BRPI0817535B1 - método in vitro eficiente para obter células apresentadoras de antígenos ativadas (apcs), especialmente células dendríticas (dcs), úteis na preparação de vacinas para o tratamento do câncer - Google Patents

Abstract

MÉTODO IN VITRO, EM DUAS ETAPAS, PARA OBTER CÉLULAS APRESENTADAS DE ANTÍGENOS ATIVADAS (APCS), ESPECIALMENTE AS CÉLULAS DENDRÍTICAS (DCS),ÚTEIS NA PREPARAÇÃO DE VACINAS PARA O TRATAMENTO DO CÂNCER OU OUTRAS ENFERMIDADES RELACIONADAS AO SISTEMA IMUNOLÓGICO. A presente invenção refere-se a um processo ex vivo, rápido eficiente para obter células apresentadoras de antígenos ativadas que são úteis para terapias contra o câncer e doenças relacionadas ao sistema imunológico. Ao mesmo tempo, ela se refere a uma composição celular que contribui para estimular as células apresentadoras de antígenos ativadas a induzir uma resposta imune especifica contra os tumores em pacientes com câncer ou outras patologias que envolvam respostas imunes.

Description

[001] A presente invenção refere-se a um processo ex vivo, rápido e eficiente para obter células apresentadoras de antigenos ativadas que são úteis para terapias contra o câncer e doenças relacionadas ao sistema imuno- lógico. Ao mesmo tempo, ela se refere a uma composição celular que contribui para estimular as células apresentadoras de antigenos ativadas a induzir uma resposta imune especifica contra os tumores em pacientes com câncer ou outras patologias que envolvem respostas imunes.

Estado da Técnica

[002] Com o aperfeiçoamento de novas tecnologias médicas e a melhoria das condições dos materiais, a expectativa de vida para a população mundial aumentou, especialmente em paises desenvolvidos. Isto resultou em um aumento da incidência de diversos tumores e câncer na população, mostrando um número aumentado total de pacientes que sofrem de câncer, bem como de distúrbios associados ao sistema imunológico.

[003] O câncer é uma patologia na qual as células com uma capacidade descontrolada para o crescimento e o espalhamento são capazes de invadirem os seus órgãos ou tecidos de origem e espalharem-se para o corpo através do sangue ou tecidos linfáticos. A sua expansão anormal destrói os tecidos saudáveis, produzindo desequilíbrios metabólicos e alterando a função dos órgãos, muitas vezes causando a morte. Considerando os desenvolvimentos recentes, o tratamento para esta doença tem sido melhorado. Entretanto, esta patologia ainda permanece uma das causas principais de morte no mundo todo.

[004] Durante os últimos trinta anos, tem sido obtido um grande avanço no entendimento da contribuição do sistema imunológico, em relação ao reconhecimento e à destruição das células tumorais, de modo que a manipulação do sistema imunológico como uma ferramenta antitumoral tornou-se uma alternativa potencial para o tratamento de câncer. A assim chamada terapia imune antitumoral pode ser usada como um complemento para os tratamentos usuais das condições oncológicas, tais como a cirurgia, a quimioterapia e a radioterapia.

[005] Embora alguns tipos de terapia imune já sejam uma parte do tratamento usual de alguns tipos de câncer, existem outros em um estágio de ensaio pré-clinico ou clinico. Entre as estratégias empregadas na terapia imune, o uso de moléculas imunes, tais como os interferons, as interleucinas, os fatores estimuladores de colônias e os anticorpos monoclonais, tem sido de importância vital. Uma estratégia diferente é a imunização ativa contra os tumores, que é comumente conhecida como vacinas de câncer .

[006] As vacinas terapêuticas para os distúrbios de câncer são uma forma de terapia imune especifica, cujo propósito é estimular ou reforçar uma resposta direta do paciente contra o tumor através da imunização, por exemplo, com células tumorais inativadas ou expostas à radia- ção, ou por administração de vacinas contendo antigeno (Ag) .

[007] Os antigenos associados aos tumores ou os anti- genos especificos para os tumores são moléculas de origem protéica principalmente, que são diferencialmente expressas no tecido tumoral e normal, onde elas se tornam um alvo para as respostas imunológicas.

[008] As vacinas de câncer são geralmente fornecidas após o inicio da doença; para este efeito podem ser usadas células atenuadas completas, bem como compostos celulares ou antigenos especificos com o propósito de estimular o sistema imunológico do paciente. Estas vacinas podem ser comumente classificadas como vacinas de células tumorais completas ou preparações de vacinação a partir de antigenos tumorais. As primeiras podem ser divididas em vacinas de células autólogas completas originando-se do paciente propriamente dito e em células alogênicas completas consistindo em uma combinação de células tumorais do mesmo tipo histológico, porém a partir de pacientes diferentes. Estas preparações são manufaturadas em instalações de laboratórios e elas são normalmente combinadas com adjuvante.

[009] Os Ags associados aos tumores podem ser obtidos de células tumorais completas, de proteínas ou peptideos purificados de tumor, de sequências de peptideos artificialmente sintetizadas ou material genético obtido dos tumores.

[0010] Quanto a isto, as vacinas de protei- nas/peptideos especificos são projetadas de antigenos associados aos tumores, que são reconhecidos pelos linfóci- tos T. O peptideo ou a proteína antigênica pode ser administrada purificada ou sintetizada como uma parte da composição da vacina ou por indução da síntese do peptideo ou antígeno tumoral na célula-alvo por transfecção.

[0011] Para introduzir o material genético no corpo, podem ser usados vetores virais, tais como os adenovirus. Embora o adenovirus seja o vírus mais comumente usado, os retrovirus têm também sido usados com ótimos resultados. Estes vetores virais poderiam também codificar genes de citocinas adicionais, além do antígeno associado ao tumor .

[0012] As vacinas de DNA consistindo em plasmídios codificando Ag de tumor têm a vantagem de atuar independentemente do haplótipo do MHC do paciente. Estão sendo atualmente desenvolvidas novas estratégias para este tipo de vacinas envolvendo a fusão de genes, tais como agentes codificadores para determinantes idiotípicos da molécula de imunoglobulina com uma sequência do antígeno de toxói- de titânico, que capacita a ativação dos mecanismos efe- tores do sistema imunológico.

[0013] Uma outra alternativa terapêutica corresponde às vacinas de células dendríticas ou células apresentadoras de antigenos (APC) profissionais, que é uma técnica recentemente incorporada na prática clínica e parece ser interessantemente efetiva para a geração de uma resposta do CTL específica contra os tumores e os agentes infecciosos.

[0014] Apesar da multiplicidade de alternativas em desenvolvimento para o tratamento de tumores, o sucesso da imunoterapia ativa no tratamento de câncer pode ser afetado por múltiplos fatores, tais como a heterogeneidade existente entre as células tumorais, por exemplo, a baixa imunogenicidade dos antigenos tumorais e os mecanismos de evasão imunes desenvolvidos pelos tumores para evitar a resposta imunológica. Os antigenos associados aos tumores - moléculas potencialmente imunogênicas - podem ser alvos efetivos para as vacinas de câncer, porém eles podem também estar presentes em células normais e não serem reconhecidos pelo sistema imunológico por diferentes razões, tais como a expressão oculta devida à orientação fisica ou configuração do Ag sobre a superfície da célula, à separação fisica, à separação por membranas celulares ou mascaramento por outros componentes das células; a expressão antigênica menor do que a requerida para o reconhecimento imune ou uma distribuição da superfície diferente em relação às células tumorais.

[0015] Recentemente, foi descrita a existência de linfócitos reguladores (Treg). Os Tregs são capazes de inibir as respostas imunes e a sua função principal é manter a tolerância para evitar as respostas autoimunes. Há evidência que estas células podem exercer um efeito deletério sobre a geração de respostas antitumorais em pacientes com câncer, o que aumentaria o crescimento do tumor.

[0016] Consequentemente, os objetivos buscados pela terapia imune ativa contra o câncer seriam: superar a supressão imune produzida por fatores que derivam o tumor, aumentar a imunogenicidade dos antígenos que possam auxiliar a eliminar os tumores e a metástase e a recuperação clínica de pacientes, quando tratados com qualquer vacina antitumoral.

[0017] O desenvolvimento de vacinas de células den- dríticas (DC) é uma alternativa explorada com resultados promissores. As DCs são originadas na medula óssea a partir de progenitores pluripotenciais e cerca de 0,5% das células mononucleares do sangue total corresponde à DC em circulação e elas são muito difíceis de manter nas condições de cultura (Fearnley D.B. e col. 1999) . As DCs são um subgrupo de leucócitos com uma grande capacidade de apresentação de antígenos e o potencial de induzir e regular a resposta imune (Svane IM e col. 2003, Banchereau J e col. 2003). As DCs provaram ser as células apresentadoras de antígenos (APC) mais efetivas; este é o motivo pelo qual elas são chamadas ABCs profissionais. Por apresentação dos antígenos intra- e extracelulares, elas são capazes de induzir uma resposta imune específica mediada por CD4* ou CD8*. As DCs estão estrategicamente posicionadas nos tecidos periféricos em áreas possíveis de entrada de antígenos, onde elas são capazes de capturar o processo e apresentá-los associados com moléculas de his- tocompatibilidade (HCM). As DCs compreendem uma população heterogênea com diferentes marcadores de superfície (fe- nótipo) associados com o seu ritmo de maturação. Acredi- ta-se que diferentes estímulos seriam capazes de desencadear processos de maturação qualitativamente diferentes, desse modo sugerindo que as DCs poderiam interpretar os sinais do ambiente, que dependem da natureza dos estimules, e então desenvolverem-se até DCs maduras que são capazes de polarizar a resposta imune de LT em Thl ou Th2 (resposta imune celular ou humoral, respectivamente) ou até um tipo tolerogênico de resposta (Moser M e Murphy KM. 2000) . Durante a transição da maturação, o fenótipo das DCs altera-se, os prolongamentos citoplasmáticos aumentam, bem como os marcadores característicos da DCs imaturas (DCi) diminuem; ao mesmo tempo, a expressão das moléculas coestimuladoras começa a aumentar, tais como a CD40, a CD80 e a CD86, a CD83, as moléculas do MHC de classes I e II e o receptor de quimiocina CCR-7, que reconhece as quimiocinas CCL19 e CCL21, que guiam a migração das DCs para a zona T dos órgãos linfóides secundários, onde pode ser encontrado o clone de LT especifico para o antigeno simples (Mellman I e col. 2001, Delamarre L e col. 2003).

[0018] Visto que a obtenção destas células a partir do sangue periférico é dificil e intensamente laboriosa, foram desenvolvidos diferentes métodos durante a última década para a sua geração in vitro a partir de monócitos, assim permitindo que uma quantidade maior de DCs esteja disponível para estudo e uso em terapias imunes como um tratamento alternativo para o câncer. Durante as últimas duas décadas, foram publicados diferentes ensaios clínicos de vacinação com DCs autólogas em relação ao tratamento do câncer avançado. Na maior parte deles, os pes-quisadores utilizam DCs geradas de monócitos de CD14+ ou células progenitoras de CD34+ cultivadas por sete a dez dias em um meio de cultura suplementado com colônias de granulócitos e macrófagos de fatores estimuladores (GM- CSF) e interleucina-4 (IL-4), adicionando o fator de necrose tumoral alfa (TNF-oc) como um estimulo de maturação (Sallusto F. e col. 1994, Svane IG. e col. 2003) . Foi proposto, entretanto, que a geração de DCs maduras in vitro é possível em períodos mais curtos. As FASTDC são obtidas em 48 horas, usando uma combinação de fatores pró- inflamatórios, como IL-6, IL-lβ, prostaglandina E2 e TNF- oc (Dauer e col. 2003), como estímulos de maturação. As APCs de três dias (3 dias) são geradas por mistura de macrófagos e células de Langerhans obtidas por uma combinação de GM-CSF e TNF-oc, descrita no pedido internacional W02004/050855. Embora estes protocolos encurtem o tempo de produção das DCs, as suas desvantagens são o alto custo derivado do uso de citocinas recombinantes humanas, a adição adicional necessária de antigenos capazes de estimular as respostas imunológicas contra os tumores e, em alguns casos, os niveis mais baixos de capacidade de maturação das DCs, que limita o seu uso clinico devido ao risco potencial de evasão do tumor ou indução da tolerância .

[0019] Outros estudos recentes estabelecem que a população diversa de DC sobre a periferia deriva-se de mo- nócitos que infiltram os tecidos devido aos estímulos inflamatórios, provavelmente mediados pela imunidade natural (Palucka KA e col. 1998). Este processo de diferenciação de monócitos in vivo é efetuado nos estágios iniciais da resposta imunológica para permitir, em menos que uma semana, uma resposta efetiva mediada por linfócitos T (Gwendalyn J. e col. 1998). Os métodos atuais de produção de DCs envolvem períodos de incubação in vitro de diver-sos dias, o que reduz a resistência, a viabilidade e a qualidade das DCs, ou usam um grupo complexo de fatores recombinantes pró-inflamatórios que geram um tipo de APC que é desconfiado por alguns de suas características fe- notipicas associadas com monócitos ativados, DCs imaturas e macrófagos; este é o motivo pelo qual o seu uso terapêutico contra infecções ou tumores está limitado devido à possibilidade de indução da tolerância (J Immunol. 2004, Dauer M, e col. 2003) . Há evidência na literatura que os monócitos ativados e as DCs imaturas têm a capacidade de reagir ao estimulo de moléculas chamadas padrões moleculares associados ao patógeno, PAMPs, através de receptores de reconhecimento de padrão, PRRs (Steinman RM e col. 2006) . Existem diversos ligantes dos PRRs e eles existem não somente em patógenos, porém como moléculas endógenas expressas principalmente em células transformadas, infectadas ou estressadas e são capazes de ativar os PRRs .

[0020] Entre as experiências desenvolvidas para obter DCs carregadas com antígenos, o método descrito na US20020155108 consiste em uma cocultura de DC ex vivo, efetuada juntamente com antígenos solúveis, sem contato fisico, um anticorpo é incluído contra o antigeno solúvel para formar complexos imunes, os quais as DCs são capazes de absorver, processar e apresentar sobre a superfície da célula.

[0021] No pedido de patente japonês JP2000143534, divulga-se um método para obter vacinas de DC com atividade apresentadora de antígeno. O método mencionado consiste em incubar uma DC com atividade apresentadora de antige- no. O método mencionado consiste em incubar uma DC com atividade apresentadora de antigeno com os seguintes componentes: uma suspensão de células contendo um precursor celular de DC, por exemplo, as células da medula óssea, as células sanguineas do cordão umbilical ou os monócitos do sangue periférico; um agente indutor da diferenciação, por exemplo, as combinações de GM-CSF, IL-4, TNF-oc, fatores de células-tronco e TNF-oc; e uma quimiocina.

[0022] Além disso, o W002053176 descreve um método para produzir APCs autólogas carregadas com uma mistura de pelo menos dois lisados de células tumorais de melanoma alogênico. A maturação da DC é induzida com TNF, pros- taglandina E2 e/ou ácido polirribocitidilico.

[0023] A US 2007/0014796 descreve, por sua vez, um método para a ativação de células apresentadoras de antigenos, as quais poderiam ser as DCs.

[0024] Nos resultados publicados de López M: e col (Rev Méd Chile 2004; 132: 1115-1126) e Escobar e col. (Clin. Exp. Immunology 2005; 142(3): 555-568), os autores demonstram um procedimento para a produção de DCs a partir de monócitos por incubação durante 7 dias e uma incubação posterior com TNF-oc e com lisado tumoral de três linhagens de melanoma alogênico. Além disso, Nestle FO e col. (Nature Medicine N 4, 328 - 332 (1998) divulgam um estudo clinico onde as DCs são induzidas por cultura de monócitos por também durante sete dias com GM-CSF, IL-4 e um lisado de células tumorais ou um grupo de peptideos conhecidos, identificados través do reconhecimento por linfócitos T citotóxicos.

[0025] O estado da técnica nos permite identificar algumas deficiências e limitações que resultam em obstáculos para o desenvolvimento e a aplicação prática da tecnologia divulgada nestas invenções. Por um lado, os métodos descritos requerem uma preparação dificil e demorada destas células, até 8 a 9 dias no total. Além disso, estas tecnologias resultam no envelhecimento das células, o que pode encurtar a sua sobrevivência no corpo após a sua injeção ou pode afetar a sua funcionalidade. Além do acima mencionado, estas tecnologias também envolvem uma diferenciação lenta das células, o que não reflete um processo natural, visto que se sabe que os monócitos que se diferenciam in vivo em DCs são capazes de fazer isto em horas e não dentro de 3 ou mais dias (Randolph GJ, Science 1998).

[0026] A partir do ponto de vista metodológico, os métodos descritos na técnica proporcionam tanto desvantagens de operação, quanto ineficiências, comparados com esta invenção. Primeiramente, as DCs clássicas requerem um tempo de incubação in vitro mais longo (7-9 dias), o que aumenta o custo de produção, aumentando o uso de reagentes que atuam como fatores de diferenciação e meios de cultura, além de um risco aumentado de infecção ou morte da célula. Em segundo lugar, nos processos descritos no estado da técnica, a taxa de DCs obtidas a partir de células mononucleares do sangue (PBMC) é pelo menos três vezes menor do que a obtida por utilização do método proposto nesta invenção. Ademais, as APCs obtidas de acordo com esta invenção têm características que as tornam mais efetivas de serem usadas como terapia antitumor em pacientes com câncer.

[0027] Consequentemente, para otimizar a geração in vitro de APCs, esta invenção refere-se a um extrato ou lisado de tecido ou células tumorais e a um método rápido e efetivo de produzir APCs, a partir de monócitos do sangue periférico pré-ativados por citocinas de diferenciação e maturados com componentes de lisado de células do tecido tumoral. Os lisados obtidos através de nosso tratamento têm uma função dupla: por um lado, eles são capazes de induzir a diferenciação e a maturação dos monócitos ativados em APCs altamente similares às DCs maduras e eles são também capazes de proporcionar uma faixa ampla de antigenos de tumor capazes de induzir a ativação dos linfócitos T com o potencial de reconhecer e destruir as células tumorais.

Descrição das Figuras

[0028] As figuras descritas abaixo são propostas para mostrar a informação de fundamento para suportar e descrever a invenção; portanto, elas não são pretendidas para restringir e não devem, de modo algum, ser entendidas como limitando o escopo do desenvolvimento proposto.

[0029] A figura 1 corresponde a uma tabela mostrando uma avaliação comparativa da eficiência entre o método proposto neste documento de diferenciação rápida das cé- lulas dendríticas (DC Rápida), comparado ao método tradicional de produção de DCs de sete dias (DC-padrão) . Observa-se que a partir do mesmo número de células do sangue periférico (PBMC), obtém-se quase 4 vezes a quantidade de DCs quando se usa o método proposto nesta invenção, que, por sua vez, permite obter uma quantidade maior de doses para a vacinação dos pacientes. Também, o uso de menos fatores de diferenciação e meio de cultura, as instalações e o custo de produção são reduzidos para a metade do valor.

[0030] A figura 2 mostra a expressão dos antigenos associados ao melanoma expressos em algumas linhagens de melanoma, usadas para obter um extrato ou lisado de células tumorais compreendendo parte da invenção. A expressão dos antigenos associados ao melanoma foi determinada por imunoistoquimica (*), citometria de fluxo (#) ou RT-PCR (§) . A combinação destas linhagens completamente é capaz de expressar uma ampla faixa de antigenos de melanoma.

[0031] A figura 3 mostra a morfologia das células dendriticas de diferenciação rápida (DC rápida) pertencentes a esta invenção, que não difere da morfologia das DCs-padrão (7 dias). As DCs são identificadas com setas.

[0032] A figura 4 mostra monócitos incubados com GM- CSF e IL-4 e estimulados com um lisado obtido a partir da mistura das linhagens de melanoma Mel 1, Mel 2 e Mel 3, chamadas TRIMEL, e TNF-oc. Estas células desenvolvem o fe- nótipo característico das DCs maduras dentro de 48 horas (DC rápida). (a) Conforme descrito daqui por diante nesta invenção, as DCs Rápidas foram geradas e coloridas com anticorpo monoclonal (MAb) anti-CDllc (marcador de DCs mielóides) conjugado com PE, para serem então lidas através de citometria de fluxo. A população com barreira representa a porcentagem de células CDllc positivas a partir das células totais obtidas após a cultura (a figura é a coloração representativa de 5 pacientes diferentes). (b) As CDllc+ DCs foram analisadas quanto à expressão de CD83, CD86, CCR7, CD40, MHC de classe I e MHC de classe II. A análise da expressão destes marcadores indicou que as DCs Rápidas tinham o fenótipo característico das células dendriticas maduras.

[0033] A figura 5 mostra imagens ilustrando que as células obtidas através do método de DC Rápida tinham um fenótipo similar às células obtidas pelo protocolo de FastDC curto, bem como às DCs de 7 dias tradicionais. Os monócitos incubados com GM-CSF e IL-4 por 24 horas foram cultivados por 24 horas adicionais com meio de cultura sozinho, TNF-a, TRIMEL sozinho, TNF-a e lisado de tumor TRIMEL ou IL-lβ + IL-6 + TNF-a + PG-E2 (células DC Rápida) . (a) A expressão de marcadores de DCs mielóides, CDllc+ e marcadores de maturação de DCs, tais como CD86 e CD83, foi determinada por citometria de fluxo, (b) Conforme descrito daqui por diante nesta invenção e no estado da técnica, as DCs Rápidas e as DCs de 7 dias tradicionais foram geradas e os marcadores a seguir foram determinados por citometria de fluxo: CDllc, MHC de classe I, MHC de classe II e CD83. Os histogramas representativos de 2 experimentos independentes mostram a célula CDllc+. As barras representam a MFI de células CDllc positivas. Estes resultados mostram que, com um método mais curto e usando poucos fatores, as DCs são obtidas com características similares aos protocolos mais complexos, descritos no estado da técnica.

[0034] A figura 6 mostra que a combinação do lisado de melanoma chamado TRIMEL com o TNF-a induz a DC Rápida a um processo de maturação eficiente. A avaliação é feita através de análise por citometria de fluxo dos marcadores CDllc, CD86 e CD83 de monócitos tratados por 24 horas com IL-4 e GM-CSF e sem um estimulo posterior, somente estimulados com TRIMEL ou TNF-a ou com TRIMEL e TNF-a. As barras representam a porcentagem de MFI de células CDllc positivas. Este resultado também indica que o lisado de tumor chamado TRIMEL é capaz, por si mesmo e sem o TNF-a, de induzir a expressão dos marcadores associados com as DCs maduras.

[0035] A figura 7 mostra que os lisados de células normais não são capazes de induzir a maturação das DCs Rápidas. Os lisados foram preparados a partir de PBL au- tólogos e alogênicos e eles foram usados para estimular as DCs Rápidas. A expressão dos marcadores CDllc, CD86 e CD83 foi medida por citometria de fluxo. As barras representam a porcentagem de fluorescência no que diz respeito à fluorescência máxima das células CDllc positivas. (PBL: linfócitos do sangue periférico). Este resultado indica que o processo de maturação dos monócitos depende de fa-tores que estão presentes no lisado de tumor e não nas células normais.

[0036] A figura 8 mostra que o lisado de tumor que não o TRIMEL, feito de outras três linhagens celulares de melanoma, é também capaz de induzir o processo de maturação das DCs Rápidas. Um lisado de tumor chamado lisado NO TRIMEL foi preparado a partir de 3 linhagens celulares, EM 55 (melanoma da pele) , OCM-1 e OCM-3 (melanoma do olho) e o efeito indutor da maturação foi avaliado sobre os monócitos. A expressão dos marcadores CDllc, CD83 e MHC II foi determinada por citometria de fluxo. Os niveis de marcadores de maturação são similares àqueles obtidos usando o TRIMEL. Este resultado indica que a combinação de diferentes lisados de melanoma, obtidos de diferentes indivíduos, é capaz de induzir o processo de maturação dos monócitos em DCs maduras. Isto prova que os componentes variados presentes nas células tumorais, tais como o melanoma, são úteis para a execução e o desempenho adequados desta invenção.

[0037] A figura 9 mostra que as DCs Rápidas têm uma baixa capacidade de endocitose, similar às DCs maduras tradicionais, que é uma indicação que as DCs Rápidas estão em uma fase final de diferenciação, ou seja, ótima para a indução da ativação dos linfócitos T. Efetuou-se um ensaio de fagocitose com a Dextrana ligada ao FITC e os resultados foram medidos por citometria de fluxo. Como um controle da endocitose passiva, as células foram mantidas a 4°C.

[0038] A figura 10 mostra que a DC Rápida secreta as citocinas IL-12 e IL-10. (a) Razões diferentes de células DCs Rápidas foram cocultivadas com fibroblastos, que expressam a CD40L - constitutivamente - por 12 horas. Um ensaio ELISA foi efetuado no sobrenadante da cocultura para determinar a concentração de IL-12 p70 secretada. (b) Os monócitos do sangue periférico foram incubados por 24 horas com GM-CSF e IL-4 e então estimulados com TNF-a, TRIMEL ou TNF-a e TRIMEL por 24 horas adicionais. Um ensaio ELISA foi efetuado no sobrenadante da cultura para determinar a concentração de IL-10 secretada. A secreção destas citocinas, especialmente a IL-12, indica que as DCs Rápidas são capazes de induziras respostas do tipo Thl, descritas como muito efetivas contra tumores.

[0039] A figura 11 mostra que os LTs estimulados com a DC Rápida reconhecem as células de melanoma. Os PBL au- tólogos foram cocultivados por 12 horas com a DC Rápida, as células de melanoma alogênicas (Mel 1, Mel 2 e 0505 Mel), o protótipo sensivel a NK chamado K562 e o fi- broblasto de rato (NIH 3T3) . A secreção de IFN-y foi determinada por ELISPOT. Este resultado mostra que as DCs Rápidas são capazes de estimular os linfócitos T in vitro com atividade antitumor.

[0040] A figura 12 mostra os resultados de um ensaio clinico de Fase I usando a DC Rápida para o tratamento de 9 pacientes com melanoma avançado maligno, dois pacientes com carcinoma pulmonar, um com câncer ovariano, um com carcinoma colorretal e um com câncer da próstata. Nenhum dos pacientes tratados mostrou efeitos adversos importantes, e somente em alguns pacientes observaram-se a vermelhidão da área de injeção e a erupção cutânea local, que proporcionam evidência que o tratamento é biologicamente seguro e bem tolerado. Além disso, 70% dos pacientes de- senvolveram uma resposta in vivo de hipersensibilidade retardada tipo IV (DTH), especifica contra os antigenos de tumor, o que excede os estudos publicados antes (Escobar e col. Clin, and Exp. Immunol. 2005) onde as DCs- padrão produziram resposta imunológica em 50% dos pacientes .

Descrição da Invenção

[0041] Por um lado, esta invenção refere-se a um extrato de células e/ou tecidos tumorais com a capacidade de induzir a diferenciação e a ativação das APCs. Um outro aspecto da invenção, por sua vez, está relacionado a um método de produzir DCs ex vivo a partir de monócitos do sangue periférico em um tempo mais curto, comparado com o estado da técnica, onde utiliza-se o extrato antes mencionado. As DCs produzidas neste modo são úteis para compor uma composição terapêutica como uma vacina, que é útil no tratamento de câncer e outras doenças relacionadas .

[0042] O método utiliza células sanguíneas comuns, obtidas de pacientes, doadores ou bancos de sangue, entre outras fontes, a partir dos quais as células mononuclea- res são separadas. Então, os monócitos são selecionados e incubados com fatores do crescimento e citocinas a serem então expostos a um lisado de tumor, preferivelmente na presença de um fator do crescimento. Sob estas condições, e em menos do que três dias após o cultivo ex vivo, preferivelmente dentro de 48 horas de cultura ex vivo, estas células expressam marcadores associados com as células dendriticas maduras tradicionais e adquirem a capacidade de induzir respostas a partir de linfócitos citotóxicos antitumor in vitro e geram respostas imunológicas in vivo em pacientes vacinados com estas células.

[0043] O lisado de células tumorais poderia ser obtido por meios diferentes. Em uma abordagem para a invenção, o lisado de células tumorais contém uma mistura de pelo menos dois extratos de células tumorais mantidos sob cultura. Em uma outra abordagem para a invenção, o lisado de células tumorais é obtido a partir de tecido tumoral novo obtido de pacientes com diferentes tipos de câncer, tais como melanoma e melanoma uveal, próstata, rim, co- lorretal, gástrico, pulmonar, mama, ovariano, carcinomas do testículo e outros tipos de neoplasma.

[0044] Em uma outra abordagem para a invenção, o lisado de células tumorais é obtido de tecido tumoral novo obtido de pacientes com diferentes tipos de câncer, combinado com lisado de linhagens celulares tumorais alogê- nicas do mesmo tipo de tumor.

Descrição Detalhada da Invenção

[0045] No contexto desta invenção, foi desenvolvido um método rápido, eficiente e de custo compensador, para permitir a criação de células apresentadoras de antigenos, similares às DCs, a partir de monócitos do sangue periférico, de modo que elas possam, em um curto tempo, expressar os marcadores de superfície consistentes com a sua função. Elas são também capazes de desencadear uma resposta imune quando elas entrarem em contato com os outros componentes do sistema imunológico de um organismo.

[0046] Por um lado, esta invenção utiliza células ob- Pettão 8702001 tidas do sangue de pacientes, doadores ou bancos de sangue, que são separadas dos outros componentes do sangue através dos métodos tradicionais da técnica; preferivelmente a leucaferese. Em particular, os leucócitos são selecionados através dos métodos usuais conhecidos na técnica, tais como o gradiente de densidade, por exemplo. A partir da fração de leucócitos, os monócitos são separados através dos métodos tradicionais, conhecidos por qualquer especialista na técnica. Em uma modalidade preferida, utiliza-se a capacidade dos monócitos de aderir às superficies plásticas. Em uma outra modalidade, a seleção dos monócitos pode também ser efetuada por kits de separação, que utilizam anticorpos contra a molécula de CD14 acoplada a glóbulos magnéticos para a seleção magnética do tipo celular desejado.

[0047] Em uma modalidade preferida da invenção, as células mononucleares do sangue periférico são incubadas a 13 x 106 células por ml, embora as concentrações entre 104 e 1010, preferivelmente entre 105 e 107, sejam também permitidas, em um meio de cultura livre de soro fetal bovino. A cultura pode ocorrer em recipientes apropriados, tais como as placas com números de poços diferentes, os frascos, os reatores de células e outros. As temperaturas entre 30 e 40°C são toleradas; preferencialmente 37°C em uma atmosfera de cerca de 5% de CO2 devem ser usados por 1 a 4 horas, com um tempo ideal de cerca de 2 horas.

[0048] As células que permaneceram unidas ao recipiente (poço) correspondem aos monócitos, e são mantidas sob cultura na presença de 100 a 800 U/ml, preferivelmen- te entre 400 e 600 e com uma concentração ideal de 500 U/ml de citocinas, tais como as interleucinas, preferencialmente a IL-4; e na presença de 500 a 1.100, preferivelmente entre 700 e 900 e mais preferivelmente como uma concentração ideal em torno de 800 U/ml de pelo menos um fator do crescimento, mais preferivelmente o GM-CFS. A incubação pode ser estendida por pelo menos 10 horas, embora os tempos de incubação de mais do que 18 horas sejam preferidos, atingindo um tempo ideal de cerca de 22 horas .

[0049] Então, as células podem ser incubadas por pelo menos 10 horas mais, idealmente 18 horas, e preferencialmente por cerca de 24 horas. Neste segundo ciclo de incubação, as células são mantidas em meio de cultura sozinho, ou idealmente suplementado com um fator do crescimento, como o TNF-a, ou com a mistura de lisado de células tumorais descrita acima, ou com ambos os componentes ao mesmo tempo. Em uma outra modalidade da invenção, a mistura de lisado de células tumorais descrita acima pode ser combinada com outras citocinas pró-inflamatórias, tais como o IFN-y, a IL-6, a IL-lβ, ou outros fatores como a prostaglandina E2, a CpG, as proteínas do choque térmico, os ligantes dos receptores Toll-like (TLR) ou outros fatores que ativam a maturação das DCs.

[0050] Em relação ao uso dos fatores do crescimento, o TNF-a poderia ser usado em uma concentração entre 100 pg/ml a 100 ng/ml, idealmente entre 1 ng/ml a 50 ng/ml, mais preferivelmente entre 2 ng/ml a 20 ng/ml e idealmente em torno de 10 ng/ml.

[0051] Uma parte integral e essencial desta invenção é a mistura de lisado ou extratos de células tumorais. Esta é uma mistura composta por pelo menos duas linhagens celulares de tumores a partir de tecido metastático que se deriva de pacientes com câncer. Em uma modalidade preferida da invenção, as células tumorais são selecionadas a partir de melanomas malignos e correspondem a três linhagens celulares, preferivelmente derivando-se da metás- tase da glândula. Em uma outra alternativa proporcionada pela invenção, o lisado de células tumorais é obtido a partir de célula tumoral nova derivada de pacientes com tipos diferentes de câncer, combinado ou não com lisado de linhagens celulares tumorais alogênicas do mesmo tipo de tumor. O fenótipo das células usadas é confirmado através de técnicas convencionais para determinar a expressão de antigenos associados ao tumor. As células ou os tecidos são então incubados entre 15 minutos e 4 horas, com uma escolha adequada de tempo preferida de 1 e 3 horas, idealmente em torno de 2 horas, em uma temperatura que varia entre 39 e 44°C, mais preferivelmente entre 40 e 43°C e preferencialmente próximo a 42°C, em um meio de cultura sem soro. Posteriormente, as células e/ou os tecidos são colocados na temperatura fisiológica novamente, ou seja, em torno de 37°C, por 1 a 6 horas, idealmente entre 2 e 4 horas, preferencialmente 3 horas, antes de serem lisados.

[0052] As células tratadas neste modo são submetidas a 1 a 6 ciclos de congelamento e descongelamento, preferivelmente 2 a 4 ciclos, e idealmente são usados 3 ci- cios. Para cada ciclo de congelamento, as células são introduzidas em um tanque contendo nitrogênio liquido, que as congela imediatamente, e então descongeladas até 35° a 40°C.

[0053] O lisado ou o extrato obtido é submetido à ho-mogeneização por ultrassom, por 2 a 10 ciclos de 30 segundos, a 30 a 40 KHz, em um sonicador padrão. Finalmente, o lisado ou o extrato de cada tecido é irradiado em doses variando entre 40 e 120 Gy, preferivelmente entre 70 e 90 Gy e preferencialmente em torno de 80 Gy. Posteriormente, o lisado pode ser misturado ou não em partes iguais ou usado individualmente, dependendo do tipo de tumor a ser tratado. O lisado ou o extrato obtido é usado na cultura de células dendriticas em uma concentração entre 1 p.g/ml e 1 mg/ml e idealmente em torno de 100 p,g/ml.

[0054] Um desenvolvimento muito importante desta invenção é que o extrato de lisado de células tumorais descrito é capaz de estimular a diferenciação das células dendriticas a partir de monócitos pré-ativados, com cito- cinas de diferenciação. Esta indução da maturação e a diferenciação ocorrem mesmo na ausência de outras citocinas ou fatores de maturação existentes no estado da técnica. Nestes casos, observou-se que após 24 horas de tratamento com o lisado, os monócitos mostraram uma morfologia equivalente às DCs classicamente incubadas por 7 dias (figura 3), o que confirma as vantagens do método proposto e as qualidades notáveis do extrato desenvolvido. Também, os monócitos ativados com os extratos de células tumorais mostraram a expressão do marcador de membrana CDllc, que é característica das DCs do tipo mielóide, além da expressão de diversos marcadores de membrana característicos das DCs maduras, tais como MHC I e MHC II, CD83, CD86, CD40 e CCR7 (figuras 4 a 6) .

[0055] De importância fundamental é que a maioria do lisado de tumor, e não o lisado de células normais, é capaz de induzir esta diferenciação e maturação, que é uma propriedade que não tinha sido descrita para as células tumorais (figura 7) . Uma característica-chave desta invenção está, na verdade relacionada à função desempenhada pelos componentes das células tumorais na diferenciação dos monócitos em DCs e a sua maturação posterior. Há, entretanto, alguma informação de base no estado da técnica sobre a capacidade de algumas células tumorais necróticas de induzir a maturação das DCs (Bhardwaj N. e col 2000, J Exp Med. 191:411-6; Escobar e col. 2005, Clin. Exp. Immunol. 142:555-68), porém não há nenhuma evidência com respeito ao efeito destas células e de seus componentes em induzir também a diferenciação dos monócitos em DCs. Nesta invenção, descreve-se que o lisado de tumor e/ou uma mistura deles é capaz de atuar sobre os monócitos, induzindo a sua diferenciação em células apresentadoras de antígenos profissionais, similares às DCs, e dando a elas a capacidade de ativar a resposta imune mediada por lin- fócitos T contra as células tumorais, assim tendo um grande potencial terapêutico.

[0056] Um outro aspecto da invenção refere-se à composição farmacêutica ou vacina obtida com as DCs produzidas sob os métodos descritos acima. Esta invenção proporciona evidência que as DCs obtidas sob o método pelo presente inventado, correspondendo à DCs de diferenciação rápida, têm a capacidade de induzir respostas antitumor imunes potentes. Esta qualidade é refletida no fato que os linfócitos T cocultivados com as DCs rápidas são capazes de produzir citocinas inflamatórias, tais como o in- terferon-y e o TNF-a, e reconhecer e destruir as linhagens de melanomas alogênicos através da citólise (figura 11). Também as células obtidas através do método descrito neste documento são capazes de induzir a proliferação de linfócitos T específicos contra as células tumorais.

[0057] Um outro resultado fundamental da invenção corresponde ao uso das células dendriticas obtidas sob o método da invenção em pacientes com melanoma, outros tipos de câncer ou um outro tipo de doenças associadas às respostas imunes (figura 12).

Exemplo 1

[0058] O método desta invenção permite obter DCs que podem ser incorporadas nas vacinas para tratar indivíduos sofrendo de diferentes tipos de câncer. Neste sentido, para tratar os pacientes que sofrem destas doenças, o sangue é obtido através de um método-padrão para obter subprodutos sanguíneos, chamado leucaferese. Um volume igual a 2 volemias de sangue é obtido de cada paciente. O sangue é processado em um laboratório de risco biológico. O produto da leucaferese é diluido em DBS em uma diluição de 1:1. Então, este produto é separado por um gradiente de densidade chamado Lymphoprep®, conforme descrito no estado da técnica. A fração branca do sangue consistindo nas células mononucleares do sangue periférico (PBMC) é lavada três vezes com PBS e então colocada em frascos de cultura (Nunc T75), em uma concentração que varia entre 10 e 40 x 106 de PBMC/ml de um meio de cultura sem soro, as concentrações entre 20 e 30 x 106 de PBMC/ml de um meio são usadas e idealmente 25 x 106 de PBMC/ml de um meio (sem soro). Em um outro protocolo permitido dentro dos parâmetros da invenção, as PBMCs são cultivadas em reatores de células ou em frascos do tipo cilindro ou sacos de cultivo, mantendo a concentração indicada acima. O cultivo é suplementado com citocinas, tais como IL-4 e GM-CSF, conforme já descrito. Vinte e duas horas após o cultivo, os fatores de maturação são adicionados, que correspondem ao lisado de tumor sozinho ou na presença de citocinas e/ou fatores de diferenciação, preferivelmente o TNF-a, como já descrito. Após 24 horas adicionais de incubação e cerca de 48 horas após o inicio da cultura, as DCs são coletadas, lavadas e congeladas em 1 ml de meio de congelamento em criofrascos, em doses entre 1 e 50 x 106 de DCs, preferivelmente entre 20 e 30 x 106 em 500 |il de meio de congelamento. O meio de congelamento consiste em 90% de plasma autólogo sem suplemento, tratado a 56°C para a inativação do complemento por 20 minutos, e 10% de sulfóxido de dimetila (DMSO) . Os frascos são então congelados usando câmaras de congelamento de isopropanol e mantidos em nitrogênio liquido. Para a va-cinação, o frasco é descongelado a 37°C e misturado com 150 pil de adjuvante de KLH (hemocianina que deriva do molusco lapa do buraco da fechadura), em uma concentração de 1 p,g/ml e injetado de modo intradérmico em um dos membros do paciente. Este processo pode ser repetido entre 2 e 10 vezes, preferivelmente entre 3 e 5 vezes e idealmente 4 vezes, em intervalos de 7 a 30 dias, preferivelmente 10 dias. Cada terapia imune consiste em 4 ciclos de imunização que podem ser repetidos de 6 em 6 meses ou de ano em ano, de acordo com a decisão do médico assistente. A maioria dos pacientes imunizados sob este método mostra a presença de linfócitos T específicos contra tumores, detectados através de ensaios de secreção de citocinas, e desenvolve, após a imunização, reações de hipersensibili- dade retardada tipo IV na pele contra o lisado de tumor, o que mostra a resposta imunológica de memória contra as células tumorais.

Exemplo 2

[0059] O processo de produção das células apresentadoras de antígenos, chamado DC Rápida, é descrito acima. O método é rápido, eficiente e de custo compensador, desse modo permitindo a criação de células apresentadoras de antígenos similares às DCs a partir de monócitos do sangue periférico, de modo que, em um curto tempo, elas podem expressar os marcadores da superfície de acordo com a sua função e são capazes de desencadear uma resposta imune .

[0060] Sob este método, são obtidos leucócitos a partir do sangue através da leucaferese. Estas células são separadas através de gradiente de densidade usando Lym- phoprep®, para eliminar o excesso de células vermelhas. A partir da fração de leucócitos, os monócitos são separados usando a sua capacidade característica de aderir ao plástico.

[0061] Então, as células mononucleares do sangue periférico são incubadas em uma concentração de 13 x 106 de células por ml, em um meio de cultura sem o soro fetal bovino, chamado AIM-V (Life Technologies, EUA). A cultura é feita em poços, a 37°C, em uma atmosfera de cerca de Side CO2, por 2 horas.

[0062] As células que permanecem aderidas ao poço correspondem aos monócitos, e são mantidas sob cultura na presença de 500 U/ml de IL-4; e 800 U/ml de GM-CFS. As células permanecem sob as condições de cultura acima mencionadas por cerca de 22 horas.

[0063] Então, as células são incubadas por pelo menos 24 horas adicionais. Neste segundo ciclo de incubação, as células são mantidas em um meio suplementado com 10 ng/ml de TNF-oc, e com a mistura de lisado de células tumorais, como descrito nesta invenção.

[0064] Após 48 horas do início da cultura, as células obtidas são separadas. A sua morfologia é equivalente àquela das células DCs obtidas através de outros métodos. Estas células são lavadas e congeladas para seu uso posteriormente .

Exemplo 3

[0065] Sob esta invenção, descreveu-se que pode ser usada uma mistura de lisado ou extratos de células tumorais nesta invenção, para induzir as DCs. Esta mistura é manufaturada a partir de três linhagens celulares de melanoma, obtidas do tecido metastático de pacientes com melanoma maligno, que serão chamadas TRIMEL. As células usadas são checadas através de técnicas convencionais, para determinar a expressão dos antigenos associados ao melanoma. As células ou os tecidos são então incubados por 2 horas, em uma temperatura de 42°C, em um meio de cultura sem soro. Posteriormente, as células e/ou os tecidos são colocados em temperatura fisiológica novamente, próxima a 37°C por 3 horas, antes de serem lisados.

[0066] As células tratadas neste modo são submetidas a 3 ciclos de congelamento e descongelamento. Para cada ciclo de congelamento, as células são introduzidas em um tanque contendo nitrogênio liquido, sendo imediatamente congeladas, e elas são então descongeladas a 37°C.

[0067] O lisado ou o extrato obtido é submetido a uma homogeneização de 4 ciclos de ultrassom por 30 segundos (40 a 40 KHz) em um sonicador-padrão. Finalmente, o lisado ou o extrato de cada tecido é irradiado em doses de 80 Gy. Os lisados são misturados em partes iguais e usados para a ativação in vitro de monócitos de pacientes com melanoma. 0 lisado ou o extrato obtido pode ser usado para a cultura de células dendriticas.

Exemplo 4

[0068] Em pacientes com câncer de próstata e cólon, utiliza-se um protocolo de produção de APC similar ao descrito acima. O lisado de melanoma é substituído por um outro composto por duas linhagens de carcinoma da próstata e um lisado da próstata autólogo ou linhagens celulares e tecido de carcinoma do cólon. Após o mesmo esquema de vacina como descrito acima, uma resposta de DTH foi induzida contra o lisado de tumores da próstata e cólon. Nas avaliações clinicas, observou-se uma redução dos ní-veis de antígenos da próstata PSA após o tratamento. Considerando que os niveis de PSA plasmático sempre se correlacionam com o progresso da doença, estes resultados indicam que o procedimento efetuado nesta invenção permite obter DCs de alta qualidade e eficientes para a terapia imune. Ele também proporciona evidência que a mistura do lisado ou dos extratos de células tumorais, bem como o seu processo de obtenção sob esta invenção, são úteis para obter DCs.

Claims (19)

1. Método in vitroeficiente para obter células apresentadoras de antigenos ativadas (APCs), especialmente células dendriticas (DCs), úteis na preparação de vacinas efetivas para o tratamento do câncer, compreendendo: a) obter monócitos de células do sangue periférico (PBMC); o método caracterizadopor compreender: b) pré-ativar os monócitos obtidos da etapa a) em conjunto com um fator estimulante de colônias de granulócitos e macrófagos (GM-CSF) e interleucina-4 (IL-4) por 10 a 24 horas; c) incubar monócitos ativados obtidos da etapa b) com um lisado obtido de pelo menos duas linhagens celulares de tumor que foram pré-tratadas termicamente, durante 10 a 24 horas, e, opcionalmente, por adição de fator de necrose tumoral alfa (TNF-a); e d) coletar e lavar as APCs obtidas da etapa anterior; em que na etapa c) , a referida etapa de pré-tratamento do tecido tumoral compreende incubação a uma temperatura entre 41 a 43°C por 15 minutos a 1 hora em um meio de cultivo livre de soro, e, posteriormente, incubação a 37°C durante 1 a 6 horas, obtendo uma viabilidade celular maior que 80% sem sinais de necrose celular.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que na etapa c) , o referido lisado é obtido de três linhagens celulares de tecido tumoral.

3. Método, de acordo com a reivindicação 2, caracterizadopelo fato de que na etapa c) , o referido lisado é obtido a partir de linhagens celulares tumorais alogênicas.

4. Método, de acordo com a reivindicação 3, caracterizadopelo fato de que na etapa c) , o referido lisado é obtido a partir de linhagens celulares tumorais alogênicas do mesmo tipo tumoral.

5. Método, de acordo com a reivindicação 4, caracterizadopelo fato de que na etapa c) , o referido lisado é obtido a partir de linhagens celulares de melanomas.

6. Método, de acordo com a reivindicação 5, caracterizadopelo fato de que na etapa c) , o referido lisado é obtido a partir de linhagens celulares de melanomas malignos.

7. Método, de acordo com a reivindicação 6, caracterizadopelo fato de que na etapa c) , o referido lisado é obtido a partir de uma linhagem de melanoma cutâneo e duas linhagens distintas de melanoma ocular.

8. Método, de acordo com a reivindicação 2, caracterizadopelo fato de que na etapa c) , o referido lisado é obtido a partir de duas linhagens celulares de células de carcinoma de próstata e linhagens celulares de tecido de tumor prostático autólogo e tecido de carcinoma de cólon.

9. Método, de acordo com a reivindicação 5, caracterizadopelo fato de que na etapa c) , o referido lisado é obtido a partir de linhagens celulares de melanoma uveal.

10. Método, de acordo com a reivindicação 2, caracterizadopelo fato de que na etapa c) , o referido lisado é obtido a partir de linhagens celulares de tumor prostático, renal, colorretal, gástrico, pulmonar, mama, ovariano, testicular ou misturas dos mesmos.

11. Método, de acordo com a reivindicação 2, caracterizadopelo fato de que na etapa c) , o referido lisado é obtido a partir de linhagens celulares derivadas de nódulos metastáticos.

12. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que na etapa b) , os referidos monócitos são fornecidos como PBMC, os quais são incubados com o referido fator de crescimento e a referida IL-4 a uma concentração entre 20 e 30xl06 células/mL em meio de cultivo livre de soro.

13. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que na etapa b) , a concentração da referida IL-4 está entre 400 a 600 U/mL.

14. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que na etapa b) , a concentração da referida GM-CSF está entre 700 a 900 U/mL.

15. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que a etapa c) compreende incubar os referidos monócitos ativados com uma ou mais citocinas pró-inflamatórias selecionadas de INF-y, IL-6, IL-β, fatores de prostaglandinas E2, CpG, proteínas de choque térmico, ligantes dos receptores Toll-like (TLR) e misturas dos mesmos.

16. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que na etapa c) , a concentração de TNF-a está entre 100 pg/mL a 100 ng/mL.

17. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a referida concentração do lisado está entre 1 pg/mL a 10 mg/mL.

18. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que na etapa b) , a concentração de IL-4 e GM-CSF é de 500 U/mL e 800 U/mL, respectivamente, e a etapa c) é realizada na presença de 10 ng/ml de TNF-a e uma mistura de lisados de células tumorais.

19. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por compreender ainda a etapa e) de congelar as APCs da etapa d).

Images