书、权利要求书及附图进一步详细说明。
技术性解决方法
根据本发明一个实施例，提供一种具有癌症特异免疫反应诱导能力的成熟树突状细胞的制备方法，该制备方法包括：(a)将未成熟树突状细胞用与肽YGRRARRRRRR融合的癌症特异抗原蛋白质致敏而使其成熟化的步骤；以及(b)分离所述步骤(a)中成熟化的树突状细胞的步骤。
根据本发明的另一个实施例，提供一种用于预防或治疗癌症的药物组合物，该药物组合物包括：(a)药学有效量的以所述成熟树突状细胞的制备方法制备且具有癌症特异性免疫反应诱导能力的成熟树突状细胞；以及(b)可药用载体。
根据本发明的另一个实施例，提供一种用于抑制癌症转移的药物组合物，该药物组合物包括：(a)药学有效量的以所述成熟树突状细胞的制备方法制备且具有癌症特异性免疫反应诱导能力的成熟树突状细胞；以及(b)可药用载体。
根据本发明的另一个实施例，提供一种用于预防或治疗癌症的药物试剂盒(KIT)，该试剂盒包括：(a)药物组合物，包括根据所述成熟树突状细胞的制备方法制备且具有癌症特异性免疫反应诱导能力的成熟树突状细胞；以及(b)包含以下述化学式1表示的化合物的组合物。
[化学式1]
Figure BPA00001445349700051
根据本发明的另一个实施例，提供一种用于抑制癌症转移的药物试剂盒，该试剂盒包括：(a)药物组合物，包括根据所述成熟树突状细胞的制备方法制备且具有癌症特异性免疫反应诱导能力的成熟树突状细胞；以及(b)包含上述化学式1表示的化合物的组合物。
根据本发明的另一个实施例，提供一种利用树突状细胞的预防或治疗癌症的方法，该方法包括：将通过所述成熟树突状细胞的制备方法制备且具有癌症特异性免疫反应诱导能力的成熟树突状细胞给予患癌受试者的步骤。
根据本发明的另一个实施例，提供一种利用树突状细胞的抑制癌症转移的方法，该方法包括：将通过所述成熟树突状细胞的制备方法制备且具有癌症特异性免疫反应诱导能力的成熟树突状细胞给予患癌受试者的步骤。
根据本发明的另一个实施例，提供一种利用树突状细胞的预防或治疗癌症的方法，该方法包括：(a)将根据所述成熟树突状细胞的制备方法制备且具有癌症特异性免疫反应诱导能力的成熟树突状细胞给予患癌受试者的步骤；以及(b)在给予所述成熟树突状细胞的部位施用包含以上述化学式1表示的化合物的组合物的步骤；或(a’)在待给予所述成熟树突状细胞的患癌受试者的投入部位施用含有以上述化学式1表示的化合物的组合物的步骤；以及(b’)将根据所述成熟树突状细胞的制备方法制备且具有癌症特异性免疫反应诱导能力的成熟树突状细胞给予患癌受试者的步骤。
根据本发明的另一个实施例，提供一种利用树突状细胞的抑制癌症转移的方法，该方法包括：(a)将根据所述成熟树突状细胞的制备方法制备且具有癌症特异性免疫反应诱导能力的成熟树突状细胞给予患癌受试者的步骤；以及(b)在给予所述成熟树突状细胞的部位施用包含以上述化学式1表示的化合物的组合物的步骤；或(a’)在待给予所述成熟树突状细胞的患癌受试者的投入部位施用含有以上述化学式1表示的化合物的组合物的步骤；以及(b’)将根据所述成熟树突状细胞的制备方法制备且具有癌症特异性免疫反应诱导能力的成熟树突状细胞给予患癌受试者的步骤。
以下对本发明进行详细说明。
本发明提供包括如下步骤的具有癌症特异性免疫反应诱导能力的成熟树突状细胞的制备方法。(a)将未成熟树突状细胞用与肽YGRRARRRRRR融合的癌症特异性抗原蛋白质致敏而使其成熟化的步骤；以及(b)分离所述(a)步骤中成熟化的树突状细胞的步骤。
在本说明书中，术语“树突状细胞(dendritic cell)”是指通过MHC(major histocompatibility complex)向T细胞提供抗原的专门抗原提供细胞。
在本说明书中，术语“成熟树突状细胞(mature dendritic cell)”是指，将未成熟树突状细胞在离体(ex vivo)条件下以抗原致敏后，使用适当的细胞因子等使其成熟分化。以下，根据需要将树突状细胞记载为“DC”，将成熟树突状细胞记载为“mDC”。
根据本发明的一个实施例，具有癌症特异性免疫反应诱导能力的自体成熟树突状细胞可以在癌症特异性抗原存在的情况下，对未成熟树突状细胞进行成熟化诱导培养而获得。未成熟树突状细胞可以通过对人体器官、组织、骨髓或血液中的前体细胞进行分化诱导而制备，也可以从人体直接分离。在本发明中使用的树突状细胞优选地是骨髓性树突状细胞(myeloid DC)。
据本发明的优选实施例，本发明中的未成熟树突状细胞是在存在适当的细胞因子的情况下，使树突状细胞的前体细胞分化至未成熟阶段而获得。用于未成熟分化的适当细胞因子包括，例如GM-CSF(Granulocytemacrophage colony stimulating factor，粒细胞巨噬细胞集落刺激因子)与IL(Interleukin，白细胞介素)-4，GM-CSF与IL-13或GM-CSF与IL-7，但并不限于此。最普遍使用的细胞因子是GM-CSF与IL-4的混合物。添加的细胞因子的适当量是足以使得分化至树突状细胞的量，可以在各个研究人员的实验室中通过最佳实验而决定，通常分别在100U/ml-1000U/ml的浓度范围内选择施用。
用于将树突状细胞的前体细胞分化诱导为未成熟树突状细胞的培养基可以使用用于动物细胞培育的普通培养基。优选使用包含血清(例如，牛胎血清、马血清及人体血清)的培养基。在本发明中可以使用的培养基，例如，包括RPMI系列(例如，RPMI 1640)、Eagles′s MEM(Eagle′sminimum essential medium，Eagle，H.Science 130：432(1959))、α-MEM(Stanner，C.P.et al.，Nat.New Biol.230：52(1971))、Iscove′s MEM(Iseove，N.et al.，J.Exp.Med.147：923(1978))、199培养基(Morgan et al.，Proc.Soc.Exp.Bio.Med.73：1(1950))、CMRL 1066，RPMI 1640(Moore etal.，J.Amer.Med.Assoc.199：519(1967))、F12(Ham，Proc.Nat1.Acad.Sci.USA53：288(1965))、F10(Ham，R.G.Exp.Cell Res.29：515(1963))、DMEM(Dulbecco′s modification of Eagle′s medium，Dulbecco，R.et al.，Virology8：396(1959))、DMEM与F12的混合物(Barnes，D.etal.，Anal.Biochem.102：255(1980))、Way-mouth′s MB752/1(Waymouth，C.J.Nat1.Cancer Inst.22：1003(1959))、McCoy′s 5A(McCoy，T.A.，etal.，Proc.Soc.Exp.Biol.Med.100：115(1959))及MCDB系列(Ham，R.G.etal.，In Vitro 14：11(1978))，但并不限于此。上述培养基可以包括例如抗氧化剂(例如，β-巯基乙醇)等其他成分。对于培养基及培养的一般说明记载于R.Ian Freshney，Culture of Animal Cells，Alan R.Liss，Inc.，NewYork(1984)，该文献以引用的方式纳入本说明书中。
本发明中所利用的成熟树突状细胞是在存在与肽YGRRARRRRRR融合的适当癌症特异性抗原蛋白质和细胞因子的情况下，对未成熟树突状细胞进行培养及成熟化诱导而获得。本发明中，适于对未成熟树突状细胞的进行成熟化诱导的细胞因子是，例如TNF(Tumor necrosisfactor)-α、IFN(Interferon)-γ、IL-1β、IL-6、PGE2(Prostaglandin E2，前列腺素E2)或其混合物，但并不限于此。并且，为了诱导树突状细胞的成熟化，可以在培养基中添加Poly I：C(polyinosinic：polycytidylicacid，聚肌苷酸：聚胞苷酸)。并且，还可以利用CpG、SAC(inactivatedStaphylococcus aureus，灭活的金黄色葡萄球菌)、SEB(Staphylococcalenterotoxin B，葡萄球菌肠毒素B)或诸如LPS(lipopolysaccharide，脂多糖)的细菌来源物质来加强刺激。
用于成熟化的培养基，可以使用用于对树突状细胞前体细胞的进行未成熟分化诱导的培养基。
根据本发明的优选实施例，本发明中用于成熟化诱导的癌症抗原是肝癌特异性抗原。
本发明的成熟树突状细胞是在存在与肽YGRRARRRRRR融合的肝癌特异性抗原蛋白质的情况下，使未成熟树突状细胞成熟化而获得的细胞，其具有诱导肝癌特异性免疫反应的能力。
在本发明中可以使用的肝癌特异性抗原蛋白质包括，例如与肽YGRRARRRRRR融合的AFP(Alpha-Fetoprotein，甲胎蛋白)、GPC3(Glypican-3，磷脂酰肌醇蛋白多糖-3)、MAGE 1(Melanoma AssociatedGene Family A1，黑素瘤相关基因家族A1)、NY-ESO-1(cancer/testisantigen，癌症/睾丸抗原)、Aurora-A(serine/threonine protein kinaseinvolved in centrosome formation during mitosis，有丝分裂期间参与中间体形成的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶)、及Gankyrin(liver-specificoncoprotein involved in cell cycle regulation，参与细胞周期调节的肝脏特异性癌基因蛋白)，但不限于此。
根据本发明的优选实施例，上述肝癌特异性抗原蛋白质为与肽YGRRARRRRRR融合的AFP、GPC 3或MAGE 1，优选与肽YGRRARRRRRR融合的SEQ ID NO：1的AFP氨基酸序列中的20-346序列、SEQ ID NO：2的GPC 3氨基酸序列中33-358序列或SEQ ID NO：3的MAGE1氨基酸序列。
本发明中使用的肽YGRRARRRRRR可以融合于癌症抗原蛋白质的N末端或C末端。
根据本发明的优选实施例，将上述肽用在标记(tagging)癌症抗原蛋白质N末端的融合蛋白质中而进行成熟化培养时，可以制备效价提高的树突状细胞疫苗。
本发明提供一种用于预防或治疗癌症的药物组合物，包括(a)药学有效量的具有癌症特异性免疫反应诱导能力的成熟树突状细胞；以及(b)可药用载体。
根据本发明的优选实施例，上述成熟树突状细胞是通过上述用于制备本发明成熟树突状细胞的方法制备的细胞。
根据本发明的另一优选实施例，上述癌为肝癌。
如在本发明的成熟树突状细胞制备方法中所述，在存在与肽YGRRARRRRRR融合的肝癌特异性抗原蛋白质的情况下，使未成熟树突状细胞成熟化而获得的成熟树突状细胞表现在细胞表面，使停止状态的CD4+T细胞分化为Th1细胞，并且使停止状态的CD8+T细胞分化为活化的细胞毒性细胞(CTL)，从而可以诱导对肝癌细胞的特异性细胞免疫(cell immunity)。由此，上述成熟树突状细胞对肝癌的免疫预防或治疗非常有效，所述成熟树突状细胞是用根据本发明方法制备的与肽YGRRARRRRRR融合的肝癌特异性抗原蛋白质致敏的。
在本发明的药物组合物中，可以使用的成熟树突状细胞为源自受试者的未成熟树突状细胞的自体(autologous)或同种异体(allogenic)树突状细胞。最优选地，本发明中的树枝状细胞为自体树突状细胞。自体树突状细胞来自受试者的细胞，因此，为了治疗或预防而使用于受试者时，无排斥反应并且安全。
本发明提供一种用于抑制癌症转移的药物组合物，包括(a)药学有效量的具有癌症特异性免疫反应诱导能力的成熟树突状细胞；以及(b)可药用载体。
根据上述本发明方法制备的成熟树突状细胞不仅用于预防或治疗癌症，也可以有效地用于抑制癌症转移，所述成熟树突状细胞是用与肽YGRRARRRRRR融合的癌症特异性抗原蛋白质致敏的。并且，其毒性较弱，从而提供安全的药物组合物。
根据本发明的优选实施例，本发明提供用于抑制肝癌转移的药物组合物。
根据本发明的另一优选实施例，本发明提供用于抑制肝癌的肺转移的药物组合物。
在本发明的药物组合物中，可以使用的成熟树突状细胞为源自受试者的未成熟树突状细胞的自体(autologous)或同种异体(allogenic)树突状细胞。优选地，本发明中的树突状细胞为自体树突状细胞。
包括于本发明药物组合物中的可药用载体通常是在制剂时使用，包括乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、阿拉伯胶、磷酸钙、藻酸盐、凝胶、硅酸钾、细微结晶性纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、糖浆、甲基纤维素、羟苯甲酯、羟苯丙酯、滑石、硬脂酸镁及矿物油等，但不限于此。除了以上成分，本发明的药物组合物还可以包括润滑剂、湿润剂、甜味剂、香味剂、乳化剂、悬浮剂、防腐剂等。适当的可药用载体及制剂详细记载于Remington’s Pharmaceutical Sciences(19th ed.，1995)中。
本发明中的药物组合物可以口服或非口服，优选非口服。非口服时，本发明的药物组合物可以通过静脉注射、皮下注射、肌肉注射及腹腔注射而给药。优选地，本发明的药物组合物是根据所针对的疾病的种类来决定给药路径。
本发明药物组合物的适当使用量可以根据制剂化方法、给药方式、受试者的年龄、体重、性别、病症、饮食、给药时间、给药路径、排泄速度及反应感应性等因素而不同。本发明药物组合物的使用量优选地为每日1×103-1×108cells/kg(体重)。
本发明的药物组合物是根据本技术领域普通技术人员易于实现的方法，利用可药用载体和/或赋形剂而制剂化，可以制作成单位剂型或内装于多剂量容器内。
本发明提供(a)包括具有癌症特异性免疫反应诱导能力的成熟树突状细胞的药物组合物；以及(b)包括包含以下化学式1表示的化合物的组合物的用于预防或治疗癌症的药物试剂盒(pharmaceutical kit)。
[化学式1]
Figure BPA00001445349700111
根据本发明的优选实施例，上述成熟树突状细胞是依上述本发明的成熟树突状细胞制备方法所制备的。
根据本发明的另一优选实施例，上述癌症为肝癌。
上述化学式1中的化合物为1-(2-甲基丙基)-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-4-胺，也被称为“咪喹莫特(imiquimod)”。
包含上述“咪喹莫特”的组合物与本发明中包括成熟树突状细胞的药剂组合物的联合使用，明显提高依树突状细胞的癌症免疫治疗或免疫预防功效。
在包含化学式1的化合物的组合物中，对上述化合物的含量并没有特殊限定，但与含有化学式1的化合物的组合物比较，优选1-10重量％，更优选3-7重量％。
根据本发明的优选实施例，包含化学式1的化合物的组合物是具有皮肤施用形态的制型，优选乳膏(cream)。包含乳膏状咪喹莫特的组合物，除了有效成分咪喹莫特化合物外，还可以包括异硬脂酸、十六烷醇、十八烷醇、白色矿脂、聚山梨酯60、山梨醇酐单硬脂酸酯、甘油、黄原胶、净化水、苯甲醇、甲基对苯甲酸、对羟基苯甲酸丙酯等，但不限于此。
本发明未特别限定包含化学式1的化合物的组合物的给药方式，但根据本发明的优选实施例，使用涂布于树突状细胞的给药部位的方式。
本发明提供一种用于抑制癌症转移的药物试剂盒，包括(a)包括具有癌症特异性免疫反应诱导能力的成熟树突状细胞的药物组合物；以及(b)包含上述化学式1表示的化合物的组合物。
包含化学式1的化合物的组合物与包含上述成熟树突状细胞的药物组合物的联合使用，可显著抑制癌症转移。
根据本发明的优选实施例，上述成熟树突状细胞是依上述本发明的成熟树突状细胞制备方法所制备。
根据本发明的另一优选实施例，上述癌症转移是肝癌转移。
根据本发明的另一优选实施例，上述肝癌转移为肝癌的肺转移。
在本发明的方法中，将以癌症特异性抗原致敏的自体成树突状细胞给予受试者后；或者在给予前，在给予部位施用上述含有化学式1的化合物的组合物。
在本发明的方法中，未特别限定包含化学式1的化合物的组合物的施用方式，优选将自体成熟树突状细胞涂布于给药皮肤来施用，施用次数不限于1次，可以适当涂布2次以上。
在本发明的方法中，作为包含自体树突状细胞的组合物与包含化学式1的化合物的组合物的联合施用对象的受试者为动物，优选哺乳动物，更优选人体。
上述可利用于本发明的用于预防或治疗癌症的药物试剂盒或用于抑制癌症转移的药物试剂盒的成熟树突状细胞是源自受试者的未成熟树突状细胞的自体(autologous)或同种异体(allogenic)树突状细胞。本发明的树突状细胞优选自体树突状细胞。
本发明提供包括以下步骤的利用树突状细胞的癌症预防或治疗方法。(a)将具有癌症特异性免疫反应诱导能力的成熟树突状细胞使用于患癌症的受试者的步骤；以及(b)在使用成熟树突状细胞的部位施用包括以上述化学式1表示的化合物的组合物的步骤；或者(a’)在待使用成熟树突状细胞的患癌受试者的使用部位上施用包含由上述化学式1表示的化合物的组合物的步骤；以及(b’)将具有癌症特异性免疫反应诱导能力的成熟树突状细胞给予患癌受试者的步骤。
根据本发明的优选实施例，上述成熟树突状细胞是依上述本发明的成熟树突状细胞制备方法制备的细胞。
根据本发明的另一优选实施例，上述癌是肝癌。
本发明提供包括以下步骤的利用树突状细胞的抑制癌转移的方法。(a)将具有癌症特异性免疫反应诱导能力的成熟树突状细胞使用于患癌症的受试者的步骤；以及(b)在使用成熟树突状细胞的部位施用包括以上述化学式1表示的化合物的组合物的步骤；或者(a’)在待使用成熟树突状细胞的患癌受试者的使用部位上施用包含由上述化学式1表示的化合物的组合物的步骤；以及(b’)将具有癌症特异性免疫反应诱导能力的成熟树突状细胞给予患癌受试者的步骤。
根据本发明的优选实施例，上述成熟树突状细胞是依上述本发明的成熟树突状细胞制备方法制备的细胞。
根据本发明的另一优选实施例，上述癌症转移是肝癌转移。
根据本发明的另一优选实施例，上述肝癌转移是肝癌的肺转移。
本发明提供利用树突状细胞的癌症预防或治疗方法，包括将具有癌症特异性免疫反应诱导能力的成熟树突状细胞给予患癌受试者的步骤。
根据本发明的优选实施例，上述成熟树突状细胞是依上述本发明的成熟树突状细胞制备方法所制备。
本发明提供利用树突状细胞的癌症转移抑制方法，包括将具有癌症特异性免疫反应诱导能力的成熟树突状细胞给予患癌受试者的步骤。
根据本发明的优选实施例，上述成熟树突状细胞是依上述本发明的成熟树突状细胞制备方法所制备。
上述使用于本发明的癌症预防或治疗方法或者癌症转移抑制方法的成熟树突状细胞优选自体树突状细胞。
本发明的特征及优点如下。
(i)根据本发明的成熟树突状细胞制备方法，可以制备具有显著提高的癌症特异性免疫反应诱导能力，并且毒性非常小且安全的树突状细胞。
(ii)本发明提供具有癌症特异性免疫反应诱导能力的成熟树突状细胞用于预防或治疗癌症(特别是肝癌)或者抑制癌症转移的用途。
(iii)本发明的药物试剂盒为利用成熟树突状细胞的免疫治疗提供了使用咪喹莫特的联用治疗。
(iv)在本发明的药物试剂盒中，咪喹莫特的联合处理明显提高以树突状细胞给药的癌症免疫治疗、癌症的预防或治疗以及癌症转移的抑制。
有利效果
根据本发明的成熟树突状细胞的制备方法，可以制备癌症特异性免疫反应诱导能力明显提高的成熟树突状细胞。根据本发明方法制备的成熟树突状细胞，不仅其癌症预防、治疗及癌症转移抑制的作用效果显著，其毒性也非常小且非常安全。本发明的药物试剂盒的咪喹莫特和本发明中包含成熟树突状细胞的药物组合物的联合使用可以明显改善癌症免疫治疗、预防或治疗癌症以及抑制癌症转移。
附图说明
图1表示将用于致敏树突状细胞的CTP-融合肝癌特异抗原(YGRRARRRRRR-AFP，YGRRARRRRRR-GPC 3，YGRRARRRRRR-MAGE 1)纯化并SDS-PAGE分析后，通过蛋白质印迹(western blot)确认的结果。
图2a表示在小鼠肝癌防御模式中，通过本发明的成熟树突状细胞和乐得美乳膏联合施用而得到的实体癌形成抑制效果。在防御模式中，向作为对照组的给予PBS的鼠群(n＝8，PBS)、给予树突状细胞治疗剂的鼠群(n＝8，Ag-DC)、仅用乐得美乳膏的鼠群(n＝8，PBS+Aldara)、联合施用树突状细胞治疗剂和乐得美乳膏的鼠群(n＝8，Ag-DC+Aldara)皮下给予适当量(1.5×105cells/head)的肝癌抗原表达细胞株，以2-3天为周期观察肿瘤生长。图2b是表示在小鼠肝癌防御对象中，实验组及对照组的各个个体小鼠的肿瘤大小的照片。图2c表示在小鼠肝癌防御模式中，实验组及对照组的各个个体小鼠的肿瘤形成抑制结果。NR：对照组(PBS处理群)肿瘤平均大小的70％以上，PR：对照组肿瘤平均大小的70％以下，CR：无肿瘤形成。图2d表示在小鼠肝癌防御模式中，实验组及对照组的各个个体小鼠的寿命测量结果。
图3表示通过MTT分析，对从小鼠肝癌防御受试者的对照组及实验组各个个体小鼠的脾细胞(splenocyte)中分离的T细胞进行肝癌特异性T细胞的增殖分析的结果。PBS：给予PBS的小鼠对照组，Ag-DC：给予树突状细胞治疗剂的鼠群，Ag-DC+aldara：联合使用树突状细胞治疗剂和乐得美乳膏的鼠群，PBS+Aldara：仅用乐得美乳膏的鼠群。
图4a及图4b表示将从小鼠肝癌防御对象中的对照组及实验组各个小鼠的脾细胞(splenocyte)中分离的T细胞与肝癌特异抗原提供细胞一同培养后，测量T细胞的IFN-γ和IL-4的分泌量的结果。PBS：投入PBS的小鼠对照组，Ag-DC：给予树突状细胞治疗剂的鼠群，Ag-DC+aldara：联合使用树突状细胞治疗剂和乐得美乳膏的鼠群，PBS+Aldara：仅用乐得美乳膏的鼠群。
图5表示测量小鼠肝癌防御对象中的对照组及实验组的各个小鼠的CTL活性的结果。PBS：给予PBS的小鼠对照组，Ag-DC：给予树突状细胞治疗剂的鼠群，Ag-DC+aldara：联合使用树突状细胞治疗剂和乐得美乳膏的鼠群，PBS+Aldara：仅用乐得美乳膏的鼠群。
图6a及图6b表示在小鼠肺转移治疗对象中的对照组及实验组的各个小鼠个体上，通过树突状细胞及乐得美乳膏的并用获得的肺转移病变抑制效果。PBS：给予PBS的小鼠对照组，Ag-DC：给予树突状细胞治疗剂的鼠群，Ag-DC+aldara：联合使用树突状细胞治疗剂和乐得美乳膏的鼠群，PBS+Aldara：仅用乐得美乳膏的鼠群。
图7a表示对小鼠肝癌治疗对象中的对照组及实验组中各个小鼠的癌组织的癌细胞密度进行组织学观察的结果。PBS：给予PBS的小鼠对照组，Ag-DC：给予树突状细胞治疗剂的鼠群，Ag-DC+aldara：并用树突状细胞治疗剂和乐得美乳膏的鼠群，PBS+Aldara：仅用乐得美乳膏的鼠群。图7b表示通过测量小鼠肝癌治疗对象下的对照组及实验组中小鼠的肿瘤大小，确认并用树突状细胞及乐得美乳膏的固体癌形成抑制效果的结果。PBS：给予PBS的小鼠对照组，Ag-DC：给予树突状细胞治疗剂的鼠群，Ag-DC+aldara：联合使用树突状细胞治疗剂和乐得美乳膏的鼠群，PBS+aldara：仅用乐得美乳膏的鼠群。
图8表示通过MTT分析，对从小鼠治疗对象中的对照组及实验组中各个小鼠获得的脾细胞(splenocyte)分离的T细胞进行T细胞增殖分析(T cell proliferation assay)的结果。PBS：给予PBS的小鼠对照组，Ag-DC：给予树突状细胞治疗剂的鼠群，Ag-DC+aldara：联合使用树突状细胞治疗剂和乐得美乳膏的鼠群，PBS+Aldara：仅用乐得美乳膏的鼠群。
图9表示从小鼠治疗对象中的对照组及实验组中各个小鼠获取的脾T淋巴球的CTL活性的测量结果。PBS：给予PBS的小鼠对照组，Ag-DC：给予树突状细胞治疗剂的鼠群，Ag-DC+aldara：联合使用树突状细胞治疗剂和乐得美乳膏的鼠群，PBS+Aldara：仅用乐得美乳膏的鼠群。
图10a及图10b图示因从小鼠治疗对象中的对照组及实验组中各个小鼠获取的T淋巴球的Th1主动免疫反应导致的IFN-γ及IL-4分泌量的增加。PBS：给予PBS的小鼠对照组，Ag-DC：给予树突状细胞治疗剂的鼠群，Ag-DC+aldara：联合使用树突状细胞治疗剂和乐得美乳膏的鼠群，PBS+Aldara：仅用乐得美乳膏的鼠群。
具体实施方式
以下，通过实施例对本发明进行详细说明。所述实施例用于更具体说明本发明，本技术领域的普通技术人员应该理解，根据本发明的思想，本发明的保护范围并不被实施例所限定。
实施例
实验材料及方法
实施例1-1：重组抗原蛋白质的制备
利用作为人体肝癌细胞株及乳房癌细胞株的HepG2、SK-BR-3合成cDNA，克隆肝癌特异抗原AFP(alpha-fetoprotein)、MAGE 1(melanomaassociated family A1)、GPC 3(glypican3)。
如果为AFP，则表达部位选择SEQ ID NO：1的全谱氨基酸序列中20-346氨基酸序列，如果为GPC 3，则SEQ ID NO：2序列中的全谱氨基酸序列中33-358氨基酸序列，如果为MAGE 1，则选择SEQ ID NO：3序列中的全谱氨基酸序列。并且，使用了将肽YGRRARRRRRR融合于上述选择的蛋白质的抗原蛋白质。
克隆合成于YGRRARRRRRR肽-融合表达载体的抗原cDNA后，转化至大肠菌表达菌株BL21-DE3，并选择了可稳定表达YGRRARRRRRR肽-融合抗原蛋白质的转化体。在包括氨比西林的LB培养基中培养表达各个融合抗原的转化菌株，添加0.1-0.5mM IPTG(isopropylthio-β-D-galactoside；Sigma公司)，以诱导各个融合蛋白质的表达。离心分离菌株培养液而回收菌体后，通过超声破碎及离心分离过程，从菌体获得包涵体(inclusion body)形态的重组抗原蛋白质。用清洗缓冲液(50mM Tris，100mM NaCI，0.05％Triton X-100，pH 8.0)清洗多次，尽量去除内毒素(endotoxin)。接着，添加6M Gn-HCI溶液(6MGuanidin-HCI，100mM NaCI，50mM Tris，pH 8.0)而充分溶解包涵体(inclusion body)。为了分离存在于重组蛋白质的利用His-tag的蛋白质，使用了Ni-NTA agarose affinity column。蛋白质的洗脱利用了咪唑(imidazole)浓度梯度(100mM-1M)，分离的蛋白质通过Gel filterationcolumn(HiprepTM 16/60sephacrylTM S-100HR，Amersham-Pharmacia)补充清洗。接着，通过利用PBS的透析去除了包含于咪唑(imidazole)及洗脱溶液中的尿素(urea)。使用Ultra-filteration(Vivaspin 20，Satoriusco.)将纯化的蛋白质浓缩至适当浓度，并将浓缩的蛋白质分为适当量保存于-80℃。为了确认净化的蛋白质，通过SDS-PAGE分析确认了该蛋白质条带(band)，通过利用抗-His抗体(Qiagene)的蛋白质印迹(westernblot)确认了纯化的蛋白质特异性应答于抗-His抗体(参照图1)。
实施例1-2：表达人体肝癌抗原的肿瘤细胞株的准备
作为用于肝癌小鼠受试者的肿瘤细胞株，使用了与通过真核细胞表达载体(pcDNA3.1，Invitrogen公司)转化的C3H小鼠系列同种的肝癌细胞株MH234细胞株，以稳定表达人体AFP、MAGE 1、GPC 3。
实施例1-3：用于树突状细胞制备的骨髓细胞(未成熟树突状细胞的前体细胞)分离
小鼠(C3H系)骨髓细胞(bone marrow cell)来自大腿骨及胫骨。为了获得大腿骨及胫骨，首先以颈椎脱臼法处死小鼠，利用70％乙醇对手术部位进行消毒。将大腿骨及胫骨分离，在70％乙醇中浸泡约30秒而消毒，用磷酸盐缓冲溶液(phosphate buffered saline：PBS)洗涤，并浸泡于RPMI-1640培养基。利用灭菌的手术用剪刀切断大腿骨及胫骨两端，在1cc注射器中注入RPMI-1640培养基，并在切断部位插入注射针并挤压后，盛于50ml管而获得骨髓细胞。获得的细胞进行离心分离，将骨髓细胞清洗一次后，去除了骨髓细胞内的红血球。去除红血球后，进行两次离心分离而清洗后，保管于冰块中，直到下一次实验中使用。
实施例1-4：诱导分化为未成熟树突状细胞的培养
作为用于分化为未成熟树突状细胞的培养基，使用在包括10％FBS(fetal bovine serum；Life technologies)的RPMI-1640培养基中添加10ng/ml的小鼠重组白细胞介素-4(mouse recombinant interleukin-4，mrIL-4；CreaGene INC.)和10ng/ml的小鼠重组巨噬细胞/粒细胞集落刺激因子(mouse recombinant granulocyte/macrophage colonystimulatory factor，mrGM-CSF；CreaGene INC.)的培养基，在37℃的CO2培养基中将上述分离的骨髓细胞(未成熟树突状细胞的前体细胞)培养两天。树突状细胞的前体细胞具有伏贴而生长的吸附性质(plasticadherence)，因此在培养两天后将非吸附性细胞从吸附性细胞分离，从而将树突状细胞的前体细胞从非前体细胞中分离出。去除非吸附性细胞后，再填充2ml相同的树突状细胞分化培养基，并进行树突状细胞分化培养。此时，每隔2-3日更换部分培养基，避免树突状细胞分化所需的细胞因子的缺乏。未成熟树突状细胞是在第6-7天获得。
实施例1-5：抗原特异性成熟树突状细胞的抗原处理及成熟化诱导培养
用适当浓度的YGRRARRRRRR肽与各个肝癌特异抗原的融合蛋白质处理未成熟树突状细胞后，在第4个小时时添加成熟化培养基。用于成熟化的培养基是，在树突状细胞分化培养基中添加小鼠重组干扰素(mouse recombinant interferon(IFN)-γ；Endogen)和小鼠重组肿瘤坏死因子-α(mouse recombinant tumornecrosis factor(TNF)-α；Endogen)及poly I：C(Sigma公司)的组合物。第6-7日，将小鼠树突状细胞的分化培养基更换为添加有一定浓度抗原的成熟化培养基，在CO2培养基中进行了树突状细胞成熟化培养。作为最终产物的成熟树突状细胞为不会伏贴的非吸附性细胞，在制备最终日收获非吸附性的悬浮细胞而获得。成熟化树突状细胞利用磷酸盐溶液清洗三次后用于下次实验。
成熟化树突状细胞的成熟度是通过细胞大小、颗粒性及CD11c、CD40、CD54、CD80、CD86、Class II的表达与否来判断，树突状细胞的纯度是通过CD14的表达与否来确认。树突状细胞的表面抗原表达是通过荧光流式细胞仪进行分析。
实施例2-1：实验动物
实验动物为由韩国Orient-Bio公司或日本Charles River公司提供的6周龄的雌性C3H小鼠。收容动物的饲养笼是使用了小鼠用聚碳酸酯饲笼，每个饲笼收容了4只。在试验期间，让小鼠自由摄取了鼠类饲料和高压蒸汽杀菌的蒸馏水。饲养环境维持温度20.0-24.3℃、湿度36.9-67.4％、通风次数是每小时12-15次、12小时自动照明(照明：08:00-20:00，照度150-300lux)。每个动物个体的识别是通过耳朵标识法实现，各个饲笼上帖附每个个体的识别卡，标记实验组、动物号而区分。
实施例2-2：通过表达人体肝癌抗原的细胞株的固体癌形成及癌症转移的诱导
利用添加10％FBS和400μg/ml的G418的RPMI-1640培养基，在100mm板上培养/维持分别稳定表达人体AFP或人体MAGE 1、人体GPCF 3的细胞株(以下标记为MH134/AFP或MH134/MAGE 1、MH134/GPC 3)。传代培养2-3次后，在实验前一天更换新培养基，以优化细胞的生存率。利用生理盐水注射液悬浮细胞，将活细胞数量调整为1.5×105/100μl，用注射器吸入1cc，从而准备肝癌抗原表达细胞株注射剂。用酒精棉消毒小鼠个体的要注射的皮肤部位，在小鼠的左胁腹皮下组织倾斜45°角插入注射针而注射肝癌细胞株。从注射肝癌抗原表达细胞株的时间点开始，每隔2-3天观察固体癌形成与否，利用卡尺(caliper)测量，依算式长轴X短轴2X 0.52计算了大小。并且，就诱导癌症转移的个体来说，利用补偿器固定小鼠，使其一定程度能动，以免发生窒息死亡。利用酒精棉向下擦拭整个尾部而进行消毒。使要插入注射针的部位的静脉朝上而固定，将注入有肝癌抗原表达细胞株的注射剂(0.75×105/100μl)维持小于15°的角度而插入至尾部静脉，使得注射针和静脉平行而注射内容物。注射完后，止血约10秒钟，确认小鼠状态后，放入饲笼。确认各个实验组和标识后，进行下一实验。
实验例1：通过抗原特异性成熟树突状细胞和/或咪喹莫特处理诱导预防或防御免疫
将在实施例1-5中制备的以肝癌抗原重组蛋白质致敏而成熟的树突状细胞，在灭菌PBS溶液中悬浮，将存活的树突状细胞数量控制在1×106/100μl。根据实验组将100μl悬浮液或PBS溶液作为1次给药量，每周1次，每次两回给予至小鼠右胁腹(right flank)。其中，在树突状细胞给药2-3天前，利用刮胡刀给小鼠除毛。如果是抹乐得美乳膏(5％咪喹莫特乳膏，iNOVA Pharmaceuticals)，则在使用树突状细胞或PBS的前一天、当天、第二天，每天都取适当量的乐得美乳膏在施用树突状细胞或PBS溶液的部位涂抹30秒钟。最终在使用树突状细胞或PBS一星期后，如实施例2-2所述，将用PBS悬浮的适当量肝癌抗原表达细胞株(MH134/AFP、MH134/MAGE 1、MH134/GPC 3)混合液(1×106cells/100μl)皮下注射至注射树突状细胞的相反侧胁腹。对如上构建的固体癌预防或防御对象，研究了通过抗原特异性成熟树突状细胞和/或咪喹莫特联用处理后的抗癌效果。
作为实验组，有抗原特异性成熟树突状细胞单独给药组(Ag-DC，n＝8)、乐得美乳膏单独给药组(PBS+乐得美乳膏，n＝8)及抗原特异性成熟树突状细胞+乐得美乳膏联用给药组(Ag-DC+乐得美乳膏，n＝8)，对照组为PBS溶液给药组。
实验例2：通过抗原特异性成熟树突状细胞和/或咪喹莫特处理的治疗免疫诱导
首先，如实施例2-2，将被PBS悬浮的适当量肝癌抗原表达细胞株(MH134/AFP、MH134/MAGE 1、MH134/GPC 3)混合液(1.5×105cells/100μl)皮下注射或静脉注射至小鼠的左胁腹(left flank)。在注射癌细胞后的2天及9天时，将因用实施例1-5中制备的肝癌抗原重组蛋白质致敏而成熟的树突状细胞悬浮于灭菌PBS溶液中，将存活的树突状细胞量控制在1×106/100μl。根据实验组，将100μl悬浮液或PBS溶液作为1次给药量，给予小鼠右胁腹(right flank)。此时，在树突状细胞给药2-3天前，利用刮胡刀给小鼠除毛。如果是抹乐得美乳膏(5％咪喹莫特乳膏，iNOVA Pharmaceuticals)，则在给予树突状细胞或PBS的前一天、当天、第二天，每天都取适当量的乐得美乳膏在施用树突状细胞或PBS溶液的部位涂抹30秒钟。对如上构建的固体癌预防或防御对象，调查了通过抗原特异性成熟树突状细胞及/或咪喹莫特联用处理后的抗癌免疫效果。
作为实验组，有抗原特异性成熟树突状细胞单独投入组(Ag-DC，n＝8)、乐得美乳膏单独给药组(PBS+乐得美乳膏，n＝8)及抗原特异性成熟树突状细胞+乐得美乳膏联用给药组(Ag-DC+乐得美乳膏，n＝8)，对照组为PBS溶液给药组。
实验例3：在肺组织分离及固定后癌症转移过程中肺转移病变的观察
在实验例2中构建的癌症转移治疗对象中，通过癌细胞株的静脉注射的癌症转移诱导后第18天，用颈椎脱臼法处死小鼠，利用70％乙醇进行全身消毒后固定。接着，以腹部正中央线为准，将皮肤H切开向两侧展开而固定，再将腹膜沿中心线切开而向两侧展开固定。确认脏器形态的异常与否后，切开隔膜沿着肋软骨切开胸骨后，部分固定并观察胸腔。取肺组织并用磷酸盐缓冲溶液清洗，并去除血液凝固组织后，浸泡于固定液Bouin’s fixative(Sigma公司)，并观察由肝癌抗原表达细胞株引起的肺转移病变。
实验例4：肝癌抗原特异性T细胞增殖、Th1细胞因子分泌能力及CTL诱导能力实验
以颈椎脱臼法使实验例1及2中的对照组和实验组的小鼠安乐死，取出脾后，保存于RPMI-1640培养基中，以避免分离的脾干燥。将各个脾取出后通过70μm网而去除悬浮组织，进行一次离心分离获得细胞后，用0.83％氯化铵溶液悬浮而去除了红血球。将制备的脾细胞(splenocyte)与尼龙纤维柱(nylon wool column)反应一个小时，仅将T淋巴球分离出，进行非吸附性分级分离后进行对CD3抗原进行荧光流式细胞仪分析，确认85％以上为T细胞后，用于下一实验中。与为了效应T细胞(Effector T cell)刺激而准备的抗原呈递细胞(APC，antigen presentingcells)以5∶1比例混合培养五天。在实验日两天之前，APC通过以下方法准备。取出正常小鼠的脾，去除红血球，用3μg/ml的Concanavalin A刺激48小时。刺激后，处理适当量的肝癌抗原重组蛋白质(YGRRARRRRRR-AFP、YGRRARRRRRR-MAGE 1、YGRRARRRRRR-GPC 3)并培养24小时。培养24小时后，以MitomycinC处理40分钟，清洗3次而准备APC。将效应T细胞(Effector T cell)和APC共培养5天的过程中，第三天取出一部分进行MTT分析，从而执行T细胞增殖分析(T cell proliferation assay)。并且，在培养第四天取一部分培养基，确认Th1 type/Th2 type细胞因子(IFN-gamma，IL-4)的分泌量。培养五天后，利用Histopaque(Sigma公司)去除坏死细胞，分离效应T细胞(Effector T cell)，将表达肝癌抗原的靶细胞(MH134/AFP、MH134/GPC 3、MH134/MAGE 1混合细胞)与效应T细胞(Effector Tcell)混合而培养四小时，其混合比例(E∶T ratio)为5∶1、10∶1、20∶1及40∶1。根据Promega公司的非-放射性增殖分析KIT(Non-RadioactiveProliferation assay kit)指南进行实验，并计算特异性溶胞率(specific lysisrate)。
实验例5：本发明成熟树突状细胞的安全性实验
为了测试本发明的实施例1-5中制备的成熟树突状细胞的安全性，利用小鼠(Balb/C，雌性，6周岁)进行单次皮下给药毒性实验、重复皮下给药毒性实验及免疫毒性实验。这些实验由被核准为GLP实验机构的(株)Biotoxtec co.公司进行。单次皮下给药毒性实验根据其给药剂量分为4个实验组进行实验，每个组包括雌性及雄性各5只，共40只投入到实验中。对照组注射了生理盐注射液，实验组以皮下途径分别给予了2.5×105、7.5×105、2.5×106剂量。之后的14天期间观察死亡率、一般症状、体重变化，14天后进行尸检进行了肉眼尸检及组织病理检查。为了重复皮下给药毒性实验及免疫毒性实验，根据给药剂量，分为3个实验组进行实验，每个组使用雌性、雄性各10只。对照组注射了生理盐注射液，实验组以皮下途径分别给予了5×104、5×105剂量。对照组及5×105剂量给药组包括恢复组，每个组使用了雌性、雄性各5只。给药周期为每周1次，反复给予了五周，本实验组在最终投入一星期后进行尸检，恢复组是在四周后进行尸检。实验项目为一般症状、体重变化、饲料摄取量、眼科检查、尿验、血液检查、血液生化检查、脏器重量、尸检及组织病理检查，免疫毒性实验为脾内淋巴细胞分析，利用CD3e、CD4、CD8a及CD45R/B220抗体，测试了T细胞、B细胞的活化与否，并分析脾内自然杀伤细胞(NK cell)活化。
实验结果
实验例1及实验例4的结果：固体癌预防或防御免疫的诱导
上述实验为在小鼠肝癌对象中对固体癌的预防或防御免疫进行确认的实验，向作为对照组的给予PBS的鼠群(n＝8)、本发明中给予树突状细胞治疗剂的鼠群(n＝8)、仅涂抹乐得美乳膏的鼠群(n＝8)、本发明中并用树突状细胞治疗剂和乐得美乳膏的鼠群(n＝8)的皮下给予适当量(1.5×105cells/head)的肝癌抗原表达细胞株，以2-3日为间隔观察肿瘤生长。固体癌的长轴及短轴上的大小是利用卡尺(Caliper)以算式长轴X短轴2X 0.52计算。实验结果，本发明的树突状细胞治疗剂及树突状细胞治疗剂和乐得美乳膏联用的小鼠实验组相比PBS对照组或仅用乐得美乳膏的实验组，呈现出显著的固体癌生长抑制效果。特别是在联用树突状细胞治疗剂及乐得美乳膏的实验组中的3只(CR：43％)，其皮下注射的细胞株并未形成固体癌，其他3只(PR：43％)的固体癌大小为PBS对照组的平均固体癌大小的70％以下，与其他对照组及实验组的固体癌相比，形成尺寸非常小的肿瘤(参照图2a-图2c)。
并且，为了确认本发明的成熟树突状细胞对被诱导癌症的个体的寿命延长效果，以2-3天为间隔持续调查小鼠的生存与否。对诱导肿瘤的小鼠，肿瘤诱导后40天左右，PBS对照组全部死亡，但给予本发明的树突状细胞治疗剂的个体存活50％，本发明的树突状细胞和乐得美乳膏联合给药组存活80％，特别是联合给药组，在50天之后也继续呈现出寿命延长效果(参照图2d)。
上述防御对象中的固体癌生长抑制效果，估计与实验组小鼠个体的细胞性免疫反应相关的i)肝癌抗原特异性T细胞的增殖反应；ii)预测为主导免疫反应的IFN-γ的表达；以及iii)CTL活性结果具有相关性，为了确认此相关性进行以下实验。完成最后树突状细胞治疗剂的给药后，分别过一星期、两星期、三星期时，处死对照组和各个实验组中的1只小鼠，调查脾部T淋巴细胞的活性。就从用本发明的树突状细胞治疗剂及树突状细胞和乐得美乳膏联用处理后的鼠群分离出的脾部T淋巴细胞来说，相比于用PBS处理的鼠群的T淋巴球，其增殖比例更高(参照图3)。并且，在可以类推Th1主导细胞性免疫反应的体外(in vitro)IFN-γ及IL-4的数值比较中也呈现出相同的结果(参照图4a及图4b)。并且，经确认，就对表达抗原的标靶细胞的溶解活性(cytotoxic T lymphocyteactivity，毒性T细胞活性)来说，用本发明的树突状细胞治疗剂处理的小鼠及用本发明的树突状细胞和乐得美乳膏并用处理后的小鼠相比于对照组更高，特别是联用给药组最高(参照图5)。
实验例2及实验例4的结果：固体癌治疗免疫的诱导
作为从小鼠肝癌对象中确认固体癌的治疗免疫的实验，将适当量的肝癌抗原表达细胞株皮下注射至28只小鼠，以形成固体癌。固体癌形成后，调查给予PBS的鼠群(n＝7)、给予本发明的树突状细胞治疗剂的鼠群(n＝7)、仅用乐得美乳膏处理的鼠群(n＝7)、联用本发明的树突状细胞治疗剂和乐得美乳膏的鼠群(n＝7)的抗癌效果。作为评价指标，观察了癌组织内癌细胞密度(图7a)及固体癌生长(图7b)。确认了在用本发明的树突状细胞治疗剂处理的小鼠及用本发明的树突状细胞和乐得美乳膏联用处理的鼠群中的癌组织内癌细胞密度降低，特别是在联用处理的鼠群中，癌组织内癌细胞密度明显降低(图7a)。并且，就固体癌生长来说，用本发明中树突状细胞及乐得美乳膏联用处理的鼠群呈现出优选的抑制效果(图7b)。这种结果表示，相比于固体癌大小抑制方面，本发明中树突状细胞的治疗效果反而是在构成肿瘤的实质细胞(viabletumor cells，存活的肿瘤细胞)密度方面呈现出治疗学上的性质变化，如果联用乐得美乳膏，在肿瘤生长抑制及癌组织内实质细胞数减少方面非常有效。
通过肝癌抗原特异性T细胞的增殖实验、CTL活性实验、Th1/Th2细胞因子分析，与相关于T细胞活性的细胞性免疫反应关联而对本发明中树突状细胞治疗剂及乐得美乳膏联用处理组的治疗效果进行了追加实验确认，上述肝癌抗原特异性T细胞的增殖实验、CTL活性实验、Th1/Th2细胞因子分析是使用上述治疗免疫对象中的各个对照组及实验组的小鼠个体的脾进行。这种实验结果是在最后树突状细胞给药结束一星期后，在对照组和各个实验组中各处死一只小鼠，对其脾部T淋巴球活性进行调查而获得。就从本发明中给予树突状细胞的鼠群中分离的脾部T淋巴球来说，相比于给予PBS的鼠群的T淋巴球，可以观察到更高比例的增殖现象(参照图8)。并且，确认了在联用树突状细胞治疗剂+乐得美乳霜的鼠群中，对肝癌抗原表达标靶细胞的Th1主导细胞毒性效果更高(参照图9、图10a及图10b)。从仅用乐得美乳霜处理的鼠群中分离的T淋巴球的CTL诱导，因其细胞数不足而除外。除此之外，去除对照组及实验组的邻近淋巴结而制备单细胞悬浮液后，通过流式细胞仪调查免疫细胞群的比例，此时相比于对照组，在联用组观察出CD8+T细胞的小幅上升及显著的T reg细胞的减少现象。
实验例3结果：转移癌治疗免疫的诱导
为了确认肝癌小鼠对象对转移癌的治疗免疫，通过静脉路径注射表达肝癌抗原的癌细胞株而诱导癌转移，对诱导出癌转移的各个小鼠个体分别给予PBS，单独给予本发明的树突状细胞治疗剂，联合给予本发明的树突状细胞治疗剂及乐得美乳膏及单独给予乐得美乳膏。给予肿瘤细胞后第18-20天，分离肺组织而用Bouin’s fixative溶液固定，观察癌转移中的肺转移病变(图6a及图6b，n＝8)。表达肝癌特异抗原的MH134肿瘤细胞的癌转移对象的特征是，转移节结(nodule)的数量不均匀，并随机(random)分布(图6b)。因此，并各个个体产生的肺集落(lungcolony)数量不平均，根据所产生的肺集落(lung colony)数的分布任意指定范围，计算在其范围内发生肺集落的个体数量而判断转移抑制效果(图6a)。表达肝癌特异抗原的MH134的lung colony(colony)为光滑型(smooth type)，是较宽的斑点状，如果lung colony(colony)数量超过30个，则互相融合从而计算困难。在用本发明的树突状细胞治疗剂处理及联用乐得美乳膏的给药组中，分别呈现出良好的肺转移抑制效果，特别是在联用本发明的树突状细胞治疗剂+乐得美乳膏的鼠群中，3只(37.5％)根本无法观察到肺转移病变，其他5只(62.5％)的集落(colony)数量也未超过5个(参照图6a)。
实验例5的结果：确认树突状细胞治疗剂的安全性
就本发明的成熟树突状细胞的单次皮下给药毒性而言，在雌性、雄性实验物质给药组中并未观察到因给药而发生的死亡例、一般症状的异常及需注意的体重变化。尸检结果，在雌性、雄性实验物质给药组中并未观察到肉眼能确认的异常。由此，未进行对脏器组织的组织病理学检查。从结果上来说，将本发明的成熟树突状细胞单次给予至Balb/C小鼠皮下的结果，并未观察到因实验物质导致的死亡例，因此，判断大概致死量为雌性、雄性分别为2.5×106cells/head以上。作为反复皮下给药毒性的结果，对实验物质给药组的进行一般症状、体重、饲料摄取量、眼科检查、尿检、血液检查、脏器重量测量及尸检的结果，并未发现因实验物质给药导致的变化。组织病理学实验结果，实验组雌雄5×104、5×105cells/head时，观察到给药部位的细胞浸润，判断为是因实验物质导致的。但是，在恢复组的给药部位中，仅在雌性5×105cells/head给药组的一例中观察到，因此认为给药部位的刺激是可以恢复的。免疫毒性实验结果，就脾内淋巴球活化及自然杀手细胞活化来说，认为在雌雄实验物质给药组中并无实验物质导致的影响。由此判断，小鼠CreaVax-HCC的无毒量(NOAEL)为5×105cells/head以上。
通常，在以肝癌为对象的临床试验中，树突状细胞的给药剂量以0.5-50×106cells/individual为准，通常使用的最大给药剂量为5×107cells/individual。将临床预定剂量设为最大给药量5×107cells/individual，将癌症患者的体重假设为50kg时，本发明中成熟树突状细胞的致死量为临床最大实验预定剂量的100倍，无毒量为临床最大实验预定剂量的20倍以上，由此可知，本发明中成熟树突状细胞的毒性很弱，非常安全。
结论
通过本实验证明，在固体癌或癌转移小鼠对象中因用与肽YGRRARRRRRR融合的癌症抗原蛋白质致敏而成熟化的树突状细胞，具有良好的肿瘤预防及治疗效果和癌症转移抑制效果，如果联用乐得美乳膏，可以提高肿瘤生长抑制和癌症转移抑制效果。
制作了可以稳定表达人体肝癌抗原的癌细胞株，选择具有相同的组织适应性的鼠类，通过皮下及尾部静脉注射，制备了诱导皮下固体癌及癌转移的动物实验品，向该动物实验品给予因用与肽YGRRARRRRRR融合的肝癌抗原蛋白质致敏而成熟化的树突状细胞治疗剂，及联合给予乐得美乳膏时，发现对皮下固体癌的预防及治疗效果优越，肺转移病变数明显下降。特别是在固体癌预防对象中，不仅呈现出肿瘤生长的抑制，也呈现出肿瘤的根除效果，最终在寿命延长方面具有显著的效果。即，通过本发明中树突状细胞治疗剂及咪喹莫特的联用疗法，可以诱导良好的肿瘤大小减小效果和寿命延长效果。具体强调，在实际肝癌等癌症治疗中，经手术及/或非手术疗法等首次治疗后，初期过程较好但复发可能性较高的情况下，在第一次癌症治疗(去除肿瘤负荷(tumor burden)等)后，给予本发明的树突状细胞治疗剂及联合给予乐得美乳膏，则可以有效预防或抑制(2nd tumor prevention，2次肿瘤预防)由残留的微细癌细胞引起的复发。
特别是，可以确认到，在癌转移治疗对象中，通过本发明的成熟树突状细胞处理，可以有效阻碍以下现象：即在癌细胞注射到静脉内后移动到肺组织的肿瘤细胞所诱导形成肺集落(lung colony)。并且，该效果在与咪喹莫特联合给药时更加显著。从结果上来说，暗示本发明的成熟树突状细胞的给药及乐得美乳膏的联合给药对癌转移的抑制非常有效。
从T细胞的免疫性侧面，通过肝癌抗原特异性T细胞增殖诱导、CTL反应实验及Th1/Th2细胞因子分析，额外确认了本发明抗癌效果的提高。
就皮下固体癌治疗对象来说，肿瘤增殖具有攻击性，因此，对通过用本发明成熟树突状细胞处理所获得的肿瘤大小的抑制效果较差，但通过肿瘤组织分析确认，肿瘤内实质细胞密度明显降低。也即，将本发明的成熟树突状细胞使用于手术或非手术治疗后的癌症患者时，通过抗癌免疫诱导可以带来抑制癌转移及复发的抗癌效果，并且，通过实验已证明：如果与本发明的树突状细胞治疗剂联用乐得美乳膏，则可以提高树突状细胞对肝癌的免疫治疗效果。
并且，进行本发明成熟树突状细胞的单次皮下给药毒性、重复皮下给药毒性及免疫毒性实验的结果，在所有项目中确认其安全性良好。
如上所述详细记载了本发明的特定部分，本技术领域的普通技术人员应清楚，上述具体技术仅为优选实施例，并不能用于限定本发明的保护范围。因此，本发明实质性的保护范围由权利要求书及其等价物所定义。
参考文献：
1.Butterfield L.H.Recent advances in immunotherapy forhepatocellular carcinoma.SWISS MED WKLY.2007 137：83-90
2.Sun K.，Wang L.，Zhang Y.，Dendritic cell as therapeutic vaccinesagainst tumors and its role in therapy for hepatocellular carcinoma.Cellula&Molecula immunity 2006；3(3)：197-203.
3.Pietesz GA et al.Generation of cellular immune responses toantigenic tumor peptides.Cell Mol Life Sci 2000；57(2)：290-310.
4.Morris MC et al.A peptide carrier for the delivery of biologicallyactive proteins into mammalian cells，Nat.Biotechnol.2001；19：1173-1176.
5.Kim D et al.cytoplasmic transduction peptide(CTP)：Newapproach for the delivery of biomolecules into cytoplasm in vitro and invivo.Exp.cell Res.2006；312：1277-1288.
6.Hemmi，H.，et al.Small anti-viral compounds activate immunecells via the TLR7 MyD88-dependent signaling pathway.NatImmunol..2002 3(2)：196-200.
7.Sauder，D.N.，Imiquimod：modes of action.British Journal ofDermatology.2003 149(Suppl.66)：5-8.
8.Miller，R.L.，et al.Imiquimod applied topically：a novel immuneresponse modifier and a new class of drug.Int J Immunopharmacol.1999Jan；21(1)：1-14.
9.Zagon IS，Donahue RN，Rogosnitzky M，Mclaughlin PJ(August2008).“Imiquimod upregulates the opioid growth factor receptor toinhibit cell proliferation independent of immune function”.Exp.Biol.Med.(Maywood)233(8)：968-79.
Figure IPA00001445349200011
Figure IPA00001445349200021
Figure IPA00001445349200041

Claims (20)

1.一种具有诱导癌症特异性免疫反应的能力的成熟树突状细胞的制备方法，其特征在于，包括：
(a)将未成熟的树突状细胞用与肽YGRRARRRRRR融合的癌症特异性抗原蛋白质致敏而使其成熟化的步骤；及，
(b)分离所述步骤(a)中的成熟化的树突状细胞的步骤。
2.根据权利要求1所述的具有癌症特异免疫反应诱导能力的成熟树突状细胞的制备方法，其特征在于，所述步骤(a)是在存在作为树突状细胞的成熟化诱导细胞因子的TNF(Tumor necrosisfactor)-α、IFN(Interferon)-γ、IL-1β、IL-6、PGE2(Prostaglandin E2)或其混合物的情况下进行。
3.根据权利要求1所述的具有癌症特异性免疫反应诱导能力的成熟树突状细胞的制备方法，其特征在于，所述步骤(a)中的癌症特异性抗原为肝癌特异性抗原。
4.根据权利要求3所述的具有癌症特异性免疫反应诱导能力的成熟树突状细胞的制备方法，其特征在于，所述肝癌特异性抗原为AFP(Alpha-Fetoprotein)、GPC 3(Glypican-3)、MAGE 1(MelanomaAssociated Gene Family A1)、NY-ESO-1(cancer/testis antigen)、Aurora-A(serine/threonine protein kinase involved in centrosomeformation during mitosis)或Gankyrin(liver-specific oncoproteininvolved in cell cycle regulation)。
5.根据权利要求4所述的具有癌症特异性免疫反应诱导能力的成熟树突状细胞的制备方法，其特征在于，所述肝癌特异抗原为AFP(Alpha-Fetoprotein)、GPC 3(Glypican-3)或MAGE 1(MelanomaAssociated Gene Family A1)。
6.根据权利要求5所述的具有癌症特异性免疫反应诱导能力的成熟树突状细胞的制备方法，其特征在于，所述肝癌特异抗原是SEQID NO：1的AFP氨基酸序列中20-346序列、SEQ ID NO：2的GPC3氨基酸序列中33-358序列或SEQ ID NO：3的MAGE1氨基酸序列。
7.一种用于预防或治疗癌症的药物组合物，其特征在于，包括：
(a)药学有效量的根据所述权利要求1至6中任一项所述方法制备且具有癌症特异性免疫反应诱导能力的成熟树突状细胞；及，
(b)可药用载体。
8.根据权利要求7所述的用于预防或治疗癌症的药物组合物，其特征在于，所述癌症为肝癌。
9.一种用于抑制癌症转移的药物组合物，其特征在于，包括：
(a)药学有效量的根据所述权利要求1至6中任一项所述方法制备且具有癌症特异性免疫反应诱导能力的成熟树突状细胞；及，
(b)可药用载体。
10.根据权利要求9所述的用于抑制癌症转移的药物组合物，其特征在于，所述癌症转移为肝癌的转移。
11.根据权利要求10所述的用于抑制癌症转移的药物组合物，其特征在于，所述肝癌转移为肝癌的肺转移。
12.一种用于预防或治疗癌症的药物试剂盒，其特征在于，包括：
(a)药物组合物，包括根据所述权利要求1至6中任一项所述方法制备且具有癌症特异性免疫反应诱导能力的成熟树突状细胞；以及
(b)包含以下述化学式1表示的化合物的组合物。
[化学式1]
Figure FPA00001445349600021
13.根据权利要求12所述的用于预防或治疗癌症的药物试剂盒，其特征在于，所述癌症为肝癌。
14.一种用于抑制癌症转移的药物试剂盒，其特征在于，包括：
(a)药物组合物，包括根据所述权利要求1至6中任一项所述方法制备且具有癌症特异性免疫反应诱导能力的成熟树突状细胞；及，
(b)包含以下述化学式1表示的化合物的组合物。
[化学式1]
15.根据权利要求14所述的用于抑制癌症转移的药物试剂盒，其特征在于，所述癌症转移为肝癌转移。
16.根据权利要求15所述的用于抑制癌症转移的药物试剂盒，其特征在于，所述肝癌转移为肝癌的肺转移。
17.一种利用树突状细胞的治疗或预防癌症方法，其特征在于，包括：
(a)将根据所述权利要求1至6中任一项所述方法制备且具有癌症特异性免疫反应诱导能力的成熟树突状细胞给予患癌受试者的步骤；及，
(b)在给予成熟树突状细胞的部位施用包含以下述化学式1表示的化合物的组合物的步骤；或，
(a’)在欲给予成熟树突状细胞的患癌受试者的给予部位施用含有以下化学式1表示的化合物的组合物的步骤；及，
(b’)将根据所述权利要求1至6中任一项所述方法制备且具有癌症特异性免疫反应诱导能力的成熟树突状细胞给予患癌受试者的步骤。
[化学式1]
Figure FPA00001445349600032
18.一种利用树突状细胞的抑制癌症转移方法，其特征在于，包括：
(a)将根据所述权利要求1至6中任一项所述方法制备且具有癌症特异性免疫反应诱导能力的成熟树突状细胞给予患癌受试者的步骤；及，
(b)在给予所述成熟树突状细胞的部位施用包含以下述化学式1表示的化合物的组合物的步骤；或，
(a’)在待给予成熟树突状细胞的患癌受试者的给予部位施用含有以下化学式1表示的化合物的组合物的步骤；及，
(b’)将根据所述权利要求1至6中任一项所述方法制备且具有癌症特异性免疫反应诱导能力的成熟树突状细胞给予患癌受试者的步骤。
[化学式1]
Figure FPA00001445349600041
19.一种利用树突状细胞的预防或治疗癌症方法，其特征在于，其包括：将通过权利要求1至6中任一项所述方法制备的具有癌症特异性免疫反应诱导能力的成熟树突状细胞给予患癌受试者的步骤。
20.一种利用树突状细胞的抑制癌症转移方法，其特征在于，其包括：将通过权利要求1至6中任一项所述方法制备的具有癌症特异性免疫反应诱导能力的成熟树突状细胞给予患癌受试者的步骤。
CN2009801585170A 2009-03-31 2009-03-31 具有诱导癌症特异性免疫反应的能力的树突状细胞的制备方法,包含该树突状细胞的用于预防或治疗癌症或者抑制癌症转移的药物组合物及试剂盒(kit) Pending CN102439137A (zh)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PCT/KR2009/001650 WO2010114185A1 (ko) 2009-03-31 2009-03-31 암 특이 면역반응 유도능을 갖는 수지상 세포의 제조 방법, 이 수지상 세포를 포함하는 암의 예방, 치료, 또는 전이 억제용 약제학적 조성물 및 키트

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN102439137A true CN102439137A (zh) 2012-05-02

Family

ID=42828463

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN2009801585170A Pending CN102439137A (zh) 2009-03-31 2009-03-31 具有诱导癌症特异性免疫反应的能力的树突状细胞的制备方法,包含该树突状细胞的用于预防或治疗癌症或者抑制癌症转移的药物组合物及试剂盒(kit)

Country Status (2)

Country Link
CN (1) CN102439137A (zh)
WO (1) WO2010114185A1 (zh)

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2014149871A1 (en) * 2013-03-14 2014-09-25 Icahn School Of Medicine At Mount Sinai Autologous tumor lysate-loaded dendritic cell vaccine for treatment of liver cancer
CN106604989A (zh) * 2014-08-01 2017-04-26 Jw可瑞基因株式会社 用于制备树突状细胞的方法、由该方法制备的树突状细胞、及其应用
WO2018119610A1 (zh) * 2016-12-26 2018-07-05 广州中科蓝华生物科技有限公司 一种重组质粒、其构建的重组疟原虫及其应用
CN110922492A (zh) * 2019-12-18 2020-03-27 重庆医科大学 融合肽、ctp介导的诱导cml细胞免疫应答的dc疫苗及其制备方法
CN112243382A (zh) * 2018-01-18 2021-01-19 南佛罗里达大学 死抗原刺激的未成熟异源性树突细胞作为疾病治疗剂

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1309417C (zh) * 2001-02-15 2007-04-11 王荣福 穿细胞肽在产生抗肿瘤免疫力上的用途
JP4188909B2 (ja) * 2002-03-29 2008-12-03 クレアゼン インコーポレーテッド 細胞質残留性細胞膜透過ペプチド及びこれの用途｛ＣｙｔｏｐｌａｓｍｉｃＴｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎＰｅｐｔｉｄｅｓａｎｄＵｓｅｓｔｈｅｒｅｏｆ｝

Cited By (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2014149871A1 (en) * 2013-03-14 2014-09-25 Icahn School Of Medicine At Mount Sinai Autologous tumor lysate-loaded dendritic cell vaccine for treatment of liver cancer
US20160008446A1 (en) * 2013-03-14 2016-01-14 Icahn School Of Medicine At Mount Sinai Autologous Tumor Lysate-loaded Dendritic Cell Vaccine for Treatment of Liver Cancer
US10238723B2 (en) 2013-03-14 2019-03-26 Icahn School Of Medicine At Mount Sinai Autologous tumor lysate-loaded dendritic cell vaccine for treatment of liver cancer
CN106604989A (zh) * 2014-08-01 2017-04-26 Jw可瑞基因株式会社 用于制备树突状细胞的方法、由该方法制备的树突状细胞、及其应用
US10478479B2 (en) 2014-08-01 2019-11-19 Jw Creagene Inc. Method for preparing dendritic cell, dendritic cell prepared thereby, and use thereof
CN106604989B (zh) * 2014-08-01 2020-10-16 Jw可瑞基因株式会社 用于制备树突状细胞的方法、由该方法制备的树突状细胞、及其应用
WO2018119610A1 (zh) * 2016-12-26 2018-07-05 广州中科蓝华生物科技有限公司 一种重组质粒、其构建的重组疟原虫及其应用
CN112243382A (zh) * 2018-01-18 2021-01-19 南佛罗里达大学 死抗原刺激的未成熟异源性树突细胞作为疾病治疗剂
CN110922492A (zh) * 2019-12-18 2020-03-27 重庆医科大学 融合肽、ctp介导的诱导cml细胞免疫应答的dc疫苗及其制备方法
CN110922492B (zh) * 2019-12-18 2022-02-15 重庆医科大学 融合肽、ctp介导的诱导cml细胞免疫应答的dc疫苗及其制备方法

Also Published As

Publication number Publication date
WO2010114185A1 (ko) 2010-10-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6134763B2 (ja) ＧＭ−ＣＳＦ及びインターフェロンαを用いて生成され、且つ熱処理され死滅したがん細胞を取り込んだ樹状細胞
KR102190890B1 (ko) 암 치료를 위한 t 세포의 활성화 방법
Wells et al. Combined triggering of dendritic cell receptors results in synergistic activation and potent cytotoxic immunity
Baxevanis et al. Toll-like receptor agonists: current status and future perspective on their utility as adjuvants in improving antic ancer vaccination strategies
AU2006288348A1 (en) Method for activation treatment of antigen-presenting cell
Mineharu et al. Gene therapy-mediated reprogramming tumor infiltrating T cells using IL-2 and inhibiting NF-κB signaling improves the efficacy of immunotherapy in a brain cancer model
Yu et al. Chicken HSP70 DNA vaccine inhibits tumor growth in a canine cancer model
KR20100109099A (ko) 암 특이 면역반응 유도능을 갖는 수지상 세포의 제조 방법,이 수지상 세포를 포함하는 암의 예방, 치료, 또는 전이 억제용 약제학적 조성물 및 키트
BRPI0817535B1 (pt) método in vitro eficiente para obter células apresentadoras de antígenos ativadas (apcs), especialmente células dendríticas (dcs), úteis na preparação de vacinas para o tratamento do câncer
CN102439137A (zh) 具有诱导癌症特异性免疫反应的能力的树突状细胞的制备方法,包含该树突状细胞的用于预防或治疗癌症或者抑制癌症转移的药物组合物及试剂盒(kit)
Salem The use of dendritic cells for peptide-based vaccination in cancer immunotherapy
JP6602377B2 (ja) 樹状細胞の製造方法、これにより製造された樹状細胞及びその用途
KR101911380B1 (ko) 아스파라기닐-β-히드록실라제 발현 종양을 위한 수지상 세포 백신
WO2017177907A1 (zh) 抗免疫检查点pd-l1和pd-l2肿瘤疫苗
JP2024509935A (ja) 免疫細胞療法における両親媒性物質の使用及びそのための組成物
Graham et al. Targeting interferon-alpha to dendritic cells enhances a CD8+ T cell response to a human CD40-targeted cancer vaccine
US10238723B2 (en) Autologous tumor lysate-loaded dendritic cell vaccine for treatment of liver cancer
KR20120027740A (ko) 면역성 펩타이드 및 그 펩타이드를 포함하는 ｈｐｖ 관련 질환 예방 또는 치료용 조성물
WO2017177908A1 (zh) Pd-l1和pd-l2重组蛋白及其用途
Wu et al. Extracellular domain of human 4-1BBL enhanced the function of cytotoxic T-lymphocyte induced by dendritic cell
Shafer-Weaver et al. T cell tolerance to tumors and cancer immunotherapy
CA3028168C (en) Compositions and methods for activating antigen presenting cells with chimeric poliovirus
Shi et al. Cbl-b gene silencing in splenic T lymphocytes as a therapeutic strategy to target the prostate cancer RM-1 cell tumors in immune competent mice
Himoudi et al. Development of anti-PAX3 immune responses; a target for cancer immunotherapy
Xie et al. Inhibitory effects of a dendritic cell vaccine loaded with radiation-induced apoptotic tumor cells on tumor cell antigens in mouse bladder cancer

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C02 Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001)
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20120502