CN105658232A - 使用白细胞介素-10治疗疾病和病症的方法 - Google Patents
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Abstract
提供了治疗具有响应于IL-10的疾病、病症或病状,包括与胆固醇动态平衡相关的病症的受试者的方法,包括与其相关的施用方法和给药方案。更具体地,本公开涉及优化的给药参数以在受试者的代谢疾病、病症和病状的治疗和/或预防中实现和维持功效,同时使与其相关的不良作用降至最低。具体的实施方案涉及受试者中异常高的水平的胆固醇和/或高胆固醇血症的表现的治疗和/或预防。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求2013年8月30日提交的美国临时申请序列号61/872,394的优先权权益,所述申请整体并入本文。
技术领域
本发明总体上涉及使用IL-10和相关试剂治疗或预防高胆固醇血症和一批不同的相关疾病及病症的方法。
前言
细胞因子白细胞介素-10(IL-10)是通过对T细胞、B细胞、巨噬细胞和抗原呈递细胞(APC)的作用调节多个免疫应答的多效性细胞因子。IL-10可通过抑制IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α、GM-CSF和G-CSF在活化的单核细胞和活化的巨噬细胞中的表达来抑制免疫应答,并且其还抑制NK细胞产生IFN-γ。虽然IL-10主要在巨噬细胞中表达,但还已在活化的T细胞、B细胞、肥大细胞和单核细胞中检测到表达。除了抑制免疫应答以外,IL-10还展示免疫刺激性质,包括刺激IL-2和IL-4处理的胸腺细胞的增殖,增强B细胞的活力,和刺激MHCII类的表达。
人IL-10是在破坏两个单体亚单位之间的非共价相互作用后变成无生物学活性的同二聚体。从IL-10的公开的晶体结构获得的数据表明功能性二聚体展示与IFN-γ的某些相似性(Zdanov等,(1995)Structure(Lond)3:591-601)。作为其多效性活性的结果,IL-10已与广泛的疾病、病症和病状(包括炎性病状、免疫相关病症、纤维化病症、代谢病症及癌症)相关。
鉴于代谢疾病、病症和病状诸如高胆固醇血症的流行及其相关发病率,替代的治疗方案和优化功效、患者耐受性等的给药参数将具有极大的价值。
概述
本公开设想了使用IL-10、经修饰的(例如,聚乙二醇化的)IL-10和本文中公开的相关试剂及其组合物治疗和/或预防各种疾病、病症和病状和/或其症状的方法。更具体地,本公开涉及在受试者的代谢疾病、病症和病状的治疗和/或预防中实现和维持功效,同时使与其相关的不良作用降至最低的优化的给药参数。特定的实施方案涉及受试者中胆固醇的异常高水平和/或高胆固醇血症的表现的治疗和/或预防。本公开部分基于以下发现:存在以最低程度的暴露实现血清胆固醇的最大治疗相关降低的最佳平均IL-10血清谷浓度范围和最佳剂量范围。
如下文中详细所示的,给药参数的此类优化包括,例如,与吸收、分布、代谢和排泄(“ADME”)相关的药代动力学和药效学参数的评估、考虑施用途径和其它因素。应理解,除非在本文中另外指明,否则涉及ADME和其它参数的术语旨在具有它们在相关科学领域内普遍接受的含义。通过举例的方式,术语“血清半衰期”或“t1/2”是指消除半衰期(即,试剂的血清浓度已达到其初始或最大值的一半时的时间)。如本文中所用,提及血清浓度意在包括血浆浓度,并且反之亦然。
高胆固醇血症本身通常是无症状的。然而,血清胆固醇的慢性升高促成动脉粥样硬化斑块在动脉形成。相对小的斑块可破裂并引起血块形成和阻塞血流。相比之下,较大的斑块可导致动脉狭窄或所牵涉的动脉的阻塞。冠状动脉的突然阻塞导致心肌梗塞,其中供应大脑的动脉的阻塞可导致中风。
引起供给组织和器官的血液逐步减少的狭窄或阻塞的逐渐发展经常导致其活性的减弱。组织缺血可表现为一个或多个症状。例如,脑的短暂缺血(短暂性脑缺血发作)可表现为视力的短暂丧失、眩晕或平衡受损、失语症、轻瘫和感觉异常。供给心脏的血液不足可表现为胸痛;眼的缺血可表现为一只眼的短暂视力丧失;以及供给腿的血液不足可表现为小腿疼痛。
高胆固醇血症可根据特征表现被分类成各种类型。例如,IIa型高脂蛋白血症可与睑黄斑瘤(眼睑周围的皮肤下面的淡黄色斑块)、老年环(角膜外周的白色或灰色变色)和肌腱(通常手指)的黄瘤(淡黄色富含胆固醇的物质的沉积)相关。相反地,III型高脂血症可与掌、膝盖和肘的黄瘤相关。
根据脂质假说,血液中的胆固醇水平异常(通常较高的LDL颗粒浓度和较低的功能性HDL颗粒的浓度)与因动脉中粥样硬化发展的促进而引起的心血管疾病(动脉粥样硬化)强相关。因为高循环LDL浓度已与动脉粥样硬化形成相关,因此LDL通常被称为“坏胆固醇”;与此相反,高浓度的HDL能从细胞中除去胆固醇,减少动脉粥样硬化形成,从而HDL通常被称为“好胆固醇”。然而,最近的证据表明,总胆固醇是心血管异常的最相关指标。
当单独的饮食限制不足以解决高胆固醇血症时,通常引入一种或多种降血脂剂(例如,他汀类、贝特类(fibrates)、胆固醇吸收抑制剂、烟酸衍生物和胆汁酸螯合剂)。如果药物治疗不成功,则使用几种极端方法(例如,基于血浆分离置换法的治疗)。根据本公开的教导,本文所述的IL-10相关试剂提供可替代为降血脂剂诸如本文所述的那些降血脂剂或与降血脂剂组合的替代治疗模式。
如下文中进一步论述的,人IL-10为同二聚体,并且每一个单体包含178个氨基酸,其中的前18个包含信号肽。本公开的具体实施方案包括缺少信号肽的成熟人IL-10多肽(参见,例如,美国专利第6,217,857号),或成熟人PEG-IL-10。在另外的具体实施方案中,IL-10试剂为成熟人IL-10的变体。所述变体可展示比成熟人IL-10小、与其相当或比其大的活性;在某些实施方案中,所述活性可与成熟人IL-10的活性相当或比其大。
本公开的某些实施方案设想IL-10的修饰,以增强一个或多个性质(例如,药代动力学参数、功效等)。此类IL-10修饰包括聚乙二醇化、糖基化、白蛋白(例如,人血清白蛋白(HSA))缀合和融合,以及羟乙基化(hesylation)。在具体实施方案中,IL-10被聚乙二醇化。在其它实施方案中,IL-10的修饰不会导致对免疫原性的治疗相关的不利影响,并且在其它实施方案中,经修饰的IL-10比未修饰的IL-10的免疫原性低。术语“IL-10”、“IL-10多肽”、“试剂”等旨在被广义地解释,并包括,例如,人和非人IL-10相关多肽,包括同系物、变体(包括突变蛋白)及其片段,以及具有例如前导序列(例如,信号肽)的IL-10多肽,和前述的修饰形式。在其它具体实施方案中,术语“IL-10”、“IL-10多肽”、“试剂”为激动剂。具体实施方案涉及聚乙二醇化的IL-10,其在文中也被称为“PEG-IL-10”。本公开内容还设想了编码前述的核酸分子。
本公开的具体实施方案涉及治疗或预防受试者(例如,人)的疾病、病症或病状的方法,所述方法包括向受试者施用治疗有效量的IL-10试剂,其中所述量足以实现1pg/mL至10.0ng/mL的平均IL-10血清谷浓度;并且其中所述疾病、病症或病状为a)心血管病症,b)血栓性病症,或c)炎性病症。
本公开还设想了描绘治疗或预防受试者(例如,人)的疾病、病症或病状的方法的实施方案,所述方法包括向受试者施用治疗有效量的IL-10试剂,其中所述量足以在一段时间内维持平均IL-10血清谷浓度;其中所述疾病、病症或病状为a)心血管病症,b)血栓性病症,或c)炎性病症;其中平均IL-10血清谷浓度为1.0pg/mL至10.0ng/mL;并且其中平均IL-10血清谷浓度维持至少95%的一段时间。
在本公开的一些实施方案中,平均IL-10血清谷浓度在如下范围内:1.0pg/mL至100pg/mL;0.1ng/mL至1.0ng/mL;1.0ng/mL至10ng/mL;0.5ng/mL至5.0ng/mL;0.75ng/mL至1.25ng/mL或0.9ng/mL至1.1ng/mL。在本公开的具体实施方案中,平均IL-10血清谷浓度为至少1.25ng/mL、至少1.5ng/mL、至少1.6ng/mL、至少1.7ng/mL、至少1.8ng/mL、至少1.85ng/mL、至少1.9ng/mL、至少1.95ng/mL、至少1.97ng/mL和至少1.98ng/mL、至少1.99ng/mL、至少2.0ng/mL或大于2ng/mL。在其它具体实施方案中,平均IL-10血清谷浓度低于10.0ng/mL、低于9.0ng/mL、低于8.0ng/mL、低于7.0ng/mL、低于6.0ng/mL、低于5.0ng/mL、低于4.0ng/mL、低于3.0ng/mL、低于2.5ng/mL、低于2.0ng/mL、低于1.9ng/mL、低于1.8ng/mL、低于1.7ng/mL、低于1.6ng/mL、低于1.5ng/mL、低于1.4ng/mL、低于1.3ng/mL、低于1.2ng/mL、低于1.1ng/mL、低于1.0ng/mL、低于0.75ng/mL、低于0.5ng/mL、低于0.25ng/mL、低于0.1ng/mL、低于0.075ng/mL、低于0.05ng/mL、低于0.025ng/mL或低于0.01ng/mL。
在其它实施方案中,一段时间为至少12小时、至少24小时、至少48小时、至少72小时、至少1周、至少2周、至少3周、至少1个月、至少6周、至少2个月、至少3个月、至少6个月、至少9个月或大于12个月。
在本公开的具体实施方案中,使平均IL-10血清谷浓度维持至少85%的一段时间,至少90%、至少96%、至少98%、至少99%或100%的一段时间。
可以设想,足以维持所需稳态血清谷浓度(例如,1ng/mL)的给药方案可导致高于所需稳态血清谷浓度的初始血清谷浓度。由于哺乳动物受试者中IL-10的药效学和药代动力学特征,甚至当给药参数(量和频率)保持恒定时,初始谷浓度(例如,通过一个或多个负荷剂量的施用,随后一系列维持剂量实现的)在一段时间内逐渐但连续地降低。在该时间段后,逐渐但连续的降低结束,并且稳态血清谷浓度得以维持。
通过举例的方式,约0.1mg/kg/日的IL-10试剂(例如,mIL-10)至小鼠(例如,C57BL/6小鼠)的肠胃外施用(例如,SC和IV)是维持2.0ng/mL的稳态血清谷浓度所需要的。然而,该稳态血清谷浓度直至以0.1mg/kg/日的给药开始后(以及也在任何负荷剂量后)约30天才可达到。相反地,在已达到初始血清谷浓度(例如,2.5ng/mL)后,该浓度在例如约30天的时期过程中逐渐但连续地降低,该时间后维持所需稳态血清谷浓度(2.0ng/mL)。本领域技术人员将能够使用例如ADME和患者特异性参数来测定维持所需稳态谷浓度所需要的剂量。
本公开设想了其中IL-10试剂包含至少一个修饰来形成经修饰的IL-10试剂的方法,其中所述修饰不改变IL-10试剂的氨基酸序列。在一些实施方案中,经修饰的IL-10试剂为PEG-IL-10试剂。PEG-IL-10试剂可包含至少一个共价附接于IL-10的至少一个亚单位的至少一个氨基酸残基的PEG分子,或在其它实施方案中包含单-聚乙二醇化和二-聚乙二醇化IL-10的混合物。PEG-IL-10试剂的PEG组分可具有大于约5kDa、大于约10kDa、大于约15kDa、大于约20kDa、大于约30kDa、大于约40kDa或大于约50kDa的分子质量。在一些实施方案中,所述分子质量为约5kDa至约10kDa、约5kDa至约15kDa、约5kDa至约20kDa、约10kDa至约15kDa、约10kDa至约20kDa、约10kDa至约25kDa或约10kDa至约30kDa。
在一些实施方案中,经修饰的IL-10试剂包含至少一种Fc融合分子、至少一种血清白蛋白(例如,HSA或BSA)、HAS融合分子或白蛋白缀合物。在另外的实施方案中,经修饰的IL-10试剂被糖基化,羟乙基化或包含至少一个白蛋白结合结构域。一些经修饰的IL-10试剂可包含不止一个类型的修饰。在具体实施方案中,所述修饰为位点特异性的。一些实施方案包含接头。在下文中详细地论述了经修饰的IL-10试剂。
本公开设想了其中每日至少2次、每日至少1次、每48小时至少1次、每72小时至少一次、每周至少一次、每2周至少一次、每个月至少一次、每2个月至少一次或每3个月至少一次向受试者施用IL-10试剂的方法。一些实施方案还包括施用IL-10试剂和至少一种另外的预防剂或治疗剂。在本公开的某些实施方案中,预防剂或治疗剂为胆固醇动态平衡剂。在一些实施方案中,胆固醇动态平衡剂包含他汀类、胆汁酸树脂、依泽替米、纤维酸、烟酸或PCSK9抑制剂。胆固醇动态平衡剂频繁地直接或间接促进心血管病症。在具体实施方案中,预防剂或治疗剂是用于预防或治疗动脉粥样硬化的试剂。在另外的实施方案中,预防剂或治疗剂是抗糖尿病剂或抗肥胖剂,而在其它实施方案中,其为免疫剂或抗炎剂。另外的示例性预防剂和治疗剂在下文阐述。
可通过任何有效途径施用IL-10试剂。在一些实施方案中,通过肠胃外注射包括皮下注射施用IL-10试剂。
本公开内容的具体实施方案涉及包含药学上可接受的量的IL-10试剂(例如,治疗有效量)(包括上述的那些试剂)连同一种或多种药学上可接受的稀释剂、载体或赋形剂(例如,等渗注射溶液)的药物组合物。所述药物组合物通常为适于人施用的药物组合物。此外,在一些实施方案中,所述药物组合物包含至少一种另外的预防剂或治疗剂。
本公开的某些实施方案设想了含有上述药物组合物之一和任选地一种或多种另外的组分的无菌容器。通过举例的方式,但不限于,所述无菌容器可以是注射器。在其它实施方案中,所述无菌容器为试剂盒的一个组分;所述试剂盒还可含有例如包含至少一种预防剂或治疗剂的第二无菌容器,其实例示于本文中。
附图简述
图1描绘人IL-10(SEQIDNO:1)和小鼠IL-10(SEQIDNO:2)的氨基酸序列。
图2A-E描绘在喂食高脂肪膳食的LDLR-/-小鼠中PEG-rmIL-10暴露对指定的脂质相关参数的作用。每日一次向小鼠皮下施用(SC)1mg/kg、0.2mg/kg或0.02mg/kg或媒介物对照,持续14天,并且在第28天测量以下参数:血清胆固醇(图2A);甘油三酯(图2B);LDL(图2C);HDL(图2D);和LDL/HDL比率(图2E)。(n=10;棒代表数据点的中位数)。
图3A-3C描绘在喂食高脂肪西方饮食4周的LDLR-/-小鼠中PEG-rmIL-10对胆汁酸合成、细胞内胆固醇运输和胆固醇流出的调节剂(CYP7A1、APOL8和ABCG1)的作用。在第3周和第4周期间,每日一次向小鼠皮下施用PEG-rmIL-10(1mg/kg、0.2mg/kg或0.02mg/kg)或媒介物对照,之后分析肝的CYP7A1(图3A)、APOL8(图3B)和ABCG1(图3C)的信息表达的变化。(n=10;棒代表数据点的中位数)。
图4A和4B描绘PEG-rmIL-10对PCSK9和APOA2的作用,所述PCSK9和APOA2分别参与LDL和HDL的调控。给LDLR-/-小鼠喂食高脂肪西方饮食,持续4周。在第3周和第4周期间,每日一次向小鼠皮下施用PEG-rmIL-10(1mg/kg、0.2mg/kg或0.02mg/kg)或媒介物对照,随后分析肝的PCSK9和APOA2的信息表达的变化。(n=10;棒代表数据点的中位数)。
图5描绘在喂食高脂肪西方饮食4周的LDLR-/-小鼠中PEG-rmIL-10对CRP(炎症和/或动脉粥样硬化的指标)的调控的作用。在第3周和第4周期间,每日一次向小鼠皮下施用PEG-rmIL-10(1mg/kg、0.2mg/kg或0.02mg/kg)或媒介物对照,之后分析肝的CRP的信息表达的变化。(n=10;棒代表数据点的中位数)。
图6A和6B描绘PEG-rmIL-10对MSR1和MARCO(分别为清道夫受体-A1和清道夫受体A-2)的作用,所述MSR1和MARCO与胆固醇摄入的机制相关。给LDLR-/-小鼠喂食高脂肪西方饮食4周。在第3周和第4周期间,每日一次向小鼠皮下施用PEG-rmIL-10(1mg/kg、0.2mg/kg或0.02mg/kg)或媒介物对照,随后分析肝的MSR1和MARCO的信息表达的变化。(n=10;棒代表数据点的中位数)。
图7(图A-E)描绘吞噬细胞的耗竭在喂食高脂肪膳食的LDLR-/-小鼠和野生型小鼠中(图7,图A、D和E)和喂食正常膳食的LDLR-/-小鼠和野生型小鼠中(图7C和7B)中所具有的对PEG-rMuIL-10诱导的胆固醇降低的作用。
图8(图A-J)描绘用PEG-rHuIL-10体外处理的人单核细胞、巨噬细胞、枯否细胞(Kupffercells)或肝细胞是否响应PEG-rHuIL-10。
图9(图A和B)描绘PEG-rHuIL-10在具有低的和升高的血浆胆固醇水平的癌症患者中的作用。
详述
在进一步描述本公开之前,应理解,本公开不限于本文中所示的具体实施方案,并且还应理解,本文中所用的术语仅仅是为了描述具体实施方案,而不旨在限制。
当提供值的范围时,应当理解,该范围的上限和下限之间的每个居间数值(至下限单位的十分之一,除非本文另外清楚地规定)以及所述范围内的任意其它所述或居间数值都包括在本发明中。这些较小范围的上限和下限可独立地包括在该较小的范围内,并且也包括在本发明内,服从于所述范围内的任何特别排除的限值。当所述范围包括上下限值之一或两者时,排除那些所包括的限值之一或两者的范围也包括在本发明中。除非另外定义,否则本文中所使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域内的普通技术人员通常理解的意义相同的意义。
必须指出,如本文中和所附权利要求中所用,除非上下文中另外明确指定,否则单数形式“一种/一个(a)”、“一种/一个(an)”和“该/所述(the)”包括复数指示物。还要指出的是,可撰写权利要求来排除任何可选元素。这样,该陈述旨在用作与权利要求要素的描述组合使用的此类排他性术语诸如“单独地”、“仅仅”等或使用“否定(negative)”限制的在先基础。
本文所论述的出版物仅针对它们在本申请提交日之前的公开内容而提供。另外,所提供的公布日期可能不同于实际的公布日期,这可能需要独立地进行确认。
概述
本公开内容设想了本文中描述的试剂及其组合物用于治疗和/或预防各种代谢相关疾病(例如,高胆固醇血症)、病症和病状和/或其症状的用途。在本公开的某些方面,此类治疗或预防通过利用特定给药参数来进行。本公开基于以下发现:存在达到血清胆固醇的治疗相关降低以及避免因较高的IL-10血清浓度而导致的严重毒性的最佳平均IL-10血清谷浓度范围和最佳剂量范围。
在本公开的一些实施方案中,以足以达到大于约1ng/mL但小于约10ng/mL血清谷浓度的量向具有可利用IL-10试剂(例如,IL-10多肽)治疗的疾病或病症或处于具有所述疾病或病症的风险中的受试者施用IL-10试剂,然而在其它实施方案中,所述血清谷浓度大于约2ng/mL但小于约10ng/mL。
应指出,结合本公开的多肽和核酸分子对“人”的任何提及并不意味着限定于其中获得所述多肽或核酸的方式,而是仅参考序列,因为其可对应于天然存在的人多肽或核酸分子的序列。除了人多肽和编码它们的核酸分子以外,本公开还设想了IL-10相关多肽和来自其它物种的相应核酸分子。
定义
除非另外指出,以下术语旨在具有下文所示的含义。在整个本说明书的其它地方定义其它术语。
术语“患者”或“受试者”可互换使用,意指人或非人动物(例如,哺乳动物)。
术语“施用(administration)”、“施用(administer)”等,当它们用于例如受试者、细胞、组织、器官或生物体液时,是指例如IL-10或PEG-IL-10)、核酸(例如,编码天然人IL-10的核酸)、包含前述的药物组合物、或诊断剂与所述受试者、细胞、组织、器官或生物体液的接触。在细胞的上下文中,施用包括试剂与细胞的接触(例如,体外或离体)以及试剂与体液的接触,其中所述体液与细胞接触。
术语“治疗(treat)”、“治疗(treating)”、“治疗(treatment)”等是指在疾病、病症或病状或其症状已被诊断、观察等后开始(以消除、减轻、抑制、缓解或改善(暂时地或永久地)折磨受试者的疾病、病症或病状的潜在原因中的至少一个原因,或与折磨受试者的疾病、病症或病状相关的症状中的至少一个症状)的作用(诸如施用IL-10或包含IL-10的药物组合物)的过程。因此,治疗包括抑制(例如,阻滞疾病、病症或病状或与其相关的临床症状的发展或进一步发展)活动性疾病。术语可用于其它背景中,诸如其中IL-10或PEG-IL-10接触例如体液相或胶体相中的IL-10受体的情况。
如本文中所用,术语“需要治疗”是指由医生或其他照护者作出的受试者需要或将受益于治疗的判断。该判断是基于多个存在于医生或照护者的专业知识领域中的因素作出的。
术语“预防(prevent)”、“预防(preventing)”、“预防(prevention)”等是指以通常在易患特定疾病、病症或病状的受试者的背景中预防、压制、抑制或减少(暂时地或永久地)受试者发生疾病、病症、病状等的风险(如通过例如临床症状的不存在测定的)或延迟其发作的方式起始的(例如,在疾病、病症、病状或其症状发作之前)作用过程(诸如施用IL-10或包含IL-10的药物组合物)。在某些情况下,术语还指减缓疾病、病症或病状的进展或抑制其至有害或另外地不期望的状态的进展。
如本文中所用,术语“需要预防”是指由医生或其他照护者作出的受试者需要或将受益于预防保健的判断。该判断是基于多个存在于医生或照护者的专业知识领域中的因素作出的。
短语“治疗有效量”是指将试剂单独地或作为药物组合物的部分和以单次剂量或作为一系列剂量的部分,以当向受试者施用时能够具有对疾病、病症或病状的任何症状、方面或特征的任何可检测的积极作用的量向受试者施用。治疗有效量可通过测定相关生理效应来确定,并且可结合给药方案和受试者的病状的诊断分析等来调节。通过举例的方式,施用后产生的炎性细胞因子的量的测量可指示是否已使用治疗有效量。
短语“以足以实现改变的量”意味着在特定疗法施用之前(例如,基线水平)和之后测量的指标的水平之间存在可检测的差异。指标包括任何客观参数(例如,IL-10的血清浓度)或主观参数(例如,受试者的健康幸福感)。
术语“小分子”是指具有小于约10kDa、小于约2kDa或小于约1kDa的分子量的化合物。小分子包括,但不限于,无机分子、有机分子、含有无机成分的有机分子、包含放射性原子的分子和合成分子。在治疗上,小分子可以更加能够渗透细胞,不太容易被降解,并且相较于大分子不太可能引发免疫应答。
术语“配体”是指例如可用作受体的激动剂或拮抗剂的肽、多肽、膜相关或膜结合分子或其复合物。“配体”涵盖天然和合成配体,例如,细胞因子、细胞因子变体、类似物、突变蛋白和从抗体衍生的结合组合物。“配体”还涵盖小分子,例如,细胞因子的肽模拟物和抗体的肽模拟物。该术语还包括既不是激动剂也不是拮抗剂,但可结合受体而不显著影响其生物学特性,例如信号传导或附着的试剂。此外,该术语包括已例如通过化学或重组方法改变成膜结合配体的可溶性形式的膜结合配体。配体或受体可以是完全细胞内的,即,其可驻留在细胞质、细胞核或某些其它胞内区室中。配体和受体的复合物被称为“配体-受体复合物”。
术语“抑制剂”和“拮抗剂”或“活化剂”和“激动剂”是指是分别例如用于例如配体、受体、辅因子、基因、细胞、组织或器官的活化的抑制或激活分子。抑制剂是减少、阻断、防止、延迟活化、灭活、脱敏或下调例如基因、蛋白质、配体、受体或细胞的分子。活化剂是增加、活化、促进、增强活化、敏化或上调例如基因、蛋白质、配体、受体或细胞的分子。抑制剂也可被定义为降低、阻断或灭活组成型活性的分子。“激动剂”是与靶相互作用以引起或促进靶的活化的增加的分子。“拮抗剂”是与激动剂的作用相反的分子。拮抗剂防止、降低、抑制或中和激动剂的活性,并且拮抗剂也可防止、抑制或减少靶例如靶受体的组成型活性,甚至在不存在鉴定的激动剂的情况下。
术语“调节”、“调节(modulation)”等是指直接或间接增强或减弱IL-10试剂(或编码它们的核酸分子)的功能或活性的分子(例如,活化剂或抑制剂)的能力;或增强分子产生与IL-10试剂的作用相当作用的能力。术语“调节剂”意在广义地指能够实现上述活性的分子。通过举例的方式,例如,基因、受体、配体或细胞的调节剂是改变所述基因、受体、配体或细胞的活性的分子,其中以其调控性质活化、抑制或改变活性。调节剂可单独作用,或其可使用辅因子,例如,蛋白质、金属离子或小分子。术语“调节剂”包括通过与IL-10(即,以与其类似的方式调节与IL-10相同的信号转导途径的试剂)相同的作用机制运行并且能够引发与IL-10的生物应答相当(或比其更大)的生物应答的试剂。
调节剂的实例包括小分子化合物和其它生物有机分子。小分子化合物(例如,组合文库)的众多文库是商购可得的,并且可用作用于鉴定调节剂的起点。本领域技术人员能够开发一个或多个其中可筛选此类化合物文库以鉴定一种或多种具有所需性质的化合物的测定(例如,基于生化或细胞的测定);此后,本领域熟练的药物化学家能够通过例如合成和评价其类似物和衍生物优化此类一种或多种化合物。合成和/或分子建模研究也可用于活化剂的鉴定。
分子的“活性”可以描述或指分子与配体或与受体的结合;催化活性;刺激基因表达或细胞信号转导、分化或成熟的能力;抗原活性;其它分子的活性的调节等。该术语也可指调节或维持细胞间相互作用(例如,粘附)中的活性,或维持细胞的结构(例如,细胞膜)中的活性。“活性”也可意指比活性,例如,[催化活性]/[mg蛋白质],或[免疫活性]/[mg蛋白质],生物区室中的浓度等。术语“增殖活性”涵盖促进例如正常细胞分裂以及癌症、肿瘤、发育不良、细胞转化、转移和血管生成,对于其是必需的或与其特异性相关的活性。
如本文中所用,“相当的”、“相当的活性”、“与……相当的活性”、“相当的作用”、“与……相当的作用”等是可被定量和/或定性考虑的相关术语。术语的含义经常取决于其中使用它们的上下文。通过举例的方式,均激活受体的两种试剂从定性角度可被看作具有相当的作用,但如果一种试剂仅能达到另一种试剂的活性的20%(如在本领域接受的测定(例如,剂量-反应测定)或本领域接受的动物模型中测定的),则这两种试剂从定量角度可被视为缺乏相当的作用。当将一个结果与另一个结果(例如,一个结果与参照标准)相比较时,“相当的”通常意指一个结果与参照标准偏差小于35%、小于30%、小于25%、小于20%、小于15%、小于10%、小于7%、小于5%、小于4%、小于3%、小于2%或小于1%。在具体实施方案中,如果一个结果与参照标准偏差小于15%、小于10%或小于5%,则其可与参照标准相当。通过举例的方式,而非限制,所述活性或作用可以指功效、稳定性、溶解性或免疫原性。
术语例如,细胞、组织、器官或生物体的“反应”涵盖生化或生理行为例如浓度、密度、粘附或生物区室中的迁移、基因表达的速率或分化状态的变化,其中变化与活化、刺激或治疗或与内部机制诸如遗传编程相关。在某些情况下,术语“激活”、“刺激”等是指如受内部机制,以及受外部或环境因素调控的细胞活化;然而术语“抑制”、“下调”等是指相反的作用。
术语“多肽”、“肽”和“蛋白”,在本文中可互换使用,是指具有任何长度的氨基酸的聚合形式,其可包括遗传编码和非遗传编码的氨基酸、化学或生物化学修饰或衍生的氨基酸和具有修饰的多肽主链的多肽。术语包括融合蛋白(包括,但不限于,具有异源氨基酸序列的融合蛋白);具有异源和同源前导序列的融合蛋白;具有或不具有N末端甲硫氨酸残基的融合蛋白;具有免疫标记的蛋白质的融合蛋白等。
应当理解,在整个本公开中,参考根据单字母或三字母代码的氨基酸。为了读者的方便,下面提供了单字母和三字母氨基酸代码:
如本文中所用,术语“变体”涵盖天然存在的变体和非天然存在的变体。天然存在的变体包括同系物(物种之间分别在氨基酸或核苷酸序列上不同的多肽和核酸)和等位基因变体(在物种内的个体之间分别在氨基酸或核苷酸序列上不同的多肽和核酸)。非天然存在的变体包括分别包含氨基酸或核苷酸序列的变化的多肽和核酸,其中人工引入序列的变化(例如,突变蛋白);例如,通过人干预(“手动”)在实验室产生变化。因此,在本文中“突变蛋白”广泛地指突变的重组蛋白质,其通常携带单个或多个氨基酸取代,并且通常来源于已经历定点或随机诱变的克隆的基因,或来源于完全合成的基因。
术语“DNA”、“核酸”、“核酸分子”、“多核苷酸”等在本文中可互换使用,是指具有任何长度的核苷酸(脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸,或其类似物)的聚合形式。多核苷酸的非限制性实例包括直链和环状核酸、信使RNA(mRNA)、互补DNA(cDNA)、重组多核苷酸、载体、探针、引物等。
如本文中所用,在多肽的结构的上下文中,“N-末端(N-terminus)”(或“氨基末端”)和“C-末端(C-terminus)”(或“羧基末端”)分别是指多肽的最氨基末端和最羧基末端,而术语“N-末端(N-terminal)”和“C-末端(C-terminal)”分别是指朝向N末端和C末端的多肽的氨基酸序列中的相对位置,并且可分别包括所述N-末端和C-末端处的残基。“紧挨着N-末端”或“紧挨着C-末端”是指第一氨基酸残基相对于第二氨基酸残基的位置,其中所述第一与第二氨基酸残基共价结合以提供连续的氨基酸序列。
“来源于”,在氨基酸序列或核苷酸序列(例如,“来源于”IL-10多肽的氨基酸序列)的上下文中,意在表示多肽或核酸具有基于参照多肽或核酸(例如,天然存在的IL-10多肽或IL-10编码核酸)的序列的序列,并且不意味着限定为其中产生所述蛋白质或核酸的来源或方法。通过举例的方式,术语“来源于”包括参照氨基酸或DNA序列的同系物或变体。
在多肽的上下文中,术语“分离的”是指目标多肽,其如果天然存在,则存在于与其中其可天然存在的环境不同的环境中。“分离的”意在包括多肽,所述多肽存在于针对目标多肽基本富集的和/或其中目标多肽被部分或基本纯化的样品内。当多肽不是天然存在的时候,“分离的”表示所述多肽已从其中通过合成或重组方法产生其的环境分离。
“富集”意指样品被非天然操纵(例如,由科学家),以使得目标多肽以a)比起始样品诸如生物样品(例如,所述多肽天然存在于其中或其在施用后存在于其中的样品)中的所述多肽的浓度大的浓度(例如,大至少3倍、大至少4倍、大至少8倍、大至少64倍或更多倍),或b)比其中产生所述多肽的环境(例如,如在细菌细胞中)更大的浓度存在。
“基本上纯的”表示组分(例如,多肽)构成大于约50%的组合物的总含量,通常地大于约60%的总多肽含量。更常见地,“基本上纯的”是指其中至少75%、至少85%、至少90%或更多的总组合物为目标组分的组合物。在一些情况下,所述多肽将构成大于约90%,或大于约95%的所述组合物的总含量。
术语“特异性结合”或“选择性结合”,当指配体/受体、抗体/抗原或其它结合对时,表示决定所述蛋白质在蛋白质的异质群体和其它生物制品中的存在的结合反应。因此,在指定的条件下,指定的配体结合于特定受体并且不以显著的量结合于存在于样品中的其它蛋白质。设想的方法的抗体或来源于抗体的抗原结合位点的结合组合物以为利用任何其它抗体或来源于其的结合组合物的亲和力至少2倍大、至少10倍大、至少20倍大或至少100倍大的亲和力结合于其抗原或其变体或突变蛋白。在具体的实施方案中,抗体将具有大于约109公升/mol的亲和力,如通过例如Scatchard分析(Munsen,等1980Analyt.Biochem.107:220-239)测定的。
IL-10和PEG-IL-10
抗炎性细胞因子IL-10,也称为人细胞因子合成抑制因子(CSIF),被分类为2型(类)细胞因子,为包括IL-19、IL-20、IL-22、IL-24(Mda-7)和IL-26、干扰素(IFN-α、-β、-γ、-δ、-ε、-κ、-Ω和-τ)和干扰素样分子(limitin、IL-28A、IL-28B和IL-29)的一组细胞因子。
IL-10为在免疫调节和炎症中具有多效性效应的细胞因子。它由肥大细胞产生,抵消这些细胞在过敏反应位点处所具有的炎性作用。虽然它能够抑制促炎性细胞因子诸如IFN-γ、IL-2、IL-3、TNFα和GM-CSF的合成,但IL-10也对某些T细胞和肥大细胞具有刺激性并且刺激B-细胞成熟、增殖和抗体生产。IL-10可阻断NF-κB活性,并参与JAK-STAT信号转导途径的调节。它还诱导CD8+T细胞的细胞毒性活性和B细胞的抗体产生,并且它抑制巨噬细胞活性和肿瘤促进炎症。CD8+T细胞的调节是剂量依赖性的,其中较高的剂量诱导更强的细胞毒性应答。
人IL-10是具有37kDa的分子质量的同二聚体,其中每一个18.5kDa单体包括178个氨基酸,其前18个氨基酸包含信号肽和两个形成两个分子内二硫键的半胱氨酸残基。IL-10二聚体在两个单体亚单位之间的非共价相互作用破坏后变为无生物活性。
本公开设想了显示80%同源性的人IL-10和鼠IL-10及其用途。此外,本公开的范围包括来自其它哺乳动物物种的IL-10直系同源物及其修饰形式,所述哺乳动物物种包括大鼠(登录号NP_036986.2;GI148747382);牛(登录号NP_776513.1;GI41386772);绵羊(登录号NP_001009327.1;GI57164347);狗(登录号ABY86619.1;GI166244598);和兔(登录号AAC23839.1;GI3242896)。
如上文所暗示,术语“IL-10”、“IL-10多肽”、“IL-10试剂”等旨在被广义地解释,并包括,例如,人和非人IL-10相关多肽,包括其同系物、变体(包括突变蛋白)及其片段,以及具有例如前导序列(例如,信号肽)的IL-10多肽,以及前述的经修饰的形式。在其它具体实施方案中,IL-10、IL-10多肽和IL-10试剂为激动剂。
IL-10受体,II型细胞因子受体,由α和β亚基(其也被分别称为R1和R2)组成。受体激活需要结合α和β。IL-10多肽的一个同二聚体结合于α并且同一IL-10多肽的另一个同二聚体结合β。
重组人IL-10的实用性通常受其相对短的血清半衰期限制,所述相对短的血清半衰期可归因于例如肾清除率、血流中的蛋白水解降解和单体化。因此,各种方法已被开发来改善IL-10的药代动力学特征谱(而不会破坏其二聚体结构,从而不利地影响其活性)。IL-10的聚乙二醇化导致某些药代动力学参数(例如,血清半衰期)的改善和/或活性的增强。
如本文中所用,术语“聚乙二醇化的IL-10”和“PEG-IL-10”是指具有一个或多个共价附接(通常通过接头,以便附接是稳定的)于IL-10蛋白质的至少一个氨基酸残基的聚乙二醇分子的IL-10分子。术语“单-聚乙二醇化的IL-10”和“单-PEG-IL-10”表示一个聚乙二醇分子共价附接于(通常通过接头)IL-10二聚体的一个亚单位上的单个氨基酸残基。在某些实施方案中,本公开中使用的PEG-IL-10是单-PEG-IL-10,其中1至9个PEG分子通过接头共价附接于IL-10二聚体的一个亚单位的N末端处的氨基酸残基的α氨基。一个IL-10亚单位上的单聚乙二醇化通常因亚单位改组而导致非聚乙二醇化、单聚乙二醇化和二聚乙二醇化IL-10的非均质混合物。此外,允许聚乙二醇化反应进行至完成将通常导致非特异性和多聚乙二醇化IL-10,从而降低其生物活性。因此,本公开的具体实施方案包括由本文所述方法(例如,实验部分)产生的单-和二-聚乙二醇化IL-10的混合物的施用。
在具体实施方案中,PEG部分的平均分子量为约5kDa至约50kDa之间。尽管PEG附接于IL-10的方法或位点不是关键的,但在某些实施方案中,聚乙二醇化不改变,或仅最低限度地改变IL-10试剂的活性。在某些实施方案中,半衰期的增加超过生物活性的任何降低。PEG-IL-10的生物学活性通常通过评估利用细菌抗原(脂多糖(LPS))攻击并且利用PEG-IL-10治疗的受试者的血清中的炎性细胞因子(例如,TNF-α或IFN-γ)的水平来测量,如在美国专利第7,052,686号中描述的。
IL-10变体可根据考虑的各种目标(包括增加血清半衰期、降低针对IL-10的免疫应答、有利于纯化或制备、减少IL-10至其单体亚单位的转换、提高治疗功效和在治疗使用过程中减轻严重性或副作用的发生)来制备。氨基酸序列变体是未在自然界中发现的通常预定的变体,尽管一些可以是翻译后变体,例如糖基化变体。可使用IL-10的任何变体,只要其保留适当水平的IL-10活性.
术语“保守氨基酸取代”是指通过用具有类似酸性、碱性、电荷、极性或侧链的尺寸的侧链的氨基酸替代蛋白质中的氨基酸来保持所述蛋白质的活性的取代。保守氨基酸取代通常使得必需进行以下组内的氨基酸残基的取代:1)L、I、M、V、F;2)R、K;3)F、Y、H、W、R;4)G、A、T、S;5)Q、N;和6)D、E。取代、插入或缺失的指导可基于不同变体蛋白质或来自不同物种的蛋白质的氨基酸序列的比对。因此,除了任何天然存在的IL-10多肽以外,本公开设想具有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个,通常不超过20个、10个或5个氨基酸取代,其中所述取代通常为保守氨基酸取代。
本公开还设想了含有来源于成熟IL-10的连续氨基酸残基的成熟IL-10的活性片段(例如,子序列)。取决于所述子序列所源自的特定的天然存在的氨基酸序列,肽或多肽序列的连续氨基酸残基的长度可变化。一般地,肽和多肽可为约20个氨基酸至约40个氨基酸、约40个氨基酸至约60个氨基酸、约60个氨基酸至约80个氨基酸、约80个氨基酸至约100个氨基酸酸、约100个氨基酸至约120个氨基酸、约120个氨基酸至约140个氨基酸、约140个氨基酸至约150个氨基酸、约150个氨基酸至约155个氨基酸、约155个氨基酸酸直至全长肽或多肽。
此外,IL-10多肽可在确定长度的连续氨基酸(例如,“比较窗口”)上相较于参照序列具有确定的序列同一性。用于比较的序列的比对方法在本领域中是公知的。可以例如通过Smith&Waterman,Adv.Appl.Math.2:482(1981)的局部同源性算法,通过Needleman&Wunsch,J.Mol.Biol.48:443(1970)的同源性比对算法,通过Pearson&Lipman,Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA85:2444(1988)的相似性搜索法,通过这些算法的计算机化执行(WisconsinGenetics软件包中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA,Madison,Wis.)或通过手工比对和目测观察(参见,例如,CurrentProtocolsinMolecularBiology(Ausubel等,编辑1995增刊)进行用于比较的序列的最佳比对。
作为实例,适当的IL-10多肽可包含氨基酸序列,所述氨基酸序列与约20个氨基酸至约40个氨基酸、约40个氨基酸至约60个氨基酸、约60个氨基酸至约80个氨基酸、约80个氨基酸至约100个氨基酸、约100个氨基酸至约120个氨基酸、约120个氨基酸至约140个氨基酸、约140个氨基酸至约150个氨基酸、约150个氨基酸至约155个氨基酸、约155个氨基酸直至全长肽或多肽的连续区段具有至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%、至少约98%或至少约99%的氨基酸序列同一性。
如下文中进一步论述的,可从天然来源(例如,除其天然存在的环境之外的环境)分离IL-10多肽,以及还可重组产生(例如,在遗传修饰的宿主细胞诸如细菌、酵母、毕赤酵母属(Pichia)、昆虫细胞等中)IL-10多肽,其中用包含编码所述多肽的核苷酸序列的核酸修饰所述遗传修饰的宿主细胞。还可合成地产生(例如,通过无细胞化学合成)IL-10多肽。
本公开设想了编码IL-10试剂的核酸分子,包括其天然存在的和非天然存在的同种型、等位基因变体和剪接变体。本公开还涵盖与天然存在的DNA序列相异在于一个或多个碱基,但因遗传密码的简并性而仍然翻译成对应于IL-10多肽的氨基酸序列的核酸序列。
IL-10血清浓度
可以以以下几种方式表征本文所描述的方法中的IL-10的血浆水平,包括:(1)高于某一指定的水平或在水平的范围内的平均IL-10血清谷浓度;(2)高于某一指定的水平持续一些数量的时间的平均IL-10血清谷浓度;(3)高于或低于某一指定的水平或在水平的范围内的稳态IL-10血清浓度水平;或(4)高于或低于某一指定的水平或在某一水平的范围内的浓度特征谱的Cmax。如本文中所示,已发现平均血清IL-10谷浓度对于在某些适应症中的功效是特别重要的。
在本公开的一些实施方案中,可产生的血浆和/或血清水平浓度谱包括:大于约1.0pg/mL、大于约10.0pg/mL、大于约20.0pg/mL、大于约30pg/mL、大于约40pg/mL、大于约50.0pg/mL、大于约60.0pg/mL、大于约70.0pg/mL、大于约80.0pg/mL、大于约90pg/mL、大于约0.1ng/mL、大于约0.2ng/mL、大于约0.3ng/mL、大于约0.4ng/mL、大于约0.5ng/mL、大于约0.6ng/mL、大于约0.7ng/mL、大于约0.8ng/mL、大于约0.9ng/mL、大于约1.0ng/mL、大于约1.5ng/mL、大于约2.0ng/mL、大于约2.5ng/mL、大于约3.0ng/mL、大于约3.5ng/mL、大于约4.0ng/mL、大于约4.5ng/mL、大于约5.0ng/mL、大于约5.5ng/mL、大于约6.0ng/mL、大于约6.5ng/mL、大于约7.0ng/mL、大于约7.5ng/mL、大于约8.0ng/mL、大于约8.5ng/mL、大于约9.0ng/mL、大于约9.5ng/mL或大于约10.0ng/mL的平均IL-10血浆和/或血清谷浓度。在其它实施方案中,可产生的血浆和/或血清水平浓度谱包括:小于约10.0ng/mL、小于约9.0ng/mL、小于约8.0ng/mL、小于约7.0ng/mL、小于约6.0ng/mL、小于约5.0ng/mL、小于约4.0ng/mL、小于约3.0ng/mL、小于约2.5ng/mL、小于约2.0ng/mL、小于约1.9ng/mL、小于约1.8ng/mL、小于约1.7ng/mL、小于约1.6ng/mL、小于约1.5ng/mL、小于约1.4ng/mL、小于约1.3ng/mL、小于约1.2ng/mL、小于约1.1ng/mL、小于约1.0ng/mL、小于约0.75ng/mL、小于约0.5ng/mL、小于约0.25ng/mL、小于约0.1ng/mL、小于约0.075ng/mL、小于约0.05ng/mL、小于约0.025ng/mL或小于约0.01ng/mL的平均IL-10血浆和/或血清谷浓度。
在本公开的具体实施方案中,平均IL-10血清谷浓度在1.0pg/mL至10ng/mL的范围内。在一些实施方案中,平均IL-10血清谷浓度在1.0pg/mL至100pg/mL的范围内。在其它实施方案中,平均IL-10血清谷浓度在0.1ng/mL至1.0ng/mL的范围内。在其它实施方案中,平均IL-10血清谷浓度在1.0ng/mL至10ng/mL的范围内。应理解,本公开设想并入由本文中所示的那些范围涵盖的任何浓度的范围,即使此类范围未被明确地引用。通过举例的方式,实施方案中的平均血清IL-10浓度可在0.5ng/mL至5ng/mL的范围内。通过举例的方式,本公开的具体实施方案包含在如下范围内的平均IL-10血清谷浓度:约1.0pg/mL至约9.5ng/mL、约0.5ng/mL至约10.5ng/mL、约1.0ng/mL至约10.0ng/mL、约1.0ng/mL至约9.0ng/mL、约1.0ng/mL至约8.0ng/mL、约1.0ng/mL至约7.0ng/mL、约1.5ng/mL至约10.0ng/mL、约1.5ng/mL至约9.0ng/mL、约1.5ng/mL至约8.0ng/mL、约1.5ng/mL至约7.0ng/mL、约2.0ng/mL至约10.0ng/mL、约2.0ng/mL至约9.0ng/mL、约2.0ng/mL至约8.0ng/mL和约2.0ng/mL至约7.0ng/mL。
在具体实施方案中,在治疗的持续时间中维持1-2ng/mL的平均IL-10血清谷浓度。本公开还设想了其中平均IL-10血清峰浓度在治疗的持续时间中小于或等于约10.0ng/mL的实施方案。其它实施方案预期大于或等于约1.0pg/mL的平均IL-10血清谷浓度。最优平均血清浓度通常是在该浓度下达到所需治疗作用而不引入不期望的不良作用的浓度。在大多数患者群体中,经常在约1.0ng/mL至约10ng/mL的平均IL-10血清谷浓度下实现最大血清胆固醇降低;在此类浓度下,通常未观察到不可接受的不良作用。然而,较低的平均Il-10血清谷浓度在某些患者群体中也可以是有利的。例如,已经显示约0.1ng/mL至约1.0ng/mL的IL-10血清谷浓度使血清胆固醇水平降低约30%;此类较低的IL-10血清谷浓度可能是在较高浓度下表现出不良作用的患者的治疗目标。此外,每毫升低皮克的IL-10血清水平可大大减少动脉和其它斑块。
本公开的某些实施方案提供用于监测接受IL-10疗法的受试者以预测,从而潜在地避免不良作用的方法,所述方法包括:(1)测量受试者的IL-10的峰浓度;(2)测量受试者的IL-10的谷浓度;(3)计算峰-谷波动;和,(4)使用计算的峰-谷波动来预测受试者中的潜在不良作用。在特定受试者群体中,较小的峰-谷波动表示所述受试者将经历IL-10相关不良作用的较低概率。此外,在一些实施方案中,使用特定的给药参数测定用于特定疾病、病症和病状的治疗的特定峰-谷波动,并且将这些波动用作参照标准。
对于大多数药物,血浆药物浓度以多指数方式下降。静脉内施用后,药物立即迅速分布在整个初始空间(最低程度地定义为血浆体积)中,然后至血管外空间(例如,某些组织)的较慢的平衡分布发生。静脉内IL-10施用与此类两室动力学模型相关(参见Rachmawati,H.等(2004)Pharm.Res.21(11):2072-78))。还已研究了皮下重组hIL-10的药代动力学(Radwanski,E.等(1998)Pharm.Res.15(12):1895-1901)。因此,当评估适当的IL-10给药相关参数时,分布体积的考虑是恰当的。此外,已探索了将IL-10试剂靶向特定的细胞类型的努力(参见,例如,Rachmawati,H.(2007年5月)DrugMet.Dist.35(5):814-21),并且IL-10药代动力学和给药原理的杠杆作用可证明对于此类努力的成功是无价的。
本公开设想了导致上文中所示的任何IL-10血清谷浓度的维持的任何剂量和给药方案的施用。通过举例的方式,但非限制地,当受试者为人时,可以以如下剂量施用非聚乙二醇化hIL-10:大于0.5μg/kg/日、大于1.0μg/kg/日、大于2.5μg/kg/日、大于5μg/kg/日、大于7.5μg/kg、大于10.0μg/kg、大于12.5μg/kg、大于15μg/kg/日、大于17.5μg/kg/日、大于20μg/kg/日、大于22.5μg/kg/日、大于25μg/kg/日、大于30μg/kg/日或大于35μg/kg/日。此外,通过举例的方式,但非限制地,当受试者为人时,可以以如下剂量施用包含相对小的PEG的聚乙二醇化hIL-10(例如,5kDa单-二-PEG-hIL-10):大于0.5μg/kg/日、大于0.75μg/kg/日、大于1.0μg/kg/日、大于1.25μg/kg/日、大于1.5μg/kg/日、大于1.75μg/kg/日、大于2.0μg/kg/日、大于2.25μg/kg/日、大于2.5μg/kg/日、大于2.75μg/kg/日、大于3.0μg/kg/日、大于3.25μg/kg/日、大于3.5μg/kg/日、大于3.75μg/kg/日、大于4.0μg/kg/日、大于4.25μg/kg/日、大于4.5μg/kg/日、大于4.75μg/kg/日或大于5.0μg/kg/日。在本公开的某些实施方案中,当受试者为人时,可以以如下剂量施用非聚乙二醇化hIL-10:小于50μg/kg/日、小于40μg/kg/日、小于35μg/kg/日、小于30μg/kg/日、小于25μg/kg/日、小于20μg/kg/日、小于15μg/kg/日、小于12.5μg/kg/日、小于10μg/kg/日、小于7.5μg/kg/日、小于5.0μg/kg/日、小于2.5μg/kg/日、小于2.0μg/kg/日、小于1.5μg/kg/日或小于1.0μg/kg/日。在其它实施方案中,通过举例的方式,但非限制地,当受试者为人时,可以以如下剂量施用包含相对小的PEG的聚乙二醇化hIL-10(例如,5kDa单-二-PEG-hIL-10):小于5.0μg/kg/日、小于4.5μg/kg/日、小于4.0μg/kg/日、小于3.5μg/kg/日、小于3.0μg/kg/日、小于2.5μg/kg/日、小于2.0μg/kg/日、小于1.75μg/kg/日、小于1.5μg/kg/日、小于1.25μg/kg/日、小于1.0μg/kg/日、小于0.75μg/kg/日或小于0.5μg/kg/日。
胆固醇和PEG-IL-10对胆固醇动态平衡的作用及其指标
生理学:胆固醇在许多生理过程,包括细胞膜结构和类固醇激素、胆汁酸和维生素D的生物合成中起着不可缺少的作用。胆固醇合成需要复杂的37个步骤的过程,所述过程始于通过酶HGM-CoA还原酶进行的3-羟基-3-甲基戊二酰CoA(HMG-CoA)至甲羟戊酸的还原。这是胆固醇合成中受调节的、限速且不可逆转的步骤,并且是他汀类药物(HMG-CoA还原酶的竞争性抑制剂)的作用位点。
肝是胆固醇的主要调节器。其不仅是VLDL(循环中的大多数LDL的前体)的形成位点,而且还是其中绝大部分LDL的受体介导的清除发生的位置。
肝脏最初清除所有从小肠吸收的胆固醇。过量胆固醇的吸收可增加储存在肝脏中的胆固醇的量,从而导致增加的VLDL分泌(从而导致LDL形成)和肝LDL-受体活性的下调。平均而言,约一半进入肠道的所有胆固醇被吸收。分数吸收率在个体间变化很大,这可至少部分地解释为何一些患者对他汀类或其它种类的降脂药响应不佳或根本无响应。参见,例如,Turley,SD,(2004)Clin.Cardiol.6增刊3:III16-21。肝脏也通过以非酯化形式(经由胆汁)将其分泌入消化道来回收胆固醇。
血脂项:总胆固醇被定义为LDL、HDL和VLDL的总和。一般地,<200mg/dL的总血液胆固醇水平被认为是正常的,200–239mg/dL之间的水平被认为是高于边界线的,并且>240mg/dL的水平被认为是高的。
自1988年以来,美国国家胆固醇教育计划(NCEP)已颁发了将LDL鉴定为胆固醇疗法的主要靶标的指导方针。成人治疗小组-III(ATP-III)中所示的目前的指导方针设立了LDL<100mg/dL(2.6mmol/L)的目标。增加的LDL与动脉粥样硬化疾病相关,这赋予冠心病(CHD)相关事件,包括临床CHD、症状性颈动脉疾病、外周动脉疾病和腹主动脉瘤的高风险。与升高的胆固醇水平相关的疾病、病症和病状及其治疗和/或预防在下文中进行了详细描述。
有相当多的证据表明,低水平的高密度胆固醇(HDL-C,或者单纯HDL)是动脉粥样硬化和CHD的发展中的促进因素。低HDL是早发冠心病患者的最常见的血脂异常之一。高甘油三酯血症患者通常具有较低的HDL胆固醇。某些药物,包括β-阻断剂、黄体酮和睾酮也降低HDL水平。
在普通男子中,HDL胆固醇水平的范围为40至50mg/dL,而在普通女子中,其范围为50至60mg/dL。研究已表明,与动脉粥样硬化事件的最低风险相关的HDL的中位数值在男子中为62mg/dL以及在女子中为81mg/dL。用于降脂治疗的ATP-III指导方针将低于40mg/dL的HDL水平确定为主要阳性危险因素以及将≥60mg/dL的LDL水平确定为阴性危险因素(即,保护性的)。小于5:1的总胆固醇对HDL的比率被认为是理想的。
甘油三酯是在血流中主要通过极低密度脂蛋白(VLDL)运载。存在相当大的富含甘油三酯颗粒的异质性。从膳食脂肪-乳糜微粒衍生的富含甘油三酯的颗粒-本身与CHD无关,但当非常高(>1,000mg/dL)时,可引起胰腺炎、静脉和动脉血栓、急性心脏发作和中风。然而,这些乳糜微粒在尺寸上逐渐被脂蛋白脂肪酶减小至导致动脉粥样化的中间密度脂蛋白(IDL)。类似地,来自肝的VLDL在尺寸上被脂蛋白脂肪酶减小,从而产生导致动脉粥样化的IDL。VLDL预测冠状动脉疾病和CHD事件的进展,并从而高甘油三酯血症已经日益被认为是CHD的危险因素。
高甘油三酯水平因遗传原因而导致或为获得性的。在遗传原因方面,约1/500的人具有朝向高血浆甘油三酯的遗传倾向。获得的高甘油三酯最常见地与过量饮酒、外源性雌激素或雌激素激动剂、控制不佳的糖尿病、β-阻断剂、皮质类固醇和尿毒症相关。超过1,000mg/dL的甘油三酯水平反映叠加在遗传原因上的高甘油三酯的获得性原因。获得性高甘油三酯的不太常见的原因包括肾衰竭、肾病综合症、蛋白尿、甲状腺功能减退、许多肝脏疾病、血色素沉着病、甲状旁腺机能亢进和糖原贮积病。
根据美国心脏协会,低于150mg/dL的甘油三酯水平是正常的;150至199mg/dL的水平是高于边界线的;200至499mg/dL的水平是高的;以及≥500mg/dL的水平是非常高的。一般地,150与200mg/dL之间的甘油三酯水平不进行药理学治疗。
测试:若干一般方法和系统已用于评估受试者的脂质特征谱。可将现有的或以后开发的任何方法或系统与本公开的教导结合使用。
通常利用比色测定系统的禁食胆固醇测试是用于测量血清总胆固醇的常规装置。此类测试需要在12小时的禁食后抽取血液来测定脂蛋白特征谱。一般地,只测量总胆固醇、HDL和甘油三酯;出于成本原因,通常将VLDL估计为甘油三酯的五分之一,并使用Friedewald公式估算LDL。尽管此类测试是便宜的和广泛可用的(例如,Sigma-Aldrich,St.Louis,MO;BioVision,Inc.,Milpitas,CA),但它们需要禁食并且因为估计而非精确地测定LDL而不如其它测试一样灵敏。
当评估高胆固醇血症时,测量所有脂蛋白亚级分(VLDL、IDL、LDL和HDL)常常是有用的。因为特定的治疗目标是减少LDL(同时保持或增加HDL),因此直接测量LDL水平的胆固醇测试更精确,并且对于具有升高的甘油三酯的那些患者是特别有用的。虽然是商购可得的(例如,BeckmanCoulter,Inc;Brea,CA),但这些直接测量测试的使用有时因它们的成本而受到限制。
PEG-IL-10对胆固醇动态平衡及其指标的作用:如实验部分中论述的,向小鼠施用PEG-IL-10下调几种参与胆固醇合成途径(甲羟戊酸途径)的肝酶的表达水平。另外,该实验部分描述了PEG-IL-10在小鼠中对血清总胆固醇、甘油三酯、LDL、HDL和LDL/HDL比率的作用。如图2中所指示的,胆固醇(图2A)、甘油三酯(图2B)和LDL(图2C)的水平在PEG-IL-10的三个剂量的每一个剂量上都显著降低。重要的是,这些数据一起表明,不必超过特定的PEG-IL-10剂量(~0.2mg/kg的剂量,于小鼠中)以达到最佳治疗效果。因此,可避免对于较高剂量观察到更严重的不良作用(例如,肝毒性)。鼠剂量至人剂量的转换应该导致相当的结果。
如图2D中所指示的,PEG-IL-10相较于媒介物对照降低血清HDL水平。根据历史上接受的教条:升高HDL水平是有利的(例如,保护心脏的),该结果可能被认为是不利的。然而,最近的证据,包括来自AIM-HIGH试验(利用低HDL/甘油三酯在代谢综合征中进行的动脉粥样硬化血栓形成干预:对全球健康结果的影响)的证据,挑战了靶向HDL的任何治疗剂一定是有益的(参见,例如,Nicholls,(2012)ClevelandClinicJ.Med.79(1):38-43)的概念。因此,PEG-IL-10降低血清HDL水平的观测结果可能,事实上,在治疗上是不相关的。此外,该结果与血清总胆固醇与增加心血管疾病风险相关的发现相符并且一致(参见,例如,Lewington等,(2005)Circulation12:3373-74))。
如在实验部分中详细描述的,评价向小鼠施用的PEG-IL-10对胆汁酸合成(CYP7A1)、细胞内胆固醇运输(APOL8)和胆固醇流出(ABCG1)的调节剂的作用。CYP7A1,即氧化胆固醇的细胞色素P450血红素酶,是从胆固醇合成胆汁酸的限速酶。如在图3A中描绘的,PEG-IL-10增加CYP7A1的信息表达,这表明存在增加的胆固醇从肝脏的流出。图3B显示PEG-IL-10的不断增加的剂量与APOL8(在胆固醇转运中起着中心作用的HDL家族的成员)的不断增加的信息表达相关;因此,存在较大的细胞内胆固醇运输和从而更多可供流出的底物。此外,IL-10增加ABCG1(参与制备胆固醇以作为胆汁酸盐从肝除去的流出分子)的信息表达,这与血清胆固醇的降低相关。
此外,测定对小鼠施用的PEG-IL-10对PCSK9(影响LDL的胆固醇动态平衡中的主要调节剂)的作用。如图4A中所示,PEG-IL-10在缺乏LDL受体的敲除小鼠中下调PCSK9的信息表达。这些数据表明,PEG-IL-10以非PCSK9-依赖性方式降低胆固醇。当向这些敲除小鼠施用时,PEG-IL-10还引起了HDL颗粒蛋白质APOA2的信息表达降低(参见图4B)。参与HDL构建的APOA2为高密度脂蛋白颗粒的第二最丰富的蛋白质。因此,APOA2信息表达的减少通过HDL的减少来促成高胆固醇血症。然而,如本文其它地方所论述的,聚乙二醇化的IL-10对LDL的有益作用大大超过因HDL减少而引起的任何不太有利的作用;当将聚乙二醇化的IL-10与具有不同作用机制的另外的试剂组合施用时,这可尤其如此。
还可评价PEG-IL-10在LDLR-/-小鼠中对CRP的作用。CRP是急性期反应物类别中的一员,在体内,其水平在炎症过程中急剧上升。CRP的高水平与心血管风险相关,这主要归因于其炎性和动脉粥样硬化作用。如图5中所描绘的,PEG-IL-10的施用降低CRP信息表达,表明IL-10具有心脏保护作用。
此外,向LDLR-/-小鼠施用PEG-IL-10对参与胆固醇摄取的几种清道夫受体具有积极作用。MSR1(也称为SR-A1(清道夫受体-A1)和CD204(分化簇204)和MARCO(也称为SR-A2(清道夫受体A-2))是介导LDL的内吞作用并从而参与胆固醇摄取的清道夫受体。观察到两种清道夫受体的信息表达增加(参见图6A和6B),这与增强的胆固醇摄取相关,并且表明MSR1和MARCO与使高胆固醇血症正常化相关。
在具体实施方案中,本文中公开的IL-10试剂(例如,PEG-IL-10)具有能够使VLDL、IDL、LDL或其组合的水平降低例如至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%的抗-高脂血症活性。在其它实施方案中,本文中公开的IL-10试剂(例如,PEG-IL-10)具有能够降低VLDL、IDL、LDL或其组合的水平的抗-高脂血症活性,所述水平在例如约10%至约100%、约20%至约100%、约30%至约100%、约40%至约100%、约50%至约100%、约60%至约100%、约70%至约100%或约80%至约100%;约10%至约90%、约20%至约90%、约30%至约90%、约40%至约90%、约50%至约90%、约60%至约90%或约70%至约90%;约10%至约80%、约20%至约80%、约30%至约80%、约40%至约80%、约50%至约80%或约60%至约80%;约10%至约70%、约20%至约70%、约30%至约70%、约40%至约70%或约50%至约70%的范围内。
在本公开的另一个实施方案中,本文中公开的IL-10试剂(例如,PEG-IL-10)升高HDL的水平。在该实施方案的一个方面,IL-10试剂使HDL的水平升高,例如,至少2%、至少3%、至少10%、至少12%、至少15%、至少17%、至少20%、至少22%、至少25%、至少27%、至少30%、至少32%、至少35%、至少37%、至少40%、至少42%、至少45%或至少47%。在本公开的另一个实施方案中,IL-10试剂在例如如下的范围内升高HDL的水平:约2%至约100%、约10%至约50%、约15%至约50%、约20%至约50%、约25%至约50%、约30%至约50%、约35%至约50%或约40%至约50%、约2%至约45%、约10%至约45%、约15%至约45%、约20%至约45%、约25%至约45%、约30%至约45%或约35%至约45%;约2%至约40%、约10%至约40%、约15%至约40%、约20%至约40%、约25%至约40%或约30%至约40%;约2%至约35%、约10%至约35%、约15%至约35%、约20%至约35%或约25%至约35%。
应理解,前述的量、范围等是举例说明性的而非限制。
IL-10的产生方法
本公开的多肽可通过任何合适的方法,包括非重组(例如,化学合成)和重组方法产生。
A.化学合成
当化学合成多肽时,可通过液相或固相进行合成。固相肽合成(SPPS)允许非天然氨基酸的掺入和/或肽/蛋白质主链修饰。各种形式的SPPS,例如9-芴基甲氧羰基(Fmoc)和叔丁氧羰基(Boc)可用于合成本公开的多肽。化学合成的细节在本领域中是已知的(例如,GanesanA.(2006)MiniRev.Med.Chem.6:3-10;和CamareroJ.A.等,(2005)ProteinPeptLett.12:723-8)。
可如下文所述来进行固相肽合成。利用酸不稳定性或碱不稳定性基团来保护α官能团(Nα)和任何反应性侧链。保护基团在用于连接酰胺键的条件下是稳定的,但可被容易地切割而不损害已形成的肽链。α氨基官能团的合适的保护基团包括,但不限于以下基团:Boc、苄氧羰基(Z)、O-氯苄氧羰基、双-苯基异丙氧羰基、叔丁氧羰基(Amoc)、α,α-二甲基-3,5-二甲氧基-苄氧基羰基、邻-硝基硫基、2-氰基-叔丁氧基-羰基、Fmoc、1-(4,4-二甲基-2,6-二氧环己基-1-亚基)乙基(Dde)等。
合适的侧链保护基团包括,但不限于:乙酰基、烯丙基(All)、烯丙氧基羰基(Alloc)、苄基(Bzl)、苄氧基羰基(Z)、叔丁氧羰基(Boc)、苄氧基甲基(Bom)、邻-溴苄氧羰基、叔丁基(tBu)、叔丁基二甲基甲硅烷基、2-氯苄基、2-氯苄氧羰基、2,6-二氯苄基、环己基、环戊基、1-(4,4-二甲基-2,6-二氧环己基-1-亚基)乙基(Dde)、异丙基、4-甲氧基-2,3-6-三甲基苄基磺酰基(Mtr)、2,3,5,7,8-五甲基色满-6-磺酰基(Pmc)、新戊酰基、四氢吡喃-2-基、甲苯磺酰基(Tos)、2,4,6-三甲氧基苄基、三甲基甲硅烷基和三苯甲基(Trt)。
在固相合成中,将C-末端氨基酸偶联至合适的载体材料。合适的载体材料是对于用于合成过程中的逐步缩合和裂解反应的试剂和反应条件呈惰性的,并且不溶解于待使用的反应介质中的那些材料。商购可得的载体材料的实例包括已用反应性基团和/或聚乙二醇修饰的苯乙烯/二乙烯基苯共聚物;氯甲基化苯乙烯/二乙烯基苯共聚物;羟甲基化或氨甲基化苯乙烯/二乙烯基苯共聚物等。当期望制备肽酸时,可使用利用4-苄氧基苄基-醇(Wang-锚)或2-氯三苯甲基氯衍生的聚苯乙烯(1%)-二乙烯基苯或在肽酰胺的情况下,可使用利用5-(4'-氨基甲基)-3',5'-二甲氧基苯氧基)戊酸(PAL-锚)或对-(2,4-二甲氧基苯基-氨基甲基)-苯氧基基团(Rink酰胺锚)衍生的聚苯乙烯(1%)二乙烯基苯或
通过在室温或升高的温度(例如,40℃与60℃之间)下添加活化试剂,使C末端Fmoc-保护的氨基酸与载体材料在乙醇、乙腈、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、二氯甲烷、四氢呋喃、N-甲基吡咯烷酮或类似溶剂中反应来实现与聚合物载体的键联,反应时间为例如2至72小时。
Nα保护的氨基酸(例如,Fmoc氨基酸)与PAL、Wang或Rink锚的偶联可以,例如在1-羟基苯并三唑或1-羟基-7-氮杂苯并三唑存在或不存在的情况下,借助于偶联试剂诸如N,N'-二环己基碳二亚胺(DCC)、N,N'-二异丙基碳二亚胺(DIC)或其它碳二亚胺、2-(1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲四氟硼酸盐(TBTU)或其它脲盐、O-酰基-脲、苯并三唑-1-基-三-吡咯烷子基-鏻六氟磷酸盐(PyBOP)或其它鏻盐、N-羟基琥珀酰亚胺、其它N-羟基酰亚胺或肟类,例如借助于TBTU,添加HOBt,添加或不添加碱诸如,例如,二异丙基乙胺(DIEA)、三乙胺或N-甲基吗啉,例如,二异丙基乙胺,利用2至72小时的反应时间(例如,3小时,以1.5至3倍过量的氨基酸和偶联试剂,例如,以2倍过量,并在约10℃与50℃之间的温度,例如25℃下,于溶剂诸如二甲基甲酰胺、N-甲基吡咯烷酮或二氯甲烷中,例如,二甲基甲酰胺中)来进行。
也可能在上述条件下使用活性酯(例如,五氟苯基、对硝基苯基等)、Nα-Fmoc-氨基酸的对称酸酐、其酰基氯或酰基氟来替代所述偶联试剂。
可通过添加DIEA,在二氯甲烷(但不限于使用该溶剂和该碱)中,使用10至120分钟,例如20分钟的反应时间,将Nα保护的氨基酸(例如,Fmoc氨基酸)偶联于2-氯三苯甲基树脂。
在肽合成中,通常地在自动化肽合成仪中,按照常规方法进行保护的氨基酸的连续偶联。可在于固相上裂解(通过利用例如哌啶(10%至50%)在二甲基甲酰胺中进行5至20分钟,例如,利用50%在DMF中的哌啶进行2×2分钟和利用20%在DMF中的哌啶进行1×15分钟的处理)偶联的氨基酸的Nα-Fmoc保护基团后,将下一个保护的氨基酸以3至10倍过量,例如以10倍过量在惰性非水性极性溶剂诸如二氯甲烷、DMF或两者的混合物中,在约10℃与50℃之间的温度下,例如在25℃下偶联于先前的氨基酸。用于将第一Nα-Fmoc氨基酸偶联至PAL、Wang或Rink锚的先前提及的试剂适合用作偶联试剂。保护的氨基酸的活性酯或其氯化物或氟化物或对称酸酐也可作为替代物。
在固相合成结束时,将肽从载体材料切下,同时同时地切割侧链保护基团。可通过添加5%-20%V/V的清除剂诸如二甲基硫醚、乙基甲基硫醚、茴香硫醚、硫代甲酚、间甲酚、茴香醚乙二硫醇、酚或水,例如15%v/v的1:1:1的二甲硫醚/乙二硫醇/间甲酚,在0.5至3小时,例如2小时内,利用三氟乙酸或其它强酸介质进行裂解。具有完全受保护的侧链的肽通过用2:2:6的冰醋酸/三氟乙醇/二氯甲烷切割2-氯三苯甲基锚来获得。可通过在硅胶上层析来纯化被保护的肽。如果通过Wang锚将肽连接于固相,以及如果期望获得具有C末端烷基酰胺化的肽,则可通过利用烷基胺或氟代烷基胺的氨解来进行裂解。在约-10℃与50℃之间的温度(例如,约25℃)下进行氨解,反应时间为约12至24小时(例如,约18小时)。此外,可通过再酯化例如利用甲醇从载体切割该肽。
可将获得的酸性溶液与3至20倍量的冷乙醚或正己烷,例如,10倍过量的二乙醚混合,以沉淀所述肽,从而使清除剂和保留在乙醚中的裂解的保护基团分离。通过从冰醋酸中再沉淀肽数次来进行进一步纯化。可将获得的沉淀物溶解在水或叔丁醇或这两种溶剂的混合物例如叔丁醇/水的1:1混合物中,并将其冷冻干燥。
可通过各种层析方法纯化获得的肽,包括在呈乙酸盐形式的弱碱性树脂上进行的离子交换;在非衍生的聚苯乙烯/二乙烯基苯共聚物(例如,XAD)上进行的疏水吸附层析;在硅胶上进行的吸附层析;离子交换层析,例如,在羧甲基纤维素上进行;分配层析,例如,在G-25上进行;逆流分配层析;或高压液相色谱(HPLC)例如,反向HPLC,在辛基或十八烷基甲硅烷基二氧化硅(ODS)相上进行。
B.重组产生
描述人和小鼠IL-10的制备的方法可参见,例如,美国专利第5,231,012号,其教导了用于生产具有IL-10活性的蛋白质的方法,包括重组和其它合成技术。IL-10可以是病毒来源的,并且在Moore等,(1990)Science248:1230中公开了来自EB病毒的病毒IL-10(BCRF1蛋白质)的克隆和表达。可使用本领域已知的标准技术诸如本文中描述的那些技术以许多方式获得IL-10。重组人IL-10也是可商购获得的,例如从PeproTech,Inc.,RockyHill,N.J商购获得。
当使用重组技术产生多肽时,可使用任何合适的构建体和任何合适的宿主细胞(其可以是原核或真核细胞,诸如分别为细菌(例如,大肠杆菌(E.coli))或酵母宿主细胞)将多肽产生为细胞内蛋白质或分泌型蛋白质。可被用作宿主细胞的真核细胞的其它实例包括昆虫细胞、哺乳动物细胞和/或植物细胞。当使用哺乳动物宿主细胞时,它们可包括人细胞(例如,HeLa、293、H9和Jurkat细胞);小鼠细胞(例如,NIH3T3、L细胞和C127细胞);灵长类动物细胞(例如,Cos1、Cos7和CV1);和仓鼠细胞(例如,中国仓鼠卵巢(CHO)细胞)。
可根据本领域已知的标准方法来使用多种适于多肽表达的宿主-载体系统。参见,例如,Sambrook等,1989CurrentProtocolsinMolecularBiologyColdSpringHarborPress,NewYork;和Ausubel等1995CurrentProtocolsinMolecularBiology,Wiley和Sons编。用于将遗传物质引入宿主细胞的方法包括,例如,转化、电穿孔、接合、磷酸钙方法等。可选择用于转移的方法以提供所述引入的编码多肽的核酸的稳定表达。可将所述编码多肽的核酸提供为可遗传的附加型元件(例如,质粒)或可将其进行基因组整合。多种用于产生目标多肽的适当载体是商购可得的。
载体可在宿主细胞中提供染色体外维持或可提供至宿主细胞基因组中的整合。表达载体提供转录和翻译调控序列,并且可以提供诱导型或组成型表达,其中在转录起始区以及转录和翻译终止区的转录控制下将编码区可操作地连接。一般地,转录和翻译调控序列可包括但不限于,启动子序列、核糖体结合位点、转录起始和终止序列、翻译起始和终止序列以及增强子或激活子序列。启动子可以是组成型或诱导型的,并且可为强组成型启动子(例如,T7)。
表达构建通常具有位于启动子序列附近,以提供编码目标蛋白质的核酸序列的插入的方便的限制性位点。可提供在表达宿主中是可操作的选择标记,以有利于含有载体的细胞的选择。此外,表达构建体可包括附加元件。例如,表达载体可具有一个或两个复制系统,从而使其能够被保持在生物体例如哺乳动物或昆虫细胞中以进行表达,以及在原核宿主中以进行克隆和扩增。另外,表达构建体可含有选择标记基因,以允许转化宿主细胞的选择。可选择的基因在本领域中是公知的,并且将随所用的宿主细胞而变化。
可按照本领域已知的方法来实现蛋白质的分离和纯化。例如,可从经遗传修饰以组成型地和/或在诱导后表达蛋白质的细胞的裂解物,或从通过免疫亲和纯化从合成反应混合物来分离蛋白质,所述免疫亲和纯化通常包括将样品与抗-蛋白质抗体接触,洗涤以除去非特异性结合的材料,和洗脱特异性结合的蛋白质。可通过透析和通常用于蛋白质纯化的其它方法进一步纯化分离的蛋白。在一个实施方案中,可使用金属螯合层析法分离蛋白质。蛋白质可含有修饰,以促进分离。
可以以基本上纯或分离的形式(例如,不含其它多肽)制备多肽。多肽可存在于相对于可存在的其它组分(例如,其它多肽或其它宿主细胞组分)针对所述多肽富集的组合物中。例如,可提供纯化的多肽,以使得所述多肽存在于基本上不含其它表达的蛋白质(例如,少于约90%,少于约60%,少于约50%,少于约40%,少于约30%,少于约20%,少于约10%,少于约5%或少于约1%)的组合物中。
可使用本领域中已知的操纵不同的IL-10相关核酸以提供能够编码所述IL-10多肽的构建体的重组技术,来产生IL-10多肽。应当理解的是,当提供特定氨基酸序列时,鉴于本领域普通技术人员在例如分子生物学中的背景和经验,她将认识编码此类氨基酸序列的各种不同的核酸分子。
酰胺键取代
在一些情况下,IL-10包括除肽键外的一个或多个键联,例如,至少两个相邻氨基酸经由除酰胺键外的键联联接。例如,为了减少或消除不希望的蛋白水解或降解的其它方式,和/或增加血清稳定性和/或限制或增加构象灵活性,可取代IL-10的主链内的一个或多个酰胺键。
在另一个实例中,可用酰胺键联的电子等排体的键联诸如-CH2NH-、-CH2S-、-CH2CH2-、-CH=CH-(顺式和反式)、-COCH2-、-CH(OH)CH2-或-CH2SO-来替代IL-10中的一个或多个酰胺键(-CO-NH-)。还可利用例如还原的电子等排体假肽键替代IL-10的一个或多个酰胺键联。参见Couder等(1993)Int.J.PeptideProteinRes.41:181-184。此类替代以及如何实现它们对于本领域普通技术人员来说是已知的。
氨基酸取代
可在IL-10多肽中产生一个或多个氨基酸取代。以下是非限制性实例:
a)烷基取代的疏水氨基酸,包括丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、正亮氨酸、(S)-2-氨基丁酸、(S)-环己基丙氨酸或被从C1-C10碳的脂肪族侧链取代(包括分枝、环状和直链烷基、烯基或炔基取代)的其它简单α-氨基酸的取代;
b)芳族取代的疏水氨基酸,包括苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸、硫代酪氨酸、联苯基丙氨酸、1-萘基丙氨酸、2-萘基丙氨酸、2-苯并噻吩基丙氨酸、3-苯并噻吩基丙氨酸、组氨酸的取代,包括上列芳族氨基酸的氨基、烷基氨基、二烷基氨基、氮杂、卤代(氟、氯、溴或碘)或烷氧基(从C1-C4)-取代的形式,其举例说明性实例为:2-,3-或4-氨基苯丙氨酸、2-,3-或4-氯苯丙氨酸、2-、3-或4-甲基苯丙氨酸、2-、3-或4-甲氧基苯丙氨酸、5-氨基-、5-氯-、5-甲基-或5-甲氧基色氨酸、2'-、3'-或4'-氨基-、2'-、3'-或4'-氯-、2、3或4-联苯基丙氨酸、2'-、3'-或4'-甲基-、2-、3-或4-联苯基丙氨酸和2-或3-吡啶基丙氨酸;
c)含有碱性侧链的氨基酸,包括精氨酸、赖氨酸、组氨酸、鸟氨酸、2,3-二氨基丙酸、高精氨酸的取代,包括前述氨基酸的烷基、烯基或芳基取代的(从C1-C10的分枝、线性或环状)衍生物,无论取代基在杂原子(诸如α氮或远端一个或多个氮)还是在α碳上,在例如pro-R位置中。用作举例说明性实例的化合物包括:N-ε-异丙基-赖氨酸、3-(4-四氢吡啶基)-甘氨酸、3-(4-四氢吡啶基)-丙氨酸、N,N-γ,γ'-二乙基-高精氨酸。还包括的是如α-甲基-精氨酸、α-甲基-2,3-二氨基丙酸、α-甲基-组氨酸、α-甲基-鸟氨酸的化合物,其中烷基占据α-碳的pro-R位置。还包括的是从烷基、芳族、杂芳族(其中杂芳基具有一个或多个氮、氧或硫原子(单个地或组合地))、羧酸或许多公知的活化衍生物诸如酰氯、活性酯、活性偶氮杂环(azolides)和相关衍生物以及赖氨酸、鸟氨酸或2,3-二氨基丙酸的任一个形成的酰胺;
d)酸性氨基酸,包括天冬氨酸、谷氨酸、高谷氨酸、酪氨酸、2,4-二氮基丙酸、鸟氨酸或赖氨酸的烷基、芳基、芳烷基和杂芳基磺酰胺以及四唑基取代的烷基氨基酸的取代;
e)侧链酰胺残基,包括天冬酰胺、谷氨酰胺,以及天冬酰胺或谷氨酰胺的烷基或芳族取代的衍生物的取代;和
f)含羟基的氨基酸,包括丝氨酸、苏氨酸、高丝氨酸、2,3-二氨基丙酸以及丝氨酸或苏氨酸的烷基或芳族取代的衍生物的取代。
在一些情况下,IL-10包含一个或多个天然存在的非遗传编码的L-氨基酸、合成的L-氨基酸或氨基酸的D型对映体。例如,IL-10可以仅包含D-氨基酸。例如,IL-10多肽可包含下列残基中的一个或多个:羟基脯氨酸、β-丙氨酸、邻氨基苯甲酸、间氨基苯甲酸、对氨基苯甲酸、间-氨甲基苯甲酸、2,3-二氨基丙酸、α-氨基异丁酸、N-甲基甘氨酸(肌氨酸)、鸟氨酸、瓜氨酸、叔丁基丙氨酸、叔丁基甘氨酸、N-甲基异亮氨酸、苯基甘氨酸、环己基丙氨酸、正亮氨酸、萘基丙氨酸、吡啶基丙氨酸3-苯并噻吩基丙氨酸、4-氯苯基丙氨酸、2-氟苯基丙氨酸、3-氟苯基丙氨酸、4-氟苯基丙氨酸、青霉胺、1,2,3,4-四氢异喹啉-3-羧酸、β-2-噻吩基丙氨酸、甲硫氨酸亚砜、高精氨酸、N-乙酰基赖氨酸、2,4-二氨基丁酸、ρ-氨基苯丙氨酸、N-甲基缬氨酸、高半胱氨酸、高丝氨酸、ε-氨基己酸、ω-氨基己酸、ω-氨基庚酸、ω-氨基辛酸、ω-氨基十二烷酸、ω-氨基肉豆蔻酸、环己基丙氨酸、α,γ-二氨基丁酸、α,β-二氨基丙酸、δ-氨基戊酸和2,3-二氨基丁酸。
另外的修饰
可将半胱氨酸残基或半胱氨酸类似物引入IL-10多肽以通过二硫键为另一个肽提供键联,或提供IL-10多肽的环化。引入半胱氨酸或半胱氨酸类似物的方法在本领域中是公知的;参见,例如,美国专利第8,067,532号。
IL-10多肽可以被环化。可将一个或多个半胱氨酸或半胱氨酸类似物引入IL-10多肽,其中所引入的半胱氨酸或半胱氨酸类似物可形成具有再次引入的半胱氨酸或半胱氨酸类似物的二硫键。环化的其它手段包括引进肟接头或羊毛硫氨酸接头;参见,例如,美国专利第8,044,175号。可使用和/或可引入可形成环化键的氨基酸(或非氨基酸部分)的任何组合。环化键可利用具有允许引入桥的官能团的氨基酸的任何组合(或用氨基酸和-(CH2)n-CO-或-(CH2)n-C6H4-CO-)来产生。一些实例为二硫化物、二硫化物模拟物诸如-(CH2)n-卡巴桥(carbabridge)、硫缩醛、硫醚桥(胱硫醚或羊毛硫氨酸)和含有酯和醚的桥。在这些实例中,n可以是任何整数,但常常是小于10。
其它修饰包括,例如,N-烷基(或芳基)取代(ψ[CONR]),或主链交联以构建内酰胺和其它环状结构。其它衍生物包括C-末端羟甲基衍生物、邻位-修饰的衍生物(例如,C-末端羟甲基苄基醚)、N-末端修饰的衍生物,包括取代的酰胺诸如烷基酰胺和酰肼。
在一些情况下,IL-10多肽中的一个或多个L-氨基酸被一个或多个D-氨基酸替代。
在一些情况下,IL-10多肽为逆反(retroinverso)类似物(参见,例如,Sela和Zisman(1997)FASEBJ.11:449)。逆向-反转(Retro-inverso)肽类似物是其中氨基酸序列的方向被颠倒(逆向)的线性多肽的异构体,并且其中一个或多个氨基酸的手性、D-或L-构型被倒转(反转),例如,使用D-氨基酸而非L-氨基酸。[参见,例如,Jameson等(1994)Nature368:744;和Brady等(1994)Nature368:692]。
IL-10多肽可包括“蛋白转导结构域”(PTD),其是指有助于穿过脂质双层、胶束、细胞膜、细胞器膜或小囊泡膜的多肽、多核苷酸、碳水化合物或有机或无机分子。附接于另一个分子的PTD有助于所述分子穿过膜,例如,从细胞外空间进入细胞内空间,或从胞质溶胶进入细胞器内。在一些实施方案中,将PTD共价连接于IL-10多肽的氨基末端,而在其它实施方案中,将PTD共价连接于IL-10多肽的羧基末端。示例性蛋白转导结构域包括,但不限于,最小的十一肽蛋白转导结构域(对应于包含YGRKKRRQRRR的HIV-1TAT的残基47-57;SEQIDNO:3);包含足以指导进入细胞内的许多精氨酸残基(例如,3,4,5,6,7,8,9,10或10-50个精氨酸)的聚精氨酸序列;VP22结构域(Zender等.(2002)CancerGeneTher.9(6):489-96);果蝇触角足蛋白转导结构域(Noguchi等(2003)Diabetes52(7):1732-1737);截短的人降钙素肽(Trehin等(2004)Pharm.Research21:1248-1256);多聚赖氨酸(Wender等(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.USA97:13003-13008);RRQRRTSKLMKR(SEQIDNO:4);转运肽(Transportan)GWTLNSAGYLLGKINLKALAALAKKIL(SEQIDNO:5);KALAWEAKLAKALAKALAKHLAKALAKALKCEA(SEQIDNO:6);和RQIKIWFQNRRMKWKK(SEQIDNO:7))。示例性PTD包括,但不限于,YGRKKRRQRRR(SEQIDNO:3)、RKKRRQRRR(SEQIDNO:8);从3个精氨酸残基至50个精氨酸残基的精氨酸均聚物;示例性PTD结构域氨基酸序列包括,但不限于,以下序列的任一个:YGRKKRRQRRR(SEQIDNO:3);RKKRRQRR(SEQIDNO:9);YARAAARQARA(SEQIDNO:10);THRLPRRRRRR(SEQIDNO:11)和GGRRARRRRRR(SEQIDNO:12)。
IL-10多肽的C-末端处的氨基酸的羧基COR3可以以游离形式(R3=OH)或以生理上可耐受的碱或碱土金属盐形式(诸如,例如,钠盐、钾盐或钙盐)存在。羧基也可用伯、仲或叔醇诸如,例如甲醇、支链或无支链C1-C6-烷基醇,例如,乙醇或叔丁醇来酯化。羧基也可用伯胺或仲胺诸如氨、支链或无支链C1-C6-烷基胺或C1-C6二-烷基胺例如甲胺或二甲胺来酰胺化。
IL-10多肽的N-末端处的氨基酸NR1R2的氨基可以以游离形式(R1=H和R2=H)或以生理上可耐受的盐诸如例如氯化物或醋酸盐的形式存在。也可用酸将氨基乙酰化,以使得R1=H且R2=乙酰基、三氟乙酰基或金刚烷基。氨基可以以由常规用于肽化学的氨基保护基团诸如上文中提供的那些基团(例如,Fmoc、苄氧基-羰基(Z)、Boc和Alloc))保护的形式存在。可将氨基N-烷基化,其中R1和/或R2=C1-C6烷基或C2-C8烯基或C7-C9芳烷基。烷基残基可以是直链、支链或环状的(例如,分别为乙基、异丙基和环己基)。
增强和/或模拟IL-10功能的特定修饰
通常有益的,且有时必要的是改进本文中公开的治疗模式(例如,IL-10)的多个物理性质之一和/或其中施用它们的方式。物理性质的改进包括,例如,调节免疫原性;增加水溶性、生物利用度、血清半衰期和/或治疗半衰期的方法;和/或调节生物活性。某些修饰也可用于,例如,用于检测测定的抗体的产生(例如,表位标签),和提供蛋白质纯化的容易性。通常必须赋予此类改进而不会不利地影响治疗模式的生物活性和/或增加其免疫原性。
IL-10的聚乙二醇化是由本公开设想的一种特定修饰,而其它修饰包括,但不限于,糖基化(N-和O-连接的);聚唾液酸化;包含血清白蛋白(例如,人血清白蛋白(HSA),猕猴(cyno)血清白蛋白,或牛血清白蛋白(BSA))的白蛋白融合分子;通过例如缀合的脂肪酸链(酰化)的白蛋白结合;和Fc-融合蛋白。
聚乙二醇化:蛋白质治疗剂的临床功效通常受短的血浆半衰期和对蛋白酶降解的易感性限制。各种治疗性蛋白(例如,非格司亭(filgrastim))的研究已表明,此类困难可通过各种修饰来克服,所述修饰包括将多肽序列缀合或连接于多种非蛋白质类聚合物的任一种,例如,聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇或聚氧化烯。这常常通过共价地结合于蛋白质和非蛋白质类聚合物例如PEG的连接部分来实现。已显示此类PEG缀合的生物分子具有临床上有用的性质,包括更好的物理和热稳定性、针对对酶促降解的易感性的保护作用、增加的溶解度,增长的体内循环半衰期和降低的清除率、减弱的免疫原性和抗原性以及降低的毒性。
除了聚乙二醇化对药代动力学参数的有益作用以外,聚乙二醇化本身可增强活性。例如,已显示PEG-IL-10比未聚乙二醇化的IL-10更加有效地抗某些癌症(参见,例如,EP206636A2)。
适合用于至多肽序列的缀合的PEG在室温下通常是溶于水的,并且具有通式R(O-CH2-CH2)nO-R,其中R是氢或保护基团,诸如烷基或烷醇基团,并且其中n为从1至1000的整数。当R为保护基团时,其通常具有1至8个碳。缀合于多肽序列的PEG可以是线性的或分枝的。本公开设想了支链PEG衍生物,“星-PEG(star-PEG)”和多臂PEG。本公开中使用的PEG的分子量不限于任何特定的范围内,并且实例示于本文中其它地方;通过举例的方式,某些实施方案具有5kDa与20kDa之间的分子量,而其它实施方案具有4kDa与10kDa之间的分子量。
本公开还设想了缀合物的组合物,其中PEG具有不同的n值,因此各种不同的PEG以特定的比例存在。例如,一些组合物包含其中n=1、2、3和4的缀合物的混合物。在一些组合物中,其中n=1的缀合物的百分比为18-25%,其中n=2的缀合物的百分比为50-66%,其中n=3的缀合物的百分比为12-16%,以及其中n=4的缀合物的百分比达到5%。通过本领域中已知的反应条件和纯化方法来产生此类组合物。在整个说明书中描述了示例性反应条件。阳离子交换层析可用于分离缀合物,随后鉴定含有具有例如期望数目的附接的PEG、纯化的不含未修饰的蛋白质序列和不含具有其它数目的附接的PEG的缀合物的缀合物的级分。
聚乙二醇化最常在多肽的N-末端处的α氨基、赖氨酸残基的侧链上的ε氨基和组氨酸残基的侧链上的咪唑基上发生。由于大多数重组多肽具有单个α和许多ε氨基和咪唑基团,因此可取决于接头化学,产生大量位置异构体。本文中可应用本领域中已知的一般聚乙二醇化策略。PEG可通过介导一个或多个多肽序列的游离氨基或羧基与聚乙二醇之间的键的末端反应性基团(“间隔子”)结合于本公开的多肽。具有可结合于游离氨基的间隔子的PEG包括可通过用N-羟基琥珀酰亚胺活化聚乙二醇的琥珀酸酯来制备的N-羟基琥珀酰亚胺聚乙二醇。可结合于游离氨基的另一种活化的聚乙二醇是2,4-二(O-甲氧基聚乙二醇)-6-氯-均三嗪,其可通过将聚乙二醇单甲醚与氰尿酰氯反应来制备。结合于游离羧基的活化的聚乙二醇包括聚氧化乙烯二胺。
本公开的一个或多个多肽序列与具有间隔子的PEG的缀合可以通过各种常规方法来进行。例如,可在4℃至室温的温度下,利用4:1至30:1的试剂对蛋白质的摩尔比,在pH5至10的溶液中进行缀合反应,持续30分钟至20小时。反应条件可被选择来将反应导向主要生产所需程度的取代。一般地,低温、低pH值(例如,pH=5)和短的反应时间倾向于减少附接的PEG的数量,然而高温、中性至高pH(例如,pH≥7)和较长的反应时间倾向于增加附接的PEG的数量。本领域中已知的各种手段可用于终止反应。在一些实施方案中,通过酸化反应混合物,和在例如-20℃下冷冻来终止反应。在例如美国专利第5,252,714、5,643,575、5,919,455、5,932,462和5,985,263号中论述各种分子的聚乙二醇化。在例如美国专利第7,052,686号中描述了PEG-IL-10。设想用于本文中的特定反应条件示于实验部分。
本公开还设想了PEG模拟物的用途。已开发了保留PEG的属性(例如,延长的血清半衰期)同时赋予几个额外的有利性质的重组PEG模拟物。通过举例的方式,可重组产生已融合于目标肽或蛋白质药物(例如,Amunix’XTENtechnology;MountainView,CA)的能够形成类似于PEG的伸展构象的简单多肽链(包含,例如,Ala、Glu、Gly、Pro、Ser和Thr)。这避免在制造过程中对另外的缀合步骤的需要。此外,已建立的分子生物学技术使得能够控制多肽链的侧链组成,从而允许免疫原性和制造性能的优化。
糖基化:为了本公开的目的,“糖基化”在广义上意指将聚糖附接于蛋白质、脂质或其它有机分子的酶促过程。与本公开结合使用的术语“糖基化”的使用通常旨在表示添加或删除一个或多个糖类部分(通过除去潜在的糖基化位点或通过利用化学和/或酶促手段删除糖基化),和/或添加一个或多个可以存在于或可以不存在于天然序列中的糖基化位点。另外,该短语包括天然蛋白质的糖基化的定性变化,包括存在的各种糖类部分的性质和比例的变化。
糖基化可显著地影响多肽诸如IL-10的物理性质(例如,溶解性),并且在蛋白质的稳定性、分泌和亚细胞定位中也可以是非常重要的。糖基化的多肽也可表现出增强的稳定性或可改善一个或多个药代动力学性质诸如半衰期。另外,溶解度改善可以,例如,使得能够产生比包含非糖基化多肽的制剂更加适合用于药物施用的制剂。
糖基化位点的添加可通过改变氨基酸序列来实现。对多肽的改变可以例如通过一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基(对于O-连接的糖基化位点)或天冬酰胺残基(对于N-连接的糖基化位点)的添加或利用所述残基的取代来产生。N-连接和O-连接的寡糖和每一种类型中发现的糖残基的结构可以是不同的。在两者中通常发现的糖的一个类型是N-乙酰神经氨酸(在下文中称为唾液酸)。唾液酸通常是N-连接和O-连接的寡糖的末端残基,并且凭借其负电荷,可赋予糖蛋白酸性性质。本公开的具体实施方案包括N-糖基化变体的产生和用途。
本公开的多肽序列可任选地通过核酸水平上的改变,尤其是通过在预先选定的碱基上使编码多肽的核酸突变(以便产生将翻译成所需氨基酸的密码子)来改变。
聚唾液酸化:本公开还设想了聚唾液酸化的用途,多肽与天然存在的、可生物降解的α-(2→8)连接的聚唾液酸(“PSA”)的缀合,以改善多肽的稳定性和体内药代动力学。
白蛋白融合:用于缀合的另外的合适的组分和分子包括白蛋白诸如人血清白蛋白(HSA)、猕猴血清白蛋白和牛血清白蛋白(BSA)。
根据本公开,可将白蛋白在羧基末端、氨基末端、羧基末端和氨基末端以及内部缀合于药物分子(例如,本文中所述的多肽)(参见,例如,USP5,876,969和USP7,056,701)。
在本公开设想的HSA-药物分子缀合物中,可使用各种形式的白蛋白,诸如白蛋白分泌前序列及其变体、其片段和变体以及HSA变体。此类形式通常具有一种或多种所需的白蛋白活性。在另外的实施方案中,本公开涉及融合蛋白,其包含直接或间接融合于白蛋白、白蛋白片段和白蛋白变体等的多肽药物分子,其中所述融合蛋白具有比未融合的药物分子更高的血浆稳定性和/或所述融合蛋白保留未融合的药物分子的治疗活性。在一些实施方案中,间接融合通过接头诸如肽接头或其修饰形式来实现。
如上文所暗示,白蛋白与本公开的一种或多种多肽的融合可以,例如,通过基因操作来实现,以使得能够将编码HSA的核酸或其片段联接于编码一个或多个多肽序列的核酸。
替代性白蛋白结合策略:几种白蛋白-结合策略已被开发为指导融合的替代方案,并且可与本文所述的IL-10试剂一起使用。通过举例的方式,本公开设想了通过缀合的脂肪酸链(酰化)和融合蛋白(其包含白蛋白结合结构域(ABD)多肽序列和本文所述的一种或多种多肽的序列)的白蛋白结合。
与其它分子的缀合:用于缀合的另外的合适的组分和分子包括,例如,甲状腺球蛋白、破伤风类毒素、白喉类毒素、聚氨基酸诸如聚(D-赖氨酸:D-谷氨酸)、轮状病毒的VP6多肽、流感病毒血凝素、流感病毒核蛋白、钥孔血蓝蛋白(KLH)以及乙型肝炎病毒核心蛋白和表面抗原;或前述蛋白的任意组合。
因此,本公开设想了一个或多个另外的组分或分子在多肽序列的N-和/或C-末端处的缀合,所述多肽为诸如另一种多肽(例如,具有与主题多肽异源的氨基酸序列的多肽)或载体分子。因此,示例性多肽序列可作为与另一种组分或分子的缀合物来提供。
还可将IL-10多肽缀合于大的、缓慢代谢的大分子诸如蛋白质;多糖,诸如琼脂糖凝胶(sepharose)、琼脂糖、纤维素或纤维素珠粒;多聚氨基酸诸如聚谷氨酸或多聚赖氨酸;氨基酸共聚物;灭活的病毒颗粒;灭活的细菌毒素诸如来自白喉、破伤风、霍乱的类毒素或白细胞毒素分子;灭活的细菌;和树突细胞。此类缀合形式,如果需要,可用于产生针对本公开的多肽的抗体。
用于缀合的其它候选组分和分子包括适合用于分离或纯化的那些组分和分子。具体的非限制性实例包括结合分子,诸如生物素(生物素-抗生物素蛋白特异性结合对)、抗体、受体、配体、凝集素或包含固体载体的分子,包括,例如,塑料或聚苯乙烯珠粒、平板或珠粒、磁珠、测试条和膜。
Fc-融合分子:在某些实施方案中,可将本公开的多肽序列的氨基或羧基末端与免疫球蛋白Fc区(例如,人Fc)融合,以形成融合缀合物(或融合分子)。已显示Fc融合缀合物增加生物药物的全身性半衰期,因此生物制药产品可以需要不太频繁的施用。
Fc结合于内衬血管的内皮细胞中的新生Fc受体(FcRn),并且,在结合后,所述Fc融合分子免受降解,并且被重新释放至循环中,使分子在循环中保持更长的时间。该Fc结合被认为是内源性IgG籍以保持其长血浆半衰期的机制。更近的Fc融合技术将单拷贝的生物药物连接于抗体的Fc区以相较于常规Fc-融合缀合物,优化所述生物药物的药代动力学和药效学性质。
其它修饰:本发明设想了IL-10的目前已知的或将来开发的其它修饰用于改善一个或多个性质的用途。实例包括羟乙基化,其各个方面描述于例如美国专利申请第2007/0134197和2006/0258607号中,和包含SUMO作为融合标签的融合分子(LifeSensors,Inc.;Malvern,PA)。
接头:上文中已描述了接头及其用途。可任选地通过接头缀合用于修饰本公开的多肽序列的任何前述组分和分子。合适的接头包括“柔性接头”,其通常具有足够的长度,以允许经修饰的多肽序列与连接的组分和分子之间的一定移动。接头分子的长度通常为约6-50个原子。接头分子还可以是,例如,芳基乙炔、含有2-10个单体单位的乙二醇寡聚物、二胺、二酸、氨基酸或其组合。合适的接头可被容易地选择,并且可具有任何适当的长度,诸如1个氨基酸(例如,Gly)、2、3、4、5、6、7、8、9、10、10-20、20-30、30-50或多于50个氨基酸。
柔性接头的实例包括甘氨酸聚合物(G)n,甘氨酸-丝氨酸聚合物(例如,(GS)n、GSGGSn(SEQIDNO:13)、GGGSn(SEQIDNO:14)、(GmSo)n,(GmSoGm)n、(GmSoGmSoGm)n(SEQIDNO:15)、(GSGGSm)n(SEQIDNO:16)、(GSGSmG)n(SEQIDNO:17)和(GGGSm)n(SEQIDNO:18)及其组合,其中m和和o各自独立地选自至少为1的整数)、甘氨酸-丙氨酸聚合物、丙氨酸-丝氨酸聚合物以及其它柔性接头。甘氨酸和甘氨酸-丝氨酸聚合物是相对非结构化的,因此可用作组分之间的中性系链。示例性柔性接头包括但不限于:GGSG(SEQIDNO:19)、GGSGG(SEQIDNO:20)、GSGSG(SEQIDNO:21)、GSGGG(SEQIDNO:22)、GGGSG(SEQIDNO:23)和GSSSG(SEQIDNO:24)。
治疗性和预防性用途
本公开设想了本文所述的IL-10多肽(例如,PEG-IL-10)在治疗和/或预防与例如高胆固醇血症、异常脂质特征谱相关的或由其引起的疾病、病症或病状和/或其症状和与胆固醇动态平衡直接或间接相关的其它病症中的用途。实际上,本公开的教导旨在用于对于其达到或维持上述IL-10平均血清谷浓度参数可以是有益的任何此类疾病、病症或病状。虽然在下文中详细地描述了特定的用途,但应理解的是,本公开不局限于此。另外,虽然在下文中论述了与高胆固醇血症和异常脂质特征谱相关或由其引起的示例性疾病、病症和病状的具体类别,但应理解的是,通常在一个或多个类别之间存在重叠(例如,某些心血管疾病可具有炎性组分)。
心血管疾病。在具体实施方案中,本公开设想了本文所述的IL-10多肽(例如,PEG-IL-10)用于治疗和/或预防心血管疾病、病症和病状以及与高胆固醇血症和异常脂质特征谱相关、由其引起的病症的用途。
如本文中所用,术语“心血管疾病”、“心脏疾病”等是指影响心血管系统的任何疾病,主要指心脏病、脑和肾的血管疾病以及外周动脉疾病。心血管疾病是一系列疾病,其中一些在下文中进行进一步论述,其包括冠状心脏疾病(例如,缺血性心脏疾病或冠状动脉疾病)、动脉粥样硬化、心肌病、高血压、高血压性心脏病、肺原性心脏病、心律失常、心内膜炎、脑血管疾病和外周动脉疾病。心血管疾病是世界范围内死亡的首要原因,而其通常影响老年人,心血管疾病尤其是动脉粥样硬化的前因始于生命早期。
在某些实施方案中,本公开设想了周围血管疾病(PVD),也称为外周动脉疾病(PAD)或外围动脉闭塞性疾病(PAOD)的治疗和/或预防。PVD广义上是指特征在于大动脉的阻塞,而不是冠状或大脑血管内的阻塞的病状,其导致急性或慢性缺血。PVD还包括被分类为因动脉的偶发变窄(例如,雷诺氏现象(Raynaud'sphenomenon))或动脉的加宽(例如,血管痉挛)而引起的微血管疾病的疾病的亚组。PVD的症状包括,但不限于,疼痛、虚弱、麻木或因减少的血流而引起的肌肉抽筋、疮肿、伤口或缓慢愈合或根据不愈合的溃疡以及四肢凉或变色。约有20%的具有轻度PAD的患者可以无症状。
在具体实施方案中,本公开的IL-10试剂(例如,PEG-IL-10)用于治疗和/或预防心血管疾病,所述疾病包括心肌病(特征在于心肌功能恶化的病状)。体征和症状可能模拟几乎任何形式的心脏疾病的那些体征和症状,包括胸痛和EKG异常。轻度心肌病经常是无症状的,然而严重的情况与心脏衰竭、心律失常、全身性栓塞或心源性猝死有关。
几个方案可用于分类心肌病。一个方案在功能上将心肌病分类为包括扩张型、肥厚型或限制型。另一种方案将心肌病分类为获得性(extrinsic)或遗传性(intrinsic)。获得性心肌病是指其中主要病理是心肌本身之外的心肌病。例如,获得性心肌病可以通过代谢/贮积症、内分泌病症、神经肌肉病症、营养性病症、炎性病症、毒性(包括药物和酒精)、局部缺血,和/或感染(例如,丙型肝炎)引起。获得性心肌病的非限制性实例包括肢端肥大症、酒精性心肌病、淀粉样变性病、南美锥虫病(Chagasdisease)、糖尿病性心肌病、血色素沉着症、高血压性心肌病、甲状腺功能亢进症、炎性心肌病、缺血性心肌病、肌营养不良、瓣膜性心肌病、继发于全身代谢性疾病的心肌病、继发于全身营养性疾病的心肌病、冠状动脉疾病和先天性心脏疾病。与此相反,遗传性心肌病是指特征在于具有未知来源的心肌虚弱的心肌病。遗传性心肌病的非限制性实例包括扩张型心肌病、肥厚型心肌病、致心律失常性右室心肌病、限制型心肌病、孤立型心室致密化不全、线粒体性肌病、应激性心肌病(Takotsubocardiomyopathy)和吕弗勒心内膜炎(Loefflerendocarditis)。
本公开内容设想的实施方案包括其中所公开的IL-10试剂(例如,PEG-IL-10)用于治疗和/或预防如下疾病的那些实施方案:i)缺血性心脏疾病。缺血性心脏疾病或心肌缺血是指特征在于心肌的血液供给减少,通常因冠状动脉变窄或堵塞而引起的病状。缺血性心脏疾病的症状包括在用力时,在寒冷的天气或情绪化的情况中的胸痛;急性胸痛;急性冠状动脉综合征;不稳定型心绞痛;心肌梗塞;心脏衰竭,呼吸困难;或四肢肿胀;ii)充血性心脏衰竭,特征在于损害心脏充满或泵出足够量的血液遍布全身的能力的心脏异常的病状;和iii)高血压心脏疾病,特征在于高血压的病状,包括但不限于,左心室肥大、冠状动脉心脏疾病、充血性心脏衰竭、高血压性心肌病和心律失常。
本公开的具体实施方案涉及本文所述的IL-10多肽在治疗和/或预防动脉粥样硬化(其中动脉壁因脂肪物质诸如胆固醇和甘油三酯的积累而增厚,从而形成斑块的一种慢性病状)中的用途。如本文中进一步论述的,动脉粥样硬化经常涉及动脉壁的慢性炎症反应(主要由巨噬细胞的积累引起的和由LDL(在没有通过功能性HDL从巨噬细胞充分除去脂肪和胆固醇的情况下)促进的)。慢性扩张型动脉粥样硬化病变可引起管腔的完全封闭,其只有当管腔狭窄是如此严重,以致至下游组织的血液供应不充足,从而导致局部缺血时才可表现出来。
由本公开特别设想的是其中心血管疾病包括高脂血症(或高脂蛋白血症)(特征在于血液中脂质和/或脂蛋白的异常升高的水平的病状)的实施方案。高脂血症,当由特定的遗传异常引起时,可被分类为家族性的(或原发性的),当由另一个潜在病症引起时,被分类为获得性的(或继发性的),或当原因不明时,被分类为特发性的。高脂血症还可基于哪种类型的脂质和/或脂蛋白升高来进行分类。高脂血症的非限制性实例包括血脂异常、高胆固醇血症、高甘油酯血症、高甘油三酯血症、高脂蛋白血症、高乳糜微粒血症和合并高脂血症。高脂蛋白血症包括例如高脂蛋白血症Ia型、高脂蛋白血症Ib型、高脂蛋白血症Ic型、高脂蛋白血症IIa型、高脂蛋白血症IIb型、高脂蛋白血症III型、高脂蛋白血症IV型和高脂蛋白血症V型。
通过控制血液中的血脂和/或脂蛋白水平来治疗心血管疾病的努力获得了有限的成功。例如,尽管他汀类的施用在一些个体中降低了心血管疾病的危险,但这些治疗化合物不降低甘油三酯水平。在表现出有害的高水平甘油三酯的处于心血管疾病危险的个体中,可施用贝特类治疗剂的成员。然而,尽管降低甘油三酯和LDL水平,但贝特类不影响HDL水平。此外,涉及他汀类和贝特类,然而有时有效的联合治疗,经常导致肌病和横纹肌溶解的风险显著增加,因此只能在非常密切的医学监督下进行。鉴于如上举例的局限性,显然需要用于心血管疾病,包括与高血脂和/或脂蛋白水平相关的那些心血管疾病的使用和治疗的改进的药剂。
血栓形成和血栓性病状。在其它实施方案中,本公开设想了本文所述的IL-10多肽(例如,PEG-IL-10)用于治疗和/或预防血栓形成和血栓性疾病、病症和病状,以及与高胆固醇血症和异常脂质特征谱相关的,由其引起的病症的用途。血栓形成,导致血液通过循环系统的流动阻塞的血管内的血栓的形成,可由下列(魏克氏三联征(Virchow'striad))的一项或多项的异常而引起:高凝性或增加的血液凝结、内皮细胞损伤或扰乱的血流量(淤滞、紊流)。
血栓形成通常被归类为静脉的或动脉的,其每一种可呈现几种亚型。静脉血栓形成包括深静脉血栓形成(DVT)、门静脉血栓形成、肾静脉血栓形成、颈静脉血栓形成、布加氏综合征(Budd-Chiarisyndrome)、佩吉特氏病(Paget-Schroetterdisease)和脑静脉窦血栓形成。动脉血栓形成包括中风和心肌梗塞。
炎性病症。当胆固醇和/或LDL开始包埋于血管壁中时,免疫应答可被触发,这反过来导致慢性炎症。响应于该炎症,血液单核细胞粘附至内皮、迁移至内皮下间隙内,并朝向巨噬细胞分化。巨噬细胞,进而,通过经由与LDL受体不同的清道夫受体的吞噬作用吞食胆固醇沉积物和经修饰的LDL。然而,由巨噬细胞介导的适应机制不足以处理在病理状态下看到的不受控制的胆固醇和/或LDL沉积。因此,所述载脂巨噬细胞转变为“泡沫细胞”,通常伴随炎症诱导分子的释放。胆固醇/LDL沉积和血管壁中的伴随泡沫细胞介导的促炎性反应导致动脉粥样硬化病变的发展。因此,调节脂质或脂蛋白的水平的一个后果是慢性炎症的减轻或消除。
本公开包括其中本文所述的IL-10试剂(例如,PEG-IL-10)用于治疗和/或预防血管炎的实施方案。血管炎是表征因白细胞迁移和所造成的损伤而导致的血管壁(包括淋巴管和血管如静脉(静脉炎)、动脉(动脉炎)和毛细血管)的炎症的一组多样化的病症。炎症可影响动脉和/或静脉,无论大小。其可以是局灶性的或广泛存在的,炎症区域分散在整个特定的器官或组织中,或甚至影响不止一个身体中的器官系统。血管炎包括,但不限于,伯格氏病(Buerger'sdisease)(血栓闭塞性脉管炎)、脑血管炎(中枢神经系统血管炎)、丘-施二氏动脉炎(Churg-Straussarteritis)、冷球蛋白血症、原发性冷球蛋白血症血管炎、巨细胞(颞)动脉炎、亨诺赫-舍恩莱茵紫癜(Henoch-Schonleinpurpura)、过敏性血管炎(变应性血管炎)、川崎病(Kawasakidisease)、显微镜下多动脉炎/多血管炎、结节性多动脉炎、风湿性多肌痛(PMR)、类风湿血管炎、高安氏动脉炎(Takayasuarteritis)、血栓性静脉炎、韦格纳式肉芽肿病(Wegener'sgranulomatosis);和继发于结缔组织病症的血管炎如系统性红斑狼疮、类风湿关节炎、复发性多软骨炎、白塞氏病(Behcet'sdisease)、或其它结缔组织病症;和继发于病毒感染的血管炎。
其它实施方案涉及炎性心脏疾病,其是指特征在于心肌和/或周围组织的炎症的病状。实例包括,但不限于,心内膜炎、炎性心脏肥大和心肌炎。
药物组合物
本公开的IL-10多肽可以呈适于向受试者施用的组合物的形式。通常地,此类组合物是包含IL-10和一种或多种药学上可接受的或生理上可接受的稀释剂、载体或赋形剂的“药物组合物”。在某些实施方案中,IL-10多肽以治疗可接受量存在。药物组合物可用于本公开的方法;因此,例如,可以向受试者离体或体内施用所述药物组合物以实践本文所述的治疗和预防方法和用途。
本公开的药物组合物可被配制成与预期的施用方法或途径相容;示例性施用途径示于本文中。此外,可将所述药物组合物与本文所述的其它治疗活性剂或化合物组合使用,以治疗或预防本公开所设想的疾病、病症和病状。
药物组合物通常包含治疗有效量的本公开所设想的IL-10多肽和一种或多种药学上和生理上可接受的制剂。合适的药学上可接受的或生理上可接受的稀释剂、载体或赋形剂包括但不限于,抗氧化剂(例如,抗坏血酸和硫酸氢钠)、防腐剂(例如,苄醇、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯或正丙酯)、乳化剂、助悬剂、分散剂、溶剂、填充剂、增量剂、洗涤剂、缓冲剂、媒介物、稀释剂和/或佐剂。例如,合适的媒介物可以是生理盐水溶液或柠檬酸盐缓冲盐水,可能补充有用于肠胃外施用的药物组合物中常用的其它物质。与血清白蛋白混合的中性缓冲盐水或盐水是其它示例性媒介物。本领域技术人员将容易地认识多种可用于本文中设想的药物组合物和剂型的缓冲剂。典型的缓冲剂包括,但不限于,药学上可接受的弱酸、弱碱或其混合物。作为一个实例,缓冲组分可以是水溶性物质诸如磷酸、酒石酸、乳酸、琥珀酸、柠檬酸、醋酸、抗坏血酸、天冬氨酸、谷氨酸及其盐。可接受的缓冲剂包括,例如,Tris缓冲液、N-(2-羟乙基)哌嗪-N'-(2-乙磺酸)(HEPES)、2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)、2-(N-吗啉代)乙磺酸钠盐(MES)、3-(N-吗啉代)丙磺酸(MOPS)和N-三[羟甲基]甲基-3-氨基丙磺酸(TAPS)。
在已配制药物组合物后,可将其作为溶液、混悬剂、凝胶、乳剂,固体、或脱水或冻干的粉末贮存在无菌小瓶中。可将此类制剂以即用形式、使用前需要复溶的冻干形式、使用前需要稀释的液体形式或其它可接受的形式贮存。在一些实施方案中,在单次使用容器(例如,单次使用小瓶、安瓿、注射器或自动注射器(类似于,例如,))中提供所述药物组合物,然而在其它实施方案中提供多次使用容器(例如,多用小瓶)。任何药物递送装置可被用于递送IL-10,包括植入物(例如,可植入的泵)和导管系统、缓慢注射泵和装置,所有这些对于本领域技术人员都是公知的。通常通过皮下或肌内施用的储库注射也可用于在一段确定的时间内释放本文中公开的多肽。储库注射通常是基于固体或油的,并且通常包含本文中所示的制剂组分的至少一种。本领域普通技术人员熟悉储库注射的可能的制剂和用途。
所述药物组合物可以呈无菌可注射水性或油性混悬剂的形式。该混悬剂可根据已知的技术,使用本文中提及的那些合适的分散或润湿剂和助悬剂来配制。无菌可注射制剂也可以是在无毒的胃肠外可接受的稀释剂或溶剂中的无菌可注射溶液或混悬剂,例如如在1,3-丁二醇中的溶液。可以使用的可接受的稀释剂、溶剂和分散介质包括水、林格氏溶液(Ringer'ssolution)、等渗氯化钠溶液、CremophorELTM(BASF,Parsippany,NJ)或磷酸盐缓冲盐水(PBS)、乙醇、多元醇(例如,甘油、丙二醇和液体聚乙二醇)及其合适的混合物。此外,无菌不挥发性油通常用作溶剂或悬浮介质。为此目的,可使用任何温和的不挥发性油,包括合成的单-或二甘油酯。此外,脂肪酸诸如油酸用于注射剂的制备。特定的可注射制剂的延长吸收可通过包含延迟吸收的试剂(例如,单硬脂酸铝或明胶)来实现。
含有活性成分的药物组合物可以呈适于口服使用的形式,例如作为片剂、胶囊剂、糖锭、锭剂、水性或油性混悬剂、可分散粉剂或颗颗粒剂、乳剂、硬或软胶囊剂或糖浆剂、溶液剂、微珠或酏剂。在具体实施方案中,与本文所述的IL-10试剂共施用的试剂的活性成分呈适合于口服使用的形式。旨在用于口服使用的药物组合物可按照本领域已知的用于药物组合物的制造的任何方法来制备,并且此类组合物可含有一种或多种试剂诸如,例如,甜味剂、调味剂、着色剂和防腐剂,以提供药学上美观和可口的制剂。片剂、胶囊剂等含有与适合于制造片剂的无毒的药学上可接受的赋形剂混合的活性成分。这些赋形剂可以例如是稀释剂,诸如碳酸钙、碳酸钠、乳糖、磷酸钙或磷酸钠;粒化剂和崩解剂,例如,玉米淀粉或海藻酸;结合剂,例如淀粉、明胶或阿拉伯胶,以及润滑剂,例如硬脂酸镁、硬脂酸或滑石粉。
适于口服施用的片剂、胶囊剂等可以是未包衣的,或通过已知的技术包衣的,以在胃肠道中延迟崩解和吸收,从而提供持续作用。例如,可采用延时物质诸如单硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯。它们也可以利用本领域中已知的技术来包衣,以形成用于受控释放的渗透性治疗片剂。另外的试剂包括生物可降解或生物相容性颗粒或聚合物质诸如聚酯、聚氨基酸、水凝胶、聚乙烯吡咯烷酮、聚酐、聚乙醇酸、乙烯-乙酸乙烯酯、甲基纤维素、羧甲基纤维素、硫酸鱼精蛋白或丙交酯/乙交酯共聚物、聚丙交酯/乙交酯共聚物,或乙烯醋酸乙烯共聚物,以控制施用的组合物的受控递送。例如,可将口服剂包埋在通过凝聚技术或通过界面聚合,通过分别使用羟甲基纤维素或明胶-微胶囊剂或聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊制备的微胶囊中或胶体药物递送系统中。胶体分散系统包括大分子复合物、纳米胶囊剂、微球体、微珠和基于脂质的系统,包括水包油乳剂、胶束、混合胶束和脂质体。用于制备上述制剂的方法对于本领域技术人员而言是显而易见的。
用于口服使用的制剂也可作为硬明胶胶囊剂(其中将活性成分与惰性固体稀释剂例如,碳酸钙、磷酸钙、高岭土或微晶纤维素混合)或作为软明胶胶囊剂(其中将活性成分与水或油介质例如花生油、液体石蜡或橄榄油混合)来提供。
水性混悬剂含有与适合于其制造的赋形剂混合的活性物质。此类赋形剂可以是助悬剂,例如羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、藻酸钠、聚乙烯吡咯烷酮、黄蓍树胶和阿拉伯树胶;分散或润湿剂,例如天然存在的磷脂(例如,卵磷脂),或烯烃氧化物与脂肪酸的缩合产物(例如,聚氧乙烯硬脂酸酯),或环氧乙烷与长链脂族醇的缩合产物(例如,对于十七烷乙烯氧基十六醇),或环氧乙烷与衍生自脂肪酸和己糖醇的偏酯的缩合产物(例如,聚氧乙烯山梨醇单油酸酯),或环氧乙烷与衍生自脂肪酸和己糖醇酐的偏酯的缩合产物(例如,聚乙烯去水山梨糖醇单油酸酯)。水性混悬剂还可含有一种或多种防腐剂。
油性混悬剂可通过将活性成分悬浮于植物油例如花生油、橄榄油、芝麻油或椰子油中,或矿物油诸如液体石蜡中来配制。油性混悬剂可含有增稠剂,例如蜂蜡、硬石蜡或鲸蜡醇。可添加甜味剂诸如上文所示的那些甜味剂和调味剂以提供可口的口服制剂。
适合用于通过添加水来制备水性混悬剂的可分散粉剂和颗粒剂提供了与分散剂或润湿剂、助悬剂和一种或多种防腐剂混合的活性成分。本文中举例说明了合适的分散剂或润湿剂和助悬剂。
本公开的药物组合物也可呈水包油乳剂形式。油相可以是植物油,例如橄榄油或花生油,或矿物油,例如液体石蜡,或这些物质的混合物。合适的乳化剂可以是天然存在的树胶,例如阿拉伯树胶或黄蓍胶;天然存在的磷脂,例如大豆、卵磷脂和衍生自脂肪酸的酯或偏酯;己糖醇酐,例如去水山梨糖醇单油酸酯;和偏酯与环氧乙烷的缩合产物,例如,聚氧乙烯去水山梨糖醇单油酸酯。
制剂还可包括保护所述组合物免于从体内快速降解或消除的载体,诸如控释制剂,包括植入物、脂质体、水凝胶、前药和微胶囊化递送系统。例如,可使用单独的或与石蜡组合的延时物质诸如单硬脂酸甘油酯或硬脂酸甘油酯。
本公开设想了用于直肠施用的呈栓剂形式的IL-10多肽的施用。可通过将药物与在常温下为固体但在直肠温度下为液体,从而将在直肠中熔化以释放药物的合适的无刺激性赋形剂混合来制备栓剂。此类物质包括,但不限于,可可脂和聚乙二醇。
由本公开设想的IL-10多肽可呈目前已知的或将来开发的任何其它合适的药物组合物的形式(例如,用于经鼻或吸入使用的喷雾剂)。
制剂中的多肽或其片段的浓度可以广泛地(例如,按重量计少于约0.1%,通常为约2%或至少约2%至多达20%至50%或更多)变化并且通常将根据例如所选择的具体施用模式,主要基于体液体积、粘度和基于受试者的因素来选择。
施用途径
本公开设想以任何适当的方式进行的IL-10及其组合物的施用。合适的施用途径包括胃肠外(例如,肌内、静脉内、皮下(例如,注射或植入)、腹膜内、脑池内、关节内、腹膜内、脑内(实质内)和脑室内)、口服、经鼻、经阴道、舌下、眼内、经直肠、局部(例如,经皮)、舌下和吸入。通常皮下或肌内施用的储库注射也可用于在一段确定的时间内释放本文中公开的IL-10多肽。
本公开的具体实施方案设想了肠胃外施用,并且在更具体的实施方案中,肠胃外施用是皮下施用。
联合治疗
本公开设想了IL-10(例如,PEG-IL-10)与一种或多种活性治疗剂或其它预防或治疗模式(例如,辐照)的联合使用。在此类联合治疗中,各种活性剂常常具有与IL-10不同的作用机制。此类联合治疗可通过允许一种或多种试剂的剂量减少,从而减少或消除与一种或多种试剂相关的不良作用而特别有利;此外,此类联合治疗可具有对潜在疾病、病症或病状的协同治疗或预防作用。
在具体实施方案中,本公开提供利用本文中所述的IL-10多肽(例如,PEG-IL-10)和至少一种另外的治疗剂或诊断剂来治疗和/或预防与胆固醇动态平衡相关(直接或间接)的疾病、病症或病状(包括相关的心血管疾病、血栓形成和炎性病症)的方法。应该理解的是,联合治疗不限于治疗和/或预防上述疾病、病症或病状的试剂;例如,预期与IL-10多肽组合使用的试剂可在治疗或预防其它代谢紊乱,诸如糖尿病或肥胖中具有功效。本文中还设想了IL-10多肽(例如,PEG-IL-10)与改进的饮食和/或锻炼方案的组合使用。
如本文中所用,“组合”意在包括可单独施用,例如单独配制用于单独施用(例如,如可在试剂盒中提供)的疗法,和可在单一制剂中一起施用(即,“共制剂”)的疗法。
在某些实施方案中,相继施用或应用所述IL-10多肽,例如,其中在一种或多种其它试剂之前施用一种试剂。在其它实施方案中,例如同时施用所述IL-10多肽,其中同时或大致同时施用两种或更多种试剂;所述两种或更多种试剂存在于两种或更多种单独的制剂中或组合成单一制剂(即,共制剂)。无论相继还是同时施用所述两种或更多种试剂,它们都被认为是为了本公开的目的而被组合施用。
可许多情况下以任何适当的方式将本公开的IL-10多肽与至少一种活性剂组合使用。在一个实施方案中,在一段时间内维持利用所述至少一种活性剂和本公开的至少一种IL-10多肽的治疗。在另一个实施方案中,减少或间断(例如,当受试者稳定时)利用所述至少一种活性剂的治疗,同时以恒定的给药方案维持利用本公开的IL-10多肽的治疗。在其它实施方案中,减少或间断(例如,当受试者稳定时)利用所述至少一种活性剂的治疗,同时减少(例如,较低剂量、较低频率的给药或较短的治疗方案)利用本公开的IL-10多肽的治疗。在另一个实施方案中,减少或间断(例如,当受试者稳定时)利用所述至少一种活性剂的治疗,但增加(例如,较高剂量、更频繁的给药或较长的治疗方案)利用本公开的IL-10多肽的治疗。在另一个实施方案中,维持利用所述至少一种活性剂的治疗,并中断或减少(例如,较低剂量、较低频率的给药或较短的治疗方案)利用本公开的IL-10多肽的治疗。在另一个实施方案,中断或减少(例如,较低剂量、较低频率的给药或较短的治疗方案)利用所述至少一种活性剂的治疗和利用本公开的IL-10多肽的治疗。
虽然在下文显示了适合于与本文中所公开的IL-10多肽(例如,PEG-IL-10)组合使用的特定试剂,但应理解的是,本公开不局限于此。在下文中,某些试剂示于示例性疾病、病症和病状的特定类别中;然而,应理解的是,在一个或多个类别之间通常存在重叠(例如,某些试剂可同时具有心血管和抗炎作用)。
胆固醇动态平衡剂。本公开的具体实施方案牵涉IL-10多肽与胆固醇动态平衡相关试剂的组合。这些试剂中有许多靶向牵涉胆固醇的吸收、合成、运输、储存、分解代谢和排泄的不同途径,并从而为特别有用的用于联合治疗的候选剂。
用于治疗高胆固醇血症(且从而例如常常为动脉粥样硬化)的联合治疗的治疗剂的实例包括他汀类(例如,CRESTOR、LESCOL、LIPITOR、MEVACOR、PRAVACOL和ZOCOR),其抑制胆固醇的酶促合成;胆汁酸树脂(例如,COLESTID、LO-CHOLEST、PREVALITE、QUESTRAN和WELCHOL),其隔离胆固醇并阻止其吸收;依泽替米贝(ZETIA),其阻断胆固醇吸收;纤维酸(例如,TRICOR),其降低甘油三酯且可适度增加HDL;烟酸(例如,NIACOR),其适度降低LDL胆固醇和甘油三酯;和/或上述的组合(例如,VYTORIN(依泽替米贝与辛伐他汀(simvastatin)))。可作为与本文所述的IL-10多肽组合使用的候选物的替代胆固醇治疗包括各种补充剂和草药(例如,大蒜、甘蔗脂肪醇(policosanol)和没药甾酮(guggul))。在下文中进一步论述几类前述治疗剂。
本公开的具体实施方案包括与贝特类组合的IL-10试剂。贝特类,即一类两亲性羧酸,可用作抗-高脂血症剂以降低,例如,甘油三酯和LDL的水平,并升高HDL的水平。合适的贝特类药物的实例包括,但不限于,苯扎贝特(Bezafibrate)、环丙贝特(Ciprofibrate)、氯贝特(Clofibrate)、吉非贝齐(Gemfibrozil)和非诺贝特(Fenofibrate)。
本公开的另外的具体实施方案包括将IL-10试剂与HMG-CoA还原酶抑制剂(他汀类)组合。HMG-CoA还原酶抑制剂可通过抑制酶HMG-CoA还原酶来降低LDL和/或胆固醇水平,所述HMG-CoA还原酶在肝脏的胆固醇的产生中起着中心作用。为了补偿降低的胆固醇可用性,增加肝LDL受体的合成,这导致增加的LDL颗粒从血液的清除。合适的他汀类药物的实例包括,但不限于,阿托伐他汀(Atorvastatin)、氟伐他汀(Fluvastatin)、洛伐他汀(Lovastatin)、匹伐他汀(Pitavastatin)、普伐他汀(Pravastatin)、罗苏伐他汀(Rosuvastatin)和辛伐他汀(Simvastatin)。本文中特别地设想了IL-10多肽与他汀类的组合。
本公开的其它具体实施方案包含与烟酸组合的IL-10试剂。烟酸可通过选择性抑制肝二酰基甘油酰基转移酶-2、减少甘油三酯的合成以及通过受体HM74和HM74A或GPR109A减少VLDL分泌来降低LDL水平。烟酸的非限制性用途是作为抗-高血脂剂来抑制脂肪组织中脂肪的分解。通过阻断脂肪的分解,烟酸使血液中的游离脂肪酸减少,并且作为结果,减少肝的VLDL和胆固醇分泌。通过降低VLDL水平,烟酸还可升高血液中的HDL的水平。合适的烟酸的实例包括,但不限于,阿昔莫司(acipimox)、烟酸、烟酰胺和维生素B3。
本公开的其它具体实施方案包括与胆汁酸螯合剂组合的IL-10试剂。胆汁酸螯合剂(也称为树脂)结合胃肠道中的胆汁的某些成分,从而通过隔离它们并防止其从肠道的再吸收来中断胆汁酸的肠肝循环。胆汁酸螯合剂对于降低LDL和胆固醇是特别有效的,并且还可提高HDL水平。合适的胆汁酸螯合剂的实例包括,但不限于,考来烯胺(Cholestyramine)、考来维仑(Colesevelam)和考来替泊(Colestipol)。
本公开的另外的具体实施方案包含与胆固醇吸收抑制剂组合的IL-10试剂。胆固醇吸收抑制剂减少胆固醇从肠的吸收;这导致细胞表面上LDL-受体的上调并增加LDL胆固醇至这些细胞内的摄入,从而降低血浆中的LDL水平。合适的胆固醇吸收抑制剂的实例包括,但不限于,依泽替米贝,植物甾醇,甾醇和甾烷醇。本文中特别地设想了IL-10多肽与依泽替米贝的组合。依泽替米贝选择性阻断胆固醇吸收并使血浆LDL水平降低平均18%。当将依泽替米贝与较低剂量的他汀类共施用时,存在LDL水平的累加降低,其与利用最大剂量的单独的他汀类获得的降低相等。他汀类剂量的减少导致更少的他汀类相关的不良作用。
本公开的其它具体实施方案包含与脂肪吸收抑制剂组合的IL-10试剂。脂肪吸收抑制剂减少脂肪从肠的吸收,从而减少热量的摄入。在一个方面,脂肪吸收抑制剂抑制胰脂肪酶,一种在肠中分解甘油三酯的酶。合适的脂肪吸收抑制剂的实例包括,但不限于,奥利司他(Orlistat)。
在其它具体实施方案中,本公开设想了与PCSK9(9型前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶/kexin)的调节剂组合的本文所述的PEG-IL-10试剂的用途。PCSK9在胆固醇动态平衡中起着重要调节作用。其为主要在肝、肠和肾中表达的丝氨酸蛋白酶。所编码的蛋白质被合成为在内质网中经历自身催化的分子内加工的可溶性酶原。
作为胆固醇体内平衡过程的部分,当LDL胆固醇结合肝细胞表面上的LDL受体(LDLR)并且被此类细胞吸收时,其从血液被除去。PCSK9通过结合LDLR并诱导受体降解,从而防止LDLR再循环至细胞表面,以除去更多LDL胆固醇,最终导致其代谢减少来发挥作用。阻止PCSK9结合LDLR允许受体返回至细胞表面和除去更多的胆固醇。如本文所进一步论述的,PEG-IL-10在缺乏LDL受体的敲除小鼠中下调PCSK9的信息表达。因此,PEG-IL-10以非PCSK9依赖性方式急剧降低胆固醇,这表明PEG-IL-10与PCSK9抑制剂的组合将具有累加效应。
已显示PCSK9功能的抑制剂以可接受的不良作用特征谱引起比常规商购可得试剂多得多的胆固醇降低。本公开设想了PEG-IL-10与具有对PCSK9的直接或间接抑制作用的任何调节剂的用途。正在开发结合于PCSK9并干扰其与LDLR相互作用的几种单克隆抗体(例如,Amgen(AMG145)、Merck(1D05-IgG2)和Aventis/Regeneron(SAR236553/REGN727))中。另外,正在开发模拟结合PCSK9的LDLR的EGFA结构域的肽,并且已显示通过施用PCSK9反义寡核苷酸(ISISPharmaceuticals)的基因沉默在小鼠中增加LDLR的表达并降低循环总胆固醇水平。设想用于本文中描述的利用PEG-IL-10试剂的联合治疗的PCSK9功能的其它调节剂是通过RNA干扰(RNAi)(AlnylamPharmaceuticals)和作为锁核酸(LNA)(SantarisPharma)(也称为不可及RNA)起作用的那些调节剂。
本公开涵盖药学上可接受的盐、酸或上述任何一种的衍生物。
免疫和炎性病状。本公开提供用于利用IL-10多肽(例如,PEG-IL-10)和至少一种具有免疫-和/或炎性-相关性质的另外的试剂来治疗和/或预防免疫-和/或炎性相关疾病、病症和病状,以及与之相关的病症的方法。通过举例的方式,可将IL-10多肽与在具有炎性组分的心血管病症中具有功效的试剂一起施用。
用于联合治疗的治疗剂的实例包括,但不限于,非甾体抗炎药(NSAID)。NSAID(一大组的具有止痛、抗炎和抗-发热性质的治疗化合物)通过阻断环氧合酶减轻炎症。此类试剂的实例包括:布洛芬及其它丙酸衍生物(阿明洛芬、苯恶洛芬、布氯酸、卡洛芬、芬布芬、非诺洛芬、氟洛芬、氟比洛芬、吲哚洛芬、酮洛芬、咪洛芬、萘普生、奥沙普秦、吡洛芬、普拉洛芬、舒洛芬、噻洛芬酸和硫噁洛芬);乙酸衍生物(吲哚美辛、阿西美辛、阿氯芬酸、环氯茚酸、双氯芬酸、芬氯酸、芬克洛酸、芬替酸、弗洛芬那(fuirofenac)、异丁芬酸、伊索克酸、奥品酸(oxpinac)、舒林酸、硫平酸、托美丁、齐多美辛和佐美酸);芬那酸衍生物(氟芬那酸、甲氯芬那酸、甲芬那酸、尼氟酸和托芬那酸);联苯羧酸衍生物(二氟尼柳和氟苯柳);昔康(伊索昔康、吡罗昔康、舒多昔康和替诺昔康);水杨酸盐(乙酰水杨酸、柳氮磺吡啶);和吡唑啉酮(阿扎丙宗、贝比派瑞(bezpiperylon)、非普拉宗、莫非布宗、羟布宗、保泰松)。
其它组合包括选择性环加氧酶-2(COX-2)抑制剂、选择性环加氧酶1(COX1)抑制剂和非选择性环加氧酶(COX)抑制剂。本公开的具体实施方案设想了与合适的选择性COX-2抑制剂(诸如塞来考昔、依托考昔、非罗考昔、罗美昔布、美洛昔康、帕瑞昔布、罗非昔布和伐地考昔)组合的本文所述的IL-10多肽(例如,PEG-IL-10)。
用于组合的其它活性剂包括类固醇诸如泼尼松龙、泼尼松、甲泼尼龙、倍他米松、地塞米松或氢化可的松。此类组合可以是特别有利的,因为类固醇的一个或多个副作用可通过减小当与本发明的IL-10多肽联合治疗患者时所需的类固醇剂量来减轻或甚至消除。
用于组合以治疗例如类风湿关节炎的活性剂的另外的实例包括细胞因子抑制性抗炎药(CSAID);针对其它人细胞因子或生长因子例如TNF、LT、IL-1β、IL-2、IL-6、IL-7、IL-8、IL-15、IL-16、IL-18、EMAP-II、GM-CSF、FGF或PDGF的抗体或拮抗剂。
活性剂的特定组合可在自身免疫和随后的炎症级联中的不同点处干扰,并且包括TNF拮抗剂样嵌合、人源化或人TNF抗体、REMICADE、抗-TNF抗体片段(例如,CDP870)和可溶性p55或p75TNF受体、其衍生物、p75TNFRIgG(ENBREL.)或p55TNFR1gG(LENERCEPT)、可溶性IL-13受体(sIL-13)以及还有TNFα转化酶(TACE)抑制剂;类似地IL-1抑制剂(例如,白细胞介素-1-转化酶抑制剂)可以是有效的。其它组合包括白细胞介素11、抗-P7s和p-选择素糖蛋白配体(PSGL)。用于与本文所述的IL-10多肽组合的试剂的其它实例包括干扰素-β1a(AVONEX);干扰素-β1b(BETASERON);醋酸格拉替雷(copaxone);高压氧;静脉注射免疫球蛋白;克拉屈滨(clabribine);和针对其它人细胞因子或生长因子的抗体或拮抗剂(例如,针对CD40配体和CD80的抗体)。
本公开涵盖药学上可接受的盐、酸或上述任何一种的衍生物。
抗糖尿病剂和抗肥胖剂。需要对胆固醇相关病症进行药物治疗的一些患者也服用抗糖尿病剂和/或抗肥胖剂。本公开设想与许多抗糖尿病剂(及其种类)的联合治疗,所述抗糖尿病剂包括:1)胰岛素、胰岛素模拟物和需要刺激胰岛素分泌的试剂,包括磺酰脲类(例如,氯磺丙脲、妥拉磺脲、醋磺己脲、甲苯磺丁脲、格列本脲、格列美脲、格列吡嗪)和氯茴苯酸类(例如,瑞格列奈(PRANDIN)和那格列奈(STARLIX));2)双胍类(例如,二甲双胍(GLUCOPHAGE)),和通过促进葡萄糖利用、减少肝葡萄糖产生和/或减少肠道葡萄糖输出起作用的其它试剂;3)α-葡糖苷酶抑制剂(例如,阿卡波糖和米格列醇)和减慢糖类消化和从而从肠吸收,以及降低餐后高血糖的其它试剂;4)可增强胰岛素作用(例如,通过胰岛素致敏),从而促进外周组织中的葡萄糖利用的噻唑烷二酮类(例如,罗格列酮(AVANDIA)、曲格列酮(REZULIN)、吡格列酮(ACTOS)、格列吡嗪,巴格列酮、利格列酮、萘格列酮、曲格列酮、恩格列酮、环格列酮、adaglitazone、达格列酮;5)胰高血糖素样肽,包括DPP-IV抑制剂(例如,维格列汀(GALVUS)和西他列汀(JANUVIA)和胰高血糖素样肽-1(GLP-1)和GLP-1激动剂和类似物(例如,艾塞那肽(BYETTA));6)和DPP-IV抗性类似物(肠促胰岛素模拟物)、PPARγ激动剂、双重作用PPAR激动剂、泛作用PPAR激动剂、PTP1B抑制剂、SGLT抑制剂、胰岛素促分泌素、糖原合酶激酶-3抑制剂、免疫调节剂、β-3肾上腺素能受体激动剂、11β-HSD1抑制剂和胰淀素类似物。在其它实施方案中,将本文所述的IL-10试剂与一种或多种合适的核受体结合剂(例如,视黄酸受体(RAR)结合剂、视黄醇X受体(RXR)结合剂、肝X受体(LXR)结合剂和维生素D结合剂)组合使用。
此外,本公开设想利用用于促进体重减轻的试剂和方法,诸如刺激代谢或减弱食欲的试剂以及促进体重减轻的改进的饮食和/或锻炼方案的联合治疗。
本公开涵盖药学上可接受的盐、酸或上述任何一种的衍生物。
给药
可以以这样的量向受试者施用本公开的IL-10多肽,所述量取决于,例如施用的目的(例如,所需的解决程度);待施用所述制剂的受试者的年龄、体重、性别以及健康和身体状况;施用途径;疾病、病症、病状或其症状的性质。给药方案也可考虑与待施用的试剂相关的任何有害作用的存在、性质和程度。也可从例如安全性和剂量递增试验、体内研究(例如,动物模型)和本领域技术人员已知的其它方法容易地确定有效剂量量和给药方案。
本公开设想了实现某些血清谷浓度和/或维持某些平均血清谷浓度的IL-10的施用。在本文中其它地方和下面的本节中描述了对于IL-10是特异的方法。
一般地,给药参数决定剂量量少于可对受试者产生不可逆的毒性的量(即,最大耐受剂量“MTD”),并且不少于对受试者产生可测量的作用所需的量。通过例如与ADME相关的药代动力学参数和药效学参数,考虑施用途径和其它因素来确定此类量。
有效剂量(ED)是在一部分服用其的受试者中产生治疗反应或所需作用的试剂的剂量或量。试剂的“半数有效剂量”或ED50是在50%的施用试剂的群体中产生治疗反应或所需作用的试剂的剂量或量。虽然ED50通常用作试剂的作用的合理预期的量度,但其不一定是临床医师通过考虑所有相关因素可能认为合适的剂量。因此,在一些情况下,有效量高于计算的ED50,在其它情况下,有效量少于计算的ED50,而在其它情况下,有效量与计算的ED50相同。
另外,本公开的IL-10多肽的有效剂量可以是当以一个或多个剂量向受试者施用时,产生相对于健康受试者的期望结果的量。例如,对于经历特定病症的受试者而言,有效剂量可以是使该病症的诊断参数、量度、标志物等改善至少约5%、至少约10%、至少约20%、至少约25%、至少约30%、至少约40%、至少约50%、至少约60%、至少约70%、至少约80%、至少约90%或超过90%的剂量,其中100%被定义为由正常受试者展现的诊断参数、量度、标志物等。
治疗本文所述的疾病、病症或病状所必需的PEG-IL-10的量基于缀合蛋白的IL-10活性,其可通过本领域中已知的IL-10活性测定法来测定。通过举例的方式,在肿瘤背景中,合适的IL-10活性包括,例如,至肿瘤位点内的CD8+T细胞浸润、来自这些浸润细胞的炎性细胞因子诸如IFN-γ、IL-4、IL-6、IL-10和RANK-L的表达,和生物样品中TNF-α或IFN-γ的升高的水平。
治疗有效量的PEG-IL-10的范围可以是约0.01至约100μg蛋白质/kg体重/日、约0.1至20μg蛋白质/kg体重/日、约0.5至10μg蛋白质/kg体重/日或约1至4μg蛋白质/kg体重/日。在一些实施方案中,通过连续输注以递送约50至800μg蛋白质/kg体重/日(例如,约1至16μg蛋白质/kg体重/日的PEG-IL-10)来施用PEG-IL-10。该输注速率可基于例如有害作用和血细胞计数的评估而改变。
对于口服剂的施用,组合物可以以片剂、胶囊剂等的形式提供,所述片剂、胶囊剂等含有1.0至1000毫克的活性成分,特别地1.0,3.0、5.0、10.0、15.0、25.0、50.0、75.0、100.0、150.0、200.0、250.0、300.0、400.0、500.0、600.0、750.0、800.0、900.0和1000.0毫克的活性成分。
IL-10多肽的具体给药方案(例如,给药频率)在本文的其它地方进行了描述。
在某些实施方案中,将公开的IL-10多肽的剂量包含在“单位剂量形式”中。短语“单位剂量形式”是指物理离散单位,每一个单位单独地或与一种或多种另外的试剂组合地含有足以产生所需作用的预定量的本公开的IL-10多肽。应该理解的是,单位剂量形式的参数将取决于具体试剂和要实现的作用。
试剂盒
本公开还设想了包含IL-10和其药物组合物的试剂盒。所述试剂盒通常呈装有各种组分的物理结构形式(如下文中所述的)并且可用于例如实践上述方法(例如,向需要恢复胆固醇动态平衡的受试者施用IL-10多肽)。
试剂盒可包括一种或多种本文中公开的IL-10多肽(在例如无菌容器中提供的),其可呈适于向受试者施用的药物组合物形式。可以以容易使用的形式或以在施用前需要例如复溶或稀释的形式提供IL-10多肽。当以需要由使用者复溶的形式施用IL-10多肽时,所述试剂盒还可包括与IL-10多肽一起或与其分开包装的缓冲剂、药学上可接受的赋形剂等。当设想联合治疗时,所述试剂盒可单独地含有几种试剂或它们可能已被组合在试剂盒中。可将试剂盒的每一种组分封装在单独的容器内,并且所有各种容器可在单个包装内。本公开的试剂盒可被设计用于正确保持装在其中的组分所必需的条件(例如,冷藏或冷冻)。
试剂盒可含有标签或包装插页,包括识别其中的组分的信息和其使用说明书(例如,给药参数、活性成分的临床药理学,包括作用机制、药代动力学和药效学、有害作用、禁忌症等)。标签或插页可包括制造商信息,诸如批号和有效期。标签或包装插页可以被,例如,并入装有组分的物理结构中,单独地包含在物理结构内,或贴附于试剂盒的组分(例如,安瓿、管或小瓶)。
标签或插页还可额外地包括,或被并入,计算机可读介质,诸如磁盘(例如,硬盘、卡、内存盘)、光盘诸如CD-或DVD-ROM/RAM、DVD、MP3、磁带,或电存储介质诸如RAM和ROM或这些的混合形式诸如磁/光存储介质、FLASH介质或内存类型卡中。在一些实施方案中,实际说明书不存在于试剂盒中,但提供了用于例如通过网络从远程来源获得说明书的装置。
实验
提出以下实施例,以为本领域普通技术人员提供如何制造和使用本发明的完整公开和描述,并且不旨在限制发明人所认为的他们的发明的范围,并且它们也不旨在表示进行下面的实验并且所述实验为可进行的全部实验。应该理解的是,以现在时书写的示例性描述不一定被执行,相反地可进行描述以生成本文中描述的数据等。已努力确保关于所用的数字(例如,量、温度等)的准确性,但应当考虑一些实验误差和偏差。
除非另有说明,否则份是重量份,分子量是重均分子量,温度为摄氏度(℃),并且压力等于或接近大气压。使用标准缩写,包括以下缩写:bp=碱基对;kb=千碱基;pl=皮升;s或sec=秒;min=分钟;h或hr=小时;aa=氨基酸;kb=千碱基;nt=核苷酸;pg=皮克;ng=纳克;μg=微克;mg=毫克;g=克;kg=公斤;dl或dL=分升;μl或μL=微升;ml或mL=毫升;l或L=升;μM=微摩尔;mM=毫摩尔;M=摩尔;kDa的=千道尔顿;i.m.=肌内;i.p.=腹膜内;SC或SQ=皮下;QD=每日一次;BID=每日两次;QW=每周一次;QM=每月一次;HPLC=高效液相色谱;BW=体重;U=单位;ns=不具有统计学显著性;PBS=磷酸盐缓冲盐水;PCR=聚合酶链式反应;NHS=N-羟基琥珀酰亚胺;HSA=人血清白蛋白;MSA=小鼠血清白蛋白;DMEM=达尔伯克氏改良伊格尔氏培养基;GC=基因组拷贝;EDTA=乙二胺四乙酸;APOL8=载脂蛋白L8;APOA2=载脂蛋白A-II;PCSK9=9型前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶/kexin;CYP7A1=细胞色素P4507A1、胆固醇7α-羟化酶或胆固醇7-α-单加氧酶;ABCG1=ATP结合盒亚家族G成员1;CRP=C-反应性蛋白;MSR1=巨噬细胞清道夫受体1。
材料和方法
使用以下一般材料和方法,在指定情况下或可用于以下实施例:
分子生物学中的标准方法描述于科学文献(参见,例如,Sambrook和Russell(2001)MolecularCloning,第3版,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,N.Y.;和Ausubel等(2001)CurrentProtocolsinMolecularBiology,第1-4卷,JohnWileyandSons,Inc.NewYork,N.Y.(其描述了细菌细胞中的克隆和DNA诱变(第1卷)、哺乳动物细胞和酵母中的克隆(第2卷)、糖缀合物和蛋白质表达(第3卷)以及生物信息学(第4卷))中。
所述科学文献描述了用于蛋白质纯化的方法,包括免疫沉淀、层析、电泳、离心和结晶,以及化学分析、化学修饰、翻译后修饰、融合蛋白的产生以及蛋白质的糖基化(参见,例如,Coligan等(2000),CurrentProtocolsinProteinScience,第1-2卷,JohnWileyandSons,Inc.,NY)。
描述了多克隆和单克隆抗体的制备、纯化和片段化(例如,Harlow和Lane(1999)UsingAntibodies,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY);用于表征配体/受体相互作用的标准技术是可获得的(参见,例如,Coligan等(2001)CurrentProtocolsinImmunology,第4卷,JohnWiley,Inc.,NY);用于流式细胞术,包括荧光激活细胞分选(FACS)的方法是可获得的(参见,例如,Shapiro(2003)PracticalFlowCytometry,JohnWileyandSons,Hoboken,NJ);并且适合于修饰核酸(包括核酸引物和探针)、多肽和抗体以用作例如诊断试剂的荧光试剂是可获得的(MolecularProbes(2003)Catalogue,MolecularProbes,Inc.,Eugene,OR.;Sigma-Aldrich(2003)Catalogue,St.Louis,MO.)。
用于确定例如抗原片段、前导序列、蛋白质折叠、功能结构域、糖基化位点和序列比对的软件包和数据库是可获得的(参见,例如,GCGWisconsinPackage(Accelrys,Inc.,SanDiego,CA);和DeCypherTM(TimeLogicCorp.,CrystalBay,NV)。
可通过本领域中使用的标准方法测定血清IL-10浓度水平和暴露水平。例如,可通过将全血(~50μl/小鼠)从小鼠尾剪断物收集至扁平毛细管中,通过离心分离血清和血细胞,以及通过标准ELISA试剂盒和技术测定IL-10暴露水平来进行血清暴露水平测定。
LDLR-/-小鼠获自TheJacksonLab(BarHarbor,ME)。此类小鼠具有200-400mg/dl的升高的血清胆固醇水平,并且当喂食高脂肪膳食时它们的胆固醇水平超过>2,000mg/dl。小鼠中的正常血清胆固醇为80-100mg/dl。
在尸检时从小鼠切取肝脏,并且将其快速冷冻以用于随后的分析。通过标准SybrGreen方案(参见,例如,LifeTechnologiesCorp.,GrandIsland,NY)将肝组织用于qPCR分析。
通过相对定量来测定标准化的mRNA单位,由此可基于参照样品中的基因表达来计算样品中基因表达的变化。
使用直接测量LDL水平的胆固醇测试,并且所述测试是商购可得的(例如,BeckmanCoulter,Inc;Brea,CA:AUSystemLDL-CholesterolTest)。用于测量血清总胆固醇的常规试验(其通常使用比色测定系统)非常廉价并且是广泛可用的(例如,Sigma-Aldrich,St.Louis,MO;BioVision,Inc.,Milpitas,CA)。
专利文献(例如,US2011/0250163)中所述的单-/二-PEG-IL-10混合物用于下述实施例中。两个示例性合成方案如下:
示例性方案第1号。将IL-10(例如,啮齿类动物或灵长类动物)针对50mM磷酸钠、100mM氯化钠(pH范围5-7.4)进行透析。在0.75-30mM氰基硼氢化钠存在的情况下将1:1-1:7摩尔比的5kDaPEG-丙醛与浓度为1-12mg/mL的IL-10反应。或者,可以以类似的方式用甲基吡啶硼烷活化反应。将反应在5-30℃孵育3-24小时。将聚乙二醇化反应的pH调节至6.3,并将7.5mg/mLhIL-10与PEG反应以产生1:3.5的IL-10对PEG接头的比率。氰基硼氢化物的终浓度为约25mM,并且在15℃下进行该反应12-15小时。所述单-和二-PEGIL-10是该反应的最大产物,结束时每一种的浓度为约50%。可使用氨基酸诸如甘氨酸或赖氨酸或可选择地Tris缓冲液来淬灭该反应。可使用多种纯化方法,诸如凝胶过滤、阴离子和阳离子交换层析以及尺寸排阻HPLC(SE-HPLC)来分离所需的聚乙二醇化IL-10分子。
示例性方案第2号。将IL-10针对10mM磷酸钠pH7.0、100mMNaCl进行透析。使用透析缓冲液将经透析的IL-10稀释3.2倍至约0.5至12mg/mL的浓度。在添加接头之前,将SC-PEG-12kDa(DelmarScientificLaboratories,Maywood,Ill.)和一个体积的100mM四硼酸钠pH9.1添加至9个体积的稀释的IL-10中,以将IL-10溶液的pH值升至8.6。将SC-PEG-12K接头溶解在透析缓冲液中,并将适当体积的接头溶液(1.8至3.6摩尔接头/摩尔的IL-10)添加至稀释的IL-10溶液以引发聚乙二醇化反应。在5℃进行该反应以控制速率,并且轻轻搅拌反应溶液。当单-PEG-IL-10的产量(如通过尺寸排阻HPLC(SE-HPLC)测定的)接近40%时,通过添加1M甘氨酸溶液至30mM的终浓度来终止反应。使用HCl溶液将反应溶液的pH缓慢地调节至7.0,并将反应物进行0.2微米过滤并于-80℃储存。
在含有0.05%MSA的10mMHEPES,pH6.5、100mMNaCl中以0.75-1.0mg/mL配制PEG-IL-10。对照(安慰剂)=无PEG-IL-10的同一制剂基质。
免疫组织化学
苦味酸天狼猩红(PicosiriusRed)染色:将载玻片在烘箱中于60℃下加热45分钟;使用二甲苯和一系列酒精进行脱蜡;于水中进行再水合;按照制造商的说明书在新鲜制备的苦味酸天狼猩红溶液中保持60分钟;并在酸化水中经历两次洗涤。用Weigert苏木精对细胞核染色8-10分钟,在三次更换100%乙醇中进行脱水,清洁和固定。
抗-F4/80、抗-Msr1、PCNA和Sca1:用10%中性缓冲的甲醛固定肝组织,并将其包埋在石蜡中。将组织样本切成5μm厚的切片,将切片在二甲苯中进行脱蜡,并在梯度系列的醇溶液(100%、95%、80%、70%、50%;3次更换,每次5分钟)中进行水合。将载玻片上的组织经历热诱导的表位修复(epitoperetrieval)(在98℃下10mmol/L柠檬酸钠缓冲液进行20分钟),然后用3%H2O2处理以淬灭内源性过氧化物酶。将切片在室温下于封闭溶液(5%中性山羊血清)中孵育1小时。将选择的第一抗体施用至载玻片,并于4℃下于湿室中孵育过夜。然后将第二生物素化的抗体以1:250的稀释度(VectorLab;Burlingame,CA)施用,随后用链霉抗生物素蛋白过氧化物酶孵育。在每一个步骤后用PBS洗涤切片3次。用DAB底物对切片进行染色,并用Mayer苏木精复染2分钟。在三次更换100%乙醇中对载玻片进行脱水,清洁和固定。
图像定量:为了将PEG-rMuIL-10处理的肝与媒介物处理的肝进行比较分析,随机选择每组2-5只小鼠,并用天狼猩红(SiriusRed)(PolyscienceInc.;Warrington,PA)、抗-PCNA(Abcam;Cambridge,MA)、苏木精(AmericanMasterTech;Lodi,CA)、抗-Msr1(Abcam)、抗-F4/80(Abcam)和Sca1(Abcam)对其进行染色。对于每一个肝脏,使用20x物镜收集8-10张独立的图像。随后使用MetaMorphImaging软件(MolecularDevices;Sunnyvale,CA),通过对代表性视野施加颜色阈值和调整像素分布以与阳性信号对应来分析信号的平均面积。所有图像都用20X物镜获取。
图中的条棒代表数据点的中位值。
实施例1
PEG-IL-10对脂质项的作用
PEG-rmIL-10暴露对脂质项的作用-在被喂食高脂肪膳食的LDLR-/-小鼠中测定相关参数。每日皮下向4个组(10只小鼠/组)施用1mg/kg、0.2mg/kg或0.02mg/kg的PEG-rmIL-10或媒介物对照一次,持续14天,随后测定血清总胆固醇、甘油三酯、LDL、HDL和LDL/HDL比率。
参考图2,胆固醇(图2A)、甘油三酯(图2B)和LDL(图2C)的水平在PEG-rmIL-10的每一个剂量上相较于媒介物均显著降低。更具体地,相对于媒介物对照,1mg/kg、0.2mg/kg和0.02mg/kg的PEG-rmIL-10使血清总胆固醇分别下降约68%、67%和45%(图2A);使血清甘油三酯分别下降约53%、61%和51%(图2B);以及使血清LDL分别下降约75%、75%和49%(图2C)。
有趣的是,血清总胆固醇和血清LDL的下降在接受1mg/kgPEG-rmIL-10和0.2mg/kgPEG-rmIL-10的动物的组中基本上相同。虽然为了实践本公开,不一定要理解该效应发生的原因,但据信是因高于特定IL-10血清浓度的胆固醇内化成胶束而引起;因此,当比较两个剂量时,存在标称增量的胆固醇和LDL降低。这些剂量-递增的结果表明,有可能在低于可能与严重的不利有害作用相关的剂量的聚乙二醇化IL-10的剂量下实现胆固醇、甘油三酯和LDL的治疗相关减少。
如图2D中所示,当与媒介物对照相比较时,递增剂量的PEG-rmIL-10导致递减的HDL水平(0.02mg/kg=15%;0.2mg/kg=26%;且1mg/kg=32%)。0.2mg/kg与1mg/kg剂量之间相较于0.02mg/kg与0.2mg/kg剂量之间的更小HDL降低可能至少部分地归因于如上所示的相同的胶束解释。如先前所论述的,HDL(所谓的“好的胆固醇”)的降低可能被视为不利的;然而,关键意见领袖认为,HDL的减少的不良作用可能在具有极高胆固醇水平的受试者中更加重要。参考图2E,相较于媒介物对照,LDL/HDL比率减小41%(0.02mg/kg)、66%(0.2mg/kg)和56%(1mg/kg)。由于较大的比率减小是优选的,因此这些数据表明PEG-rmIL-10的0.2mg/kg剂量比1mg/kg剂量更有益。
总之,这些数据表明,在小鼠中为了达到最佳治疗作用而超过约0.2mg/kg的PEG-IL-10剂量是不必要的。因此,可避免对于较高剂量观察到的更严重的不良作用(例如,肝毒性)。将鼠剂量转换成人剂量应当导致可比较的结果。
实施例2
PEG-IL-10对胆固醇合成的调节剂的作用
为了评估PEG-rmIL-10在胆固醇合成中的作用机制,给LDLR-/-小鼠喂食高脂肪西方饮食4周。在第3周和第4周期间,每日皮下向小鼠施用PEG-rmIL-10(1mg/kg;0.2mg/kg;或0.02mg/kg)或媒介物对照(4个组的每一个组有10只小鼠)一次,随后分析肝的一小组参与胆固醇合成途径(甲羟戊酸途径)的基因的表达。
以下肝酶的表达水平相对于用作对照的HMG-CoA还原酶被下调至至多1/2(数据未显示):HMG-CoA合酶;磷酸甲羟戊酸激酶;法尼基二磷酸合酶;和NAD(P)-依赖性类固醇脱氢酶。被评估的其它肝酶的表达水平展示低于两倍阈值的变化(数据未显示)。
这些结果表明IL-10在胆固醇合成途径中影响多个酶促步骤。
实施例3
PEG-IL-10对胆固醇调节剂的作用
为了评估PEG-rmIL-10对胆汁酸合成(CYP7A1)、细胞内胆固醇运输(APOL8)和胆固醇流出(ABCG1)的调节剂的作用,给LDLR-/-小鼠喂食高脂肪西方饮食4周。在第3周和第4周期间,每日皮下向小鼠施用PEG-rmIL-10(1mg/kg;0.2mg/kg;或0.02mg/kg)或媒介物对照(4个组的每一个组中10只小鼠),随后评估CYP7A1、APOL8和ABCG1在肝中的信息表达。
CYP7A1,即氧化胆固醇的细胞色素P450血红素酶,是从胆固醇合成胆汁酸中的限速酶,催化7-α-羟基胆固醇的形成。CYP7A1有时称为胆汁酸合酶基因。当血浆胆固醇水平低时,CYP7A1被固醇调节元件结合蛋白(SREBP)下调。相反地,当胆固醇(更具体地,氧甾醇)水平高时,其被核受体LXR(肝X受体)上调,并且该上调增加胆汁酸的产生并降低肝细胞中的胆固醇的水平。如图3A中所指示的,0.2mg/kg和0.02mg/kgPEG-rmIL-10增加CYP7A1的信息表达,这表明存在增加的胆固醇从肝的流出。
有趣的是,1.0mg/kg的PEG-rmIL-10剂量对CYP7A1的信息表达基本上没有影响。该结果的一个可能解释涉及针对CYP7A1的IL-1b与IL-10之间的相互作用。已报道,IL-1b可降低在肝中的CYP7A1的表达水平(参见Feingold等,J.LipidRes.(1996)37:223-28)。当施用高剂量的PEG-IL-10以抵抗高血清胆固醇浓度时,IL-1b表达显著增强。IL-1bmRNA和(可能地)蛋白质的高水平被认为是限制CYP7A1的表达的反馈,从而导致极少的(如果有的话)对胆固醇流出的作用。
APOL8属于HDL家族并在胆固醇运输中发挥中心作用。递增剂量的PEG-rmIL-10与APOL8的递增信息表达相关(图3B),从而导致较大的细胞内胆固醇运输和从而更多可用于流出的底物。
图3C描绘了PEG-rmIL-10对ABCG1的作用,所述ABCG1参与巨噬细胞的胆固醇和磷脂的运输,并且可调节其它细胞类型中的细胞脂质动态平衡。ABCG1是参与制备胆固醇以作为胆汁盐从肝除去的流出分子。图3C中的数据表明,较高剂量的PEG-rmIL-10与ABCG1信息表达的增加相关,这反过来又与血清胆固醇的减少相关。
实施例4
PEG-IL-10对LDL和HDL调节的作用
为了评估PEG-rmIL-10对LDL(PCSK9)和HDL(APOA2)的调节剂的作用,给LDLR-/-小鼠喂食高脂肪西方饮食4周。在第3周和第4周期间,每日皮下向小鼠施用PEG-rmIL-10(1mg/kg;0.2mg/kg;或0.02mg/kg)或媒介物对照(4个组的每一个组中10只小鼠),随后评估PCSK9和APOA2在肝中的信息表达。
PCSK9在胆固醇动态平衡中起着主要调节作用。如本文中所论述的,当LDL胆固醇结合肝细胞表面上的LDL受体(LDLR)时,LDL胆固醇从血液移除并被细胞吸收。PCSK9结合LDLR的表皮生长因子样重复序列A(EGF-A)结构域,诱导LDLR降解,这反过来减少LDL的代谢,从而导致高胆固醇血症。因此,如果PCSK9不结合,则该受体可返回至细胞表面,并除去更多的胆固醇。阻断PCSK9的试剂可降低胆固醇,并处于开发中。如图4A中所示,PEG-rmIL-10下调PCSK9的信息表达。由于敲除小鼠缺乏LDL受体,因此这些数据表明,PEG-IL-10以非PCSK9依赖性方式(即,胆固醇的聚乙二醇化IL-10的减少不依赖于PCSK9的调节)急剧降低胆固醇。
PEG-rmIL-10至敲除小鼠的施用也导致HDL颗粒蛋白APOA2的信息表达减少(图4B)。参与HDL构建的APOA2是高密度脂蛋白颗粒的第二最丰富的蛋白质。因此,因PEG-IL-10的施用导致的APOA2信息表达的减少通过HDL的减少促成高胆固醇血症。然而,如本文其它地方所论述的,聚乙二醇化IL-10对LDL的有益作用大大超过因HDL减少而引起的任何不太有利的作用;当将聚乙二醇化IL-10与具有不同作用机制的另一种试剂组合施用时,这尤其如此。
实施例5
PEG-IL-10对炎症调节剂的作用
为了评估PEG-rmIL-10对CRP的调节的作用,给LDLR-/-小鼠喂食高脂肪西方饮食4周。在第3周和第4周期间,每日皮下向小鼠施用PEG-rmIL-10(1mg/kg;0.2mg/kg;或0.02mg/kg)或媒介物对照(4组的每一组中有10只小鼠),随后评估CRP在肝中的信息表达。
CRP是急性期反应物的种类的成员,因为在体内其水平在炎症过程急剧上升。其被认为帮助补体结合外来和受损的细胞,并且增强巨噬细胞的吞噬作用,所述巨噬细胞表达CRP的受体。CRP也被认为在先天免疫中作为抗感染的早期防御系统起作用。高水平的CRP与心血管危险相关,这主要归因于其炎性和动脉粥样硬化作用。因此,对于聚乙二醇化IL-10施用看到的CRP信息表达的减少(图5)暗示其心脏保护作用。
实施例6
PEG-IL-10对胆固醇摄取的调节剂的作用
为了评估PEG-rmIL-10对MSR1和MARCO(胆固醇摄取的调节剂)的作用,给LDLR-/-小鼠喂食高脂肪西方饮食4周。在第3周和第4周期间,每日皮下向小鼠施用PEG-rmIL-10(1mg/kg;0.2mg/kg;或0.02mg/kg)或媒介物对照(4个组的每一个组中有10小鼠),随后评估MSR1和MARCO在肝中的信息表达。
MSR1,也称为SR-A1(清道夫受体-A1)和CD204(分化簇204),和MARCO(巨噬细胞受体,也称为SR-A2(清道夫受体A-2))是介导LDL的内吞作用,从而参与胆固醇摄取的清道夫受体。在施用聚乙二醇化IL-10后观察到两种清道夫受体–MSR1(图6A)和MARCO(图6B)的增加的信息表达。此类增加的表达与增强的胆固醇摄取相关,MSR1和MARCO与使高胆固醇血症正常化相关。
实施例7
吞噬细胞耗竭对PEG-rMuIL-10诱发的胆固醇减少的作用
评估髓系内的吞噬细胞与血浆胆固醇的PEG-rMuIL-10的控制之间的关系。标准技术被用于通过在PEG-rMuIL-10存在或不存在的情况下用氯膦酸盐脂质体给动物给药来除去吞噬细胞。最初,通过利用F4/80的IHC检测来确认肝中的吞噬细胞的完全耗竭。通过TUNELIHC(无凋亡细胞的增加;数据未显示)和H&E(无组织形态学或细胞组织的变化;数据未显示)确认肝细胞健康,以确保肝细胞不受氯膦酸盐影响。
在给药前使野生型和LDLR-/-C57BL/6小鼠(7-8周龄)维持正常食物或喂食高脂肪西方饮食2周。每日皮下施用PEG-rMuIL-10(1mg/kg)或媒介物(10mMHEPES、100mMNaCl,pH6.5,0.05%小鼠血清白蛋白)一次,持续1至2周。使小鼠在整个给药期间维持它们各自的饮食。为了进行氯膦酸盐耗竭研究,始于PEG-rMuIL-10给药前一天,每3天(第一剂量:0.2mL,随后剂量:0.1mL)一次用悬浮在1×PBS中的氯膦酸盐脂质体(5mg/mL氯膦酸盐;Cl)或媒介物脂质体(Li)对小鼠进行静脉内给药。
图7中的图A描绘在用HEPES/脂质体、HEPES/氯膦酸盐、PEG-rMuIL-10/脂质体和PEG-rMuIL-10/氯膦酸盐处理7天后喂食高脂肪膳食的LDLR-/-小鼠中的血浆总胆固醇。图7中的图D描绘利用脂质体或氯膦酸盐处理24小时的喂食高脂肪膳食的野生型小鼠中的血浆总胆固醇。图7中的图C描绘利用脂质体或氯膦酸盐处理24小时的喂食正常食物的LDLR-/-小鼠中的血浆总胆固醇。图7中的图B描绘利用脂质体或氯膦酸盐处理24小时的野生型小鼠的血浆总胆固醇。图7中的图E描绘在用于产生图7中的图A中的数据的小鼠的14天处理后的血浆总胆固醇。
参考图7中的图A,吞噬细胞的耗竭消除了血浆胆固醇的PEG-rMuIL-10的调节。预料之外地,仅氯膦酸盐就引起45%的血浆总胆固醇的增加。喂食正常食物的野生型和LDLR-/-小鼠(图7中的图B和C)和喂食高脂肪膳食的野生型小鼠(图7中的图D)中的吞噬细胞的耗竭导致持续增加的血浆胆固醇,这表明吞噬细胞参与血浆胆固醇的正常调节。图7中的图E显示,肝枯否细胞的再生伴随着血浆胆固醇的减少。此外,PEG-rMuIL-10给药似乎加速所述枯否细胞使组织再生的速率。
实施例8
PEG-rMuIL-10对髓系细胞清除的作用
在体外用PEG-rHuIL-10处理人外周血单核细胞、人外周血巨噬细胞、人枯否细胞和人肝细胞,以确定响应PEG-rHuIL-10的肝细胞。
参考图8中的图A-D,在暴露于10ng/mLPEG-rHuIL-1024小时后分析1×105-1×106个细胞的MSR1、MARCO、SCARB1、SCARB2和CD36的表达。图8中的图A-D描绘了人外周血单核细胞(图8中的图A)、人外周血巨噬细胞(图8中的图B)、人枯否细胞(图8中的图C)和人肝细胞(图8中的图D)的清道夫受体表达分析。图8中的图A-D中的数据代表三个独立实验。清道夫受体表达仅在枯否细胞和外周血单核细胞(参见图8中的图A-D)中得以增加。当在cRPMI培养基中暴露于50ng/mLM-CSF7天时,外周血单核细胞分化为巨噬细胞。清道夫受体调节在小鼠与人之间似乎相似(数据未显示),这表明关于对髓室的作用的IL-10的生物学的保守性。
随后确定增加的清道夫受体的表达是否与增强的脂蛋白的摄取相关。参考图8中的图E-H,将细胞暴露于对照(w/o)和PEG-rHuIL-10(10ng/mL)24小时,4-5小时后评估总摄取。在图8中的图E-H的数据代表3-10个独立的实验。还指示了来自未暴露于LDL的任何形式的细胞的背景(b.g)平均荧光强度(M.F.I)。[*p<0.05,***p<0.001]。图8中的图E-H描绘了人单核细胞(图8中的图E)、人巨噬细胞(图8中的图F)、人枯否细胞(图8中的图G)和人肝细胞(图8中的图H)的LDL、Ac-LDL和Ox-LDL摄取的定量。如图8E中所示,PEG-rHuIL-10增加新分离的外周血单核细胞对Ac和Ox-LDL但非LDL的摄取。参考图8中的图F,M-CSF-分化的巨噬细胞不响应于PEG-rHuIL-10,然而PEG-rHuIL-10增加LDL但非Ac-LDL或Ox-LDL的枯否细胞摄取(图8中的图G)。LDL、Ox-LDL和Ac-LDL的肝细胞摄取未响应PEG-rHuIL-10而改变(图8中的图H)。虽然髓系细胞通常是吞噬细胞,但这些数据表明,胆固醇摄取的性质在单核细胞、巨噬细胞、枯否细胞和肝细胞对PEG-rHuIL-10的响应之间不同。
图8中的图I和J描绘甘露糖对Ac-LDL(图8中的图I)和Ox-LDL(图8中的图J)的摄取的抑制作用。在与Ox-LDL和Ac-LDL共孵育之前,将细胞预先暴露于100mM甘露糖。将细胞暴露于对照w/o)和PEG-rHuIL-10(10ng/mL)24小时,在4-5小时后评估总摄取。图8I和J中的数据代表3-10个独立实验。还指示了来自未暴露于LDL的任何形式的细胞的背景(b.g)平均荧光强度(M.F.I)。[*p<0.05,***p<0.001]。参考图8I和J,甘露糖抑制单核细胞对Ac-LDL但非Ox-LDL摄取的PEG-rHuIL-10的增加。这些数据表明,脂蛋白摄取的PEG-rHuIL-10的控制是通过已知和可能未知的清道夫受体调节。
实施例9
癌症患者中的胆固醇的调节
在用PEG-rHuIL-10治疗的癌症患者中测量血浆总胆固醇。使完全同意的患者经历由经培训的放血者在IRB批准的方案(FDA研究ID#NCT02009449)下进行的每周外周血收集。按照标准方法由本地临床实验室进行血清胆固醇定量。
训练患者自我腹部注入PEG-rHuIL-10。每日以2.5μg/kg(n=4)或5μg/kg(n=4)向患者皮下施用PEG-rHuIL-10一次。给患者给药,持续15至28天。参考图9A和9B,PEG-rHuIL-10不影响具有低血浆胆固醇(约100mg/dL)的患者,然而具有约140mg/dL的初始血浆胆固醇的患者表现出在PEG-rHuIL-10施用后血浆胆固醇降低至约100mg/dL。140mg/dL或以下的水平与无心血管事件的终生风险相一致。图9A和B中的曲线图上的每一条线代表单个患者。
这些数据表明PEG-rHuIL-10仅在高胆固醇血症患者中调节胆固醇。
本文描述了本发明的具体实施方案,包括本发明人已知的用于进行本发明的最佳模式。在阅读前述描述后,所公开的实施方案的变型对于在本领域中工作的个体可变得显然易见,并且预期本领域技术人员可视情况而定使用此类变型。因此,本发明旨在以不同于本文具体描述的方式来实施,并且本发明包括由适用的法律允许的附于其的权利要求中所引述的所有主题的所有修改和等效物。此外,除非在本文中另有说明或另外地根据上下文明显矛盾,否则所有可能的其变型中的上述元素的任何组合涵盖在本发明中。
本说明书中引述的所有出版物、专利申请、登录号和其它参考文献通过引用并入本文,就如同每一个单独的出版物或专利申请被具体地和单独地指出通过引用并入本文一样。
Claims (68)
1.一种治疗或预防受试者中的疾病、病症或病状的方法,所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的IL-10试剂,其中所述量足以实现1pg/mL至10.0ng/mL的平均IL-10血清谷浓度;并且
其中所述疾病病症或病状为a)心血管病症、b)血栓性病症,或c)炎性病症。
2.一种治疗或预防受试者中的疾病、病症或病状的方法,所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的IL-10试剂,其中所述量足以在一段时间内维持平均IL-10血清谷浓度;
其中所述疾病病症或病状为a)心血管病症、b)血栓性病症,或c)炎性病症;
其中所述平均IL-10血清谷浓度为1.0pg/mL至10.0ng/mL;并且
其中将所述平均IL-10血清谷浓度维持至少95%的所述一段时间。
3.根据权利要求2所述的方法,其中所述平均IL-10血清谷浓度在1.0pg/mL至100pg/mL的范围内。
4.根据权利要求2所述的方法,其中所述平均IL-10血清谷浓度在0.1ng/mL至1.0ng/mL的范围内。
5.根据权利要求2所述的方法,其中所述平均IL-10血清谷浓度在1.0ng/mL至10ng/mL的范围内。
6.根据权利要求2所述的方法,其中所述平均IL-10血清谷浓度在0.5ng/mL至5.0ng/mL的范围内。
7.根据权利要求2所述的方法,其中所述平均IL-10血清谷浓度在0.75ng/mL至1.25ng/mL的范围内。
8.根据权利要求2所述的方法,其中所述平均IL-10血清谷浓度在0.9ng/mL至1.1ng/mL的范围内。
9.根据权利要求2所述的方法,其中所述一段时间为至少12小时。
10.根据权利要求9所述的方法,其中所述一段时间为至少24小时。
11.根据权利要求10所述的方法,其中所述一段时间为至少48小时。
12.根据权利要求11所述的方法,其中所述一段时间为至少72小时。
13.根据权利要求12所述的方法,其中所述一段时间为至少1周。
14.根据权利要求13所述的方法,其中所述一段时间为至少2周。
15.根据权利要求14所述的方法,其中所述一段时间为至少1个月。
16.根据权利要求2-15中任一项所述的方法,其中将所述平均IL-10血清谷浓度维持至少97%的所述一段时间。
17.根据权利要求16所述的方法,其中将所述平均IL-10血清谷浓度维持至少99%的所述一段时间。
18.根据权利要求17所述的方法,其中将所述平均IL-10血清谷浓度维持100%的所述一段时间。
19.根据权利要求1-18中任一项所述的方法,其中所述IL-10试剂为成熟人IL-10。
20.根据权利要求1-18中任一项所述的方法,其中所述IL-10试剂为成熟人IL-10的变体,并且其中所述变体表现与所述成熟人IL-10的活性相当的活性。
21.根据权利要求1-18中任一项所述的方法,其中所述疾病、病症或病状为血栓性病症。
22.根据权利要求21所述的方法,其中所述血栓性病症引起中风或心肌梗塞。
23.根据权利要求1-18中任一项所述的方法,其中所述疾病、病症或病状为炎性病症。
24.根据权利要求23所述的方法,其中所述炎性病症为脉管炎。
25.根据权利要求1-18中任一项所述的方法,其中所述疾病、病症或病状为心血管病症。
26.根据权利要求25所述的方法,其中所述心血管病症为动脉粥样硬化。
27.根据权利要求25或26所述的方法,其中所述受试者具有高胆固醇血症或脂血症。
28.根据权利要求25所述的方法,其中所述心血管病症为心肌病。
29.根据权利要求25所述的方法,其中所述心血管病症为高血压病症。
30.根据权利要求1-29中任一项所述的方法,其中所述IL-10试剂包含至少一个修饰来形成经修饰的IL-10试剂,其中所述修饰不改变所述IL-10试剂的氨基酸序列。
31.根据权利要求30所述的方法,其中所述经修饰的IL-10试剂为PEG-IL-10试剂。
32.根据权利要求31所述的方法,其中所述PEG-IL-10试剂包含至少一个共价附接于IL-10的至少一个亚单位的至少一个氨基酸残基的PEG分子。
33.根据权利要求31或32所述的方法,其中所述PEG-IL-10试剂包含单-聚乙二醇化和二-聚乙二醇化IL-10的混合物。
34.根据权利要求31-33中任一项所述的方法,其中所述PEG-IL-10试剂的PEG组分具有约5kDa至约20kD的分子质量。
35.根据权利要求31-33中任一项所述的方法,其中所述PEG-IL-10试剂的PEG组分具有大于约20kD的分子质量。
36.根据权利要求31-33中任一项所述的方法,其中所述PEG-IL-10试剂的PEG组分具有至少约30kD的分子质量。
37.根据权利要求30所述的方法,其中所述经修饰的IL-10试剂为Fc融合分子。
38.根据权利要求30所述的方法,其中所述经修饰的IL-10试剂包含血清白蛋白或白蛋白结合结构域(ABD)。
39.根据权利要求30所述的方法,其中所述经修饰的IL-10试剂被糖基化或羟乙基化。
40.根据权利要求30-39中任一项所述的方法,其中所述修饰是位点特异性的。
41.根据权利要求30-36和38-40中任一项所述的方法,其中所述修饰包含接头。
42.根据权利要求1-41中任一项所述的方法,其中每日向所述受试者施用所述IL-10试剂至少两次。
43.根据权利要求1-41中任一项所述的方法,其中每日向所述受试者施用所述IL-10试剂至少一次。
44.根据权利要求1-41中任一项所述的方法,其中每48小时向所述受试者施用所述IL-10试剂至少一次。
45.根据权利要求1-41中任一项所述的方法,其中每72小时向所述受试者施用所述IL-10试剂至少一次。
46.根据权利要求1-41中任一项所述的方法,其中每周向所述受试者施用所述IL-10试剂至少一次。
47.根据权利要求1-41中任一项所述的方法,其中每2周向所述受试者施用所述IL-10试剂至少一次。
48.根据权利要求1-41中任一项所述的方法,其中每月向所述受试者施用所述IL-10试剂至少一次。
49.根据权利要求1-48中任一项所述的方法,所述方法还包括施用与所述IL-10试剂组合的至少一种另外的预防剂或治疗剂。
50.根据权利要求49所述的方法,其中所述预防剂或治疗剂为胆固醇动态平衡剂。
51.根据权利要求50所述的方法,其中所述胆固醇动态平衡剂包含他汀类、胆汁酸树脂、依泽替米贝、纤维酸、烟酸或PCSK9抑制剂。
52.根据权利要求49所述的方法,其中所述预防剂或治疗剂为抗糖尿病剂或抗肥胖剂。
53.根据权利要求49所述的方法,其中所述预防剂或治疗剂为免疫剂或抗炎剂。
54.根据权利要求1-53中任一项所述的方法,其中所述受试者为人。
55.根据权利要求1-54中任一项所述的方法,其中所述施用是通过肠胃外注射。
56.根据权利要求55所述的方法,其中所述肠胃外注射为皮下注射。
57.一种药物组合物,所述组合物包含药学上有效量的权利要求1-56中任一项的IL-10试剂和药学上可接受的稀释剂、载体或赋形剂。
58.根据权利要求57所述的药物组合物,其中所述赋形剂为等渗注射溶液。
59.根据权利要求57所述的药物组合物,其中所述组合物适合用于人施用。
60.根据权利要求57-59中任一项所述的药物组合物,所述组合物还包含至少一种另外的预防剂或治疗剂。
61.根据权利要求60所述的药物组合物,其中所述预防剂或治疗剂为胆固醇动态平衡剂。
62.根据权利要求61所述的药物组合物,其中所述胆固醇动态平衡剂包含他汀类、胆汁酸树脂、依泽替米贝、纤维酸、烟酸或PCSK9抑制剂。
63.根据权利要求60所述的药物组合物,其中所述预防剂或治疗剂为抗糖尿病剂或抗肥胖剂。
64.根据权利要求60所述的药物组合物,其中所述预防剂或治疗剂为免疫剂或抗炎剂。
65.一种无菌容器,所述无菌容器包含权利要求57-64中任一项的药物组合物。
66.根据权利要求65所述的无菌容器,其中所述无菌容器为注射器。
67.一种试剂盒,所述试剂盒包含权利要求66的无菌容器。
68.根据权利要求67所述的试剂盒,所述试剂盒还包含含有至少一种另外的预防剂或治疗剂的第二无菌容器。
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---|---|---|---|---|
WO2015070060A1 (en) | 2013-11-11 | 2015-05-14 | Armo Biosciences, Inc. | Methods of using interleukin-10 for treating diseases and disorders |
US10293043B2 (en) | 2014-06-02 | 2019-05-21 | Armo Biosciences, Inc. | Methods of lowering serum cholesterol |
AU2015336101A1 (en) | 2014-10-22 | 2017-04-20 | Armo Biosciences, Inc. | Methods of using interleukin-10 for treating diseases and disorders |
US10618970B2 (en) | 2015-02-03 | 2020-04-14 | Armo Biosciences, Inc. | Method of treating cancer with IL-10 and antibodies that induce ADCC |
EP3302547A1 (en) | 2015-05-28 | 2018-04-11 | Armo Biosciences, Inc. | Pegylated interleukin-10 for use in treating cancer |
EP3341012A4 (en) | 2015-08-25 | 2019-03-20 | Armo Biosciences, Inc. | METHOD FOR USE OF INTERLEUKIN-10 FOR THE TREATMENT OF ILLNESSES AND SUFFERING |
US11136362B2 (en) * | 2016-03-10 | 2021-10-05 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Peptide modulators of specific calcineurin protein-protein interactions |
CA3204162A1 (en) | 2021-01-11 | 2022-07-14 | Robert Kastelein | Compositions and methods related to receptor pairing |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5945097A (en) * | 1996-09-06 | 1999-08-31 | Schering Corporation | Method for lowering cholesterol levels with interleukin-10 |
CN102256625A (zh) * | 2008-12-17 | 2011-11-23 | 先灵公司 | 单和双peg il10的生产和用途 |
Family Cites Families (105)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS63152393A (ja) | 1986-07-03 | 1988-06-24 | Takeda Chem Ind Ltd | グリコシル誘導体 |
US6217857B1 (en) | 1989-06-28 | 2001-04-17 | Schering Corporation | Cytokine synthesis inhibitory factor (IL-10) and pharmaceutical compositions thereof |
US5231012A (en) | 1989-06-28 | 1993-07-27 | Schering Corporation | Nucleic acids encoding cytokine synthesis inhibitory factor (interleukin-10) |
US5252714A (en) | 1990-11-28 | 1993-10-12 | The University Of Alabama In Huntsville | Preparation and use of polyethylene glycol propionaldehyde |
DK0567586T3 (da) | 1991-01-16 | 1995-12-04 | Schering Corp | Anvendelse af interleukin-10 ved adoptiv immunterapi af cancer |
CA2100553A1 (en) | 1991-01-16 | 1992-07-17 | Paulo J. M. Vieira | Treatment of neoplastic disease with interleukin-10 |
US5624823A (en) | 1991-11-22 | 1997-04-29 | The General Hospital Corporation | DNA encoding procine interleukin-10 |
FR2686899B1 (fr) | 1992-01-31 | 1995-09-01 | Rhone Poulenc Rorer Sa | Nouveaux polypeptides biologiquement actifs, leur preparation et compositions pharmaceutiques les contenant. |
HU220103B (hu) | 1992-08-20 | 2001-10-28 | Schering-Plough Corp. | IL-10 új alkalmazása |
EP0681589A1 (en) | 1993-02-01 | 1995-11-15 | Université Libre de Bruxelles | Use of a pharmaceutical composition comprising an effective amount of interleukin-10, an analog and/or an agonist of interleukin-10 |
US5328989A (en) | 1993-03-05 | 1994-07-12 | Schering-Plough | Purification of human interleukin-10 from a cell culture medium |
US5665345A (en) | 1993-05-24 | 1997-09-09 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Methods of inhibiting viral replication using IL-10 |
ZA945434B (en) | 1993-07-26 | 1995-01-23 | Schering Corp | Agonists and antagonists of human interleukin-10 |
GB9317618D0 (en) | 1993-08-24 | 1993-10-06 | Royal Free Hosp School Med | Polymer modifications |
US5643575A (en) | 1993-10-27 | 1997-07-01 | Enzon, Inc. | Non-antigenic branched polymer conjugates |
US5919455A (en) | 1993-10-27 | 1999-07-06 | Enzon, Inc. | Non-antigenic branched polymer conjugates |
US5951974A (en) | 1993-11-10 | 1999-09-14 | Enzon, Inc. | Interferon polymer conjugates |
SK91696A3 (en) | 1994-01-20 | 1997-04-09 | Schering Plough Corp | Use of il-10 to stimulate peripheral blood mononuclear cell cytolytic activity |
US5824784A (en) | 1994-10-12 | 1998-10-20 | Amgen Inc. | N-terminally chemically modified protein compositions and methods |
US6410008B1 (en) | 1994-12-12 | 2002-06-25 | Beth Israel Hospital Association | Chimeric IL-10 proteins and uses thereof |
US5932462A (en) | 1995-01-10 | 1999-08-03 | Shearwater Polymers, Inc. | Multiarmed, monofunctional, polymer for coupling to molecules and surfaces |
US5866134A (en) | 1995-03-24 | 1999-02-02 | Schering Corporation | Method for enhancing the antibody response to specific antigens with Interleukin-10 |
US5770190A (en) | 1995-07-14 | 1998-06-23 | Schering Corporation | Method of treatment of acute leukemia with inteleukin-10 |
GB2304047A (en) | 1995-08-09 | 1997-03-12 | Univ Manchester | Pharmaceutical compositions containing cytokines |
US5744451A (en) | 1995-09-12 | 1998-04-28 | Warner-Lambert Company | N-substituted glutamic acid derivatives with interleukin-1 β converting enzyme inhibitory activity |
US5908621A (en) | 1995-11-02 | 1999-06-01 | Schering Corporation | Polyethylene glycol modified interferon therapy |
CA2264918A1 (en) * | 1996-09-06 | 1998-03-12 | Schering Corporation | Method for lowering cholesterol levels |
US5989867A (en) | 1996-09-23 | 1999-11-23 | Knappe; Andrea | DNA encoding IL-10-like homologue; related reagents |
US6660258B1 (en) | 1997-05-09 | 2003-12-09 | Pharma Pacific Pty Ltd | Oromucosal cytokine compositions and uses thereof |
ATE375363T1 (de) | 1997-07-14 | 2007-10-15 | Bolder Biotechnology Inc | Derivate des wachstumshormons und verwandte proteine |
US5985263A (en) | 1997-12-19 | 1999-11-16 | Enzon, Inc. | Substantially pure histidine-linked protein polymer conjugates |
US6428985B1 (en) | 1998-12-02 | 2002-08-06 | The Regents Of The University Of Michigan | Immunosuppressive structural definition of IL-10 |
CA2356010A1 (en) | 1998-12-22 | 2000-06-29 | Schering Corporation | Treatment of hepatitis c virus infections with interleukin-10 |
US7666400B2 (en) | 2005-04-06 | 2010-02-23 | Ibc Pharmaceuticals, Inc. | PEGylation by the dock and lock (DNL) technique |
WO2001005821A2 (en) | 1999-07-16 | 2001-01-25 | Maria Teresa Bejarano | Viral il-10 for the inhibition of angiogenesis, tumorigenesis and metastasis |
US6989377B2 (en) | 1999-12-21 | 2006-01-24 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Treating vitamin D responsive diseases |
WO2001058950A1 (en) | 2000-02-11 | 2001-08-16 | Maxygen Aps | Improved interleukin 10 |
US20030186386A1 (en) | 2000-02-11 | 2003-10-02 | Hansen Christian Karsten | Interleukin 10 |
EP1324779B1 (en) | 2000-09-29 | 2011-07-20 | Schering Corporation | Pegylated interleukin-10 |
JP2002142770A (ja) | 2000-11-08 | 2002-05-21 | Dnavec Research Inc | 循環系への遺伝子送達用パラミクソウイルスベクター |
US6838452B2 (en) | 2000-11-24 | 2005-01-04 | Vascular Biogenics Ltd. | Methods employing and compositions containing defined oxidized phospholipids for prevention and treatment of atherosclerosis |
EP1234583A1 (en) | 2001-02-23 | 2002-08-28 | F. Hoffmann-La Roche Ag | PEG-conjugates of HGF-NK4 |
GB0212648D0 (en) | 2002-05-31 | 2002-07-10 | Immunoclin Lab Ltd | Treatment with cytokines |
EP1539960B1 (en) | 2002-09-09 | 2010-04-28 | Hanall Pharmaceutical Co., Ltd. | Protease-resistant modified interferon alpha polypeptides |
WO2004044006A1 (en) | 2002-11-14 | 2004-05-27 | Maxygen, Inc. | Conjugates of interleukin-10 and polymers |
ES2312820T3 (es) | 2002-11-29 | 2009-03-01 | Maria Grazia Roncarolo | Paramicina e il-10 para el tratamiento de enfermedades autoinmunes. |
AU2003303222A1 (en) | 2002-12-19 | 2004-07-14 | Universiteit Gent | Mutant proteins showing increased secretion |
ES2367430T3 (es) | 2002-12-23 | 2011-11-03 | Wyeth Llc | Anticuerpos contra pd-1 y sus usos. |
TWI364295B (en) | 2002-12-26 | 2012-05-21 | Mountain View Pharmaceuticals | Polymer conjugates of cytokines, chemokines, growth factors, polypeptide hormones and antagonists thereof with preserved receptor-binding activity |
ES2557286T3 (es) | 2003-03-03 | 2016-01-25 | Dyax Corp. | Usos de péptidos que se unen específicamente al receptor del HGF (cMet) |
EP2261244A3 (en) | 2003-04-15 | 2011-02-23 | Glaxosmithkline LLC | Human il-18 substitution mutants and their conjugates |
US7261882B2 (en) | 2003-06-23 | 2007-08-28 | Reagents Of The University Of Colorado | Methods for treating neuropathic pain by administering IL-10 polypeptides |
WO2005052159A1 (en) | 2003-11-28 | 2005-06-09 | The University Of Sydney | Latent phase viral interleukin-10-(vii-10) and uses thereof |
CN101659704A (zh) | 2004-03-11 | 2010-03-03 | 弗雷泽纽斯卡比德国有限公司 | 通过还原氨基化制备的羟烷基淀粉和蛋白质的偶联物 |
DK1786472T3 (da) | 2004-08-10 | 2013-04-15 | Genzyme Corp | Antisense-modulering af apolipoprotein B-ekspression |
US20060046961A1 (en) | 2004-09-02 | 2006-03-02 | Mckay William F | Controlled and directed local delivery of anti-inflammatory compositions |
CN100334112C (zh) | 2004-10-15 | 2007-08-29 | 上海海欣生物技术有限公司 | 人白细胞介素15与Fc融合蛋白 |
GB0500643D0 (en) | 2005-01-13 | 2005-02-23 | Renovo Ltd | Medicaments |
AR052741A1 (es) | 2005-04-08 | 2007-03-28 | Noxxon Pharma Ag | Acidos nucleicos de union a ghrelin |
US20100028296A1 (en) | 2005-05-02 | 2010-02-04 | Chavez Raymond A | Use of cytokine-derived peptides in treatment of pain and neurodegenerative disease |
DE602006011311D1 (de) | 2005-05-31 | 2010-02-04 | Univ Colorado | Il-10 mutante |
CA2655511C (en) | 2005-07-01 | 2017-03-21 | John Schrader | Methods of isolating cells and generating monoclonal antibodies |
EP1931704B1 (en) | 2005-10-04 | 2010-12-15 | ZymoGenetics, L.L.C. | Production and purification of il-29 |
US7939056B2 (en) | 2005-11-14 | 2011-05-10 | The Brigham And Women's Hospital, Inc. | Interleukin-10 compositions for the treatment of adenocarcinomas |
US7868139B2 (en) | 2006-01-24 | 2011-01-11 | Uab Research Foundation | Compositions and methods for the identification and treatment of immune-mediated inflammatory diseases |
JPWO2007139178A1 (ja) | 2006-05-31 | 2009-10-15 | ディナベック株式会社 | アルツハイマー病治療薬 |
AU2007314501B2 (en) | 2006-09-28 | 2013-05-23 | Merck Sharp & Dohme Corp. | Use of pegylated IL-10 to treat cancer |
EP2078201A2 (en) | 2006-10-05 | 2009-07-15 | Agency for Science, Technology and Research | Dengue diagnosis and treatment |
JP5220025B2 (ja) | 2006-12-04 | 2013-06-26 | プロメディオール, インコーポレイテッド | 線維症疾患を処置するための併用療法 |
JP2010516707A (ja) | 2007-01-19 | 2010-05-20 | カイ ファーマシューティカルズ インコーポレーティッド | ペプチド組成物の安定性および送達効率を上昇させるための修飾方法 |
CN104710518A (zh) | 2007-07-31 | 2015-06-17 | 阿菲博迪公司 | 新白蛋白结合组合物、方法及应用 |
WO2009036568A1 (en) | 2007-09-19 | 2009-03-26 | University Health Network | Methods and compositions for treating tumors and viral infections |
EP2200649A4 (en) | 2007-10-19 | 2012-09-26 | Univ California | COMPOSITIONS AND METHODS FOR TREATING CNS INFUSION, PSYCHOSIS, DELIRE, PTSD OR PTSS |
WO2009062151A1 (en) | 2007-11-08 | 2009-05-14 | Cytimmune Sciences, Inc. | Compositions and methods for generating antibodies |
GB0724231D0 (en) | 2007-12-12 | 2008-01-30 | Renono Ltd | Methods for inhibiting scarring |
US20090311187A1 (en) | 2008-05-29 | 2009-12-17 | Bristol-Myers Squibb Company | Methods for predicting patient response to modulation of the Co-stimulatory pathway |
WO2010022227A1 (en) | 2008-08-20 | 2010-02-25 | Schering Corporation | Methods for monitoring il-10 therapy |
US8927694B2 (en) | 2008-11-18 | 2015-01-06 | Merrimack Pharmaceuticals, Inc. | Human serum albumin linkers and conjugates thereof |
US10464987B2 (en) | 2009-10-06 | 2019-11-05 | Abbvie Inc. | Human single-chain T cell receptors |
US8435516B2 (en) | 2009-10-12 | 2013-05-07 | Pfizer Inc. | Cancer treatment |
US8748380B2 (en) | 2009-10-30 | 2014-06-10 | Novozymes Biopharma Dk A/S | Albumin variants |
CN102811736B (zh) | 2009-11-30 | 2016-01-20 | 生物测试股份公司 | 治疗系统性红斑狼疮(sle)的人源化抗il-10抗体 |
SG186302A1 (en) | 2010-06-16 | 2013-02-28 | Abbott Lab | Comparison of protein samples |
CA2802344C (en) | 2010-06-18 | 2023-06-13 | The Brigham And Women's Hospital, Inc. | Bi-specific antibodies against tim-3 and pd-1 for immunotherapy in chronic immune conditions |
NZ604805A (en) | 2010-07-09 | 2014-09-26 | Affibody Ab | Polypeptides |
DK3241558T3 (da) | 2010-09-28 | 2021-04-26 | Aegerion Pharmaceuticals Inc | Højopløselige leptiner |
CN103370083B (zh) | 2010-09-28 | 2016-11-16 | 艾米琳制药有限责任公司 | 具有增强的作用持续时间的工程化多肽 |
GB201018289D0 (en) | 2010-10-29 | 2010-12-15 | Biocopea Ltd | Treatment of respiratory disorders |
US8895536B2 (en) | 2010-10-29 | 2014-11-25 | Infirst Healthcare Ltd. | Compositions and methods for treating chronic inflammation and inflammatory diseases |
AU2012230780B2 (en) | 2011-03-23 | 2016-10-27 | Fred Hutchinson Cancer Center | Method and compositions for cellular immunotherapy |
CN102145178B (zh) | 2011-04-15 | 2012-09-26 | 北京凯因科技股份有限公司 | Peg化白介素15 |
EP2768856A4 (en) | 2011-10-18 | 2015-05-27 | Prolynx Llc | PEG CONJUGATES OF EXENATIDE |
WO2013074916A1 (en) | 2011-11-18 | 2013-05-23 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Car+ t cells genetically modified to eliminate expression of t- cell receptor and/or hla |
BR112014018575A2 (pt) | 2012-01-26 | 2017-07-04 | Amgen Inc | polipetídeos de fator de diferenciação de crescimento 15 (gdf-15) |
WO2013130913A1 (en) | 2012-02-29 | 2013-09-06 | Ambrx, Inc. | Interleukin-10 polypeptide conjugates and their uses |
US20150118244A1 (en) | 2012-05-10 | 2015-04-30 | Bristol-Myers Squibb Company | Anti-tumor antibodies as predictive or prognostic biomarkers of efficacy and survival in ipilimumab-treated patients |
EP2947111B1 (en) | 2013-01-17 | 2018-03-07 | Xiamen Sinopeg Biotech Co., Ltd. | Monofunctional branched polyethyleneglycol and bio-related substance modified by same |
US9943568B2 (en) | 2013-04-18 | 2018-04-17 | Armo Biosciences, Inc. | Methods of using pegylated interleukin-10 for treating cancer |
US20160068583A1 (en) * | 2013-04-24 | 2016-03-10 | Armo Biosciences, Inc. | Interleukin-10 Compositions and Uses Thereof |
ES2688206T3 (es) * | 2013-06-17 | 2018-10-31 | Armo Biosciences, Inc. | Procedimiento de evaluación de la identidad y la estabilidad de proteínas |
WO2015070060A1 (en) | 2013-11-11 | 2015-05-14 | Armo Biosciences, Inc. | Methods of using interleukin-10 for treating diseases and disorders |
WO2015108785A1 (en) | 2014-01-15 | 2015-07-23 | Armo Biosciences, Inc. | Methods of using interleukin-10 for treating diseases and disorders |
WO2015112626A1 (en) | 2014-01-21 | 2015-07-30 | June Carl H | Enhanced antigen presenting ability of car t cells by co-introduction of costimulatory molecules |
MA39711A (fr) | 2014-04-03 | 2015-10-08 | Nektar Therapeutics | Conjugués d'une fraction d'il-15 et d'un polymère |
EP3302547A1 (en) | 2015-05-28 | 2018-04-11 | Armo Biosciences, Inc. | Pegylated interleukin-10 for use in treating cancer |
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Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5945097A (en) * | 1996-09-06 | 1999-08-31 | Schering Corporation | Method for lowering cholesterol levels with interleukin-10 |
CN102256625A (zh) * | 2008-12-17 | 2011-11-23 | 先灵公司 | 单和双peg il10的生产和用途 |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
CHRISTOPHER HEESCHEN等: "Serum Level of the Antiinflammatory Cytokine Interleukin-10 Is an Important Prognostic Determinant in Patients With Acute Coronary Syndromes", 《CIRCULATION》 * |
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