BR112019025973A2 - proteína de fusão com polipeptídeo de extensão de meia-vida - Google Patents

Abstract

uma proteína de fusão é fornecida, compreendendo i) um polipeptídeo biologicamente ativo; e ii) uma fração polipeptídica que estende a meia-vida compreendendo de 2 a 80 unidades independentemente selecionadas das sequências de aminoácidos de acordo com a seq id no: 1: x1-x2-x3-x4-x5-x6-d-x8-x9-x10-x11 (seq id no: 1) em que, independentemente: x1 é p ou ausente; x2 é v ou ausente; x3 é p ou t; x4 é p ou t; x5 é t ou v; x6 é d, g ou t; x8 é a, q ou s; x9 é e, g ou k; x10 é a, e p ou t; e x11 é a, p ou t. a fração polipeptídica que estende a meia-vida tem uma conformação geralmente desdobrada e fornece uma proteína de fusão com um grande raio hidrodinâmico que pode evitar a depuração renal. como resultado, a meia-vida biológica da proteína de fusão é aumentada e o efeito biológico do polipeptídeo biologicamente ativo pode assim ser estendido.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para: “PROTEÍNA DE FUSÃO COM POLIPEPTÍDEO DE EXTENSÃO DE MEIA-VIDA” Campo de invenção

[001] A presente invenção se refere a proteínas de fusão compreendendo polipeptídeos que estendem a meia-vida e a utilizações de tais polipeptídeos que estendem a meia-vida e de proteínas de fusão.

Antecedentes

[002] Proteínas e peptídeos terapêuticos são frequentemente dificultados por uma meia-vida curta in vivo.

Proteínas e peptídeos especialmente menores são facilmente eliminados da circulação por filtração pelos rins. Como na maioria das vezes os produtos biológicos são administrados por injeção intravenosa (i.v., iv) ou subcutânea (s.c., sc), o intervalo de tempo entre cada dose é de grande importância.

Enquanto isso, essas vias de administração, em particular a injeção intravenosa, geralmente requerem a assistência de profissionais de saúde e também podem ser desconfortáveis e até dolorosas para o paciente e, portanto, dosagens mais frequentes aumentam o desconforto e o inconveniente do paciente e exigem recursos de saúde. Isso contrasta com a dosagem de um medicamento de molécula pequena, que pode ser administrado por vias menos invasivas, tais como oral, intranasal ou tópica, sempre que necessário, com muito menos esforço e inconveniência.

[003] Uma das primeiras tentativas de resolver o problema da depuração rápida de produtos biológicos ou biofarmacêuticos da circulação foi anexar quimicamente uma cadeia polimérica de polietileno glicol (PEG) a uma proteína ou peptídeo para aumentar o raio hidrodinâmico do medicamento, o que se traduz em um aumento aparente do tamanho em solução, de modo que atinja um tamanho que não seja facilmente eliminado pelos rins. Essa tecnologia, denominada PEGuilação, mostrou-se bem-sucedida e atualmente é usada em produtos farmacêuticos aprovados. No entanto, a etapa de fixação química adiciona outra etapa do processo à fabricação, resultando em um aumento do custo do medicamento fabricado. Além disso, a ligação de uma fração de PEG pode ocorrer em vários locais de uma proteína ou peptídeo, resultando em um produto de grande não homogeneidade, no qual a localização da cadeia de PEG varia entre moléculas individuais. A natureza do próprio polímero PEG também adiciona um grau de não homogeneidade, pois o polímero não é monodisperso, mas uma coleção de polímeros PEG de comprimento semelhante, mas não iguais.

[004] Contrariamente à crença original de que era não imunogênico e até capaz de reduzir a imunogenicidade também em relação às moléculas às quais estava ligado, o PEG foi mais tarde considerado imunogênico. Em um exemplo, isso levou a uma depuração significativamente maior do medicamento ao qual estava ligado (PEG-uricase; Ganson NJ et al., 2005).

[005] Com o objetivo de remover a etapa adicional de fabricação e criar um produto monodisperso, empresas como Amunix Inc e XL-Protein GmbH desenvolveram tecnologias de extensão da meia-vida baseadas em sequências aleatórias de proteínas não repetitivas que podem ser usadas como parceiras de fusão para estender a meia-vida biológica de proteínas e peptídeos terapêuticos (Podust et al. 2016 J Control Release, Schlapschy et al. 2013 Protein Eng Des Sel).

[006] Outra via para estender a meia-vida biológica dos biológicos é a fusão com um parceiro na forma de uma proteína sérica com meia-vida longa, dois dos parceiros de fusão mais comuns sendo a albumina sérica humana (HSA) e a fração Fc dos anticorpos humanos. Particularmente, o domínio Fc tem sido amplamente utilizado como um parceiro de fusão que estende a meia-vida. Tanto a HSA quanto a Fc são grandes o suficiente para evitar a depuração renal e também se beneficiam de uma via de reciclagem envolvendo o receptor Fc neonatal, ao qual essas proteínas se ligam, estendendo assim sua meia-vida além da alcançável pela depuração renal reduzida (Kontermann RE. Half-life extended biotherapeutics.

Expert Opin Biol Ther. 2016). A origem humana desses parceiros de fusão também significa uma baixa resposta imunogênica em pacientes humanos.

[007] No entanto, apesar dos avanços descritos acima, continua a haver uma necessidade na técnica de novos meios para estender a meia-vida dos produtos biológicos.

Sumário da invenção

[008] É um objetivo da presente invenção reduzir pelo menos parcialmente ou evitar os problemas da técnica anterior e fornecer novos meios de estender a meia-vida biológica de proteínas e peptídeos.

[009] Estes e outros objetivos, que serão evidentes para um especialista na presente divulgação, são alcançados pelos diferentes aspectos da invenção, conforme definido nas reivindicações anexas e como geralmente divulgado aqui.

[010] Em um aspecto, a invenção se refere a uma proteína de fusão compreendendo i) um polipeptídeo biologicamente ativo; e ii) uma fração polipeptídica que estende a meia-vida compreendendo de 2 a 80 unidades, sendo cada unidade independentemente selecionada do grupo que consiste em todas as sequências de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO: 1: X1-X2-X3-X4-X5-X6-D-X8-X9-X10-X11 (SEQ ID NO: 1) em que, independentemente, X1 é P ou ausente; X2 é V ou ausente; X3 é P ou T; X4 é P ou T;

X5 é T ou V; X6 é D, G ou T; X8 é A, Q ou S; X9 é E, G ou K; X10 é A, E P ou T; X11 é A, P ou T.

[011] As unidades de 2 a 80 podem ser iguais ou diferentes, dentro da definição da SEQ ID NO: 1 estabelecida acima. Declarado de maneira diferente, a fração polipeptídica que estende a meia-vida compreende de 2 a 80 unidades, em que cada unidade é uma sequência de aminoácidos selecionada independentemente do grupo que consiste nas sequências individuais que se enquadram na definição de SEQ ID NO: 1. De preferência, cada unidade pode ser uma sequência de aminoácidos selecionada independentemente do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 2 a 11.

[012] Os presentes inventores descobriram surpreendentemente que uma fração polipeptídica conforme definida acima, que é baseada ou derivada do domínio C- terminal da lipase estimulada por sal biliar humano (BSSL), pode fornecer uma fração excelente de meia-vida estendida quando fundida a uma proteína ou peptídeo a ser utilizado como terapêutico. A fração de polipeptídeo que estende a meia-vida tem uma conformação geralmente desdobrada em condições fisiológicas e fornece uma proteína de fusão com um grande raio hidrodinâmico e, assim, evita, ou pelo menos reduz a taxa de depuração renal do polipeptídeo biologicamente ativo. Assim, a proteína de fusão incluindo a fração polipeptídica que estende a meia-vida pode ter uma meia-vida biológica que é estendida em comparação com a meia- vida biológica do polipeptídeo biologicamente ativo sozinho.

[013] De acordo com a invenção, a proteína de fusão como um todo não é lipase estimulada por sal biliar e o polipeptídeo biologicamente ativo não corresponde a um domínio catalítico da lipase estimulada por sal.

[014] Como aqui utilizado, as expressões "fundido" e "fusão" se referem à união artificial de duas ou mais frações de entidades químicas do mesmo tipo, tal como peptídeos, polipeptídeos, proteínas ou sequências de ácidos nucleicos.

Uma proteína de fusão tal como aqui referida tipicamente compreende pelo menos duas frações polipeptídicas de origem diferente; por exemplo, uma fração polipeptídica que estende a meia-vida, que pode ser derivada de BSSL, e um polipeptídeo biologicamente ativo, que não é BSSL. A proteína de fusão da presente invenção é tipicamente uma entidade de ocorrência não natural e não corresponde ao BSSL humano. A proteína de fusão da invenção também pode ser referida como uma proteína quimérica. Entende-se por "proteína quimérica" uma proteína híbrida codificada por uma sequência nucleotídica que consiste em dois ou mais genes completos ou parciais que originalmente codificaram proteínas distintas, que podem ser da mesma ou de diferentes espécies.

[015] A proteína de fusão, ou proteína quimérica, da invenção é produzida por tecnologia de DNA recombinante.

[016] A expressão "meia-vida biológica" se refere ao tempo necessário para a concentração da substância em questão no sangue, soro ou plasma diminuir para a metade da concentração inicial. A meia-vida biológica pode ser determinada de acordo com métodos convencionais conhecidos dos especialistas na técnica. Por exemplo, a meia-vida biológica pode ser determinada com base na concentração no soro, plasma ou sangue total.

[017] Como aqui utilizado, o termo "polipeptídeo biologicamente ativo" se refere a um polipeptídeo que exerce uma atividade biológica desejada in vivo. Nesse contexto, "atividade biológica" se refere a qualquer atividade de um polipeptídeo que pode levar a um efeito terapêutico in vivo e pode ser exemplificado como uma atividade de ligação.

Exemplos não-limitativos incluem atividade enzimática, atividade agonista e atividade antagonista. Tipicamente, o polipeptídeo biologicamente ativo é um biofarmacêutico, também chamado de biológico. O polipeptídeo biologicamente ativo normalmente não é, ou não corresponde, em parte ou na totalidade, ao BSSL humano, nem ao BSSL de qualquer outra espécie.

[018] De preferência, a fração polipeptídica que estende a meia-vida, estende a meia-vida biológica do polipeptídeo biologicamente ativo por um fator de pelo menos 1,5 em pelo menos uma espécie, tipicamente humana. Em outras palavras, a proteína de fusão tem preferencialmente uma meia-vida biológica que é pelo menos 1,5 vezes a do polipeptídeo biologicamente ativo sozinho. Por exemplo, a proteína de fusão pode estender a meia-vida biológica do polipeptídeo biologicamente ativo por um fator de pelo menos 1,8, pelo menos 2, pelo menos 3, pelo menos 5, pelo menos 10, pelo menos 20 ou pelo menos 50. Como resultado do aumento da meia- vida biológica, o efeito do polipeptídeo biologicamente ativo pode ser prolongado.

[019] De uma perspectiva de dosagem, o uso da fração polipeptídica que estende a meia-vida como aqui divulgada permite uma administração menos frequente, o que é benéfico para o paciente, bem como de uma perspectiva econômica. Por exemplo, em vez da administração duas vezes por semana de um medicamento, o mesmo ou um efeito biológico ou terapêutico semelhante pode ser alcançado por apenas uma administração por semana. Essa diferença significa uma grande melhoria para os pacientes, especialmente aqueles que precisam ir a um hospital ou clínica para receber tratamento e/ou onde a administração é fisicamente desconfortável ou até dolorosa.

Além disso, com menos doses e/ou um período mais longo entre as doses, as reações adversas causadas pelo modo de administração podem ser evitadas; por exemplo, para injeção subcutânea, as reações no local da injeção, tais como dor, eczema e erupções cutâneas, podem ser reduzidas ou evitadas e, para administração intravenosa, reações de infusões envolvendo, por exemplo, febre ou náusea podem ser reduzidas ou evitadas.

[020] Outro benefício dos polipeptídeos de extensão de meia-vida utilizados na presente invenção reside na hidrofilicidade aumentada da proteína de fusão devido ao alto número de resíduos hidrofílicos no polipeptídeo de extensão de meia-vida. O aumento da hidrofilicidade pode melhorar a biodisponibilidade da proteína de fusão (em relação à biodisponibilidade do polipeptídeo biologicamente ativo como tal) e aumentar a concentração sistêmica, potencialmente permitindo doses menores e/ou menos frequentes. Como aqui utilizado, "biodisponibilidade" se refere à fração da dose de uma substância que atinge a circulação sistêmica após a administração por uma via diferente da administração intravenosa.

[021] Outra implicação prática do aumento da hidrofilicidade é que a administração subcutânea pode ser uma opção realista em vez da administração intravenosa.

Sempre que possível, a administração subcutânea é frequentemente preferida à infusão intravenosa, pois as injeções subcutâneas em geral são mais rápidas, menos desconfortáveis e requerem menos treinamento médico para serem realizadas em comparação com a administração intravenosa.

[022] Além disso, a hidrofilicidade aumentada da proteína de fusão de acordo com a invenção também pode ser uma vantagem durante a purificação de um produto de expressão bruto. Verificou-se que as proteínas de fusão de acordo com modalidades da invenção eluíram antes do polipeptídeo biologicamente ativo, como tal, utilizando cromatografia de interação hidrofóbica (HIC) usando gradiente de eluição.

Este é considerado um efeito potencialmente muito útil que poderia ser a solução para problemas relacionados com proteínas indesejáveis das células hospedeiras eluindo simultaneamente com o polipeptídeo biologicamente ativo.

Portanto, pode ser possível reduzir o número de operações da unidade de cromatografia necessárias para obter uma proteína de fusão de alta pureza.

[023] Outra vantagem de usar o polipeptídeo de extensão da meia-vida aqui descrito é que ele permite uma previsão mais precisa da meia-vida biológica da proteína de fusão resultante, com base em seu tamanho em termos de raio hidrodinâmico (ou tamanho aparente) em solução, pois a meia- vida biológica aumentada da proteína de fusão pode ser exclusiva ou pelo menos principalmente dependente do aumento de tamanho. De fato, a fração polipeptídica que estende a meia-vida, conforme usada nas modalidades da presente invenção, pode ser desprovida de ligação ao principal receptor de reciclagem, o receptor Fc neonatal, e pode assim evitar a interação complexa entre o tamanho da proteína e a reciclagem através da interação do receptor, o que, de outra forma, torna a previsão e o ajuste fino da meia-vida biológica muito incertos.

[024] A fração peptídica que estende a meia-vida pode formar uma sequência contígua de 2 a 80, tal como de 4 a 80, unidades de uma ou mais sequência (s), conforme definido na SEQ ID NO: 1. Nas modalidades, a proteína de fusão pode compreender múltiplas frações polipeptídicas que estendem a meia-vida, cada fração polipeptídica compreendendo de 2 a 80 unidades como definido acima. Tais múltiplos polipeptídeos que estendem a meia-vida podem ter o mesmo comprimento (tendo o mesmo número de unidades) ou podem ter comprimentos diferentes. Alternativamente, a proteína de fusão pode compreender apenas um polipeptídeo que estende a meia-vida, tipicamente tendo de 4 a 80 unidades como definido acima.

[025] Em modalidades, a fração polipeptídica que estende a meia-vida pode ser posicionada no terminal amino (N- terminal) ou no carboxi-terminal (C-terminal) do referido polipeptídeo biologicamente ativo. No caso de múltiplos polipeptídeos de extensão de meia-vida, pelo menos uma das referidas frações de polipeptídeos de extensão de meia-vida pode ser posicionada no N-terminal ou C-terminal do referido polipeptídeo biologicamente ativo.

[026] Alternativa ou adicionalmente, uma fração polipeptídica que estende a meia-vida pode constituir uma inserção em, ou substituição de uma parte da sequência de aminoácidos do polipeptídeo biologicamente ativo. No caso de múltiplos polipeptídeos de extensão de meia-vida, pelo menos um dos referidos grupos de polipeptídeos de extensão de meia- vida pode opcionalmente ser posicionado como uma inserção ou substituição de uma parte da sequência de aminoácidos do polipeptídeo biologicamente ativo. Uma inserção ou substituição pode ser feita em um alça exposto à superfície da estrutura terciária do polipeptídeo biologicamente ativo, de modo que a fração do polipeptídeo que estende a meia-vida que constitui uma inserção ou substituição de uma parte da sequência de aminoácidos do polipeptídeo biologicamente ativo é exposto na superfície da proteína de fusão.

[027] Em modalidades da invenção, pelo menos um dos resíduos X3 e X4 da SEQ ID NO: 1 pode ser P. Em algumas modalidades, pelo menos um dos X4 e X5 da SEQ ID NO: 1 pode ser T. Em algumas modalidades, pelo menos um de X10 e X11 da SEQ ID NO: 1 pode ser A ou P. Em algumas modalidades, X1 é P e X2 é V.

[028] Nas modalidades da invenção, a fração polipeptídica que estende a meia-vida pode compreender de 2 a 80 unidades de uma ou mais sequência(s) de aminoácidos selecionadas independentemente do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 2 a 11. Estas sequências representam variantes humanas da SEQ ID NO: 1. Verificou-se que as sequências de aminoácidos baseadas em unidades repetidas selecionadas de SEQ ID NOs: 2 a 11 avaliadas in vitro e in silico apresentaram baixo potencial imunogênico. Portanto, espera-se que as frações polipeptídicas que estendem a meia-vida consistindo em tais unidades sejam bem toleradas, em termos de resposta imune, por indivíduos humanos.

[029] Em algumas modalidades, a fração polipeptídica que estende a meia-vida pode ter a SEQ ID NO: 2 em sua extremidade N-terminal, como é tipicamente o caso de sequências que ocorrem naturalmente de origem humana. Por exemplo, a fração polipeptídica prorrogável pela meia-vida pode compreender pelo menos 4 unidades contíguas na seguinte ordem: [SEQ ID NO: 3] - [SEQ ID NO: 4] - [SEQ ID NO: 5] - [SEQ ID NO: 5], opcionalmente precedido pela SEQ ID NO: 2.

[030] Nas modalidades da invenção, a fração polipeptídica que estende a meia-vida pode compreender pelo menos uma sequência selecionada a partir das SEQ ID NOs: 12 a 21 ou 57 a 66. Por exemplo, a fração polipeptídica que estende a meia-vida pode ser selecionada do grupo de sequências de aminoácidos que consistem na SEQ ID NO: 12 a 21 e 57 a 66. Alternativamente, a fração polipeptídica que estende a meia-vida pode compreender várias cópias, por exemplo, 2, ou 3, opcionalmente contíguas, cópias de uma sequência selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NO: 12 a 21 e 57 a 66.

[031] Em modalidades, a fração polipeptídica que estende a meia-vida pode compreender, ou consistir em uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 100 a 105.

[032] Em modalidades da invenção, a fração polipeptídica que estende a meia-vida pode compreender pelo menos 4, pelo menos 6, pelo menos 8, pelo menos 10 ou pelo menos 17 unidades de uma ou mais sequência (s) de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO: 1. Além disso, nas modalidades da invenção, a fração polipeptídica prorrogável pela meia-vida pode compreender até 8, até 10, até 18, até 34, até 51, até 68 ou até 70 unidades de uma ou mais sequência(s) de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO: 1. Assim, por exemplo, a fração polipeptídica que estende a meia-vida pode compreender de 7 a 18 unidades de uma ou mais sequência (s) de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO: 1, tal como de 7 a 18 unidades selecionadas independentemente do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 2 a 11.

[033] Tipicamente, o polipeptídeo de extensão da meia- vida ou, no caso em que a proteína de fusão compreende uma pluralidade de polipeptídeos de extensão da meia-vida, pelo menos um dos polipeptídeos de extensão da meia-vida, compreende pelo menos duas sequências de aminoácidos diferentes de acordo com a SEQ ID NO: 1.

[034] Nas modalidades da invenção, o polipeptídeo de extensão da meia-vida pode ser fundido a um polipeptídeo biologicamente ativo que sozinho possui um tamanho aparente em solução de pelo menos 5 kDa. Em particular para pequenos polipeptídeos biologicamente ativos, o presente polipeptídeo que estende a meia-vida pode ser de grande benefício, pois pode aumentar o tamanho o suficiente para evitar a depuração renal. Como um todo, a proteína de fusão pode tipicamente ter um tamanho aparente em solução de pelo menos 60 kDa, conforme determinado por cromatografia de exclusão de tamanho. Em modalidades, o tamanho aparente na solução da proteína de fusão é maior que o tamanho aparente na solução do polipeptídeo biologicamente ativo sozinho, por um fator de pelo menos 1,5 e até um fator de 300. Em termos de raio hidrodinâmico, a proteína de fusão como um todo pode exibir um raio hidrodinâmico de pelo menos 3,8 nm. Em modalidades, o raio hidrodinâmico da proteína de fusão pode ser pelo menos 1,25 vezes maior, por exemplo, duas vezes maior que o raio hidrodinâmico do polipeptídeo biologicamente ativo sozinho.

[035] O aumento aparente do tamanho fornecido pelo polipeptídeo de extensão da meia-vida pode ser pelo menos parcialmente explicado pela conformação não estruturada ou desdobrada do polipeptídeo de extensão da meia-vida. Por exemplo, o polipeptídeo de extensão da meia-vida pode não ter elementos de estrutura secundários, tais como α-hélices e folhas β, e, portanto, o polipeptídeo de extensão da meia- vida pode ser caracterizado como não contribuindo para o conteúdo da α-hélice e/ou da folha β da proteína de fusão.

[036] Nas modalidades da invenção, uma sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO: 1 pode ser de origem humana. Por exemplo, a fração polipeptídica que estende a meia-vida pode corresponder a uma sequência de aminoácidos humanos que ocorre naturalmente. O uso de uma sequência de origem humana pode ser vantajoso, pois é esperado que contribua para uma menor imunogenicidade em indivíduos humanos. De fato, o Exemplo 14 abaixo confirma que uma fração polipeptídica que estende a meia-vida consistindo em unidades repetidas selecionadas das SEQ ID NOs: 2 a 11 tem um baixo potencial imunogênico em humanos. No entanto, sequências compreendendo ou correspondendo a unidades repetitivas de ocorrência natural de outras espécies também são contempladas para uso em um polipeptídeo que estende a meia-vida, sozinho ou em combinação com unidades repetidas de origem humana. Essas outras espécies incluem particularmente primatas não humanos, por exemplo, gorila, chimpanzé, orangotango, bonobo e macaco.

[037] Nas modalidades da invenção, cada unidade de repetição de acordo com a SEQ ID NO: 1 tem um, ou no máximo um, sítio potencial de O-glicosilação. Além disso, quando a fração polipeptídica que estende a meia-vida foi produzida em um sistema de expressão em mamíferos, cada unidade pode compreender no máximo uma O-glicosilação e tipicamente uma maioria, mas não todas, das referidas unidades compreende uma O-glicosilação cada. Por exemplo, um determinado número ou parte das referidas unidades pode não ter glicosilação.

Embora alguma glicosilação possa ser benéfica, pois pode contribuir ainda mais para o aumento do tamanho, um padrão de glicosilação inespecífico ou desconhecido pode apresentar problemas práticos durante a caracterização da proteína.

Portanto, o padrão de glicosilação limitado e relativamente bem definido da fração polipeptídica que estende a meia-vida de acordo com as modalidades da presente invenção é vantajoso a esse respeito. Em algumas modalidades, no entanto, em particular onde a proteína de fusão é produzida em células de não mamíferos, a fração polipeptídica que estende a meia- vida pode não ter glicosilação completa.

[038] A proteína de fusão pode compreender pelo menos um polipeptídeo biologicamente ativo. Em modalidades, a proteína de fusão pode compreender uma pluralidade de polipeptídeos biologicamente ativos, tais como dois polipeptídeos biologicamente ativos.

[039] O(s) polipeptídeo(s) biologicamente ativo(s) da proteína de fusão, cuja meia-vida é desejável estender por fusão com a fração polipeptídica que estende a meia-vida, pode ser selecionado do grupo que consiste em hormônios, fatores de crescimento, citocinas, enzimas, ligantes, aglutinantes, co-fatores, anticorpos e fragmentos de anticorpos, tais como fragmentos de ligação ao antígeno (Fab). Em algumas modalidades, o polipeptídeo biologicamente ativo pode ser um agonista do receptor. Em outras modalidades, o polipeptídeo biologicamente ativo pode ser um antagonista do receptor.

[040] A proteína de fusão pode ter uma meia-vida biológica que é estendida por um fator de pelo menos 1,5 em relação à meia-vida biológica do polipeptídeo biologicamente ativo sozinho.

[041] Em outro aspecto, a invenção fornece um método para prolongar a meia-vida biológica de um polipeptídeo biologicamente ativo ou um método para produzir uma proteína de fusão de acordo com o primeiro aspecto da invenção acima mencionado, compreendendo as etapas de: a) fornecer um polinucleotídeo, tipicamente um construto de DNA, que codifica uma proteína de fusão como descrito acima, compreendendo o polipeptídeo biologicamente ativo e uma fração de polipeptídeo que estende a meia-vida; b) introduzir o referido polinucleotídeo em uma célula; c) manter a referida célula em condições que permitam a expressão da referida proteína de fusão; e d) isolar a referida proteína de fusão.

[042] Em algumas modalidades, a célula é uma célula de mamífero. A expressão em sistemas de expressão em mamíferos pode ser benéfica, pois pode fornecer glicosilação da proteína de fusão. Em outras modalidades, a célula pode ser uma célula eucariótica não mamífera, tal como uma célula de levedura, uma célula vegetal ou uma célula animal não mamífera. Em ainda outras modalidades, a célula pode ser uma célula procariótica, tal como E. coli.

[043] Em algumas modalidades, a proteína de fusão pode ser co-expressa com uma α2,6-sialiltransferase (EC:

2.4.99.1; um nome alternativo é antígeno de célula B CD75).

Tais métodos podem compreender as etapas de i) fornecer um polinucleotídeo, tipicamente um construto de DNA, codificando uma α2,6-sialiltransferase ou promovendo a expressão da α2,6-sialiltransferase endógena, ii) introduzir o referido polinucleotídeo em uma célula, que pode ser a mesma célula que é usada na etapa b) acima para expressão de uma proteína de fusão de acordo com as modalidades da invenção, e iii) manter a referida célula em condições também permitindo a expressão da referida α2,6-sialiltransferase.

[044] O polinucleotídeo pode ser o mesmo construto que na etapa a) acima que codifica uma proteína de fusão.

Alternativamente, pode ser um construto de DNA diferente.

Nas modalidades que utilizam construtos de DNA diferentes que codificam a proteína de fusão e que codificam, ou promovem a expressão da α2,6-sialiltransferase, respectivamente, os construtos de DNA podem ser introduzidos na mesma célula, simultaneamente ou em diferentes momentos no tempo. Alternativamente, podem ser utilizadas células diferentes, caso em que as células podem ser cultivadas em conjunto e, assim, mantidas juntas em condições que permitem, simultânea ou sequencialmente, a expressão da proteína de fusão e da α2,6-sialiltransferase.

[045] Em outros aspectos, a invenção fornece um polinucleotídeo que codifica uma proteína de fusão como aqui descrito, um vetor de expressão compreendendo esse polinucleotídeo e uma célula, que pode ser uma célula de mamífero ou uma célula não de mamífero, compreendendo esse vetor de expressão.

[046] Em outro aspecto, a invenção fornece uma composição farmacêutica compreendendo a proteína de fusão como aqui descrito e um carreador farmaceuticamente aceitável. Em modalidades, a composição farmacêutica pode ser formulada para administração subcutânea e/ou para administração intravenosa.

[047] Ainda em outro aspecto, a invenção fornece uma proteína de fusão para uso como medicamento e, em particular, para uso como medicamento destinado a ser administrado por via subcutânea a um indivíduo.

[048] Em outros aspectos, a invenção se refere ao uso de um polipeptídeo de extensão de meia-vida, como definido aqui, para aumentar a meia-vida biológica de um polipeptídeo biologicamente ativo, bem como ao uso de um polipeptídeo de extensão de meia-vida, como definido aqui para aumentar a biodisponibilidade de um polipeptídeo biologicamente ativo.

Como mencionado acima, um benefício distinto da fração polipeptídica de extensão de meia-vida aqui descrita é o aumento da hidrofilicidade da proteína de fusão resultante devido ao alto número de resíduos hidrofílicos no polipeptídeo de extensão da meia-vida. A hidrofilicidade aumentada pode melhorar a biodisponibilidade e aumentar a concentração sistêmica (por exemplo, concentração sérica), potencialmente permitindo doses menores ou menos frequentes.

Outra implicação prática de uma hidrofilicidade aumentada é que, para certos polipeptídeos biologicamente ativos, a administração subcutânea pode ser uma opção realista em vez da administração intravenosa.

[049] Nota-se que a invenção se refere a todas as combinações possíveis dos recursos citados nas reivindicações.

Breve descrição dos desenhos

[050] A Figura 1 é uma representação esquemática de um gene que codifica um polipeptídeo biologicamente ativo (branco) e de um ou mais genes que codificam uma fração de polipeptídeo que estende a meia-vida (sombreada) de acordo com as modalidades da invenção.

[051] A Figura 2 é uma representação gerada por computador de uma proteína de fusão de acordo com as modalidades da invenção.

[052] As Figuras 3a e 3b são gráficos que ilustram a relação entre tamanho e número de unidades de repetição na fração de meia-vida para diferentes proteínas de fusão de acordo com as modalidades da invenção e comparadas com os tamanhos dos polipeptídeos biologicamente ativos isoladamente. A Figura 3a mostra o peso molecular aparente em solução (eixo Y) versus número de unidades repetidas (eixo X). A Figura 3b mostra o raio hidrodinâmico (eixo Y) versus número de unidades de repetição (eixo X).

[053] A Figura 4 é uma imagem que mostra os resultados da análise SDS-PAGE de proteínas de fusão de acordo com as modalidades da invenção produzidas em E. coli.

[054] As Figuras 5a-c são gráficos que mostram a meia- vida terminal das proteínas de fusão (eixo Y) de acordo com modalidades da invenção em função do tamanho, representado pelo tamanho aparente na solução (Figura 5a) da proteína de fusão, o raio hidrodinâmico (Figura 5b) da proteína de fusão e o número de unidades repetidas da fração polipeptídica que estende a meia-vida (Figura c), respectivamente.

Descrição detalhada

[055] A glândula mamária humana e o pâncreas produzem uma enzima lipolítica, a lipase estimulada pelo sal biliar (BSSL), também conhecida como lipase ativada pelo sal biliar (BAL) ou lipase do éster carboxílico (CEL) (EC 3.1.1.13). A proteína está disposta em dois domínios, um domínio amino terminal globular grande e um domínio carboxi terminal (C- terminal) menor, porém estendido (para uma revisão, ver, por exemplo, Wang & Hartsuck (1993) Biochim. Biophys Acta 1166: 1-19). Os presentes inventores descobriram surpreendentemente que sequências repetitivas baseadas ou derivadas do domínio C-terminal do BSSL humano podem ser fundidas com sucesso a proteínas ou peptídeos biologicamente ativos e conferir meia-vida biológica aumentada ao parceiro de fusão, estendendo assim seu efeito biológico ou terapêutico in vivo, como demonstrado nos exemplos abaixo.

[056] O domínio C-terminal do BSSL humano consiste em repetir unidades de, ou semelhantes à fórmula "PVPPTGDSGAP".

A Tabela 2 no Exemplo 1 abaixo lista as unidades repetidas das variantes humanas do BSSL. A forma mais comum do domínio do C-terminal contém 18 unidades repetidas (entrada UniProt P19835). Contudo, existem variações na população humana, tanto no que diz respeito ao número de unidades de repetição e a sequência de aminoácidos das unidades de repetição individuais. Além disso, cada unidade de repetição possui um sítio que pode ser O-glicosilado, aumentando a hidrofilicidade e o tamanho da região (Strömqvist et al.

Arch. Biochem. Biophys. 1997). A extremidade C-terminal do domínio é, no entanto, hidrofóbica e demonstrou-se que se liga ao sítio ativo de BSSL e causa auto inibição da enzima.

A sequência humana mais frequente desta fração hidrofóbica é "QMPAVIRF" (Chen et al. Biochemistry 1998).

[057] Especulou-se anteriormente que o domínio C- terminal pode ser responsável pela estabilidade do BSSL in vivo, por exemplo, sua resistência à desnaturação por ácido e agregação sob condições fisiológicas (Loomes et al., Eur.

J. Biochem. 1999, 266, 105-111). Em contraste, outro estudo da estrutura da colesterol esterase mostrou que o domínio C- terminal, que é enriquecido com os resíduos Pro, Asp, Glu, Ser e Thr, é uma reminiscência das sequências ricas em PEST em proteínas de vida curta, sugerindo que a proteína pode ter uma meia-vida curta in vivo devido às sequências repetitivas no domínio C-terminal (Kissel et al., Biochimica et Biophysica Acta 1989, 1006).

[058] Na presente invenção, acredita-se que a meia-vida biológica estendida de uma proteína de fusão compreendendo uma fração polipeptídica que estende a meia-vida como aqui definida, com base no, ou derivado do, domínio c-terminal do BSSL humano, é devida principalmente ao aumento raio hidrodinâmico da proteína. No entanto, também está previsto que outros mecanismos possam contribuir para o aumento da meia-vida biológica.

[059] Como aqui utilizado, as expressões "fundido" e "fusão" se referem à união artificial de duas ou mais frações de entidades químicas do mesmo tipo, tais como peptídeos, polipeptídeos, proteínas ou sequências de ácidos nucleicos.

Uma proteína de fusão como aqui referida compreende tipicamente pelo menos duas frações de polipeptídeo, que podem ser de origem diferente; por exemplo, um polipeptídeo biologicamente ativo, que não é BSSL, e uma fração polipeptídica que estende a meia-vida, que pode ser derivada do BSSL. Geralmente, uma fusão pode conter as partes fundidas em qualquer ordem e posição; no entanto, uma fusão de genes é tipicamente feita na estrutura (em linha), de modo que as estruturas de leitura aberta (ORFs) dos genes fundidos sejam mantidas, como apreciado por pessoas versadas na técnica.

[060] A Figura 1 ilustra esquematicamente um construto de ácido nucleico que codifica uma proteína de fusão de acordo com modalidades da presente invenção, compreendendo um gene que codifica um polipeptídeo biologicamente ativo (barra branca) e um gene que codifica uma fração de polipeptídeo que estende a meia-vida (barra tracejada). Por uma questão de simplicidade, outros elementos, tais como sequências promotoras ou potenciadoras e similares, não são marcados, embora um especialista na técnica compreenda que tais elementos podem ser incluídos conforme necessário. Por exemplo, o gene que codifica o polipeptídeo biologicamente ativo pode ser precedido por um peptídeo sinalizador para expressão em células de mamíferos, ou um peptídeo sinal ou resíduo de metionina para expressão em E. coli.

[061] Como mostrado na Figura 1, o gene que codifica a fração polipeptídica que estende a meia-vida pode estar localizado no C-terminal (Figura 1b), N-terminal (Figura 1c) ou em ambos os terminais N e C (Figura 1d) ao gene que codifica o polipeptídeo biologicamente ativo.

Alternativamente, uma sequência que codifica uma fração polipeptídica que estende a meia-vida pode ser posicionada dentro dos limites do gene que codifica o polipeptídeo biologicamente ativo (posicionamento em linha). Em tais modalidades, as sequências que codificam frações polipeptídicas que estendem a meia-vida podem opcionalmente estar presentes em vários locais, por exemplo em três locais, como mostrado na Figura 1f, ou mais locais, conforme desejado, desde que a inserção não perturbe a estrutura terciária ou dobrável do polipeptídeo biologicamente ativo.

O posicionamento em linha de uma ou mais frações que estendem a meia-vida pode ser combinado com as fusões N- e/ou C- terminais.

[062] O(s) polipeptídeo(s) biologicamente ativo(s) que constituem o(s) parceiro(s) de fusão da fração polipeptídica que estende a meia-vida pode ser qualquer polipeptídeo biologicamente ativo ou uma combinação de polipeptídeos biologicamente ativos, que pode ser adequado para uso no tratamento ou prevenção de qualquer condição ou desordem, onde a função biológica requer uma certa concentração sistêmica do polipeptídeo biologicamente ativo.

[063] Tipicamente, o polipeptídeo biologicamente ativo é um biofarmacêutico, também chamado de biológico. Exemplos de polipeptídeos biologicamente ativos adequados incluem hormônios peptídicos, fatores de crescimento, citocinas, enzimas, co-fatores, ligantes, aglutinantes (incluindo aglutinantes naturais e artificiais) e anticorpos e fragmentos de anticorpos. Nas modalidades da invenção, o polipeptídeo biologicamente ativo pode ser um agonista do receptor. Em outras modalidades, o polipeptídeo biologicamente ativo pode ser um antagonista do receptor.

[064] O polipeptídeo biologicamente ativo como tal pode ser um polipeptídeo de ocorrência natural ou pode ser um polipeptídeo de ocorrência não natural. No entanto, fundida com a fração polipeptídica que estende a meia-vida, a proteína de fusão resultante será sempre uma entidade que não ocorre naturalmente. O polipeptídeo biologicamente ativo não faz parte do BSSL humano, de modo que a proteína de fusão corresponda a uma proteína BSSL nativa. A proteína de fusão compreendendo um polipeptídeo de ocorrência natural ou não natural pode ser produzida recombinantemente ou sintetizada quimicamente, por exemplo, conforme descrito nos exemplos abaixo.

[065] A Figura 2 ilustra uma proteína de fusão de acordo com as modalidades da presente invenção (PSI0540 dos Exemplos abaixo, proteína de fusão representada pela SEQ ID NO: 38), em que o polipeptídeo biologicamente ativo é representado por um domínio dobrado globular que neste exemplo é IL- 1Ra, e a fração polipeptídica de extensão da meia-vida formando uma cauda na extremidade do C-terminal e do polipeptídeo biologicamente ativo, sendo o polipeptídeo de extensão da meia-vida deste exemplo representado por 17 unidades repetitivas de acordo com a SEQ ID NO: 57. O polipeptídeo ativo é ligado em sua fração C-terminal ao polipeptídeo de extensão da meia-vida através de um ligante peptídico, aqui [G4S]3, ligando a extremidade do C-terminal do polipeptídeo biologicamente ativo ao N-terminal da extensão de meia-vida polipeptídeo e, assim, forma uma parte proximal da cauda. No entanto, como explicado acima com referência à Figura 1, a fração polipeptídica de extensão da meia-vida não está necessariamente localizada no C-terminal do polipeptídeo biologicamente ativo. Nas modalidades da invenção, a fração polipeptídica de extensão de meia-vida pode estar localizada no N-terminal do polipeptídeo biologicamente ativo (Figura 1c), ou a fração de extensão de meia-vida pode estar localizada cada uma no N-terminal e C-terminal, respectivamente (Figura 1d). Em outras modalidades, um ou mais polipeptídeos que estendem a meia-vida podem ser inseridos em uma posição dentro do polipeptídeo biologicamente ativo (Figura 1e), por exemplo, em uma posição localizada em uma alça exposta à superfície do polipeptídeo biologicamente ativo.

[066] Em algumas modalidades, a fração polipeptídica que estende a meia-vida pode substituir um segmento de sequência específico do polipeptídeo biologicamente ativo. Por exemplo, quando posicionada como um inserto, a fração polipeptídica que estende a meia-vida pode substituir uma parte de uma alça exposta à superfície no polipeptídeo biologicamente ativo. Alternativamente, um polipeptídeo de extensão de meia-vida pode substituir um domínio inteiro,

como um domínio N-terminal ou C-terminal, ou um domínio interno, do polipeptídeo biologicamente ativo.

[067] Em ainda outras modalidades, uma fração de polipeptídeo de meia-vida inserida em linha pode ser combinada com uma fração de N-terminal, uma fração de C- terminal, ou ambas as frações de polipeptídeo de extensão de meia-vida de N-terminal e C-terminal (Figura 1f).

Notavelmente, nas modalidades da invenção compreendendo várias frações de extensão da meia-vida, localizadas em posições diferentes, cada uma dessas frações de extensão da meia-vida pode ser definida independentemente como aqui descrito. De outro modo, cada uma dessas frações que estendem a meia-vida pode compreender de 4 a 80 unidades de uma sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO: 1.

[068] Finalmente, a presente invenção não se limita ao uso de um único polipeptídeo biologicamente ativo como parceiro de fusão; em vez disso, como ilustrado na Figura 1g, prevê-se que, em algumas modalidades, a proteína de fusão possa compreender múltiplos polipeptídeos biologicamente ativos separados por ligantes e/ou, como no exemplo da Figura 1g, por um polipeptídeo de meia vida útil. Alternativamente ou adicionalmente, uma ou mais frações ou frações polipeptídicas com extensão de meia-vida também podem estar localizadas no N- ou C-terminal da proteína de fusão.

[069] No caso de múltiplos polipeptídeos biologicamente ativos, estes podem ser iguais ou diferentes. Por exemplo, a proteína de fusão pode compreender dois polipeptídeos biologicamente ativos diferentes, opcionalmente separados por uma sequência ligante ou espaçadora e/ou uma fração de polipeptídeo que estende a meia-vida. Alternativamente, a proteína de fusão pode compreender três polipeptídeos biologicamente ativos diferentes. Nas modalidades da proteína de fusão, incluindo vários polipeptídeos biologicamente ativos, um deles pode ser selecionado a partir do grupo que consiste em fatores de crescimento, citocinas, enzimas e ligantes, e que os polipeptídeos biologicamente ativos restantes podem ser selecionados a partir de anticorpos ou fragmentos de anticorpo. Como um exemplo, a fração polipeptídica de extensão da meia-vida pode ser posicionada como um ligante entre diferentes regiões de ligação ao antígeno.

[070] De acordo com a invenção, a fração polipeptídica de extensão da meia-vida usada para fusão com um polipeptídeo biologicamente ativo compreende uma sequência de aminoácidos compreendendo de 2 a 80 unidades de repetição, sendo cada unidade selecionada independentemente do grupo de sequências de aminoácidos definidas pela SEQ ID NO: 1: X1-X2-X3-X4-X5-X6-D-X8-X9-X10-X11 (SEQ ID NO: 1) em que, independentemente,

X1 é P ou ausente; X2 é V ou ausente; X3 é P ou T; X4 é P ou T; X5 é T ou V; X6 é D, G ou T; X8 é A, Q ou S; X9 é E, G ou K; X10 é A, E P ou T; X11 é A, P ou T.

[071] Como aqui utilizado, uma "unidade" se refere a uma ocorrência de uma sequência de aminoácidos da fórmula geral de acordo com a SEQ ID NO: 1 como definido acima, incluindo, por exemplo, qualquer uma das sequências de acordo com a SEQ ID NOs: 2 a 11. O polipeptídeo que estende a meia-vida compreende de 2 a 80 unidades, que podem ser iguais ou diferentes, dentro da definição estabelecida acima. As unidades do polipeptídeo de extensão da meia-vida também podem ser chamadas de "unidades repetitivas", embora haja alguma variação na sequência de aminoácidos entre unidades individuais e, portanto, "unidades repetidas" não deve ser entendida exclusivamente como a repetição de uma e a mesma sequência. Declarado de maneira diferente, a fração polipeptídica que estende a meia-vida compreende de 2 a 80 unidades, em que cada unidade é uma sequência de aminoácidos selecionada independentemente do grupo que consiste nas sequências individuais que se enquadram na definição de SEQ ID NO: 1.

[072] A fração polipeptídica prorrogável pela meia-vida pode compreender uma sequência contígua de pelo menos 18 aminoácidos (correspondendo a duas unidades que são ambas as versões 9-méricas da SEQ ID NO: 1) e tipicamente até 880 aminoácidos (correspondendo a 80 unidades que são todas as versões de 11-mer da SEQ ID NO: 1). As unidades de repetição podem ser contíguas uma com a outra, embora também seja possível que as unidades de repetição sejam separadas por sequências de espaçamento curto. Por exemplo, duas unidades de repetição podem ser separadas por até 10 resíduos de aminoácidos que não correspondem à SEQ ID NO: 1; por exemplo, a sequência de espaçamento curto pode ser um ligante peptídico da fórmula (G4S)2. Em algumas modalidades, uma sequência de espaçamento pode ter até 5 resíduos de aminoácidos. Em algumas modalidades, um ou mais resíduos de aminoácidos podem ser posicionados entre duas unidades de repetição, por exemplo, para conferir uma funcionalidade desejada, como um sítio de N-glicosilação, ou para fornecer um sítio para outro tipo de modificação, por exemplo, empregando um único resíduo Cys. Em algumas modalidades, um ligante, como um ou mais ligantes G4S, pode ser usado como sequências de espaçamento entre as unidades de repetição adjacentes. Portanto, em vista dessa possibilidade, a sequência contígua compreendendo até 80 unidades de repetição pode ser maior que 880 aminoácidos, por exemplo, até 900 aminoácidos ou até 1000 aminoácidos.

[073] As unidades repetitivas da fração polipeptídica prorrogável pela meia-vida são definidas pela SEQ ID NO: 1, que é baseada nas unidades repetidas de variantes humanas do domínio C-terminal BSSL e que permite alguma variação dos resíduos de aminoácidos nas posições X3, X4, X5, X6, X8, X9, X10 e X11. Em contraste, os resíduos nas posições X1, X2 e X7 são fixos, embora as posições X1 e X2 possam estar ausentes. Em modalidades, ambos X1 e X2 estão ausentes e, nessas modalidades, uma unidade de repetição consiste apenas em 9 aminoácidos.

[074] Uma fração polipeptídica que estende a meia-vida compreendendo 2 a 80 unidades (unidades de repetição) tipicamente compreende várias variantes do motivo de sequência de aminoácidos geralmente definido pela SEQ ID NO: 1, tal como pelo menos duas variantes diferentes de acordo com a SEQ ID NO: 1. Por exemplo, nas modalidades da invenção em que a fração polipeptídica que estende a meia-vida compreende pelo menos 4 unidades, pode compreender pelo menos uma unidade de cada uma das SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 e SEQ ID NO: 5. Nas modalidades da invenção, em que a fração polipeptídica que estende a meia-vida compreende pelo menos

2 unidades, estas podem ser selecionadas independentemente do grupo que consiste em SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 e SEQ ID NO: 5. Vantajosamente, a fração polipeptídica de extensão da meia-vida pode compreender as SEQ ID NOs: 3 a 5 nesta ordem, opcionalmente precedida pela SEQ ID NO: 2. Uma unidade de acordo com a SEQ ID NO: 2 pode estar especialmente localizada na extremidade N-terminal da fração polipeptídica de extensão da meia-vida, representando a primeira unidade da fração polipeptídica de extensão da meia-vida. Embora outras variações específicas das unidades de repetição (por exemplo, as unidades de acordo com as SEQ ID NOs: 3 a 11) possam aparecer repetidamente, a SEQ ID NO: 2, se presente, geralmente aparece apenas uma vez, como a primeira unidade repetitiva da meia-vida fração polipeptídica de extensão.

[075] A conformação da fração polipeptídica que estende a meia-vida é geralmente não estruturada. Por exemplo, nas modalidades da invenção, o polipeptídeo de extensão da meia- vida não contribui para o conteúdo de α-hélice a e/ou folha β da proteína de fusão, conforme determinado por dicroísmo circular ou FTIR (espectroscopia no infravermelho por transformada de Fourier).

[076] Nas modalidades da invenção, uma unidade de repetição definida pela SEQ ID NO: 1 é de origem humana e, de preferência, todas as unidades de repetição da fração polipeptídica que estende a meia-vida correspondem às unidades de repetição que ocorrem naturalmente de uma variante do domínio C-terminal do BSSL humano.

Tais unidades de repetição são representadas pelas SEQ ID NOs: 2 a 11 (Veja também a Tabela 2 nos Exemplos). Nas modalidades da invenção,

todas as unidades repetidas da fração polipeptídica que estende a meia-vida são selecionadas do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 2 a 11, por exemplo, SEQ ID NOs: 3 a 11. Ou seja, a fração polipeptídica que estende a meia-vida pode compreender de 2 a 80 unidades, cada uma selecionada independentemente do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 2 a

11, por exemplo SEQ ID NOs: 3 a 11. O uso de uma sequência de origem humana pode ser vantajoso, pois é esperado que contribua para uma menor imunogenicidade em indivíduos humanos em comparação com frações de meia-vida que se estendem com unidades repetidas de origem não humana ou parcialmente humana, seja com base em polipeptídeo ou outro como usado na técnica anterior.

Como descrito em mais detalhes abaixo no Exemplo 14, nenhum peptídeo derivado de um polipeptídeo de origem humana com extensão de meia-vida exemplar foi apresentado em células apresentadas por antígeno de doadores saudáveis humanos.

Isso indica que uma fração polipeptídica que estende a meia-vida consistindo em unidades repetidas selecionadas das SEQ ID NOs: 2 a 11 tem um baixo potencial imunogênico em humanos.

[077] Além disso, nas modalidades da invenção, a fração polipeptídica que estende a meia-vida compreende, ou consiste em uma sequência de unidades de repetição que corresponde a uma sequência de unidades de repetição humana que ocorre naturalmente. Exemplos de tais sequências humanas naturais de unidades de repetição são apresentados nas SEQ ID NO: 12 a 21 e 57 a 66. Normalmente, essas sequências compreendem, como as cinco primeiras unidades repetitivas, nesta ordem: [SEQ ID NO: 2] - [SEQ ID NO: 3] - [SEQ ID NO: 4] - [SEQ ID NO: 5] - [ SEQ ID NO: 5] ou, alternativamente, como as quatro primeiras unidades repetitivas, nesta ordem: [SEQ ID NO: 3] - [SEQ ID NO: 4] - [SEQ ID NO: 5] - [SEQ ID NO: 5]

[078] Assim, nas modalidades da invenção, a fração polipeptídica que estende a meia-vida compreende uma sequência de aminoácidos de acordo com qualquer uma das SEQ ID NO: 12 a 21 ou 57 a 66. Em algumas modalidades, a fração polipeptídica que estende a meia-vida consiste em um múltiplo de qualquer uma das SEQ ID NO: 12 a 21 ou 57 a 66. Por exemplo, a fração polipeptídica de extensão da meia-vida pode consistir em três múltiplos contíguos, ou cópias, de uma sequência de aminoácidos de acordo com qualquer uma das SEQ ID NOs: 12 a 21 ou 57 a 66; por exemplo, SEQ ID NO: 57.

A SEQ ID NO: 57 compreende 17 unidades de uma sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO: 1 e, portanto, um múltiplo de três cópias da SEQ ID NO: compreende pelo menos 51 unidades. No entanto, deve-se notar que as unidades de repetição da fração polipeptídica de extensão da meia-vida podem ser selecionadas independentemente de todas as unidades de acordo com a SEQ ID NO: 1 e a invenção não é, portanto, limitada a certas sequências de unidades que são repetidas. Por conseguinte, por exemplo, uma fração polipeptídica de meia-vida com 51 unidades de extensão não é necessariamente formada de três cópias de uma sequência de 17 unidades, mas pode ser formada a partir de qualquer combinação de unidades de acordo com a SEQ ID NO: 1 e, em particular, de qualquer combinação de unidades de repetição selecionadas de SEQ ID NOs: 2 a 11.

[079] Em modalidades, uma fração polipeptídica que estende a meia-vida com pelo menos 34 unidades pode compreender ou consistir em uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 100 a 105. Por exemplo, uma fração polipeptídica que estende a meia-vida de 34 unidades pode consistir em uma sequência de acordo com a SEQ ID NO: 100 ou SEQ ID NO: 101; um polipeptídeo gasto em meia-vida de 51 unidades pode consistir em uma sequência de acordo com a SEQ ID NO: 102 ou SEQ ID NO: 103; e uma fração polipeptídica de extensão da meia-vida de 68 unidades pode consistir em uma sequência de acordo com a SEQ ID NO: 104 ou SEQ ID NO: 105.

[080] Verificou-se que cada unidade de repetição como definida acima possui um potencial sítio de O-glicosilação.

Ou seja, após a expressão em um ambiente de mamífero permitindo a glicosilação, cada unidade de repetição pode ser glicosilada em no máximo uma posição predeterminada, tipicamente em um resíduo de treonina (T, Thr). Para as unidades de repetição das SEQ ID NOs: 2 a 11, os sítios potenciais de O-glicosilação estão indicados na Tabela 2 (ver Exemplo 1). Pode haver um limite superior para o número de glicanos, que é menor que o número total de unidades.

Isto é, tipicamente, menos do que todas as unidades da fração polipeptídica que estende a meia-vida são glicosiladas. Por exemplo, de uma sequência de 17 unidades (como SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15 ou SEQ ID NO: 19) normalmente apenas 10 unidades são glicosiladas. Portanto, nas modalidades, a maioria das unidades pode ser glicosilada, enquanto uma minoria das unidades pode ser não glicosilada. Além disso, o grau de glicosilação (por exemplo, a proporção de unidades glicosiladas para unidades não glicosiladas, ou similares) pode ser possível ajustar de acordo com medidas conhecidas, por exemplo selecionando adequadamente o sistema de expressão e/ou controlando as condições de cultivo ou expressão das células produtoras.

[081] Como mencionado acima, a proteína de fusão compreendendo a fração polipeptídica de extensão da meia-

vida de acordo com a invenção se beneficia de uma meia-vida biológica aumentada em comparação com a do polipeptídeo biologicamente ativo sozinho. O aumento da meia-vida biológica deve-se principalmente ao aumento do tamanho da proteína de fusão vis-à-vis o polipeptídeo biologicamente ativo sozinho. O tamanho da proteína de fusão de acordo com a invenção é grande o suficiente para diminuir a depuração da circulação pelos rins (depuração renal).

[082] O raio da maioria dos poros da membrana glomerular é de 4,5 a 5 nm. A membrana é carregada negativamente e, portanto, são proteínas carregadas negativamente menos propensas a serem eliminadas pelos rins. Por exemplo, moléculas com carga negativa podem ser significativamente protegidas da depuração renal já em um raio hidrodinâmico de 2,5 nm, enquanto moléculas neutras precisam de um tamanho de 3,5 nm para obter uma proteção semelhante da depuração renal (Haraldsson et al. Physiological Reviews 88 (2) 451 -487).

Para uma proteína globular não carregada, o limite de tamanho para a depuração renal (abaixo do qual uma proteína é secretada) é um peso molecular de cerca de 60 kDa.

[083] O peso molecular real de uma proteína, conforme determinado, por exemplo, por espalhamento de luz multi- ângulo (MALS), corresponde ao peso molecular teórico baseado na composição de aminoácidos e em quaisquer glicanos ligados.

Em contraste, o tamanho aparente (ou peso molecular aparente)

na solução de uma proteína pode ser determinado por Cromatografia por Exclusão de Tamanho (SEC), por exemplo, como descrito no Exemplo 4 abaixo, e produz um peso molecular aparente, ou tamanho aparente, de uma proteína que corresponde ao peso molecular real de uma proteína globular.

Para proteínas e peptídeos que não possuem uma conformação globular, o peso molecular real pode diferir do peso molecular aparente, ou tamanho aparente, em solução.

[084] Tipicamente, uma proteína ou polipeptídeo não globular pode exibir um tamanho aparente em solução que é maior que seu peso molecular real. No caso das atuais frações de polipeptídeos que estendem a meia-vida, que normalmente têm uma conformação não estruturada e desdobrada, os inventores descobriram que cada unidade de repetição representava aproximadamente 9 kDa, conforme determinado pela SEC (Figura 3a, descrita em mais detalhes abaixo), mesmo embora o peso molecular real fosse de apenas cerca de 1 kDa.

Portanto, o tamanho aparente na solução da proteína de fusão pode ser aumentado em aproximadamente 9 kDa para cada unidade contida na proteína de fusão, de acordo com modalidades da invenção.

[085] No total, a proteína de fusão pode ter um tamanho aparente em solução, conforme determinado pela SEC, maior que o tamanho do polipeptídeo biologicamente ativo sozinho por um fator de pelo menos 1,5, pelo menos 1,8, pelo menos

2, pelo menos 3, pelo menos 5, pelo menos 10, pelo menos 20 ou pelo menos 50 e até 10, até 20, até 40, até 60, até 80, até 100, até 100, até 200, até 250, até 270, e até um fator de 300. O fator de aumento dependerá, naturalmente, do tamanho do polipeptídeo biologicamente ativo em questão. No entanto, para um polipeptídeo biologicamente ativo na faixa de tamanho aparente de 6 kDa a 60 kDa, a proteína de fusão pode ter um tamanho aparente que é maior por um fator de pelo menos 1,5 e até um fator de cerca de 250. peptídeos biologicamente ativos, por exemplo cerca de 3 kDa, pode ainda ser preferível procurar um aumento de tamanho que não exceda um fator de 250, por exemplo cerca de 240.

[086] O tamanho da fração polipeptídica que estende a meia-vida e da proteína de fusão, respectivamente, também pode ser definido pelo raio hidrodinâmico, também conhecido como raio de Stokes, medido em nanômetros (nm). Tanto o tamanho aparente em solução como o raio hidrodinâmico são determinados por cromatografia de exclusão por tamanho (SEC), por exemplo, como descrito no Exemplo 4 abaixo.

[087] De acordo com o que foi dito acima em relação ao tamanho aparente da solução, o raio hidrodinâmico da proteína de fusão é tipicamente grande o suficiente para evitar a depuração renal. Para comparação, a albumina sérica humana, que tem um tamanho acima do limite da depuração renal, tem um raio hidrodinâmico de 3,8 nm. A proteína de fusão pode ter um raio hidrodinâmico que é pelo menos 1,25 vezes maior, ou pelo menos 1,5 vezes maior, que o raio hidrodinâmico do polipeptídeo biologicamente ativo sozinho. Por exemplo, o raio hidrodinâmico da proteína de fusão pode representar um aumento de pelo menos um fator de 2, 3, 5, 10, 20 ou 50 do raio hidrodinâmico do polipeptídeo biologicamente ativo sozinho. O raio hidrodinâmico da proteína de fusão pode ser maior que o raio hidrodinâmico do polipeptídeo biologicamente ativo por um fator de até 8, até 10, até 12, ou até 12 ou até 30 ou até 100. Verificou-se que cada a unidade de repetição da fração polipeptídica que estende a meia-vida geralmente contribui para o aumento do raio hidrodinâmico em 0,11 nm.

[088] Além do número de unidades repetidas na fração polipeptídica que estende a meia-vida, também a localização da fração polipeptídica na proteína de fusão pode afetar o aumento do tamanho. Por exemplo, espera-se que a localização no N-terminal ou no C-terminal de uma fração polipeptídica que estende a meia-vida forneça um raio hidrodinâmico maior em comparação com uma fração que estende a meia-vida localizada como uma inserção na sequência de aminoácidos do polipeptídeo biologicamente ativo (por exemplo, formando uma alça de superfície).

[089] Além disso, a estrutura desdobrada da fração de meia-vida, não apenas como tal, fornece um grande raio hidrodinâmico, mas pode contribuir para o aumento do tamanho devido ao caráter hidrofílico de muitos dos aminoácidos das unidades de repetição, pela ligação da água moléculas para a fração polipeptídica que estende a meia-vida, para aumentar ainda mais o raio hidrodinâmico.

[090] Finalmente, a glicosilação de algumas das unidades de repetição pode contribuir ainda mais para um tamanho maior, como demonstrado no Exemplo 4 abaixo. Verificou-se que uma fração polipeptídica de extensão da meia-vida de 17 unidades de repetição exibia um tamanho aparente de mais 60- 70 kDa em comparação com a mesma sequência de unidades de repetição sem glicosilação.

[091] A Figura 3 ilustra a relação entre o número de unidades de repetição e o tamanho aparente em solução de acordo com várias modalidades da invenção. Nestas modalidades, descritas nos Exemplos abaixo, um polipeptídeo biologicamente ativo foi fundido com frações de polipeptídeo com extensão de meia-vida de vários comprimentos (número diferente de unidades: 17, 34 e 51, respectivamente). Os inventores descobriram que a correlação entre o tamanho da solução e o número de unidades repetidas é linear na área investigada. Também foi constatado que o tamanho da solução de uma unidade corresponde a uma proteína globular com peso molecular de 9 kDa. Portanto, o aumento de tamanho alcançado pela adição de um determinado número de unidades pode ser previsto.

Por exemplo, uma fração polipeptídica com 80 unidades de repetição teria um tamanho aparente em solução correspondente a uma proteína globular de peso molecular de aproximadamente 720 kDa.

Além disso, verificou-se que a relação linear também é traduzida nas propriedades farmacocinéticas das proteínas de fusão, como mostrado na

Figura 5 a-c, onde a meia-vida terminal das proteínas de fusão é plotada contra o tamanho aparente na solução (ver

Exemplo 8) Essas informações podem ser usadas para ajustar as propriedades farmacocinéticas de um tempo de residência biológico, em particular a meia-vida e o tempo médio de residência, por fusão com uma fração de polipeptídeo que estende a meia-vida, conforme descrito aqui, em que a fração de polipeptídeo tem um certo tamanho, projetado para proporcionar uma meia-vida desejada in vivo.

Para cada polipeptídeo biologicamente ativo, o tamanho do polipeptídeo que estende a meia-vida em termos do número de unidades de repetição pode ser escolhido em relação ao tamanho e meia-

vida do polipeptídeo biologicamente ativo como tal, a via de administração, a dosagem quantidade e o intervalo de dosagem desejado; no entanto, a relação linear demonstrada entre o tamanho (Figura 5a, 5b) e o número de unidades (Figura 5c)

permite o design racional dos polipeptídeos de extensão da meia-vida desejados para uma proteína de fusão específica de interesse.

[092] Notavelmente, também acima do limite de tamanho da depuração renal (que é de cerca de 60 kDa para a proteína globular não carregada), um aumento no tamanho aparente na solução da proteína de fusão pode ser útil, pois ainda contribui para uma meia-vida biológica aumentada (veja o exemplo 8). No entanto, para polipeptídeos biologicamente ativos que, como tais, já possuem um tamanho aparente em solução de pelo menos 60 kDa, pode ser desejável aumentar o tamanho aparente em pelo menos um fator 2, de modo que a proteína de fusão tenha um tamanho aparente de pelo menos o dobro do polipeptídeo biologicamente ativo sozinho.

[093] Para produtos terapêuticos aprovados no mercado, a caracterização precisa é um requisito regulatório necessário e, para uma proteína glicosilada, a posição exata de quaisquer glicanos deve ser conhecida. O fato de que cada unidade da presente fração polipeptídica de extensão da meia- vida possui no máximo um sítio de O-glicosilação pode facilitar a caracterização de uma proteína de fusão expressa em sistemas de mamíferos.

[094] Uma protease adequada para a caracterização dos polipeptídeos que estendem a meia-vida de acordo com a invenção é a pepsina, que cliva após os resíduos ácidos: ácido glutâmico (Glu, E) e ácido aspártico (Asp, D). No entanto, como a pepsina normalmente não se clivará proximalmente a um resíduo glicosilado devido à interferência estérica do glicano com a protease, as unidades repetidas que transportam uma O-glicosilação terão diferentes padrões de clivagem em comparação com as unidades não glicosiladas. Com base nesse conhecimento e em vista do padrão de glicosilação limitado e relativamente previsível, a caracterização das presentes proteínas de fusão usando métodos estabelecidos, como métodos cromatográficos e espectrometria de massa, é bastante simplificada em comparação com as frações estendidas pela meia-vida que são potencialmente glicosiladas a uma extensão maciça ou desconhecida, tornando mais viável a expressão industrial das presentes proteínas de fusão em sistemas de mamíferos.

[095] Outra vantagem potencial da glicosilação da fração polipeptídica que estende a meia-vida é que a glicosilação pode fornecer um meio de aumentar a tolerância imunológica em relação à proteína de fusão. Os O-glicanos que terminam com um ácido siálico terminal ligado α2,6 podem se ligar ao CD22 ou ao Siglec-10, que são dois receptores inibidores da família da lectina do tipo imunoglobulina (Siglec) que liga o ácido siálico. Esses receptores atuam amortecendo o sinal do receptor de células B (BCR), o que pode levar ao desenvolvimento de tolerância das células B em relação à proteína de fusão. Os glicanos das proteínas humanas possuem ácido siálico terminal ligado a α2,6- e α2,3. Para aumentar o teor de ácido siálico com o ácido siálico terminal ligado a α2,6 nas proteínas de fusão expressas nas células de origem humana, a proteína de fusão de interesse pode ser co-expressa com α2,6-sialiltransferase. As proteínas de fusão produzidas nas células do ovário de hamster chinês (CHO) têm apenas ligação α2,3 devido à ausência de expressão de α2,6- sialiltransferase. Para introduzir o ácido siálico terminal ligado a α2,6 nos O-glicanos das proteínas de fusão produzidas nas células CHO, a proteína de fusão de interesse pode ser co-expressa com α2,6-sialiltransferase.

[096] Como indicado acima, com referência à Figura 2, a proteína de fusão pode compreender um ligante, tipicamente um ligante peptídico, ligando o polipeptídeo biologicamente ativo a uma ou mais frações de polipeptídeo que estendem a meia-vida, como aqui descrito. Portanto, nas modalidades da invenção, a proteína de fusão compreende ainda um ligante peptídico posicionado entre uma sequência de aminoácidos do polipeptídeo biologicamente ativo e uma sequência de aminoácidos da fração polipeptídica que estende a meia-vida.

Por exemplo, o ligante peptídico pode ser selecionado de - GS- e - (G4S)n-, em que n é um número inteiro de 1 a 5, tipicamente de 1 a 3 ou de 2 a 3. O uso de um ligante pode ser vantajoso, pois pode reduzir a ocorrência de, ou, no caso de n ser pelo menos 2, impedir a formação de neo- epítopos e subsequente ligação desses neo-epítopos por células apresentadoras de antígenos do sistema imunológico.

[097] As proteínas de fusão aqui descritas podem ser produzidas por técnicas recombinantes usando sistemas de expressão procarióticos ou eucarióticos, como mamíferos, utilizando métodos convencionais conhecidos por pessoas versadas na técnica. O Exemplo 2 abaixo descreve a clonagem e a produção de proteínas de fusão nas quais frações polipeptídicas que estendem a meia-vida são fundidas a polipeptídeos biologicamente ativos. Deve notar-se que a invenção não se limita de modo algum à utilização dessas estirpes e tipos de células do Exemplo 2; em contraste, as linhas de células adequadas para a produção de proteínas de fusão são conhecidas dos especialistas na técnica, e exemplos incluem E. coli, Pichia pastoris, Saccharomyces cerevisiae, algas, células de musgo, células vegetais como células de cenoura e células de mamíferos como como CHO, HEK-293 e HT1080.

[098] Em relação ao projeto de construções de DNA que codificam a fração polipeptídica que estende a meia-vida, pode ser vantajoso usar genes sintéticos que utilizam a redundância do código genético ao incluir variantes de códon diferentes ou todas as variantes para cada aminoácido a ser codificado. O uso de sequências de DNA mais variáveis pode facilitar a caracterização dos componentes de ácido nucleico, pois a caracterização de sequências altamente repetitivas pode ser problemática.

[099] A proteína de fusão de acordo com a invenção tem um raio hidrodinâmico aumentado e tamanho aparente em solução em comparação com o tamanho do polipeptídeo biologicamente ativo sozinho. Como consequência, pelo menos em parte da depuração renal reduzida devido ao aumento do tamanho, as propriedades farmacocinéticas da proteína de fusão são alteradas. Mais notavelmente, a meia-vida biológica é estendida, como demonstrado nos Exemplos 8 a 10 e 15 abaixo.

Estes exemplos também mostram que o efeito de extensão da meia-vida da fração polipeptídica de extensão da meia-vida é uma função do comprimento da fração (o número de unidades, ver em particular a Figura 5c).

[100] De preferência, a fração polipeptídica que estende a meia-vida estende a meia-vida biológica do polipeptídeo biologicamente ativo por um fator de pelo menos 1,5 em pelo menos uma espécie, tipicamente humanos. Em outras palavras, a proteína de fusão tem preferencialmente uma meia-vida biológica que é pelo menos 1,5 vezes a do polipeptídeo biologicamente ativo sozinho. Por exemplo, a proteína de fusão pode estender a meia-vida biológica do polipeptídeo biologicamente ativo por um fator de pelo menos 1,8, pelo menos 2, pelo menos 3, pelo menos 5, pelo menos 10, pelo menos 20 ou pelo menos 50 e até um fator de 500 ou menos, tal como um fator de 60. Por exemplo, para polipeptídeos biologicamente ativos com uma meia-vida biológica inferior a 1 hora, a meia-vida biológica pode ser estendida por um fator de até a 500, enquanto que para polipeptídeos biologicamente ativos com meia-vida biológica igual ou superior a 1 hora, pode ser suficiente se a meia-vida biológica for estendida por um fator de até 60.

[101] De uma perspectiva farmacocinética, pode ser desejável estender a meia-vida biológica o máximo possível.

No entanto, como o efeito de extensão da meia-vida demonstrou ser proporcional ao tamanho da fração de extensão da meia- vida, e as frações polipeptídicas de extensão da meia-vida muito grandes podem ser indesejáveis por várias razões, como viabilidade de produção ou impedimento de a atividade biológica do polipeptídeo biologicamente ativo, a extensão da meia-vida de um determinado polipeptídeo biologicamente ativo pode ter que ser balanceada com outros requisitos, e a extensão ideal da meia-vida pode, portanto, ser menor que a extensão máxima teórica da meia-vida alcançável por presente invenção. Por exemplo, pode ser desejável usar não mais que três frações polipeptídicas extensíveis para meia- vida de 80 unidades cada (isto é, um total de 240 unidades distribuídas por três frações) ou não mais que duas frações polipeptídicas extensíveis para meia-vida de 80 unidades cada (ou seja, um total de 160 unidades distribuídas em duas frações). Um limite superior concebível alternativo à fração polipeptídica que estende a meia-vida pode ser duas frações

(por exemplo, uma no N-terminal e uma no C-terminal) de 68 unidades cada.

[102] Além disso, a fração polipeptídica que estende a meia-vida, pode fornecer maior solubilidade à proteína de fusão. Em particular, a natureza hidrofílica da fração polipeptídica que estende a meia-vida pode ser benéfica, pois pode aumentar a biodisponibilidade de uma proteína de fusão que é administrada por via subcutânea, em relação à biodisponibilidade do polipeptídeo biologicamente ativo isolado. Nesses casos, a maior solubilidade da proteína de fusão pode promover a transferência para a corrente sanguínea, em vez de permanecer na matriz extracelular do tecido após a injeção. Isso pode significar que, para alguns polipeptídeos biologicamente ativos que, de outra forma, requerem administração intravenosa devido à biodisponibilidade limitada, a administração subcutânea pode ser uma opção realista se os polipeptídeos biologicamente ativos forem fundidos a uma fração polipeptídica que estende a meia-vida, conforme descrito aqui.

[103] Assim, a fração polipeptídica de extensão da meia- vida usada na presente invenção pode ser usada como um meio de estender a meia-vida biológica de um polipeptídeo biologicamente ativo e possivelmente de adaptar outras propriedades farmacocinéticas do mesmo.

[104] A proteína de fusão da invenção pode ser formulada como uma composição farmacêutica, para uso em terapia e/ou prevenção de uma condição, distúrbio ou doença. O termo "composição" como aqui utilizado deve ser entendido como abrangendo formas sólidas e líquidas. Uma composição pode preferencialmente ser uma composição farmacêutica, adequada para administração a um paciente (por exemplo, um mamífero), por exemplo, por injeção ou por via oral. A composição farmacêutica inclui tipicamente a proteína de fusão de acordo com a invenção e pelo menos um veículo ou substituinte farmaceuticamente aceitável. A composição farmacêutica pode, por exemplo, compreender qualquer um de um sal, um regulador de pH, um óleo, um conservante, um agente osmoticamente ativo e qualquer combinação dos mesmos.

[105] A composição farmacêutica pode ser formulada para qualquer via de administração, incluindo administração intravenosa, subcutânea, nasal, oral e tópica. Por exemplo, a composição pode ser formulada para administração intravenosa ou subcutânea.

[106] A condição, distúrbio ou doença a ser tratada não é limitada pelo polipeptídeo que estende a meia-vida; em vez disso, a adequação da proteína de fusão para o tratamento de uma condição, distúrbio ou doença específica pode ser determinada apenas pelo polipeptídeo biologicamente ativo, que pode ser um biofarmacêutico existente. Exemplos de polipeptídeos biologicamente ativos adequados que podem se beneficiar da fusão com a fração polipeptídica de meia-vida aqui descrita incluem fatores de crescimento, citocinas, enzimas, ligantes, ligantes e fragmentos de anticorpos.

[107] A proteína de fusão da invenção pode ser usada em um método de tratamento de uma condição, distúrbio ou doença, compreendendo a etapa de administração a um paciente que sofre da referida condição, distúrbio ou doença de uma proteína de fusão compreendendo um polipeptídeo biologicamente ativo útil para o tratamento de a referida condição, distúrbio ou doença, fundida com uma fração polipeptídica que estende a meia-vida como descrito aqui. O paciente é tipicamente um mamífero, como um humano. Nesse método, a administração pode ocorrer com menos frequência em comparação com um regime de tratamento envolvendo a administração apenas do polipeptídeo biologicamente ativo.

Por exemplo, o Kineret®, contendo o polipeptídeo biologicamente ativo anakinra (Met-hull-1Ra) é normalmente administrado diariamente por injeção subcutânea. No entanto, uma proteína de fusão de IL-1Ra e uma fração polipeptídica que estende a meia-vida, conforme descrito aqui, podem aumentar a meia-vida biológica em pelo menos um fator 2, de modo que a proteína de fusão possa ser administrada em dias alternados ou por um fator de pelo menos 3, ou pelo menos 7, de modo que possa ser administrado duas ou mesmo uma vez por semana. Para alguns polipeptídeos biologicamente ativos, como hormônio do crescimento, pode ser desejável estender ainda mais o período de tempo entre cada dose; por exemplo, está prevista uma dosagem uma vez por mês.

[108] A invenção será ainda descrita nos seguintes exemplos.

Exemplos

[109] Exemplo 1: Identificação de unidades repetidas de origem humana

[110] Foi realizada uma pesquisa blast com o domínio catalítico da lipase estimulada por sal biliar (BSSL) versus o banco de dados de sequências de proteínas não redundantes no Instituto Nacional de Saúde (NIH), EUA, e identificou 10 sequências de proteínas relatadas para a proteína de origem humana que continha todo ou parte do domínio não estruturado repetitivo do C-terminal.

[111] Material e Métodos

[112] A explosão no NIH foi usada para procurar proteínas de origem humana que correspondam ao domínio catalítico da lipase estimulada por sal biliar com UniProt ID P19835 (número de acesso CEL_HUMAN).

[113] Resultados

[114] A pesquisa BLAST resultou na localização de 10 entradas que continham uma fração significativa do domínio catalítico e do domínio não estruturado repetitivo do C-

terminal.

O número de unidades de repetição nos domínios diferiu e foi observada alguma variabilidade entre a sequência das unidades de repetição, consulte a Tabela 1 para os diferentes acertos.

Cada domínio de repetição é iniciado por uma sequência truncada de 9 resíduos, enquanto as unidades de repetição mais prevalentes têm 11 resíduos de comprimento.

Na tabela abaixo, as unidades repetidas são separadas por um sinal "~" para maior clareza.

O trecho de sequência final do domínio não estruturado não possui similaridade de sequência com as unidades de repetição e está sublinhado na Tabela 1. Na lista de sequências anexas,

as frações repetitivas (isto é, excluindo os motivos hidrofóbicos sublinhados) são representadas pelas SEQ ID

NOs: 12 a 21

Tabela 1. Variantes do BSSL-CTD humano.

Descrição Parte Sequência repetitiva representada Petição 870190129824, de 09/12/2019, pág. 72/164 por P19835.3 Lipase ativada SEQ ID NO: 12 PTVTDQEAT~PVPPTGDSEAT~PVPPTGDSETA~PVPPTGDSGAP~PVPPTGDSGAP~PVPPTGDSGAP~ por sal biliar PVPPTGDSGAP~PVPPTGDSGAP~PVPPTGDSGAP~PVPPTGDSGAP~PVPPTGDSGAP~PVPPTGDAGPP~ PVPPTGDSGAP~PVPPTGDSGAP~PVTPTGDSETA~PVPPTGDSGAP~PVPPTGDSEAA~PVPPTDDSKEA~

QMPAVIRF NP_001798.2 precursor da SEQ ID NO: 13 PTVTDQEAT~PVPPTGDSEAT~PVPPTGDSETA~PVPPTGDSGAP~PVPPTGDSGAP~PVPPTGDSGAP~ lipase ativada por sal 57/125 PVPPTGDSGAP~PVPPTGDSGAP~PVPPTGDSGAP~PVPPTGDSGAP~PVPPTGDSGAP~PVPPTGDAGPP~ biliar [Homo sapiens] PVPPTGDSGAP~PVPPTGDSGAP~PVTPTGDSETA~PVPPTGDSGAP~PVPPTGDSEAA~PVPPTDDSKEA~

QMPAVIRF Produto proteico sem nome SEQ ID NO: 14 PTVTDQEAT~PVPPTGDSEAT~PVPPTGDSETA~PVPPTGDSGAP~PVPPTGDSGAP~PVPPTGDSGAP~ CAA38325.1 [Homo sapiens] PVPPTGDSGAP~PVPPTGDSGAP~PVPPTGDSGAP~PVPPTGDSGAP~PVPPTGDAGPP~PVPPTGDSGAP~ > AAA51973.1 lipase de PVPPTGDSGAP~PVTPTGDSETA~PVPPTGDSGAP~PVPPTGDSEAA~PVPPTDDSKEA~QMPAVIRF éster carboxílico [Homo sapiens]> AAC26514.1 lipase de éster carboxílico [Homo sapiens]> EAW88033.1 lipase de éster carboxílico (lipase

Petição 870190129824, de 09/12/2019, pág. 73/164 estimulada por sal biliar), isoforma CRA_d

[Homo sapiens]> sal biliar prfll1702227A lipase estimulada do leite

Lipase ativada por sal SEQ ID NO: 15 PTVTDQEAT~PVPPTGDSEAT~PVPPTGDSETA~PVPPTGDSGAP~PVPPTGDSGAP~PVPPTGDSGAP~ biliar AAA63211.1 [Homo PVPPTGDSGAP~PVPPTGDSGAP~PVPPTGDSGAP~PVPPTGDSGAP~PVPPTGDAGPP~PVPPTGDSGAP~ sapiens] 58/125

PVPPTGDSGAP~PVTPTGDSETA~PVPPTGDSGAP~PVPPTGDSEAA~PVPPTDDSKEA~QMPAVIRF > prfl I1717328A éster carboxílico lipase

Colesterol esterase SEQ ID NO: 16 PTVTDQEAT~PVPPTGDSEAT~PVPPTGDSETA~PVPPTGDSGAP~PVPPTGDSGAP~PVPPTGDSGAP~

AAA52014.1 [Homo sapiens] PVPPTGDSGAP~PVPPTGDSGAP~PVPPTGDSGAP~PVPPTGDSGAP~PVPPTGDAGPP~PVPPTGDSGAP~

PVPPTGDSGAP~PVTPTGDSETA~PVPPTGDSGAP~CAPRVTLRLPLCPPQMTPRKLRCLQSIGFSVP

AAC71012.1 isoforma SEQ ID NO: 17 PTVTDQEAT~PVPPTGDSEAT~PVPPTGDSETA~PVPPTGDSGAP~PVPPTGDSGAP~PVPPTGDSEAA~ oncofetal de lipase PVPPTGDSKEA~QMPAVIRF dependente de sal biliar,

parcial [Homo sapiens]

Proteína CEL AAH42510.1 SEQ ID NO: 18 PTVTDQEAT~PVPPTGDSEAT~PVPPTGDSETA~PVPPTGDSGAP~PVPPTGDSGAP~PVPPTGDSGAP~

[Homo sapiens] PVPPTGDSGAP~PVPPTGDSGAP~PVPPTGDAGPP~PVPPTGDSGAP~PVPPTGDSGAP~PVTPTGDSETA~

Petição 870190129824, de 09/12/2019, pág. 74/164 PVPPTGDSGAP~PVPPTGDSEAA~PVPPTDDSKEA~QMPAVIRF

Lipase dependente de sal SEQ ID NO: 19 PTVTDQEAT~PVPPTGDSEAT~PVPPTGDSETA~PVPPTGDSGAP~PVPPTGDSGAP~PVPPTGDSGAP~ biliar AAB35488.2 [Homo PVPPTGDSGAP~PVPPTGDSGAP~PVPPTGDSGAP~PVPPTGDSGAP~PVPPTGDAGPP~PVPPTGDSGPP~ sapiens] PVPPTGDSGAP~PVTPTGDSETA~PVPPTGDSGAP~PVPPTGDSEAA~PVPPTDDSKEA~QMPAVIRF

EAW88031.1 lipase de SEQ ID NO: 20 PTVTDQEAT~PVPPTGDSEAT~PVPPTGDSETA~PVPPTGDSGAP~PVPPTGDSGAP~PVPPTGDSGAP~ éster carboxílico (lipase PVPPTGDSGAP~PVPPTGDSGAP~PVPPTGDSGAP~PVPPTGDSGAP~PVPPTDDSKEA~QMPAVIRF estimulada por sal 59/125 biliar), isoforma CRA b,

parcial [Homo sapiens]

Produto proteico sem nome SEQ ID NO: 21 PTVTDQEAT~PVPPTGDSEAT~PVPPTGDSETA~PVPPTGDSGAP~PVPPTGDSGAP~PVPPTGDSGAP~

BAG61791.1 [Homo sapiens] PVPPTGDSGAP~PVPPTGDSGAP~PRAAHG

[115] A Tabela 2 abaixo lista as sequências únicas de unidades repetidas de origem humana, com referência ao número de identidade da sequência na lista de sequências em anexo.

Os resíduos ausentes da primeira sequência são marcados por um traço. Os locais potenciais de O-glicosilação estão sublinhados.

Tabela 2. Unidades correspondentes às unidades de repetição encontradas no BSSL-CTD humano. O potencial sítio de glicosilação está sublinhado.

SEQ ID NO Sequência SEQ ID NO: 2 --PTVTDQEAT SEQ ID NO: 3 PVPPTGDSEAT SEQ ID NO: 4 PVPPTGDSETA SEQ ID NO: 5 PVPP-TGDSGAP SEQ ID NO: 6 PVPPTGDAGPP SEQ ID NO: 7 PVTPTGDSETA SEQ ID NO: 8 PVPPTGDSEAA SEQ ID NO: 9 PVPPTDDSKEA SEQ ID NO: 10 PVPPTGDSGPP SEQ ID NO: 11 PVPPTGDSKEA

[116] Portanto, existe uma variedade de comprimentos do domínio C-terminal na população humana. Além disso, a ordem das unidades repetidas pode variar na população humana. Isso poderia implicar que variações na ordem das unidades repetidas e no comprimento de todos os motivos do domínio sejam permitidas. Cada unidade possui um sítio que pode ser O-glicosilado.

[117] A forma humana mais prevalente é composta pela combinação da seguinte sequência de unidades repetidas: [SEQ ID NO: 2] - [SEQ ID NO: 3] - [SEQ ID NO: 4] - [SEQ ID NO: 5] - [SEQ ID NO: 5] - [SEQ ID NO: 5] - [SEQ ID NO: 5] - [SEQ ID NO: 5] - [SEQ ID NO: 5] - [SEQ ID NO: 5] - [SEQ ID NO: 5] - [SEQ ID NO: 6] - [SEQ ID NO : 5] - [SEQ ID NO: 5] - [SEQ ID NO: 7] - [SEQ ID NO: 5] - [SEQ ID NO: 8] - [SEQ ID NO: 9]

[118] Expresso de forma diferente: [SEQ ID NO: 2] - [SEQ ID NO: 3] - [SEQ ID NO: 4] - [SEQ ID NO: 5]x8 - [SEQ ID NO: 6] - [SEQ ID NO: 5]x2 - [SEQ ID NO: 7] - [SEQ ID NO: 5] - [SEQ ID NO: 8] - [SEQ ID NO: 9]

[119] Exemplo 2: Clonagem e produção de proteínas de fusão

[120] Este exemplo descreve as estratégias gerais para clonagem e produção de proteínas de fusão em diferentes formatos, que foram usadas nos exemplos abaixo.

[121] Material e Métodos

[122] Construtos de DNA: sequências de DNA (consulte a Tabela 3 abaixo) que codificam um conjunto de proteínas de fusão, incluindo polipeptídeos com meia-vida estendida, foram otimizadas para a expressão em E. coli ou para expressão em células humanas (Expi293) e sintetizadas pelo serviço Invitrogen GeneArt Gene Synthesis na Thermo Fisher

Scientific.

Os genes foram clonados em vetores de expressão para expressão subsequente em E. coli ou em células Expi293.

Tabela 3. Visão geral das proteínas de fusão e sequências nucleotídicas correspondentes.

Nome Descrição Número de unidades da Número de Sequência fração polipeptídica de polipeptídeo(s) de extensão de meia-vida biologicamente Petição 870190129824, de 09/12/2019, pág. 78/164 nucleotídeo ativo(s) PSI0540 IL1RA-G4SG4SG4S- [metade do polipeptídeo com 17 1 SEQ ID extensão de meia-vida] NO:22 PSI0541 IL1RA-G4SG4SG4S- [fração polipeptídica com 17 2 SEQ ID extensão da meia-vida] -GS-IL1RA NO:23 PSI0542 IL1RA-G4SG4SG4S- [fração polipeptídica com 34 1 SEQ ID 63/125 extensão da meia-vida] -GS NO:24 PSI0543 IL1RA-G4SG4SG4S- [fração polipeptídica com 34 1 SEQ ID extensão da meia-vida] -GS NO:25 PSI0544 M-IL1RA-G4SG4S- [fração polipeptídica com 34 1 SEQ ID extensão da meia-vida] -GS NO:26 PSI0545 M- IL1RA-G4SG4S- [fração polipeptídica com 34 1 SEQ ID extensão da meia-vida] -GS NO:27

PSI0546 M-IL1RA-G4SG4S- [fração polipeptídica com 51 1 SEQ ID extensão da meia-vida] -GS NO:28

PSI0547 M-IL1RA-G4SG4S- [fração polipeptídica com 51 1 SEQ ID extensão da meia-vida] -GS NO:29

Petição 870190129824, de 09/12/2019, pág. 79/164 PSI0548 M-IL1RA-G4SG4S- [fração polipeptídica com 68 1 SEQ ID extensão da meia-vida] -GS NO:30

PSI0549 M-IL1RA-G4SG4S- [fração polipeptídica com 68 1 SEQ ID extensão da meia-vida] -GS NO:31

PSI0550 M-IL1RA-G4SG4S- [fração polipeptídica com 34 2 SEQ ID

NO:32 64/125 extensão da meia-vida] -GSG4SG4S-IL 1RA

PSI0551 M-IL1RA-G4SG4S- [fração polipeptídica com 34 2 SEQ ID extensão da meia-vida] -GSG4SG4S-IL 1RA NO:33

PSI0493 Z06175 (bb1) -GS- [fração polipeptídica 17 1 SEQ ID prorrogável pela meia-vida] NO:34

[123] Cultivo e purificação: As células E. coli foram transformadas com vetores de expressão contendo os fragmentos de genes que codificam as proteínas de fusão recombinantes e, em seguida, cultivadas em biorreatores usando técnicas de lote alimentado ou em frascos de agitação, seguidos pela expressão de proteínas e colheita de células por centrifugação. Os péletes celulares foram armazenados a -20 ºC ou diretamente indivíduos a choque osmótico, as proteínas liberadas foram esclarecidas por centrifugação e armazenadas a -20 ºC. A expressão de proteínas de fusão recombinantes também foi realizada usando o sistema de expressão Expi293 (Thermo Fisher Scientific), essencialmente de acordo com o protocolo do fabricante. Os sobrenadantes foram colhidos por centrifugação 6 dias após a transfecção dos vetores de expressão e armazenados a – 70 ºC. A Tabela 4 lista as sequências de proteínas codificadas.

[124] Os grânulos de células de E. coli congelados foram ressuspensos e depois rompidos por sonicação e os detritos celulares subsequentemente removidos por centrifugação seguida de filtração (0,22 µm). Amostras de choque osmótico e sobrenadantes das culturas Expi293 foram descongeladas e filtradas (0,22 µm) antes da purificação. Cada sobrenadante, contendo as proteínas de fusão recombinantes, foi purificado usando métodos convencionais de cromatografia, como cromatografia de afinidade, cromatografia de troca iônica,

cromatografia de interação hidrofóbica e cromatografia de exclusão por tamanho. As proteínas de fusão recombinantes para uso em estudos com animais também foram submetidas a uma purificação por remoção de endotoxina usando colunas de remoção de endotoxina em gel Detoxi (Pierce, cat. no 20344).

As proteínas de fusão purificadas foram trocadas de tampão para PBS e, salvo indicação em contrário, o PBS também foi o tampão de formulação utilizado em experiências subsequentes. A pureza das proteínas de fusão foi analisada por SDS-PAGE corada com azul de Coomassie e o peso molecular de cada proteína foi analisado usando espectrometria de massa (HPLC/MS ou MALDI-TOF/MS).

[125] Resultados

[126] Todas as proteínas de fusão foram expressas em células de E. coli ou Expi293 como proteínas solúveis. A Figura 4 mostra o resultado da expressão no E. coli do Met- hulL-1Ra contendo 51 e 68 unidades de repetição, respectivamente, analisadas por SOS-PAGE. Pista 1: marcador SeeBlue Plus 2, 10 ul. Pista II: unidades de repetição M- IL1RA 51, células colhidas, tratadas com Bugbuster/rLysozyme/Bensonase, 7 ul. Pista III: unidades repetitivas M-IL1RA 51, material de choque osmótico, 1,5 ul.

Pista IV: unidades de repetição M IL1RA 51, material de choque osmótico, 3 ul. Pista V: unidades de repetição M- IL1RA 68, células colhidas, tratadas com

Bugbuster/rlysozyme/Bensonase, 7 ul. Pista VI: unidades repetitivas M-IL1RA 68, material de choque osmótico, 1,5 ul.

Pista VII: unidades repetitivas M-IL1RA 68, material de choque osmótico, 3 ul. As posições das proteínas de fusão são marcadas com duas linhas curtas.

[127] A purificação resultou em preparações de proteínas com alta pureza, que foram analisadas por SDS-PAGE corada com azul de Coomassie. A identidade correta e o peso molecular de cada proteína de fusão foram confirmados por análise por espectrometria de massa.

Tabela 4. Nome da proteína, sistema de expressão e SEQ ID das proteínas produzidas.

Número PSI Descrição Número de Sequência de unidades proteínas Petição 870190129824, de 09/12/2019, pág. 83/164 PSI0162 Met-hulL-1Ra (Anakinra) - SEQ ID NO: 35 PSI0493 Z06175 (bb1) -GS- [fração polipeptídica prorrogável pela 17 SEQ ID NO: 37 meia-vida] PSI0540 IL1RA-G4SG4SG4S- [metade do polipeptídeo com extensão de 17 SEQ ID NO: 38 meia-vida] PSI0541 IL1RA-G4SG4SG4S- [fração polipeptídica com extensão da 17 SEQ ID NO: 39 68/125 meia-vida] -GS-IL1RA PSI0542 IL1RA-G4SG4SG4S- [fração polipeptídica com extensão da 34 SEQ ID NO: 40 meia-vida] -GS PSI0543 IL1RA-G4SG4SG4S- [fração polipeptídica com extensão da 34 SEQ ID NO: 41 meia-vida] -GS PSI0544 M-IL1RA-G4SG4S- [fração polipeptídica com extensão da meia- 34 SEQ ID NO: 42 vida] -GS PSI0545 M- IL1RA-G4SG4S- [fração polipeptídica com extensão da 34 SEQ ID NO: 43 meia-vida] -GS

PSI0546 M-IL1RA-G4SG4S- [fração polipeptídica com extensão da meia- 51 SEQ ID NO: 44 vida] -GS

PSI0547 IL1RA-G4SG4S- [fração polipeptídica com extensão da meia- 51 SEQ ID NO: 45

Petição 870190129824, de 09/12/2019, pág. 84/164 vida] -GS

PSI0548 M-IL1RA-G4SG4S- [fração polipeptídica com extensão da meia- 68 SEQ ID NO: 46 vida] -GS

PSI0549 M-IL1RA-G4SG4S- [fração polipeptídica com extensão da meia- 68 SEQ ID NO: 47 vida] -GS 69/125

PSI0550 M-IL1RA-G4SG4S- [fração polipeptídica com extensão da meia- 34 SEQ ID NO: 48 vida] -GSG4SG4S-IL1RA

PSI0551 M-IL1RA-G4SG4S- [fração polipeptídica com extensão da meia- 34 SEQ ID NO: 49 vida] -GSG4SG4S-IL1RA

PEG(L30kDa)-Met-hulL-1Ra - PEG-L30K-[SEQ ID

NO:

35]

[128] Conclusões

[129] As proteínas de fusão contendo polipeptídeos que estendem a meia-vida de vários comprimentos podem ser produzidas construindo genes sintéticos seguidos de expressão em E. coli ou sistemas de mamíferos e purificação com alta pureza usando técnicas convencionais.

[130] Exemplo 3: Síntese química de proteínas de fusão

[131] Este exemplo descreve as estratégias gerais para a produção de polipeptídeos em diferentes formatos por síntese química, que foram usadas nos exemplos adicionais abaixo.

[132] Materiais e Métodos

[133] Versões quimicamente sintetizadas de GLP-1 (7-37) (Bachem AG, número de catálogo H5102), GLP-2 (1-33) (Bachem AG, número de catálogo H-7742), GLP-1 (7-37) - metade polipeptídeo de extensão da vida útil (2 unidades de 11 resíduos cada), GLP- 2 (1-33) - polipeptídeo de extensão da meia-vida (uma unidade), GLP-2 (1-33) - polipeptídeo de extensão da meia-vida (duas unidades) foram encomendados à BACHEM AG. As proteínas liofilizadas foram dissolvidas em um tampão contendo NaP 25 mM e NaCl 125 mM a pH 7 com uma concentração alvo de 10 mg/ml. Os compostos de ligação C5 PSI0400 e sua versão PEGuilada PSI0489 também foram encomendados à BACHEM AG, o PSI0489 foi dissolvido no tampão acima mencionado a uma concentração de 35 mg/ml e o PSI0400 foi dissolvido a uma concentração de 29 mg/ml. Os detalhes das proteínas estão resumidos na Tabela 5.

Tabela 5. Nome e sequência de proteínas de fusão sintetizadas quimicamente Número PSI Descrição Sequência PSI0400 Z06175(N52S, D53E) SEQ ID NO: 50 PSI0489 Z06175-Cys-PEG(L30kDa) [SEQ ID NO: 51]-PEG-L30K PSI0611 GLP-2 BSSL CTD 22 aa SEQ ID NO: 52 PSI0612 GLP-2 BSSL CTD 11 aa SEQ ID NO: 53 PSI0614 GLP-1(7-37) BSSL CTD SEQ ID NO: 54 22 aa PSI0632 GLP-1(7-37) SEQ ID NO: 55 PSI0633 GLP-2 (1-33) SEQ ID NO: 56

[134] A integridade e a identidade das proteínas sintetizadas quimicamente foram confirmadas por espectrometria de massa (HPLC/MS ou MALDI-TOF/MS).

[135] Resultados

[136] As proteínas quimicamente sintetizadas contendo um polipeptídeo meia-vida existente poderiam ser dissolvidas na concentração desejada, enquanto o GLP-1 exibia alguma precipitação a 10 mg/ml e o GLP-2 só poderia ser dissolvido na metade da concentração, 5 mg/ml. Isto mostrou a natureza hidrofílica das unidades de repetição de polipeptídeos que se estendem pela meia-vida e a utilidade de aumentar a solubilidade de uma proteína, fundindo-as a essas sequências. PSI0400 e PSI0489 podem ser facilmente dissolvidos em concentrações acima de 20 mg/ml. A identidade correta e o peso molecular de cada variante foram confirmados por análise por espectrometria de massa.

[137] Conclusões

[138] A fusão de peptídeos e polipeptídeos que estendem a meia-vida pode ser produzida por síntese química. As proteínas de fusão que contêm um polipeptídeo de extensão de meia-vida exibem uma solubilidade aumentada evidente ao permitir criar soluções com maior concentração.

[139] Exemplo 4: Caracterização biofísica de proteínas de fusão

[140] Este exemplo descreve a caracterização de proteínas de fusão contendo polipeptídeos que estendem a meia-vida, usando proteínas ou peptídeos não fundidos e proteínas PEGuiladas como referências, no que diz respeito a características biofísicas, como tamanho aparente e peso molecular em solução e determinação do raio hidrodinâmico em solução por exclusão de tamanho cromatografia (SEC) e calibração de coluna e espalhamento de luz multi-ângulo (MALS).

[141] Material e Métodos

[142] O tamanho das proteínas de fusão, proteínas não fundidas e proteínas PEGuiladas em solução, foi avaliado por filtração analítica em gel em um AKTA Micro (GE Healthcare Life Sciences) usando uma coluna calibrada Superdex 200 Aumento 3,2/300 (GE Healthcare Life Sciences). A coluna foi calibrada com o Gel Filtration Calibration Kit LMW (código nº 28-4038-41, GE Healthcare Life Sciences) e o Kit de Calibração HMW (código nº 28-4038-42, GE Healthcare Life Sciences), contendo 8 proteínas globulares a faixa de tamanho de 6 a 669 kDa e Blue Dextran 2000, usando um tampão de NaP 25 mM e NaCI 125 mM pH 7,0 com uma vazão de 75 µl/min a uma temperatura de 25 ºC. O tamanho e o raio hidrodinâmico correspondentes em solução podem ser calculados a partir do volume de eluição de uma proteína em uma coluna calibrada pelos métodos descritos no apêndice 10 do Manual de princípios e métodos de cromatografia de exclusão por tamanho (número de ordem 18-1022-18, GE Healtcare Life Sciences).

[143] As proteínas de interesse foram analisadas nas condições sarne como durante a calibração. O peso molecular das proteínas foi determinado pelo sistema MALS-RI: detector estático de dispersão de luz DAWN HELEOS 8+ e refratômetro diferencial Optilab T-rEX, e o software Astra 6 (Wyatt Technology Europe, Alemanha) conectado a um HPLC Agilent 1100 (Agilent Technologies) usando uma coluna AdvanceBio SEC 300 A de 2,7um 7,8x300 mm (número da peça Agilent: PL1180- 5301, Agilent Technologies). A temperatura da coluna era de

30 °C e o tampão de corrida era PBS, pH 7,0 com uma taxa de fluxo de 0,7 mL/min.

[144] Resultados

[145] As tabelas 6, 7 e 8 apresentam os resultados para fusões de IL-1Ra, fusões de moléculas Affibody® e peptídeos de GLP-1 e GLP-2, respectivamente.

Tabela 6. Moléculas à base de IL-1Ra

Sequência Nome MW teórico MWMALS MW por volume de Raio de Stokes Expressão Aumento de N º de

(kDa) (kDa) eluição (kDa) (nm) tamanho Unidades

SEQ ID NO: E, coli

Petição 870190129824, de 09/12/2019, pág. 90/164 44 PSI0546 68,3 76,6 533 7,6 36,8 51

SEQ ID NO: E, coli

45 PSI0547 69,2 72,7 587 7,8 40,5 51

SEQ ID NO: E, coli

43 PSI0545 52,1 47,6 299 6,6 20,6 34

SEQ ID NO:

40 PSI0542 51,9 66,3 352 6,9 Expi293 24,3 34 75/125

SEQ ID NO:

38 PSI0540 35,3 43,2 132 5,3 Expi293 9,1 17

(lote BB1595)

SEQ ID NO:

38 PSI0540 (lote 35,3 50,0 204 6,0 Expi293 14,1 17

B81596)

SEQ ID NO: E, coli

49 PSI0551 69,9 67,0 334 6,8 11,5 34

SEQ ID NO:

39 PSI0541 52,4 53,9 156 5,6 Expi293 5,4 17

Met-hulL-1Ra 17,3 17,6 14,5 1,6 E, coli - o

SEQ ID NO:

35

Petição 870190129824, de 09/12/2019, pág. 91/164 E, coli

PEGL10K- Met- 27,6 29,8 112 4,3 7,7 PEG 10K hulL-1Ra

E, coli

PEGL20K- Met- 38,7 39,0 253 5,6 17,4 PEG 20K 76/125 hulL-1Ra

E, coli

PEGL30K- Met- 49,8 48,8 392 6,4 27,0 PEG30K hulL-1Ra

Tabela 7. Moléculas à base de Affibody®

Sequência Constructo MW teórico MWMALS MW por volume de Raio de Expressão Aumento N º de

(kDa) (kDa) eluição Stokes de Unidades

(kDa) (nm) tamanho

Petição 870190129824, de 09/12/2019, pág. 92/164 SEQ ID PSI0493 23,9 25 146 4,7 E. coli 10,1 17

NO: 37

[SEQ ID PSI0489- 36 39,6 346 6,1 Sintético 23,9 -

NO: 51]- PEGL30K

PEGL30K

SEQ ID PSI0400 6,6 7,2 14,5 1,6 Sintético - o 77/125

NO: 50

Tabela 8. Peptídeos GLP-1/GLP-2 sintéticos Sequência Descrição MW teórico (kDa) Mw MALS Mw por volume de Stokes Aumento de N º de (kDa) eluição (kDa) radius (nm) tamanho Unidades SEQ ID NO: 55 GLP-1(7-37) 3,4 6,4 6,3 0,3 - o Petição 870190129824, de 09/12/2019, pág. 93/164 SEQ ID NO: 54 GLP-1(7-37)- 22 BSSL 5,5 7,5 16 1,7 2,5 2

CTD SEQ ID NO: 56 GLP-2(1-33) 3,8 8,8 9,8 1,0 - o SEQ ID NO: 53 GLP-2(1-33)-11 BSSL 4,8 8,7 17,7 1,8 1,8 1

CTD SEQ ID NO: 52 GLP-2(1-33)-22 BSSL 5,9 17,4 20,6 2,1 2,1 2

CTD 78/125

[146] Além disso, as Figuras 3a e 3b ilustram a relação entre tamanho e número de unidades na fração de meia-vida para diferentes moléculas: os diamantes mostram os raios de Met-hulL-1Ra (os valores "0" representam a ausência de meia- vida) frações polipeptídicas) e fusões de um único IL-1Ra com frações polipeptídicas com meia vida útil, os quadrados mostram raios de PSI0400 e suas fusões com frações polipeptídicas extensíveis com meia vida, os triângulos mostram raios de GLP-1 e uma fusão com uma metade a fração polipeptídica que estende a vida e os cruzamentos mostram raios de GLP-2 e suas fusões com frações polipeptídicas que estendem a meia-vida.

[147] A Figura 3a mostra o peso molecular aparente, ou seja, o tamanho aparente na solução (embora simplesmente indicado como "MW" no gráfico) determinado pelo volume de eluição (SEC) em função do número de unidades da fração polipeptídica que estende a meia-vida. A Figura 3b mostra o raio hidrodinâmico em função do número de unidades da fração polipeptídica que estende a meia-vida das mesmas amostras que na Figura 3a.

[148] Conclusões

[149] Foi observada uma correlação entre o comprimento da fusão do polipeptídeo de extensão da meia-vida e o tamanho da solução: cada unidade de 11 resíduos, com um peso molecular real em média de 1 kDa, correspondia ao tamanho de uma proteína globular de MW 9 kDa em solução, devido à sua natureza desdobrada.

[150] Em uma nota lateral, o raio hidrodinâmico ou o raio de Stokes da albumina é de 3,8 nm, o que poderia servir como um marcador de tamanho mínimo necessário para evitar a depuração renal, tendo em vista que a albumina, como tal, está acima do limite de tamanho da depuração renal.

[151] A glicosilação que a proteína de fusão recebe no sistema mamífero aumenta ainda mais o tamanho da proteína de fusão, como é evidente pelo tamanho aumentado do PSI0540: BB1596 glicosilado em comparação com o PSI0540: BB1595 não glicosilado, que possui a mesma sequência de aminoácidos.

[152] Exemplo 5: análise da atividade farmacológica in vitro usando um ensaio baseado em células.

[153] Os fibroblastos dérmicos humanos normais (NHDF) respondem à IL-113 pela produção de IL-6, um recurso que pode ser explorado para bloquear estudos in vitro. Nesta experiência, a capacidade de proteínas de fusão recombinantes de IL-1Ra e polipeptídeos que estendem a meia- vida para bloquear a IL-113 foi testada em um ensaio de NHDF.

[154] Materiais e Métodos

[155] As células foram semeadas três dias antes do tratamento com proteínas. As proteínas (proteínas de fusão IL-1Ra recombinantes de acordo com modalidades da invenção, Met-hulL-1Ra PEGuilado ou Anakinra/Met-hulL-1Ra) foram diluídas para uma concentração inicial de 100 nM e subsequentemente diluídas em série 1: 4 nove vezes, resultando em uma gama de concentrações de 100 nM a 0,38 pM no meio de crescimento livre de soro na presença de albumina sérica humana recombinante 9 uM (rHSA). As proteínas de fusão IL-1Ra recombinantes com polipeptídeos que estendem a meia- vida e Met-hull-1Ra foram testadas na presença de uma dose de desafio de 3,4 pM de IL-113 e as células foram incubadas por 22 horas com proteínas a 37 ºC, seguida de colheita de meio. O meio colhido foi diluído 41 X antes que o conteúdo de IL-6 fosse analisado usando um kit ELISA de IL-6 humano (R&D Systems) de acordo com as recomendações do fabricante.

Os dados foram analisados usando X1fit e os valores de IC50 foram calculados a partir de curvas de resposta à concentração.

[156] Resultados

[157] A liberação de IL-6 induzida por IL-1b a partir de células NHDF foi reduzida de maneira dependente da concentração pelas proteínas de fusão IL-1Ra, PEGuilado Met hulL-1Ra, bem como por Anakinra/Met-hull-1Ra. Os dados das experiências são apresentados na Tabela 9.

Tabela 9. Inibição in vitro da sinalização de IL-1 Sequência Nome Descrição Número NHDF ICSO de (pM) unidades SEQ ID NO: PSI0547 IL1RA-G4SG4S-[fração 51 2500 45 polipeptídica de extensão de meia-vida]-GS SEQ ID NO: PSI0545 M-IL1RA-G4SG4S-[fração 34 914 43 polipeptídica de extensão de meia-vida]-GS SEQ ID NO: PSI0542 IL1RA-G4SG4SG4S-[fração 34 6490 40 polipeptídica de extensão de meia-vida]-GS SEQ ID NO: PSI0540 IL1RA-G4SG4SG4S-[fração 17 2520 38 polipeptídica de extensão de meia-vida] SEQ ID NO: PSI0541 IL1RA-G4SG4SG4S-[fração 17 400 39 polipeptídica de extensão de meia-vida]-GS-IL1RA SEQ ID NO: PSI0551 M-IL1RA-G4SG4S-[fração 34 146 49 polipeptídica de extensão de meia-vida]-GSG4SG4S-IL1RA SEQ ID NO: Met-hull- o 70 35 1Ra PEG(L30kDa)- PEGylated - 900 [SEQ ID NO: Met-hull- 35] 1Ra

[158] O resultado mostrou que a resposta à secreção de citocinas induzida por IL-1b foi reduzida de maneira dependente da concentração pelo efeito antagonista das fusões recombinantes de IL-1Ra com polipeptídeos que se estendem pela meia-vida, levando a uma liberação reduzida de IL-6 do Células NHDF.

[159] Conclusões

[160] A fusão com o polipeptídeo de extensão da meia- vida diminuiu a atividade do IL-1Ra em uma questão dependente do tamanho, mas não aboliu a função biológica.

[161] Exemplo 6: inibição da atividade hemolítica no soro com deficiência de C5

[162] Para estudos da função clássica da via do complemento e sua inibição por PSI0493 (SEQ ID NO: 37), PSI0489 ([SEQ ID NO: 51] -PEG30K) e PSI0400 (SEQ ID NO: 50), foram preparados eritrócitos de ovinos a partir de ovinos frescos sangue total na solução da Alsever (instituto nacional veterinário sueco) e posteriormente tratado com anti-soro de eritrócito de coelho anti-ovelha (Sigma) para se tornar eritrócito de ovelha sensibilizado a anticorpos (EA). Todo o processo foi realizado em condições assépticas.

Todos os outros reagentes eram de fontes comerciais.

[163] O ensaio in vitro foi realizado em placa de microtitulação em forma de U de 96 cavidades por adições consecutivas de uma proteína de teste, soro de complemento e suspensão de EA. As concentrações finais de todos os reagentes, em um volume total de reação de 50 µL por cavidade e em pH 7,3-7,4, foram: CaCl2 0,15 mM; MgCl2 0,5 mM; NaN3 3 mM; NaCl 138 mM; Gelatina a 0,1%; Barbital de sódio 1,8 mM; Ácido barbitúrico 3,1 mM; 5 milhões de EA; complemente o soro da proteína C5 em diluição adequada e polipeptídeos de ligação a C5 nas concentrações desejadas.

[164] As proteínas investigadas foram pré-incubadas com o soro de complemento descrito acima por 20 min em gelo antes de iniciar a reação pela adição de suspensão de EA. A reação hemolítica foi deixada prosseguir a 37 ºC durante agitação por 45 min e foi finalizada pela adição de 100 µL de solução salina gelada contendo 0,02% de Tween 20. As células foram centrifugadas no fundo e na fração superior, correspondendo a 100 µL sobrenadante, foi transferido para uma microplaca transparente com cavidades de meia área e fundo plano. Os resultados da reação foram analisados como densidade ótica usando um leitor de placas de microtitulação no comprimento de onda de 415 nm.

[165] As potências inibidoras (valores de IC50) dos polipeptídeos de ligação a C5 testados foram definidas aplicando o mesmo ensaio na presença de uma concentração controlada de C5 humano adicionada ao soro empobrecido em C5. Para inibidores altamente potentes (baixo nanomolar a sub-nanomolar), uma concentração final de C5 da mistura de reação foi controlada a 0,1 nM. Os resultados são apresentados na Tabela 10.

Tabela 10. As potências inibidoras dos polipeptídeos de ligação C5 testados Sequência Nome N° de IC 50 (nM) unidades SEQ ID NO: 37 PSI0493 17 0.5 SEQ ID NO: 50 PSI0400 o 2.9 [SEQ ID NO: 51]-PEG30K PSI0489:PEG30K - (PEG30K) 1.5

[166] Conclusões

[167] A fusão com o polipeptídeo de extensão da meia- vida não afetou a inibição da atividade hemolítica no soro com deficiência de C5.

[168] Exemplo 7: Ligação ao C5 humano

[169] Material e Métodos

[170] A afinidade de ligação dos polipeptídeos de ligação C5 ao C5 humano foi analisada usando um instrumento Biacore T200 (GE Healthcare). O C5 humano (A403, Quidel Corporation) foi acoplado a um chip sensor CM5 (900 RU) usando química de acoplamento de amina de acordo com o protocolo do fabricante. O acoplamento foi realizado por injeção de hC5 a uma concentração de 7,5 µg/mL em tampão acetato de sódio 10 mM pH = 5 (GE Healthcare). A célula de referência foi tratada com os mesmos reagentes, mas sem a injeção de C5 humano. A ligação dos polipeptídeos de ligação C5 ao hC5 imobilizado foi estudada com o método de cinética de ciclo único, no qual cinco concentrações de amostra,

tipicamente 25, 12,5, 6,25, 3,12 e 1,56 nM em tampão HBS-EP (10 mM HEPES pH 7,4, 150 mM NaCl, 3 mM de EDTA, 0,005% de Surfactante P20, GE Healthcare) foram injetados um após o outro a uma vazão de 30 µL/min a 25 ºC no mesmo ciclo, sem regeneração entre as injeções. Os dados da célula de referência foram subtraídos para compensar as alterações do índice de refração em massa. Na maioria dos casos, uma injeção de HBS-EP também foi incluída como controle, para que os diagramas dos sensores fossem duplos. As superfícies foram regeneradas em tampão HBS-EP. As constantes cinéticas foram calculadas a partir dos diagramas de sensor usando o modelo de analito Langmuir 1: 1 do Biacore T200 Evaluation Software versão 1.0.

[171] Resultados

[172] Os valores KD resultantes são tabulados na Tabela

11.

Tabela 11. Ligação ao complemento humano imobilizado C5 em Biacore Sequência Nome N° de unidades Biacore KD (nM) SEQ ID NO: 37 PSI0493 17 2,4 SEQ ID NO: 50 PSI0400 o 0,5 [SEQ ID NO: 51]- PSI0489:PEG30K (PEG30K) 1,4 PEG30K

[173] Conclusões

[174] Embora não tenha sido observada diferença na atividade hemolítica no exemplo 6, a ligação a C5 foi marginalmente influenciada pela proteína de fusão, medida pelo equipamento Biacore neste exemplo. A molécula PEGuilada exibe uma afinidade de ligação correspondente à inibição hemolítica.

[175] Exemplo 8: Farmacocinética in vivo

[176] Neste exemplo, a farmacocinética das proteínas de fusão IL-1Ra PSI0540 (SEQ ID NO: 38), PSI0541 (SEQ ID NO: 39), PSI0542 (SEQ ID NO: 40), PSI0545 (SEQ ID NO: 43), PSI0547 (SEQ ID NO: 45) e PSI0551 (SEQ ID NO: 49) foram avaliadas em um estudo de dose única em camundongos machos.

[177] Material e Métodos

[178] Itens de teste: PSI0540, PSI0541, PSI0542, PSI0545, PSI0547 e PSI0551. Todos os seis itens de teste foram constituídos como uma solução em fosfato de sódio 25 mM e cloreto de sódio 250 mM, pH 7,0.

[179] Fase em vida: As propriedades farmacocinéticas foram investigadas em camundongos Sprague-Dawley machos após administração de dose única intravenosa e subcutânea. Os níveis de dose testados e o número de animais por grupo de doses são apresentados na Tabela 12.

Tabela 12: Níveis de doses de proteínas de fusão IL-1Ra testadas em um estudo de dose única de PK em camundongos machos Sprague-Dawley. Para detalhes das proteínas de fusão, consulte as Tabelas 4, 6 e 9.

Petição 870190129824, de 09/12/2019, pág. 103/164 Sequência Nome Via de administração Nº de animais Dose (mg/kg) Dose (nmol/kg) SEQ ID NO: 49 PSI0551 s.c. 2 10 149 i.v. 2 5 73 SEQ ID NO: 43 PSI0545 s.c. 3 8 160 s.c. 3 24 483 i.v. 3 4 77 i.v. 3 12 230 88/125 SEQ ID NO: 45 PSI0547 s.c. 3 10 149 s.c. 3 30 448 i.v. 3 5 73 i.v. 3 15 219 SEQ ID NO: 39 PSI0541 s.c. 1 8 166 i.v. 1 4 75 SEQ ID NO: 40 PSI0542 s.c. 3 8 156 i.v. 3 4 78 SEQ ID NO: 38 PSI0540 s.c. 2 6 182 i.v. 2 3 85

[180] As doses subcutâneas foram injetadas na região do pescoço a um volume de dose de 5 mi/kg. As doses intravenosas foram injetadas na veia lateral da cauda a um volume de dose de 2,5 mi/kg. Amostras de sangue foram coletadas do plexo sublingual usando frascos padrão sem ativador de coagulação sérica. Seguindo s.c. Foram coletadas amostras de sangue para administração na preparação do soro pré-dose e às 20 min e 1, 4, 8, 24, 30, 48, 72 e 96 horas após a administração, exceto PSI0545 no nível de dose 24 mg/kg e PSI0547 na dose nível 30 mg/kg, onde as amostras foram coletadas antes da dose e aos 20 min e 1, 4, 8, 24, 48, 72, 96 e 120 horas após a dosagem. Após administração intravenosa, as amostras de sangue para a preparação do soro foram coletadas pré-dose e aos 5 e 20 minutos e 1, 4, 8, 24, 30, 48 e 72 horas após a administração, exceto PSI0545 no nível de dose 12 mg/kg e PSI0547 no nível de dose 15 mg/kg, onde as amostras foram coletadas antes da dose e aos 5 e 20 minutos e 1, 4, 8, 24, 48, 72 e 96 horas após a dosagem.

[181] ELISA quantitativo: A determinação dos níveis modificados de anakinra em amostras de soro de camundongo foi realizada por ensaio imunoabsorvente ligado a enzima (ELISA). Um anticorpo policlonal de cabra anti-IL-1RA humano (AF280, R&D Systems) foi revestido em uma microplaca (placa de meia área de alta ligação de 96 cavidades, Corning 3690) 0,25 µg/ml em PBS (Medicago), 50 µl por cavidade, para 2 horas a temperatura ambiente. Os anticorpos policlonais não ligados foram lavados com 2 x 150 µl de PBS-Tween (Medicago) usando uma lavadora de microplacas (MultiWash +, Molecular Devices) e 150 µl de 1% de bloqueador de caseína em PBS (Thermo Scientific) foram adicionados aos cavidades por 2 horas RT.

[182] As amostras de soro foram analisadas a partir de uma diluição de 100 vezes e em relação aos padrões diluídos em PBS suplementado com caseína a 0,5% e soro normal de camundongo a 1%. Para cada construto, os padrões foram preparados por uma série de diluições de 2 vezes entre 40 ng/ml e 20 pg/ml. As amostras de soro foram inicialmente diluídas 100 vezes em PBS suplementado com caseína a 0,5%, seguidas de diluições em série em PBS suplementado com caseína a 0,5% e soro normal de camundongo a 1% (Adlego). As diluições em série das amostras nas etapas de 1/5 foram preparadas em uma placa de polipropileno (Corning 3365) usando um robô de manipulação de líquidos (Biomek 4000, Beckman Coulter).

[183] A proteína bloqueadora não ligada foi removida por lavagem com 2 x 150 µl de PBS- Tween e 25 µl de amostras e padrões foram pipetados para os cavidades e incubados por uma hora RT com agitação de 600 rpm, seguido de uma incubação durante a noite a + 4 ºC. Após lavagem de quaisquer substâncias não ligadas com 3x150 µl de PBS-Tween, 50 µl de um anticorpo de detecção policlonal conjugado com biotina específico para IL-1RA humana (BAF280, R&D Systems) foram adicionados aos cavidades e incubados por 2 horas a temperatura ambiente. O anticorpo de detecção foi diluído para 0,4 µg/ml em PBS suplementado com caseína a 0,5%. O anticorpo de detecção não ligado foi lavado com 3 x 150 µl de PBS-Tween e 50 µl de estreptavidina marcada com HRP (MabTech) foram adicionados aos cavidades e incubados por uma hora RT com agitação de 400 rpm. O conjugado SA-HRP foi diluído 1/10000 em PBS suplementado com caseína a 0,5%. Após uma lavagem com 3 x 150 µl de PBS Tween para remover qualquer conjugado SA-HRP não ligado, 50 µl de solução de substrato (substrato Easy Blue Enhanced TMB, Medicago) foi adicionado às cavidades e cor desenvolvida proporcionalmente à quantidade de construtos de anakinra ligados. O desenvolvimento da cor foi interrompido após aprox. 30 min adicionando 25 µl de HCl 2 M aos cavidades e a intensidade da cor foi medida a 450 nm, com 540 nm como comprimento de onda de referência para o fundo da placa, em um leitor de microplacas (SpectraMax i3, Molecular Devices).

[184] Uma curva padrão foi criada com uma função logística de quatro parâmetros (equação 200 usando X1fit para MS Excel). As concentrações de leitura foram multiplicadas pelo fator de diluição da amostra para obter a concentração em soro puro.

[185] Análise farmacocinética: A análise farmacocinética foi baseada na concentração sérica média versus dados de tempo de cada grupo de dose. A concentração máxima observada (Cmax) e o tempo até a concentração sérica máxima (tmax) foram obtidos diretamente dos dados de concentração bioanalítica versus tempo. Outros parâmetros farmacocinéticos: Cmax normalizada para dose (Cmax/Dose), área sob a curva de concentração versus tempo (AUC), depuração (CL), depuração aparente após administração subcutânea (CL/F), volume aparente de distribuição no estado estacionário (Vss), tempo médio de permanência (MRT) e meia-vida terminal (t1/2z), foram estimados por análise não compartimental utilizando o software Phoenix WinNonlin versão 6.3 (Pharsight Corp., EUA). O cálculo da biodisponibilidade subcutânea (F) foi realizado no Microsoft Excel.

[186] Resultados

[187] As estimativas de parâmetros farmacocinéticos de dose única de PSI0540, PSI0541, PSI0542, PSI0545, PSI0547 e PSI0551 em camundongos são apresentadas nas Tabelas 13 e 14.

[188] A depuração e outros parâmetros farmacocinéticos intravenosos do PSI0551 não foram determinados devido a anomalias bioanalíticas. Para os outros cinco itens de teste, os resultados após a administração intravenosa mostraram que a depuração (ml/h-kg) aumentou na ordem de classificação: PSI0547 (SEQ ID NO: 45) (3,73) < PSI0545 (SEQ ID NO: 43) (

9,25) < PSI0542 (SEQ ID NO: 40) (12.9) < PSI0540 (SEQ ID NO: 38) (21.2) < PSI0541 (SEQ ID NO: 39) (30,5). O volume aparente de distribuição (Vss) era pequeno, variando entre 41,2 ml/kg (PSI0547 (SEQ ID NO: 45)) e 98,9 mi/kg (PSI0541 (SEQ ID NO: 39)). O tempo médio de permanência (hrs), ou seja, a razão Vss sobre CL, aumentou na ordem de classificação: PSI0540 (SEQ ID NO: 38) (3.03) PSI0541 (SEQ ID NO: 39) (3,24) < PSI0545 (SEQ ID NO: 43) (5,59) PSI0542 (SEQ ID NO: 40) (6,72) < PSI0547 (SEQ ID NO: 45) (11,0).

[189] Os resultados após a administração subcutânea mostraram que o PSI0547 teve a depuração mais baixa, a Cmax normalizada com a dose mais alta e o tempo médio de permanência mais longo dos seis itens do teste. A depuração, CL/F (ml/h-kg), inversamente proporcional à AUC, aumentou na ordem de classificação: PSI0547 (SEQ ID NO: 45) (12) < PSI0545 (SEQ ID NO: 43) (34 ) < PSI0551 (SEQ ID NO: 49) (50) < PSI0542 (SEQ ID NO: 40) (87) < PSI0540 (SEQ ID NO: 38) (128) < PSI0541 (SEQ ID NO: 39) (439).

Tabela 13: Estimativas dos parâmetros farmacocinéticos após administração iv.

SEQ ID NO Nome CL (ml/h-kg) Vss (ml/kg) MRT (h) t1/2z (h) 38 PSI0540 21 64 3,0 3,8 39 PSI0541 31 99 3,2 3,3 40 PSI0542 13 87 6,7 6,1

43 9,3a (10, 8,4) 52a (56, 47) 5,6a 6,2a PSI0545 (5,6, (5,3, 5,6) 7,0) 45 3,7b (3,7, 3,8) 41b 11b 8,6b PSI0547 (39, 43) (11,11) (8,0, 9,3) 49 PSI0551 n.d.* n.d.* n.d.* n.d.* * Não determinado; as estimativas foram consideradas não confiáveis devido a anomalias bioanalíticas. a Estimativa média para as duas doses testadas; estimativa em 4 e 12 mg/kg, respectivamente, entre parênteses. b Estimativa média para as duas doses testadas; estimada em 5 e 15 mg/kg, respectivamente, entre parênteses Tabela 14: Estimativas dos parâmetros farmacocinéticos após a administração SC.

SEQ F C/Dose* tmax CL/F MRT t1/2z ID NO Nome (%) max (h) (ml/h- (h) (h) kg) 38 PSI0540 17 0,43 8 128 15 5,8 39 PSI0541 6,9 0,096 8 439 17 5,1 40 PSI0542 15 0,36 24 87 24 7,6 43 27a (31, 0,91a 16a 34a 22a 7,4a PSI0545 24) (0,99, (8, (33, (21, (7,4, 0,84) 24) 35) 22) 7,4)

45 31b 2,2b (1,9, 24b 12b 34b 10,9b PSI0547 (26, 36) 2,5) (24, (14, (32, (9,9, 24) 10) 35) 11,9) 49 PSI0551 n.d.** 0,74 8 50 18 4,6 * Cmax normalizada da dose em unidade nM por nmol/kg ** A biodisponibilidade subcutânea não foi determinada devido à falta de i.v. dados de exposição ª Estimativa média para as duas doses testadas; estimada em 8 e 24 mg/kg, respectivamente, em colchetes b Estimativa média para as duas doses testadas; estimada em 10 e 30 mg/kg, respectivamente, entre parênteses

[190] Além disso, a meia-vida terminal estimada, t1/2z, (horas) após a infusão intravenosa das proteínas de fusão PSI0540, PSI0542, PSI0545 e PSI0547, que incluem M-IL-1Ra com frações polipeptídicas com meia-vida estendida com 17, 34 , 34 e 51 unidades, respectivamente, foram plotadas em relação ao tamanho aparente pelo volume de eluição calibrado contra proteínas globulares (Figura 5a), o raio hidrodinâmico em solução (Figura 5b) e o número de unidades repetidas da fração polipeptídica que estende a meia-vida (Figura 5c), respectivamente. PSI0162 (Met-hulL-1Ra) foi incluído como referência.

[191] Conclusões

[192] As propriedades de extensão da meia-vida do polipeptídeo de extensão da meia-vida mostraram ser uma função do comprimento do domínio com PSI0547 com 51 unidades mostrando consistentemente as melhores propriedades. Em geral, as proteínas de fusão contendo duas moléculas de IL- 1Ra exibem meia-vida mais curta do que as proteínas de fusão únicas correspondentes. Além disso, verificou-se que a biodisponibilidade dos compostos não diminui com o comprimento do polipeptídeo de extensão da meia-vida adicionado. Em vez disso, observou-se uma tendência de maior biodisponibilidade nas proteínas de fusão maiores, em comparação com proteínas de fusão menores com a mesma arquitetura, nas séries PSI0540, PSI0542, PSI0545, PSI0547 e PSI0541 e PSI0551, respectivamente.

[193] Exemplo 9: Farmacocinética in vivo de Met-hulL-1Ra e suas variantes PEGuiladas

[194] Este exemplo comparativo descreveu a investigação da farmacocinética de Met-hulL-1Ra e Met-hulL-1Ra PEGuilado no N-terminal com PEG linear de 10 kDa, PEG linear de 20 kDa e PEG linear de 30 kDa, respectivamente, em dois estudos separados em homens camundongos.

[195] Materiais e Métodos

[196] Os dois estudos separados seguiram o mesmo desenho geral que no Exemplo 8. As proteínas Met-hull-1Ra com ou sem PEG foram administradas a camundongos Sprague-Dawley machos, para a parte subcutânea n = 3, para a parte intravenosa n =

1. Os momentos de amostragem foram os seguintes: amostragem subcutânea - O (pré-dose), 15 min, 30 min, 1, 2, 4, 6, 8, 24, 48, 72, 96, 120 e 144 horas; amostragem intravenosa - 0 (pré-dose), 5 min, 20 min, 1, 2, 4, 6, 8, 24, 48, 72, 96, 120 e 144 horas. A concentração das proteínas nas amostras de soro é determinada por um ELISA em sanduíche usando reagentes padrão e um protocolo padrão.

[197] Resultados

[198] As estimativas de parâmetros farmacocinéticos de dose única em camundongos são apresentadas nas Tabelas 15 e

16.

Tabela 15. Estimativas dos parâmetros farmacocinéticos após administração intravenosa Parâmetro Met-hulL-1Ra PEG (L10k)- PEG (L20k)- PEG (L30k)- Met-hulL-1Ra Met-hulL-1Ra Met-hulL-1Ra Vss (ml/kg) 73 108 50 74 Vz (ml/kg) ~700 205 110 172 CL (ml/h·kg) 442 22 9,4 6,9 t1/2z (h) 1,1 6,4 8,1 17 MRT (h) 0,20 4,9 5,3 11 Tabela 16. Estimativas dos parâmetros farmacocinéticos após administração subcutânea Parâmetro Met-hulL-1Ra PEG (L10k)- PEG (L20k)- PEG (L30k)- Met-hulL-1Ra Met-hulL-1Ra Met-hulL-1Ra F (%) 62 46 35 37 Cmax/Dose 458 539 933 1308 tmax (h) 1,4 24 24 24 CL/F ~650 47 27 20 (ml/h·kg) Vz/F (ml/kg) ~800 311 377 513 t1/2z (h) 0,89 4,6 9,9 19 MRT (h) 2,2 26 26 37

[199] Conclusões

[200] A depuração (CL) diminui com o aumento do tamanho do PEG (442 (Met-hulL-1Ra) > 22,2 (L10k) > 9,43 (L20k) > 6,93 (L30k)). O tempo médio de permanência aumenta com o aumento do tamanho do PEG (IV: 0,20 (Met-hulL-1Ra) < 4,9 (L10k) ~ 5,3 (L20k) < 11 (L30k); SC: 2,2 (Met-hulL-1Ra) < 26 (L10k) = 26 (L20k) < 37 (L30k)). A biodisponibilidade após a dose subcutânea (F) diminui com o aumento do tamanho do PEG; esta propriedade dos conjugados de PEG contrasta com o efeito do polipeptídeo de extensão da meia-vida, onde proteínas de fusão com polipeptídeos de extensão da meia- vida mais longa exibem de fato uma maior biodisponibilidade.

Para todos os PEGs, os níveis plasmáticos máximos foram observados às 24 horas.

[201] Exemplo 10: Estudo comparativo das propriedades farmacocinéticas de variantes de polipeptídeos de ligação C5

[202] Neste exemplo comparativo, a farmacocinética da proteína de fusão de acordo com modalidades da invenção, a proteína de ligação C5 e uma proteína de ligação C5 PEGuilada

(PSI0493, PSI0489 e PSI0257) foram avaliadas em três estudos de dose única em camundongos machos.

[203] Materiais e Métodos

[204] Os três estudos seguiram o mesmo desenho geral com uma dose única intravenosa (iv) ou subcutânea (sc) em camundongos Sprague-Dawley machos (N = 3 por via de administração e proteína). Amostras de sangue para preparação de soro para determinação da concentração de PSI0257 foram coletadas nos seguintes momentos nominais: O (pré-dose), 5 min, 20 min, 1, 2, 4, 8, 12, 24, 48, 96 e 168 horas. Para PSI0489 e PSI0493, foram colhidas amostras de sangue em O (pré-dose), 5 min (somente IV), 15 min (somente SC), 1, 4, 8, 24, 48, 72, 120 e 192 horas após a dose. As concentrações séricas de PSI0257, PSI0489 e PSI0493 foram determinadas por digestão com pepsina seguida por análise LC/LC/MS/MS usando um peptídeo sintético marcado com radioisótopo comum para as três proteínas de fusão. Os perfis individuais de concentração versus tempo foram compilados a partir das medições reais e dos pontos de tempo nominais. A concentração máxima de PSI0257, PSI0489 ou PSI0493 no soro, Cmax, e o tempo para atingir essa concentração sérica máxima após a administração, tmax, foram determinados a partir de dados individuais. Os perfis farmacocinéticos individuais foram submetidos à Análise Não Compartimental para calcular a meia-vida terminal, t½z, tempo médio de residência (MRT),

área sob a curva de concentração-tempo no plasma do tempo zero ao infinito, AUC2 e depuração, CL.

[205] Resultados

[206] Os resultados estão resumidos na Tabela 17.

Tabela 17. Parâmetros farmacocinéticos associados após administração intravenosa ou subcutânea.

PSI0257 PSI0489 PSI0493 iv sc iv sc iv sc Dose (mg/kg) 2 4 9,2 22,5 6,2 15,3 Dose (umol/kg) 0,29 0,57 0,25 0,61 0,26 0,64 Cmax (umol/L) 1,9 0,7 5,7 1,7 5,1 1,4 Cmax/dose (kg/L) 6,6 1,4 23 2,8 20 2,3 tmax (h) 0,083 0,8 0,083 24 0,083 6,7 t1/2z (h) 6,2 4,5 45 48 20 21 MRT (h) 6,2 6,1 53 76 24 30 CL (ml/h/kg) 81 - 1,8 - 9,2 - AUC¥ (h*umol/L) 3,6 4,9 142 138 28,3 52,0 AUC¥/dose 12,4 8,6 570 224 109 81,4 (h*kg/L) F (%) - 70 - 39 - 75

[207] Conclusões

[208] O t1/2z da proteína de fusão que compreende o polipeptídeo de extensão da meia-vida de acordo com modalidades da invenção é estendido para 20 h em comparação com 6 h para a molécula parental sozinha, com uma AUC¥ 9 vezes maior e, portanto, uma redução de 9 vezes na depuração.

Comparado com PSI0489, que é a mesma molécula de direcionamento quimicamente conjugada com um PEG linear de 30 kDa em um Cys no C-terminal, a meia-vida terminal é de 20 h em comparação com 45 h. Isto está de acordo com os dados apresentados no Exemplo 4, Tabela 7, em que o aumento de tamanho do alvo é 10x para a proteína de fusão, incluindo o polipeptídeo de extensão da meia-vida, mas é 24x para o alvo PEGuilado.

[209] Exemplo 11: Clonagem e produção de proteínas de fusão baseadas em fragmentos de anticorpos

[210] Este exemplo descreve as estratégias gerais para clonagem e produção de proteínas de fusão de sequências de fragmentos de anticorpo Ruplizumabe com polipeptídeos que estendem a meia-vida, conforme divulgado aqui. Os polipeptídeos de extensão da meia-vida foram fundidos à cadeia leve (LC) ou à cadeia pesada (HC) dos fragmentos de anticorpo. As proteínas de fusão produzidas neste exemplo foram usadas nos exemplos 12 a 15 abaixo.

[211] Materiais e Métodos

[212] Construtos de DNA: sequências de DNA que codificam um conjunto de fragmentos de anticorpo com ou sem polipeptídeos que estendem a meia-vida foram otimizadas para a expressão em células E. coli ou CHO e sintetizadas pelo serviço lnvitrogen GeneArt Gene Synthesis da Thermo Fisher

Scientific (consulte a Tabela 18 abaixo para obter mais informações). as sequências nucleotídicas da região que correspondem à sequência proteica madura, sinalizando peptídeos não incluídos). Os genes foram clonados em vetores de expressão para expressão subsequente em E. coli, células

Expi293 ou células ExpiCHO.

Para PSI0716, PSI0717, PSI0762 e PSI0761, foi utilizado um vetor bicistrônico para incorporar ambas as sequências nucleotídicas para as cadeias pesada e leve.

Tabela 18. Visão geral das proteínas de fusão baseadas em fragmentos de anticorpos e sequências nucleotídicas correspondentes

Nome Descrição Cadeia pesada/cadeia leve (quando aplicável) Nº de unidades Sequência nucleotídica de fração

Petição 870190129824, de 09/12/2019, pág. 118/164 polipeptídica de extensão da meia-vida

PSI0698 Fab de Ruplizumabe (hu5c8) HC/Fab de Ruplizumabe (hu5c8) LC -/- SEQ ID NO: 84/SEQ ID NO:

89

PSI0699 Fab de ruplizumabe (hu5c8) HC- [metade do polipeptídeo com 17/17 SEQ ID NO: 85/SEQ ID NO: 103/125 extensão de meia-vida]/Fab de ruplizumabe (hu5c8) LC- [fração de 90 polipeptídeo com extensão de meia-vida]

PSI0700 Fab de ruplizumabe (hu5c8) HC- [metade do polipeptídeo com 34/34 SEQ ID NO: 86/SEQ ID NO:

extensão de meia-vida]/Fab de ruplizumabe (hu5c8) LC- [fração de 91 polipeptídeo com extensão de meia-vida]

PSI0701 Fab de ruplizumabe (hu5c8) HC- [fração polipeptídica de extensão 51/- SEQ ID NO: 87/SEQ ID NO:

da meia-vida]/Fab de ruplizumabe (hu5c8) LC 89

PSI0702 Fab de ruplizumabe (hu5c8) HC- [fração polipeptídica de extensão 68/- SEQ ID NO: 88/SEQ ID NO:

da meia-vida]/Fab de ruplizumabe (hu5c8) LC 89

PSI0706 Fab de ruplizumabe (hu5c8) HC- [fração polipeptídica de extensão 34/- SEQ ID NO: 86/SEQ ID NO:

da meia-vida]/Fab de ruplizumabe (hu5c8) LC 89

Petição 870190129824, de 09/12/2019, pág. 119/164 PSI0707 Fab de ruplizumabe (hu5c8) HC/fab de ruplizumabe (hu5c8) LC- -/34 SEQ ID NO: 84/SEQ ID NO:

[metade do polipeptídeo com extensão de meia-vida] 91

PSI0716 Fab de Ruplizumabe (hu5c8) HC/Fab de Ruplizumabe (hu5c8) LC -/- SEQ ID NO: 94/SEQ ID NO:

97

PSI0717 Fab de Ruplizumabe (hu5c8) HC/Fab de Ruplizumabe (hu5c8) LC -/- SEQ ID NO: 95/SEQ ID NO:

97 104/125

PSI0718 Ruplizumabe ScFv (VH-VL) 0 SEQ ID NO: 93

PSI0719 Ruplizumabe ScFv (VL-VH) 0 SEQ ID NO: 92

PSI0762 Fab de ruplizumabe (hu5c8) HC- [fração polipeptídica de extensão 34/- SEQ ID NO: 96/SEQ ID NO:

da meia-vida]/Fab de ruplizumabe (hu5c8) LC 98

PSI0761 Fab de ruplizumabe (hu5c8) HC- [fração polipeptídica de extensão 34/- SEQ ID NO: 99/SEQ ID NO:

da meia-vida]/Fab de ruplizumabe (hu5c8) LC 97

[213] Cultivo e purificação: As células de E. coli foram transformadas com vetores de expressão contendo os fragmentos de genes que codificam os fragmentos de anticorpos recombinantes ou proteínas de fusão e, em seguida, cultivadas em biorreatores usando técnicas de batelada ou em frascos de agitação, seguidos pela expressão de proteínas e colheita de células por centrifugação. Os péletes celulares foram armazenados a -20 ºC ou diretamente indivíduos a choque osmótico, as proteínas liberadas foram esclarecidas por centrifugação e armazenadas a -20 ºC. A expressão de fragmentos de anticorpo recombinante ou proteínas de fusão foi realizada usando os sistemas de expressão Expi293 e ExpiCHO (Thermo Fisher Scientific), essencialmente de acordo com o protocolo do fabricante. Os sobrenadantes foram colhidos por centrifugação 6 dias após a transfecção dos vetores de expressão e armazenados a -70ºC. A Tabela 19 lista as sequências de proteínas codificadas.

[214] Os grânulos de células de E. coli congelados foram ressuspensos e depois rompidos por sonicação e os detritos celulares subsequentemente removidos por centrifugação seguida de filtração (0,22 µm). Amostras de choque osmótico e sobrenadantes das culturas ExpiCHO e Expi293 foram descongeladas e filtradas (0,22 µm) antes da purificação.

Cada sobrenadante, contendo os fragmentos de anticorpo recombinante ou proteínas de fusão, foi purificado usando métodos de cromatografia convencionais. As proteínas de fusão recombinantes para uso em estudos com animais também foram submetidas a uma purificação por remoção de endotoxina usando colunas de remoção de endotoxina Detoxi-Gel (Pierce, cat. no. 20344). Os fragmentos de anticorpo purificados ou as proteínas de fusão foram trocados de tampão para PBS e, salvo indicação em contrário, o PBS também foi o tampão de formulação utilizado em experiências subsequentes. A pureza das proteínas de fusão foi analisada por SDS-PAGE corada com azul de Coomassie e o peso molecular de cada proteína foi analisado usando espectrometria de massa (HPLC/MS ou MALDI- TOF/MS).

[215] Resultados

[216] A purificação resultou em preparações de proteínas com alta pureza, que foram analisadas por SDS-PAGE corada com azul de Coomassie. A identidade correta e o peso molecular de cada proteína de fusão foram confirmados por análise por espectrometria de massa.

[217] A Tabela 19 abaixo lista as sequências de aminoácidos das proteínas produzidas. Um polipeptídeo de meia vida estendida foi fundido ao C-terminal da cadeia leve (LC na tabela abaixo) ou da cadeia pesada (HC na tabela abaixo), ou ambas da cadeia leve e da cadeia pesada do Ruplizumabe Fab.

[218] Conclusões

[219] As proteínas de fusão contendo fragmentos de anticorpo e polipeptídeos de extensão da meia-vida de vários comprimentos podem ser produzidos através da construção de genes sintéticos seguidos de expressão em sistemas de mamíferos ou bactérias e purificados com alta pureza usando técnicas convencionais.

Tabela 19. Descrição, sistema de expressão e SEQ ID NOs de proteínas produzidas Referência Descrição Sistema de # unidades de SEQ ID NO PSI expressão fração polipeptídica Petição 870190129824, de 09/12/2019, pág. 123/164 de extensão da meia-vida PSI0698 Fab de Ruplizumabe (hu5c8) HC/Fab de Ruplizumabe (hu5c8) ExpiCHO -/- SEQ ID NO:67/SEQ ID NO:68

LC PSI0699 Fab de ruplizumabe (hu5c8) HC-[fração polipeptídica de ExpiCHO 17/17 SEQ ID NO:69/SEQ ID NO:70 extensão da meia-vida]/ Fab de ruplizumabe (hu5c8) LC-[fração polipeptídica de 108/125 extensão da meia-vida] PSI0699 Fab de ruplizumabe (hu5c8) HC-[fração polipeptídica de Expi293 17/17 SEQ ID NO:69/SEQ ID NO:70 extensão da meia-vida]/ Fab de ruplizumabe (hu5c8) LC-[fração polipeptídica de extensão da meia-vida] PSI0700 Fab de ruplizumabe (hu5c8) HC-[fração polipeptídica de ExpiCHO 34/34 SEQ ID NO:71/SEQ ID NO:72 extensão da meia-vida]/ Fab de ruplizumabe (hu5c8) LC-[fração polipeptídica de extensão da meia-vida]

PSI0700 Fab de ruplizumabe (hu5c8) HC-[fração polipeptídica de Expi293 34/34 SEQ ID NO:71/SEQ ID NO:72 extensão da meia-vida]/

Fab de ruplizumabe (hu5c8) LC-[fração polipeptídica de extensão da meia-vida]

Petição 870190129824, de 09/12/2019, pág. 124/164 PSI0701 Fab de ruplizumabe (hu5c8) HC-[fração polipeptídica de ExpiCHO 51/- SEQ ID NO:73/SEQ ID NO:68 extensão da meia-vida]/

Fab de ruplizumabe (hu5c8) LC

PSI0701 Fab de ruplizumabe (hu5c8) HC-[fração polipeptídica de Expi293 51/- SEQ ID NO:73/SEQ ID NO:68 extensão da meia-vida]/

Fab de ruplizumabe (hu5c8) LC

PSI0702 Fab de ruplizumabe (hu5c8) HC-[fração polipeptídica de ExpiCHO 68/- SEQ ID NO: 74/SEQ ID NO: 109/125 extensão da meia-vida]/ 68

Fab de ruplizumabe (hu5c8) LC

PSI0706 Fab de ruplizumabe (hu5c8) HC- [fração polipeptídica de ExpiCHO 34/- SEQ ID NO: 71/SEQ ID NO:

extensão da meia-vida]/ 68

Fab de ruplizumabe (hu5c8) LC

PSI0707 Fab de ruplizumabe (hu5c8) HC/fab de ruplizumabe (hu5c8) ExpiCHO -/ 34 SEQ ID NO: 67/SEQ ID NO:

LC-[fração polipeptídica de extensão da meia-vida] 72

PSI0716 Fab de ruplizumabe (hu5c8) HC-GS/fab de ruplizumabe E. coli -/- SEQ ID NO: 76/SEQ ID NO:

(hu5c8) LC 68

PSI0717 Fab de ruplizumabe (hu5c8) HC-GS/fab de ruplizumabe E. coli -/- SEQ ID NO: 77/SEQ ID NO:

(hu5c8) LC 78

PSI0718 Ruplizumabe scFv (VL-VH) -C-tag Expi293 - SEQ ID NO: 79

Petição 870190129824, de 09/12/2019, pág. 125/164 PSI0719 Ruplizumabe scFv (VL-VH) -C-tag Expi293 - SEQ ID NO: 80

PSI0761 Fab de ruplizumabe (hu5c8) HC- [fração polipeptídica de E. coli 34/- SEQ ID NO: 82/SEQ ID NO:

extensão da meia-vida] -GS 68

/ Fab de Ruplizumabe (hu5c8) LC

PSI0762 Fab de ruplizumabe (hu5c8) HC- [fração polipeptídica de E. coli 34/- SEQ ID NO: 83/SEQ ID NO:

extensão da meia-vida] -GS 78

114 / Fab de Ruplizumabe (hu5c8) LC 110/125

PSI0724 Ruplizumab-N297A-HC Avitag/Ruplizumabe Fab (hu5c8) LC ExpiCHO -/- SEQ ID NO: 81/SEQ ID NO:

68

PSI0773 Fab de ruplizumabe (hu5c8) HC- [fração polipeptídica de Expi293 17/- SEQ ID NO: 69/SEQ ID NO:

extensão da meia-vida] / 68

Fab de ruplizumabe (hu5c8) LC

PSI0774 Fab de ruplizumabe (hu5c8) HC/fab de ruplizumabe (hu5c8) Expi293 -/17 SEQ ID NO: 67/SEQ ID NO:

LC- [meia-vida 70 fração polipeptídica estendida]

PSI0775 Fab de ruplizumabe (hu5c8) HC- [fração polipeptídica de Expi293 34/17 SEQ ID NO: 71/SEQ ID NO:

extensão da meia-vida] / 70

Fab de ruplizumabe (hu5c8) LC- [fração polipeptídica de extensão da meia-vida]

Petição 870190129824, de 09/12/2019, pág. 126/164 PSI0776 Fab de ruplizumabe (hu5c8) HC- [fração polipeptídica de Expi293 17/34 SEQ ID NO: 69/SEQ ID NO:

extensão da meia-vida] / 72

Ruplizumabe Fab (hu5c8) LC- [fração polipeptídica de extensão da meia-vida] 111/125

[220] Exemplo 12: Caracterização biofísica de proteínas de fusão

[221] Este exemplo descreve a caracterização de proteínas de fusão contendo Ruplizumabe Fab e polipeptídeos que estendem a meia-vida, usando proteínas não fundidas e proteínas PEGuiladas como referências, no que diz respeito a características biofísicas, como tamanho aparente e peso molecular (MW) em solução e determinação do raio hidrodinâmico em solução por cromatografia de exclusão por tamanho (SEC) e calibração em coluna e espalhamento de luz multi-ângulo (MALS).

[222] Materiais e Métodos

[223] O tamanho das proteínas de fusão, proteínas não fundidas e proteínas PEGuiladas em solução, foi avaliado por filtração analítica em gel em um AKTA Micro (GE Healthcare Life Sciences) usando uma coluna calibrada Superdex 200 Increase 3,2/300 (GE Healthcare Life Sciences). A coluna foi calibrada com o Kit de Calibração de Filtragem em Gel LMW (código 28-4038-41, GE Healthcare Life Sciences) e Kit de Calibração HMW (código 28-4038-42, GE Healthcare Life Sciences), contendo 8 proteínas globulares a faixa de tamanho de 6 a 669 kDa e Blue Dextran 2000, usando um tampão de NaP 25 mM e NaCl 125 mM pH 7,0 com uma vazão de 75 µl/min a uma temperatura de 25 ºC. O tamanho e o raio hidrodinâmico correspondentes em solução podem ser calculados a partir do volume de eluição de uma proteína em uma coluna calibrada pelos métodos descritos no apêndice 10 do Manual de princípios e métodos de cromatografia de exclusão por tamanho (pedido no 18-1022-18, GE Healtcare Life Ciências). O peso molecular das proteínas foi determinado por um sistema MALS- RI conectado: detector de dispersão estática de luz miniDawn Tristar e refratômetro diferencial Optilab rEX, e o software Astra V (Wyatt Technology Europe, Alemanha).

[224] As proteínas de interesse foram analisadas nas mesmas condições que durante a calibração.

[225] Resultados

[226] A Tabela 20 apresenta os resultados para as proteínas de fusão e proteínas de referência.

Tabela 20. Caracterização das proteínas de fusão Fab de Ruplizumabe e proteínas de referência

Nome SEQ ID NO Sistema de MW teórico MWMALS MW por volume Raio de Aumento Nº de expressão (kDa) (kDa) de eluição Stokes (nm) de unidades no

Petição 870190129824, de 09/12/2019, pág. 129/164 (kDa) tamanho HC/LC

SEQ ID NO: 67/SEQ ID NO: - -/-

PSI0698 68 ExpiCHO 48 46 39 2,9

SEQ ID NO: 69/SEQ ID NO:

PSI0699 70 ExpiCHO 83 84 457 6,7 12 17/17

SEQ ID NO: 69/SEQ ID NO:

PSI0699 70 Expi293 83 83 441 6,6 11 17/17

SEQ ID NO: 71/SEQ ID NO: 114/125

PSI0700 72 ExpiCHO 116 110 752 8,5 19 34/34

SEQ ID NO: 71/SEQ ID NO:

PSI0700 72 Expi293 116 108 757 8,5 19 34/34

PSI0701 SEQ ID NO: 73/SEQ ID NO: ExpiCHO 99 97 626 7,7 16 51/-

68

SEQ ID NO: 74/SEQ ID NO:

PSI0702 68 ExpiCHO 107 115 759 8,5 19 68/-

SEQ ID NO: 71/SEQ ID NO: 34/-

PSI0706 68 ExpiCHO 82 76 450 6,7 12

SEQ ID NO: 67/SEQ ID NO:

PSI0707 72 ExpiCHO 82 80 454 6,7 12 - /34

PSI0717 SEQ ID NO: 76/SEQ ID NO: E. coli 48 47 42 2,9 1 -/-

Petição 870190129824, de 09/12/2019, pág. 130/164 68

SEQ ID NO: 79 -

PSI0718 Expi293 27 27 28 2,4 0,7

SEQ ID NO: 80 -

PSI0719 Expi293 27 27 29 2,4 0,7

PSI0762 SEQ ID NO: 83/SEQ ID NO: E. coli 82 78 430 6,6 11 34/-

78 115/125

-

Certolizumabe Comprado 88 77 572 7,5 15 40kDa PEG/-

pegol

- -/-

Dapirolizumabe Comprado 48 49 29 2,5 0,7

Fab

[227] Conclusões

[228] Foi observada uma correlação do comprimento total do polipeptídeo de extensão da meia-vida compreendido na proteína de fusão e seu tamanho em solução: o tamanho da solução não dependia do posicionamento do polipeptídeo de extensão da meia-vida, uma vez que o tamanho da fusão diferente proteínas foi semelhante se todas as unidades do polipeptídeo de meia-vida estendida fossem fundidas à cadeia pesada (HC), à cadeia leve (LC), ou se o mesmo número de unidades fosse distribuído entre a cadeia pesada e a cadeia leve do Fab.

[229] Foi observado que o raio hidrodinâmico ou raio de Stokes da albumina, que está acima do limite de tamanho da depuração renal, é de 3,8 nm. Isso pode servir como um limite do tamanho mínimo necessário para evitar a depuração renal.

Todas as proteínas de fusão testadas acima tinham um tamanho acima do da albumina.

[230] Exemplo 13: Ligação ao CD40 humano

[231] Este exemplo descreve as características de ligação das proteínas de fusão do Ruplizumabe Fab e dos polipeptídeos que estendem a meia-vida, em que Ruplizumabe, proteína Fab não fundida e outro Fab direcionado a CD40L humano, foram utilizados como proteínas de referência.

[232] Materiais e Métodos

[233] As afinidades de ligação das proteínas de fusão contendo Ruplizumabe Fab e polipeptídeos de extensão da meia- vida para o ligante CD40 humano (CD40L ou CD154) foram analisadas usando um instrumento OctetRED96 (Pall/ForteBio).

Os polipeptídeos imobilizados usando sensores Fab-CH1 de segunda geração anti-humanos (FAB2G, Pall/ForteBio) foram testados quanto à ligação à parte extracelular do CD40L humano (aa 108-261 produzido recombinantemente em E. coli) tipicamente em uma faixa de concentração de 2,5 80 nM em incrementos de 1: 2.

[234] Tipicamente, a associação para cada concentração de CD40L foi monitorada por 180s, seguida por uma dissociação de 600 s. Os sensores foram regenerados por pulsos de 3 x 10s a pH 2 entre cada ciclo e os dados de cada sensor foram referenciados contra a exposição do tampão. As constantes cinéticas foram calculadas a partir dos diagramas dos sensores, utilizando o modelo de analito Langmuir 1: 1 (ajuste global) do software "Octet System Data Analysis, Release 10.0 - módulo cinético (ForteBio, Pall Life Sciences).

[235] Resultados

[236] Os valores de KD resultantes são tabulados na Tabela 21. Quando a dissociação ficou abaixo de 5% durante o tempo de monitoramento dos anos 600 (KD < 1e-4), esse valor foi usado como KD.

Tabela 21. Ligação da proteína de fusão Fab humana imobilizada ao CD40L humano

Nome SEQ ID NOs Célula/lote Número de unidades Constante de

(HC/LC) da fração dissociação polipeptídica de KD extensão da meia- (nM)

vida (HC/LC)

PSI0698 SEQ ID NO:67 CHO -/- < 0,3

/

SEQ ID NO:68

PSI0717 SEQ ID NO: E. coli 17/17 < 0,3

77/SEQ ID

NO:78

PSI0699 SEQ ID CHO 17/17 < 0,3

NO:69/SEQ ID

NO:70

PSI0699 SEQ ID HEK 17/17 < 0,3

NO:69/SEQ ID

NO:70

PSI0700 SEQ ID CHO 34/34 < 0,3

NO:71/SEQ ID

NO:72

PSI0701 SEQ ID CHO 51/- < 0,3

NO:73/SEQ ID

NO:68

PSI0702 SEQ ID CHO 68/- < 0,3

NO:74/SEQ ID

NO:68

PSI0707 SEQ ID CHO -/34 < 0,3

NO:67/SEQ ID

NO:72

PSI0762 SEQ ID E. coli 34/- < 0,3 NO:83/SEQ ID NO:78 Ruplizumab Comprado 0,66 Dapirolizumabe Comprado -/- < 0,3 Fab

[237] Conclusões

[238] A fusão do Fab ao polipeptídeo de extensão da meia- vida não tem influência mensurável na afinidade do referido Fab com a parte solúvel do CD40L humano. As afinidades de todas as proteínas de fusão testadas para CD40L humano foram comparáveis às proteínas de controle Ruplizumabe e Dapirolizumabe Fab.

[239] Exemplo 14: Investigação de propensão imunogênica in vitro e in silico

[240] Este exemplo tem como objetivo identificar regiões potencialmente imunogênicas presentes no PSI0699 (SEQ ID NO: 69/SEQ ID NO: 70). O ensaio ProImmune ProPresent® Antigen Presentation foi realizado por ProImmune (Reino Unido). As regiões imunogênicas foram determinadas pela identificação de peptídeos que seriam naturalmente processados por células dendríticas derivadas de monócitos e, consequentemente, apresentados pelo sistema de apresentação de antígenos do MHC. A detecção de peptídeos imunogênicos putativos foi realizada utilizando espectrometria de massa por análise baseada em LC/MS/MS.

[241] Material e métodos

[242] O ensaio ProImmune ProPresent® Antigen Presentation foi usado para identificar regiões potencialmente imunogênicas presentes no PSI0699. Eles foram determinados pela identificação de peptídeos naturalmente processados por células dendríticas derivadas de monócitos e, consequentemente, apresentados por moléculas de MHC de Classe II (HLA-DR). As células dendríticas usadas neste ensaio foram isoladas de 11 doadores de sangue saudáveis normais que apresentavam uma cobertura adequada dos tipos de HLA presentes na população humana. Os peptídeos imunogênicos putativos foram identificados por espectrometria de massa de sequenciação baseada em LC/MS/MS.

[243] A análise de imunogenicidade in silico foi realizada utilizando o software TEPredict (Antonets & Maksyutov TEpredict: Software para Biologia Molecular de Predição de Epítopos de Células T, 2010, Vol. 44, No. 1, pp.

119-127).

[244] Resultados

[245] No geral, havia 4 peptídeos potencialmente imunogênicos identificados no ensaio, 1 era da cadeia pesada do Fab do PSI0699 e 3 eram da cadeia leve do Fab. Destes, 2 foram publicados anteriormente como uma sequência tregitópica potencial, denominada Treg 134, que acampa ambos os peptídeos. Todos os peptídeos se originam de regiões constantes da fração da molécula derivada de anticorpos. Não foram apresentados peptídeos imunogênicos derivados do polipeptídeo de extensão da meia-vida no ensaio.

[246] Além disso, a avaliação in silico não previu que nenhum peptídeo do polipeptídeo que se estendesse pela meia- vida tivesse propensão a se ligar a qualquer classe de moléculas do MHC. No entanto, a análise in silico previu que outros peptídeos da fração Fab provavelmente se ligariam a várias moléculas de MHC, incluindo peptídeos das regiões variáveis que inferem a especificidade alvo do Fab.

[247] Conclusões

[248] Como nenhum peptídeo foi apresentado a partir do polipeptídeo de extensão de meia-vida na configuração atual do ensaio, o potencial para imunogenicidade do polipeptídeo de extensão de meia-vida é considerado baixo. O potencial imunogênico geral também é considerado baixo, pois apenas as regiões comuns a muitos anticorpos são apresentadas no ensaio. A apresentação de um peptídeo Tregitope publicado anteriormente também sugere uma baixa resposta.

[249] Exemplo 15: Estudo comparativo das propriedades farmacocinéticas de proteínas de fusão à base de Fab

[250] Neste exemplo, as propriedades farmacocinéticas intravenosas e subcutâneas de PSI0699 (SEQ ID NO: 69/SEQ ID NO: 70) e PSI0701 (SEQ ID NO: 73), incluindo CD40L Fab não fundido como controle (PSI0698, Ruplizumabe Fab, (SEQ ID NO: 67/SEQ ID NO: 68) foram avaliados.

[251] Materiais e Métodos

[252] O estudo seguiu o mesmo desenho geral com uma dose única intravenosa (IV) ou subcutânea (SC) em camundongos Sprague-Dawley machos (N = 3 por via de administração e proteína) para PSI0699 e PSI0701. Para PSI0698, apenas a fração IV do experimento foi realizada.

[253] Para PSI0699 e PSI0701, a dose e os pontos de tempo para o experimento IV foram os seguintes, 2 mg/kg: 5 e 20 min e 1, 4, 8, 24, 48, 72, 96 e 120 horas. Para as experiências de SC, foi utilizada uma dose de 4 mg/kg e as amostras de sangue foram coletadas nesses momentos: 20 min e 1, 4, 8, 24, 48, 72, 96, 120 e 168 horas. Para a experiência IV de PSI0698, foi utilizada uma dose de 13 mg/kg e o sangue foi retirado nos seguintes momentos: 5 e 20 minutos e 1, 2, 4, 8, 24, 30 e 48 horas. As concentrações séricas de PSI0698, PSI0699 e PSI0701 foram determinadas por um ensaio em sanduíche na plataforma Meso Scale Discovery (Meso Scale Diagnostics). O fármaco ativo foi capturado usando eD40L biotinilado e detectado usando um anticorpo IgG anti-humano conjugado com Rutenium (específico para Fab) produzido em cabra (15260, Sigman-Aldrich). Os perfis de concentração individual versus tempo foram compilados a partir das medições reais da concentração sérica e dos pontos de tempo nominais. A concentração máxima de PSI0698, PSI0699 e PSI0701 no soro, Cmax, e o tempo para atingir essa concentração sérica máxima após a administração, tmax, foram determinados a partir de dados individuais. Outras estimativas de parâmetros de exposição e farmacocinéticos foram determinados perfis por Análise Não Compartimental (usando Phoenix WinNonlin 8.0); ie AUC (área sob a curva de concentração sérica no plasma do tempo do tempo zero ao infinito), CL (depuração), CL/F, (depuração após a administração SC), Vss (volume aparente de distribuição no estado estacionário), MRT (média tempo de permanência) e t1/2z (meia-vida terminal). A biodisponibilidade subcutânea, F, foi calculada com base na AUC/Dose (SC) individual dividida pela mediana da AUC/Dose (IV).

[254] Resultados

[255] Os resultados estão resumidos na Tabela 22 para o experimento IV e na Tabela 23 para o experimento SC.

Tabela 22. Estimativas do parâmetro PK medianas (faixa) após uma dose única intravenosa.

PSI0699 (SEQ ID NO: PSI0701 (SEQ ID NO: PSI0698 (SEQ ID NO: 69/SEQ ID NO: 70) 73/SEQ ID NO: 68) 67/SEQ ID NO: 68) Dose (nmol/kg) 47,1 (44,3-50,9) 39,0 (36,7-49,9) 277 (243-279) CL (ml/h-kg) 0,79 (0,74-0,80) 0,77 (0,72-0,79) 120 (100-148) Vss (ml/kg) 50,1 (49,4-52,8) 42,2 (38,4-43,2) 90,0 (54,2-544) MRT (h) 63,1 (61,9-71,9) 55,1 (48,6-60,1) 0,75 (0,55-3,7)

t1/2z (h) 47,1 (44,3-50,9) 39,0 (36,7-49,9) 4,2 (3,3-13,4) Tabela 23. Estimativas medianas do parâmetro PK (faixa) após uma dose única subcutânea PSI0699 PSI0701 (SEQ ID NO:69/SEQ ID NO:70) (SEQ ID NO:73/SEQ ID NO:68) Dose (nmol/kg) 48,6 (48,2-49,4) 41,6 (41,2-42,8) F (%) 67,8 (60,5-69,3) 49,8 (33,7-54,8) tmax (h) 24 (24-48) 48 (24-48) CL/F (ml/h-kg) 1,14 (1,12-1,28) 1,52 (1,38-2,25) MRT (h) 93,9 (75,5-95,2) 77,3 (71,2-80,7) t1/2z (h) 52,9 (32,8-54,8) 40,2 (32,0-43,8) e168h (nM) 77,2* (47,9-82,8) 39,6 (19,8-42,4)

[256] Conclusão

[257] A depuração do PSI0699 e PSI0701 foi mais de 100 vezes menor que o CL do CD40L Fab. A PK intravenosa de PSI0699 e PSI0701, respectivamente, foi caracterizada por uma baixa depuração e um pequeno volume de distribuição.

Tanto o PSI0699 quanto o PSI0701 mostraram uma biodisponibilidade se relativamente alta, com níveis de Cmáx observados 24 ou 48 horas após a dose e, em seguida, diminuindo monofasicamente com um t1/2z na ordem de 32 a 55 horas. Com base em estimativas medianas, o PSI0699 mostrou uma biodisponibilidade um pouco maior (68 vs. 50%), meia-

vida biológica mais longa (53 vs. 40 horas) e níveis de

C168h/Dose (1,6 vs. 0,96), em comparação ao PSI0701.

Claims (24)

REIVINDICAÇÕES

1. Proteína de fusão caracterizada pelo fato de que compreende i) um polipeptídeo biologicamente ativo; e ii) uma fração polipeptídica que estende a meia-vida biológica compreendendo de 2 a 80 unidades, sendo cada unidade selecionada independentemente do grupo que consiste em todas as sequências de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO: 1, que representa uma sequência derivada das unidades repetidas do domínio C-terminal da lipase estimulada por sal biliar humano: X1-X2-X3-X4-X5-X6-D-X8-X9-X10-X11 (SEQ ID NO: 1) em que, independentemente, X1 é P ou ausente; X2 é V ou ausente; X3 é P ou T; X4 é P ou T; X5 é T ou V; X6 é D, G ou T; X8 é A, Q ou S; X9 é E, G ou K; X10 é A, E P ou T; X11 é A, P ou T; em que a proteína de fusão como um todo não é lipase estimulada por sal biliar.

2. Proteína de fusão, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a referida fração peptídica que estende a meia-vida forma uma sequência contígua de 2 a 80 unidades, tal como de 4 a 80 unidades.

3. Proteína de fusão, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que compreende múltiplas frações polipeptídicas que estendem a meia-vida, cada fração polipeptídica compreendendo de 2 a 80 unidades.

4. Proteína de fusão, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 3, caracterizada pelo fato de que a referida fração polipeptídica que estende a meia-vida, ou pelo menos uma das referidas múltiplas frações que estendem a meia-vida, está posicionada no N-terminal ou C-terminal do referido polipeptídeo biologicamente ativo.

5. Proteína de fusão, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 3, caracterizada pelo fato de que a referida fração de polipeptídeo que estende a meia-vida ou pelo menos uma das referidas múltiplas frações polipeptídicas que estendem a meia-vida, constitui uma inserção em, ou substituição de uma parte da sequência de aminoácidos do polipeptídeo biologicamente ativo.

6. Proteína de fusão, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizada pelo fato de que a referida fração polipeptídica que estende a meia-vida compreende de 2 a 80 unidades de uma ou mais sequência(s) de aminoácidos selecionadas do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 2-11.

7. Proteína de fusão, de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo fato de que a referida fração polipeptídica que estende a meia-vida compreende pelo menos uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 12 a 21 e 57 a 66.

8. Proteína de fusão, de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo fato de que a referida fração polipeptídica que estende a meia-vida consiste em uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 12 a 21 e 57 a 66.

9. Proteína de fusão, de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo fato de que a referida fração polipeptídica que estende a meia-vida compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 100 a 105.

10. Proteína de fusão, de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pelo fato de que a referida fração polipeptídica que estende a meia-vida consiste em uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 100 a 105.

11. Proteína de fusão, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizada pelo fato de que a referida fração polipeptídica que estende a meia-vida compreende de 6 a 70 unidades, tal como de 10 a 51 unidades, por exemplo, de 7 a 18 unidades.

12. Proteína de fusão, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizada pelo fato de que possui um raio hidrodinâmico de pelo menos 3,8 nm.

13. Proteína de fusão, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizada pelo fato de que possui um tamanho aparente em solução de pelo menos 60 kDa, conforme determinado por cromatografia de exclusão de tamanho.

14. Proteína de fusão, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizada pelo fato de que a sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO: 1 é de origem humana.

15. Proteína de fusão, de acordo com a reivindicação 14, caracterizada pelo fato de que a fração polipeptídica que estende a meia-vida corresponde a uma sequência de aminoácidos humana que ocorre naturalmente.

16. Proteína de fusão, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizada pelo fato de que cada unidade compreende no máximo uma O-glicosilação.

17. Proteína de fusão, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizada pelo fato de que compreende uma pluralidade de polipeptídeos biologicamente ativos.

18. Método para estender a meia-vida biológica de um polipeptídeo biologicamente ativo caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: a) fornecer um polinucleotídeo que codifica uma proteína de fusão conforme definida em qualquer uma das reivindicações de 1 a 17; b) introduzir o referido polinucleotídeo em uma célula; e) manter a referida célula em condições que permitam a expressão da referida proteína de fusão; e d) isolar a referida proteína de fusão.

19. Polinucleotídeo caracterizado pelo fato de que codifica uma proteína de fusão conforme definida em qualquer uma das reivindicações de 1 a 17.

20. Vetor de expressão caracterizado pelo fato de que compreende um polinucleotídeo conforme definido na reivindicação 19.

21. Célula caracterizada pelo fato de que compreende um vetor de expressão conforme definido na reivindicação 20.

22. Composição farmacêutica caracterizada pelo fato de que compreende a proteína de fusão conforme definida em qualquer uma das reivindicações de 1 a 17 e um carreador farmaceuticamente aceitável, opcionalmente formulado para administração subcutânea ou intravenosa.

23. Proteína de fusão, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 17, caracterizada pelo fato de que é para uso como um medicamento, opcionalmente para ser administrada por via subcutânea ou intravenosa a um indivíduo.

24. Uso de um polipeptídeo que estende a meia-vida, conforme definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 17, caracterizado pelo fato de que é para aumentar a biodisponibilidade de um polipeptídeo biologicamente ativo.