ES2312820T3 - Paramicina e il-10 para el tratamiento de enfermedades autoinmunes. - Google Patents

Paramicina e il-10 para el tratamiento de enfermedades autoinmunes. Download PDF

Info

Publication number
ES2312820T3
ES2312820T3 ES03767682T ES03767682T ES2312820T3 ES 2312820 T3 ES2312820 T3 ES 2312820T3 ES 03767682 T ES03767682 T ES 03767682T ES 03767682 T ES03767682 T ES 03767682T ES 2312820 T3 ES2312820 T3 ES 2312820T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
cells
mice
rapamycin
protocol
diabetes
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Lifetime
Application number
ES03767682T
Other languages
English (en)
Inventor
Maria Grazia Roncarolo
Manuela Battaglia
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Individual
Original Assignee
Individual
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Individual filed Critical Individual
Application granted granted Critical
Publication of ES2312820T3 publication Critical patent/ES2312820T3/es
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K38/20—Interleukins [IL]
    • A61K38/2066—IL-10
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/4353—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom ortho- or peri-condensed with heterocyclic ring systems
    • A61K31/436—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom ortho- or peri-condensed with heterocyclic ring systems the heterocyclic ring system containing a six-membered ring having oxygen as a ring hetero atom, e.g. rapamycin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • A61K38/12—Cyclic peptides, e.g. bacitracins; Polymyxins; Gramicidins S, C; Tyrocidins A, B or C
    • A61K38/13—Cyclosporins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/177—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • A61K38/1777—Integrin superfamily
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/177—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • A61K38/1793—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/06—Antiasthmatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
    • C07K16/244—Interleukins [IL]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/289—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against CD45
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/626—Diabody or triabody
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)

Abstract

El uso de una preparación farmacéutica combinada que contiene IL-10 y rapamicina como los ingredientes activos únicos para la fabricación de un medicamento para inducir una tolerancia inmune específica de antígeno en un sujeto afectado por una enfermedad autoinmune.

Description

Paramicina e IL-10 para el tratamiento de enfermedades autoinmunes.
La presente invención se refiere a composiciones para inducir una tolerancia inmune específica de antígeno en sujetos que lo necesiten. Más en concreto, la invención proporciona una preparación combinada de rapamicina e IL-10 para el uso en el tratamiento de enfermedades que implican una respuesta autoinmune excesiva, disfuncional o incontrolada mediada por células T. Se usan composiciones farmacéuticas que contienen IL-10 y rapamicina como modulares de la respuesta inmune.
Antecedentes de la invención
Trasplante y fármacos inmunosupresores. El trasplante es el tratamiento de elección para la mayoría de los pacientes con insuficiencia renal en fase terminal, enfermedad cardiaca o hepática, diabetes autoinmune de tipo y es una posibilidad en desarrollo para pacientes con deficiencias en la función del intestino delgado y de los pulmones. La supervivencia de los injertos depende de varios factores pero el más importante de estos es la administración de potente fármacos inmunosupresores. El trasplante entre individuos genéticamente diferentes suscita una respuesta inmune alorreactiva rápida y potencialmente destructiva que, si no se controla, puede conducir a una destrucción completa del órgano trasplantado. La administración de fármacos inmunosupresores atenúa esta respuesta y, por lo tanto, previene el rechazo agudo de injertos. Sin embargo, la supervivencia continua de injertos depende de una inmunosupresión de por vida porque la retirada de la inmunosupresión da como resultado la reactivación de la respuesta de rechazo, conduciendo a una rápida destrucción del injerto.
Recientemente, entre los fármacos inmunosupresores, se han desarrollado inhibidores de células T selectivos que incluyen ciclosporina A (CsA), FK506 y rapamicina. Tanto la CsA como el FK506 inhiben la activación de células T por bloqueo de la función de la calcineurina y, por lo tanto, impiden la generación del potente factor nuclear de células T activadas (NFAT). Esta etapa es esencial para la regulación positiva del ARNm de varias citocinas, incluyendo IL-2. Las limitaciones principales de la CsA y del FK506 son sus diversas toxicidades. Además, tanto la CsA como el FK506 previenen la apoptosis de células T (revisado en Yu y col. 2001).
Por el contrario, la rapamicina es un potente inmunosupresor que inhibe la proliferación de células T por unión a una proteína citosólica (FKBP-12) y bloqueo de la señalización de IL-2 (Sehgal 1998). El complejo se une a y bloquea la diana de la rapamicina en mamíferos (mTOR), dando como resultado la inhibición de citocinas inducida por la proliferación de células T. De forma importante, al contrario que CsA y FK506, la rapamicina no bloquea la activación de células T mediada por TCR (Blaha y col., 2003) ni la sensibilización de células T con IL-2 para muerte celular inducida por activación (AICD). Esta última es una forma de apoptosis de células T que parece desempeñar un papel en la inducción de la tolerancia periférica a trasplantes (Wells y col., 1999). A diferencia de la CsA, que no tiene efectos sobre las células dendríticas (DC), la rapamicina afecta profundamente al fenotipo y a la función de las DC (Hackstein y col., 2002). Reduce notablemente su capacidad de captación de antígenos, favoreciendo de este modo la diferenciación de DC con un fenotipo tolerogénico. Este efecto, presente a una concentración baja fisiológicamente importante de rapamicina (1 ng/ml) depende de la maduración de DC y se ha demostrado tanto in vitro como in vivo (Hackstein y col., 2002).
Aunque los fármacos inmunosupresores actualmente disponibles son muy eficaces a corto plazo, los problemas considerables indican una necesidad urgente de desarrollar modos alternativos y más sofisticados de prevenir el rechazo de injertos. El obstáculo principal es la incapacidad para distinguir entre respuestas inmunes beneficiosas frente a patógenos infecciosos y respuestas inmunes destructivas frente al injerto. Por lo tanto, las terapias inmunosupresoras pueden conducir a un riesgo aumentado de infecciones oportunistas. Varios estudios demuestran que la inmunosupresión inespecífica conduciría a una incidencia aumentada de cáncer en pacientes trasplantados (Hojo y col., 1999). Por lo tanto, el potencial completo del trasplante se alcanzará sólo cuando se encuentren alternativas a la inmunosupresión inespecífica. El mayor objetivo de la inmunología de trasplante es desarrollar protocolos que eviten respuestas inmunes contra el injerto pero dejen el resto del sistema inmune intacto. Este logro conduciría a la tolerancia del
trasplante.
Autoinmunidad. En enfermedades autoinmunes, las respuestas inmunes no deseadas contra antígenos propios conduce a la destrucción de tejidos periféricos. Los tratamientos de enfermedades autoinmunes se basan actualmente en la modulación negativa de la inflamación y en la inmunosupresión no específica de antígeno (Ag). Como para la prevención del rechazo de aloinjertos, con frecuencia esta estrategia no es eficaz a largo plazo, con gran riesgo de recaída una vez que el fármaco se retira y peligro de una inmunosupresión excesiva, incluyendo infecciones y tumores. El enfoque alternativo se basa en la inducción de una inmunosupresión transitoria y/o una tolerancia inmune específica, dirigida al "silenciamiento" de la respuesta patógena contra Ag propios, al tiempo que se mantienen intactos los mecanismos de defensa del huésped.
El sistema inmune ha desarrollado dos mecanismos diferentes para inducir tolerancia contra antígenos propios o no perjudiciales. Estos se denominan tolerancia de células T central y periférica. La tolerancia central se lleva a cabo durante el desarrollo fetal y el periodo natal más temprano y está mediada por la deleción clonal de células T autorreactivas durante el desarrollo del timo. Los mecanismos periféricos inducen la tolerancia en células T maduras y aparecen en la periferia durante toda la vida. Estos mecanismos incluyen la inactivación funcional de linfocitos específicos de antígeno (denominada anergia) y activación de subconjuntos de células T con capacidades supresoras y reguladoras (células T reguladoras, revisadas en Battaglia y col., 2002).
Tolerancia y células T reguladoras. Recientemente, ha habido un interés creciente en la inducción de células T reguladoras (Tr) como una estrategia para conseguir una tolerancia específica de injerto. La mayoría de las células Tr identificadas hasta la fecha están dentro de la población de CD4^{+}, aunque también se ha demostrado que otros subconjuntos de células T, tales como CD8^{+}, CD8^{+} CD28^{-} y TCR^{+} CD4^{-} CD8^{-} contienen células con capacidad reguladora. Dentro de la población de CD4^{+}, se han identificado diversas fracciones con propiedades inmunosupresoras. Se ha caracterizado un subconjunto de células Tr, definidas como células T reguladoras de tipo 1 (Tr1) que tienen un perfil de producción de citocinas diferente del de células Th1 y Th2. Las células Tr1 humanas y de ratón producen altos niveles de IL-10, cantidades significativas de IL-5, TGF-\beta e IFN-\gamma, pero bajos niveles de IL-2 y nada de IL-4 (Groux y col., 1997). La IL-10 es una citocina crucial para la diferenciación y las funciones efectoras de células Tr1. El cultivo de células T CD4^{+} en presencia de antígeno y de IL-10 conduce a la generación de células Tr1 que son capaces de suprimir respuestas de células T específicas de antígeno in vitro y el desarrollo de la colitis autoinmune in vivo (Groux y col., 1997): También pueden generarse células Tr1 in vivo. De hecho, se han aislado células Tr1 de sangre periférica de pacientes con SCID reconstituidos, en los que niveles elevados de IL-10 se asociaban con trasplante alogénico de células madre exitoso (Bacchetta y col., 1994).
Tolerancia e IL-10. IL-10 desempeña un papel clave en la inmunorregulación (revisado en Moore y col., 2001). Inhibe la proliferación y la producción de IL-2 de linfocitos T. La IL-10 tiene fuertes propiedades antiinflamatorias por inhibición de la producción de citocinas proinflamatorias, tales como TNF-\alpha, IL-1, IL-6, y quimiocinas, tales como IL-8, MIP1\alpha e MIP1\beta, por monocitos/macrófagos activados, neutrófilos, eosinófilos y mastocitos. Además, la IL-10 suprime las capacidades presentadoras de antígenos de las células presentadoras de antígenos, tales como monocitos/macrófagos/DC, por regulación negativa de moléculas del MHCII y coestimuladoras. La capacidad de IL-10 para inhibir la inducción y la función efectora de respuestas inmunes mediadas por células T y antiinflamatorias llevó a numerosos estudios sobre la expresión, función y utilidad potencial de IL-10 en el trasplante de médula ósea y órganos. En estudios de aloinjerto de corazón vascularizado en ratones, el tratamiento con IL-10 de los animales receptores antes del injerto potenciaba la supervivencia del injerto, mientras que el suministro de IL-10 en el momento o después del injerto tenía escasos efectos beneficiosos o incluso potenciaba el rechazo (Li y col., 1999). Los pacientes que presentan niveles elevados de producción de IL-10 antes del BMT tienen una menor incidencia de GVHD y una supervivencia aumentada (Baker y col., 1999). Por el contrario, elevados niveles de IL-10 en pacientes de GVHD post-BMT indican un mal pronóstico para la supervivencia (Hempel 1997). Sin embargo, Blazar y colaboradores demostraron que el tratamiento de ratones con pequeñas cantidades de IL-10 (10^{-3}, 10^{-4} de la cantidad que aumentaba la mortalidad) protege frente a la letalidad asociada con GVHD (Blazar y col., 1998).
Combinación de fármacos inmunosupresores con IL-10. La mayoría de los fármacos inmunosupresores en los usos clínicos actuales actúan por inhibición de la activación de células T y, por lo tanto, previenen el rechazo de injertos. Sin embargo, esto puede ser contraproducente ya que, en las circunstancias apropiadas, la activación de células T puede conducir a la inducción de procesos que faciliten el desarrollo de una tolerancia específica de injerto. Por lo tanto, el uso de fármacos inmunosupresores puede no ser óptimo cuando el objetivo es la inducción de la tolerancia. Una clara demostración de este fenómeno viene de pacientes con SCID en los que se consiguió una tolerancia después del trasplante alogénico de células madre hematopoyéticas sin ninguna terapia inmunosupresora (Bacchetta y col., 1994). En estos pacientes, la presencia de células Tr1 procedentes del donante específicas para los aloantígenos del huésped se correlacionaba con un quimerismo mixto estable, niveles elevados de producción de IL-10 in vivo y funciones inmunes normales en ausencia de cualquier terapia inmunosupresora. Por el contrario, en pacientes de BMT que recibían un tratamiento inmunosupresor para controlar la GVHD aguda, no pudieron aislarse células Tr1 de sangre periférica, aunque eran detectables células T procedentes del donante específicas para aloantígenos del huésped (Bacchetta y col., 1995).
La rapamicina representa un nuevo compuesto con propiedades inmunomoduladoras interesantes. Por esta razón, se combinó la administración in vivo de rapamicina con IL-10 para prevenir el rechazo de aloinjertos o modular la diabetes de tipo 1 y permitir el desarrollo de células Tr in vivo.
Estado de la técnica
La Patente de Estados Unidos 6.277.635 se refiere al uso de IL-10 para suprimir el rechazo de trasplantes. Esta patente muestra procedimientos de tratamiento e inhibición del rechazo de tejidos, inhibiendo la GVHD y las respuestas específicas de antígeno. Describe además células T que presentan anergia por un antígeno particular.
La Patente de Estados Unidos 6.428.985 describe composiciones inmunosupresoras de mamíferos, incluyendo seres humanos, que contienen polipéptidos IL-10 con al menos una mutación en la secuencia nativa (Mut IL-10) solos o en combinación con otros agentes, y diversos procedimientos de uso in vitro e in vivo de dichas composiciones y combinaciones de las mismas. Los usos incluyen terapias inmunosupresoras y de combinación para varias enfermedades y trastornos relacionados con inflamación, trasplante, fibrosis, cicatrización y tratamiento de tumores. El efecto de Mut IL-10 se ha demostrado en estudios animales pero no en entornos clínicos humanos.
La Patente de Estados Unidos 5.624.823 describe un ADN que codifica la IL-10 porcina y un procedimiento para inducir tolerancia en un mamífero receptor, por ejemplo, un primate, que recibe un trasplante alogénico. Se mencionan la rapamicina, la ciclosporina y el FK506 como "agentes reductores de auxiliares", es decir, agentes que reducen la liberación de citocinas. La IL-10 porcina se usa en el contexto del trasplante de timo solamente.
La Patente de Estados Unidos 6.022.536 describe el uso combinado de IL-10 y ciclosporina como terapia inmunosupresora para el tratamiento de enfermedades autoinmunes y GVHD. Se propone la combinación sinérgica de bajas dosis de IL-10 y ciclosporina y un vehículo farmacéutico.
La Patente de Estados Unidos 6.403.562 describe procedimientos para tratar enfermedades relacionadas con autoinmunidad, tales como esclerosis múltiple, por administración de IL-10 junto con TGF-\beta a una persona que padece o tiene predisposición a una enfermedad autoinmune. Estas citocinas actúan de una forma sinérgica como factores supresores para inhibir la activación de células T autorreactivas que están implicadas en respuestas autoinmunes.
\vskip1.000000\baselineskip
Descripción de la invención
La invención proporciona el uso de una preparación farmacéutica combinada que contiene IL-10 y rapamicina como los únicos ingredientes activos para la fabricación de un medicamento para inducir una tolerancia inmune específica de antígeno en un sujeto afectado por una enfermedad autoinmune. La inducción de una tolerancia inmune específica de antígeno mediada por células Tr1 y Tr CD4^{+} CD25^{+} es útil para el tratamiento de afecciones patológicas que implican una respuesta inmune mediada por células T contra moléculas propias excesiva, disfuncional, no regulada o descontrolada.
En una realización preferida de la invención, la IL-10 y la rapamicina están en forma de una preparación combinada para el uso simultáneo, separado o secuencial en el tratamiento preventivo o terapéutico de la diabetes de tipo 1 y de otras enfermedades autoinmunes, incluyendo la esclerosis múltiple o la artritis reumatoide.
La preparación combinada se usa para el tratamiento preventivo o terapéutico de enfermedades autoinmunes, especialmente de la diabetes de tipo 1.
La preparación combinada puede contener IL-10 humana o viral, análogos, derivados o conjugados de la misma que mejoran la biodisponibilidad o la eficacia biológica de la molécula natural, tal como IL-10 conjugada con polietilenglicol (PEG). Los análogos funcionales de IL-10 incluyen pequeñas moléculas que mimetizan los efectos de IL-10 y anticuerpos monoclonales (mAb) contra el receptor de IL-10 o proteínas de fusión de IL-10, que desencadenan la ruta de señalización de IL-10.
La preparación combinada puede contener análogos o derivados de rapamicina. La combinación de rapamicina + antiTac (un anticuerpo humanizado contra la cadena \alpha del receptor de IL-2) + IL-10 demostró ser particularmente eficaz en la prevención del rechazo alogénico, especialmente en un modelo murino de rechazo de aloinjerto de islotes \beta, por inducción de un estado de tolerancia en lugar de la inmunosupresión persistente generada por los protocolos terapéuticos convencionales. Además, la combinación de rapamicina + IL-10 demostraba ser eficaz en el tratamiento de la diabetes autoinmune y la inducción de una inmunomodulación a largo plazo en ratones NOD. La tolerancia se consigue como resultado de la expansión y diferenciación inducidas por rapamicina + IL-10 de células T reguladoras de tipo 1 (Tr1) y Tr CD4^{+} CD25^{+}, que median en la tolerancia específica de antígeno a través de diferentes mecanismos, incluyendo la producción de citocinas supresoras (IL-10 y TGF-\beta) y la inhibición de la activación de células T.
Las preparaciones combinadas de rapamicina + IL-10 de acuerdo con la invención ejercen una protección a largo plazo que puede mantenerse tras la retirada del fármaco, a pesar de la recuperación de la inmunocompetencia de células T.
Se administran composiciones farmacéuticas adecuadas mediante la vía oral, intravenosa, parenteral o subcutánea y, preferiblemente, están en forma de soluciones, suspensiones, inyectables, comprimidos o cápsulas. Las cantidades eficaces de rapamicina pueden variar de 0,001 mg/kg a 100 mg/kg y las cantidades eficaces de IL-10 pueden variar de 0,001 \mug/kg a 1000 \mug/kg.
La invención se ilustra adicionalmente mediante los siguientes ejemplos y las figuras adjuntas.
\vskip1.000000\baselineskip
Descripción de las figuras
Figura 1. Ratones tratados con el protocolo de IL-10 y el protocolo de Edmonton tienen una supervivencia de injertos comparable.
Se realizaron trasplantes bajo la cápsula renal con islotes \beta de C57BL/6 alogénicos purificados en ratones Balb/c que se habían vuelto diabéticos por inyección de estreptozotocina. Los ratones no se trataron (control, n = 13 ratones) o se trataron con rapamicina + antiTac + IL-10 (protocolo de IL-10, n = 16 ratones) o con rapamicina + antiTac + FK506 (protocolo de Edmonton, n = 4 ratones) durante 30 días. Se controló la supervivencia de los injertos mediante los niveles de glucemia. Se consideraba que un injerto se rechazaba cuando la glucemia era superior a 250 mg/dl.
El reemplazo de FK506 (protocolo de Edmonton) con IL-10 (protocolo de IL-10) daba como resultado una supervivencia de injertos comparable: en ratones tratados con protocolo de IL-10 la supervivencia del injerto era del 89%, mientras que se observaba una supervivencia del 100% en los ratones tratados con el protocolo de Edmonton.
\vskip1.000000\baselineskip
Figura 2. La ausencia de antiTac del protocolo de IL-10 aumenta ligeramente el rechazo de islotes \beta alogénicos.
Se realizaron trasplantes bajo la cápsula renal con islotes \beta de C57BL/6 alogénicos purificados en ratones Balb/c que se habían vuelto diabéticos por inyección de estreptozotocina. Los ratones no se trataron (control, n = 8 ratones) o se trataron con rapamicina en combinación con IL-10 (rapa + IL10, n = 8 ratones) o con IL-10 sola (n = 4 ratones). Se controló la supervivencia del injerto mediante los niveles de glucemia.
La ausencia de antiTac del protocolo de IL-10 (véase la Figura 1) afectaba ligeramente a la supervivencia del injerto. La rapamicina en combinación con IL-10 permitía la supervivencia del injerto en el 78% de los animales. El tratamiento con IL-10 sola no era eficaz en la prevención del rechazo de injertos.
Estos datos sugieren que no es necesario el antiTac para prevenir el rechazo de aloinjertos.
\vskip1.000000\baselineskip
Figura 3. Las células T de ratones tratados con el protocolo de IL-10 mantienen una capacidad proliferativa in vitro .
Se aislaron células T del bazo de ratones sin trasplante de control (barras blancas) y ratones tratados con el protocolo de IL-10 (barras grises) o el protocolo de Edmonton (barras negras) y se estimularon in vitro policlonalmente con mAb antiCD3 y antiCD28. Se redujo enormemente la capacidad proliferativa in vitro de las células de ratones tratados con el protocolo de Edmonton, mientras que se observó sólo una reducción moderada en la proliferación de células T aisladas de ratones tratados con el protocolo de IL-10.
Estos datos sugieren un profundo estado de inmunosupresión en células T aisladas de ratones tratados con el protocolo de Edmonton, pero no de ratones tratados con el protocolo de IL-10.
\vskip1.000000\baselineskip
Figura 4. Las células T de ratones tratados con el protocolo de IL-10 conservan una capacidad proliferativa específica de antígeno.
Se inmunizaron in vivo ratones trasplantados 280 días antes y tratados sólo durante 30 días con el protocolo de IL-10 (barras grises) o con el protocolo de Edmonton (barras negras) en la almohadilla plantar posterior con CFA + OVA. Se extirparon ganglios linfáticos de drenaje y se reestimularon in vitro con OVA y APC de autoantígenos.
La proliferación de células T específicas de OVA se reducía enormemente en ratones tratados con el protocolo de Edmonton, mientras que la respuesta a OVA en ratones tratados con el protocolo de IL-10 era comparable a la observada en ratones inmunizados sin trasplantes.
Estos datos demuestran además un estado general de inmunosupresión en ratones tratados con el protocolo de Edmonton, pero no con el protocolo de IL-10.
\vskip1.000000\baselineskip
Figura 5. Las células T aisladas de ratones tratados con el protocolo de IL-10 producen IL-10.
Se estimularon in vitro con mAb antiCD3 y antiCD28 células T CD4^{+} aisladas del riñón de ratones sin trasplantes de control o de ratones tratados con el protocolo de IL-10 (barras grises) y con el protocolo de Edmonton (barras negras). Se recogieron los sobrenadantes 96 horas después de la estimulación y se evalúo la producción de IL-10 mediante ELISA.
Las células T de ratones tratados con el protocolo de IL-10 producían mayores niveles de IL-10 en comparación con los ratones tratados con el protocolo de Edmonton y ratones sin trasplantes de control.
\vskip1.000000\baselineskip
La Figura 6A diferencia poblaciones de células T productoras de IL-10 que pueden aislarse de ratones tratados con el protocolo de IL-10.
(A) Se aislaron células T de ratones tratados con el protocolo de IL-10, el protocolo de Edmonton y de ratones sin trasplantes de control y se estimularon policlonalmente in vitro para inducir la producción de citocinas. Después de 3 horas, las células se marcaron con un diacuerpo que consistía en un mAb que se une a un marcador de superficie celular ubicuo y el otro mAb capaz de atrapar IL-10. Después, las células marcadas se incubaron durante una hora adicional a 37ºC para liberar las citocinas acumuladas durante la estimulación policlonal. Se capturó la IL-10 producida por las células marcadas mediante el diacuerpo. Las células se marcaron adicionalmente con un mAb anti-IL-10 marcado con PE. Se usaron microperlas anti-PE para separar magnéticamente las células enriquecidas para IL-10^{+} (histograma relleno) e IL-10^{-} (histograma en blanco). Se aisló una población diferente de células T enriquecidas para IL-10+ sólo a partir de ratones trasplantados tratados con el protocolo de IL-10.
(B) Se realizó una tinción intracitroplasmática en esta población de células T enriquecidas para IL-10^{+} diferente y se identificó una proporción significativa de las células con un perfil de citocinas de Tr1 (es decir, IL-10^{+}, IL-4^{-}) con el protocolo de IL-10, pero no en ratones tratados con el protocolo de Edmonton o en ratones sin trasplantes de control.
\vskip1.000000\baselineskip
Figura 7. Se requiere IL-10 para inducir las células T productoras de IL-10 in vivo .
Para comprender la necesidad de la administración de IL-10 para inducir células Tr1 IL-10^{+} in vivo, se trataron ratones trasplantados con el protocolo de IL-10 (rapamicina + antiTac + IL-10) o con rapamicina + antiTac solamente. Después se evaluó la producción de IL-10 por células T esplénicas CD4^{+} en los dos grupos de ratones.
Se aislaron células T de ratones tratados con el protocolo de IL-10 (barras grises) o con rapamicina + antiTac (barras negras) o no trasplantados de control (barras blancas) y se estimularon in vitro policlonalmente con mAb antiCD3 y antiCD28.
Se producían niveles significativos de IL-10 solamente por las células aisladas de los ratones tratados con el protocolo de IL-10.
Los datos sugieren que IL-10 es necesaria para inducir las células productoras de IL-10 in vivo.
\vskip1.000000\baselineskip
Figura 8. Resultados preliminares con rapamicina + IL-10 para el tratamiento de la diabetes de tipo 1 en ratones NOD.
Los ratones NOD de 11 semanas de edad están en una fase de prediabetes. Estos ratones tienen insulitis e infiltración de células T autoinmunes en el páncreas, no obstante, todavía tienen suficientes islotes \beta normales capaces de producir suficiente insulina como para ser normoglucémicos.
Se trataron ratones prediabéticos diariamente comenzando a partir de las 11 semanas de edad con rapamicina, rapamicina + IL-10 o IL-10 sola. Seis semanas después del tratamiento, el 33% de los ratones de control desarrollaron diabetes, mientras que los ratones tratados con rapamicina e IL-10 todavía eran normoglucémicos.
Estos resultados preliminares sugieren que la rapamicina + IL-10 pueden usarse para bloquear la diabetes en su fase temprana y para prevenir el desarrollo espontáneo posterior de la diabetes autoinmune en su fase más avanzada.
\vskip1.000000\baselineskip
Figura 9. El protocolo de IL-10 inhibe la diabetes inducida en ratones NOD.SCID después de la transferencia de células T diabetogénicas.
Se transfirieron por vía intravenosa 5 x 10^{6} esplenocitos de ratones NOD diabéticos a ratones de NOD.SCID. Los ratones receptores se dejaron sin tratar o se trataron con el protocolo de Edmonton (rapamicina + antiTac + FK506), con el protocolo de IL-10 (rapamicina + antiTac + IL-10) o con rapamicina + antiTac durante 40 días después de la transferencia.
Cincuenta días después de la transferencia todos los ratones de control sin tratar eran diabéticos.
Todos los ratones tratados con el protocolo de Edmonton y el 75% de los ratones tratados con rapamicina + antiTac se volvieron diabéticos. De forma interesante, sólo el 33% de los ratones tratados con el protocolo de IL-10 se volvieron diabéticos.
Estos datos preliminares indican que el protocolo de IL-10 inhibe la diabetes de tipo I inducida en ratones NOD.SCID por transferencia de células T diabetogénicas autoinmunes de NOD.
\vskip1.000000\baselineskip
Figura 10. El uso de rapamicina + IL-10 para el tratamiento de la diabetes de tipo 1.
A) Tratamiento de la diabetes en ratones NOD.
Se trataron ratones NOD de 11 semanas a 31 semanas de edad con IL-10 (IL-10, n = 7 ratones) o rapamicina (RAPA, n = 13 ratones) o rapamicina + IL-10 (RAPA/IL-10 n = 16 ratones) o vehículo (CNTR, n = 22 ratones). La incidencia de diabetes, controlada mediante los niveles de glucemia, era estable al menos hasta las 60 semanas de edad. La administración de rapamicina sola redujo la incidencia de diabetes desde el 95% hasta el 46%. La administración de IL-10 no tenía un efecto significativo sobre el desarrollo de la diabetes. El efecto protector de la rapamicina se mejoraba significativamente cuando se añadía IL-10 al tratamiento, reduciendo la incidencia de diabetes hasta el 13%.
B) Capacidad de esplenocitos de ratones NOD tratados para transferir la diabetes a ratones NOD.SCID.
Se transfirieron 5 x 10^{6} esplenocitos totales de ratones NOD diabéticos sin tratar (NOD DIABÉTICOS, n = 8) o ratones tratados con rapamicina (NOD con RAPA, n = 5) o con rapamicina + IL-10 (NOD con RAPA/IL-10 n = 13) a ratones NOD.SCID y se controló la incidencia de diabetes mediante los niveles de glucemia.
La transferencia de esplenocitos de ratones tratados con rapamicina dio como resultado un retraso significativo en el comienzo de la enfermedad en comparación con ratones a los que se les inyectaron esplenocitos de ratones NOD diabéticos. De forma importante, los esplenocitos de ratones tratados con rapamicina + IL-10 retrasaron aún más la transferencia de la diabetes.
\vskip1.000000\baselineskip
Figura 11. Contenido de células Tr en ratones tratados con rapamicina \pm IL-10.
Se evaluó la producción de citocinas por células T CD4^{+} (paneles izquierdos) y los porcentajes de células T CD4^{+} CD25^{+} (paneles derechos) mediante análisis de CBA y FACs, respectivamente, en el bazo (panel superior), ganglios linfáticos pancreáticos (PLN) (panel medio) y células infiltrantes en los islotes (IIC) (panel inferior) de ratones NOD diabéticos sin tratar (barras grises), ratones tratados con rapamicina (barras blancas) o ratones tratados con rapamicina + IL-10 (barras negras). Una elevada proporción de células Tr1 CD4^{+}, como se determinó por su perfil de producción de citocinas (es decir, IL-10^{++} IL-15^{+} TGF-\beta^{+}), estaba presente sólo en los bazos de ratones tolerantes tratados con rapamicina + IL-10 (barras negras). Los porcentajes de células T CD4^{+} CD25^{+} eran superiores en el bazo, PLN e IIC de ratones tratados tanto con rapamicina sola como con rapamicina + IL-10 (barras negras). Por lo tanto, en ratones tratados con rapamicina + IL-10, las células Tr1 están presentes en el bazo y las células Tr CD4^{+} CD25^{+} están presentes en el bazo, los ganglios linfáticos y el páncreas.
\vskip1.000000\baselineskip
Figura 12. Capacidad de células Tr para suprimir respuestas inmunes in vitro .
Se ensayó la actividad supresora in vitro de células Tr sobre la proliferación de células T de NOD sin tratar CD4^{+} marcadas con CFSE y cultivadas en presencia de mAb antiCD3. Se usaron células T esplénicas enriquecidas para CD4^{+} IL-10 (pureza \sim40%) (panel izquierdo) o células T CD4^{+} CD25^{+} (MAC purificadas, pureza \geq75%) (panel derecho) como células supresoras añadidas en un número igual al de células T sin tratar. Se usaron como control células T sin tratar divididas en ausencia de cualquier célula añadida (barras grises). Se evaluó la división celular en presencia de células Tr1 enriquecidas para CD4^{+} IL-10 o células Tr CD4^{+} CD25^{+}, aisladas a partir de ratones NOD diabéticos sin tratar (barras negras) o de ratones tratados con rapamicina (barras blancas) o de ratones tratados con rapamicina + IL-10 (barras punteadas) y se determinaron los porcentajes de supresión con respecto al control (números en la parte superior de cada histograma). Las células Tr1 de bazos de ratones tratados con rapamicina + IL-10 suprimen moderadamente las respuestas proliferativas de células T CD4^{+} obtenidas de ratones NOD. Se observó una fuerte supresión con células T CD4^{+} CD25^{+} aisladas de PLN e IIC de ratones tratados tanto con rapamicina como con rapamicina + IL-10.
Ejemplos
Ejemplo 1
(Comparativo)
1. Trasplante alogénico de islotes \beta. Se usó un modelo de alotrasplante de islotes murinos completamente no coincidente (C57BL/6 en Balb/C). El trasplante alogénico de islotes \beta pancreáticos se está convirtiendo en una alternativa válida a la terapia de reemplazo de insulina o al trasplante de páncreas para la curación de la diabetes de tipo 1. En los últimos años, los procedimientos mejorados para el aislamiento y la conservación de células \beta humanas y el desarrollo de nuevos agentes inmunosupresores han mejorado significativamente el resultado clínico de estos trasplantes. En concreto, recientemente se ha demostrado que un nuevo tratamiento inmunosupresor sin esteroides basado en rapamicina + antiTac + FK506 (el protocolo de Edmonton) induce una independencia de la insulina en el 80% de los pacientes a 1 año después del trasplante (Shapiro y col., 2000). Estos resultados superan en gran medida los obtenidos con todas las terapias de combinación inmunosupresoras anteriores. Sin embargo, no se ha producido la demostración de que este tratamiento puede inducir tolerancia. De forma importante, el mecanismo de acción del FK506 puede impedir la inducción de un estado de tolerancia debido a la prevención de la apoptosis y a la inhibición del desarrollo de
células Tr.
En un intento de desarrollar un protocolo tolerogénico se diseñó un tratamiento en el que se reemplazaba el FK506 en el protocolo de Edmonton por IL-10 (es decir, protocolo de IL-10: rapamicina + antiTac + IL-10).
Se realizaron trasplantes bajo la cápsula renal con islotes \beta de C57BL/6 alogénicos purificados en ratones Balb/c que se habían vuelto diabéticos por inyección de estreptozotocina. La supervivencia del injerto era similar (89% y 100% a los 240 días después del trasplante) en ratones tratados con el protocolo de IL-10 y con el protocolo de Edmonton, respectivamente (Figura 1).
El uso in vivo de antiTac se ha apoyado firmemente en los últimos años en la necesidad de bloquear células T activadas con elevada expresión de la cadena \alpha del IL-2R. Sin embargo, se ha demostrado ampliamente que un subconjunto de células Tr expresan de forma constitutiva la cadena \alpha de IL-2R (es decir, células Tr CD4^{+} CD25^{+}) y que esta población de células T es capaz de suprimir el rechazo de aloinjertos (Taylor y col., 2002). Por lo tanto, el uso de un mAb que bloquee la población de células T CD25^{+} podría estar contraindicado cuando se busca una inducción de la tolerancia in vivo mediada por células Tr. Por esta razón, se evaluó la eliminación de antiTac del protocolo de tratamiento. Se trataron ratones trasplantados durante 30 días con rapamicina + IL10 o IL-10 sola para determinar si sería suficiente para prevenir el rechazo de los islotes (Figura 2). Se obtuvo una supervivencia de injertos a largo plazo en el 30% de los ratones tratados con IL-10 sola y aumentaba hasta el 78% en ratones tratados con rapamicina + IL-10. Este nivel de supervivencia de injertos era sólo ligeramente inferior al de ratones que además se trataron con antiTac (como se muestra en la Figura 1). Estos datos indican que la ausencia del mAb antiTac del protocolo de IL-10 permite la supervivencia de aloinjertos al tiempo que no se afectan las células Tr CD4^{+} CD25^{+} y podría preservarse la inducción de la tolerancia in vivo por estas células.
Puesto que uno de los resultados deseados es la tolerancia en lugar de la inmunosupresión, se examinó si las células T de ratones tratados con los protocolos de IL-10 y de Edmonton eran sensibles a la estimulación policlonal y específica de antígeno. En primer lugar, se aislaron células T de bazos de ratones el día 240 después del trasplante (210 días después del cese del tratamiento) y se estimularon con mAb antiCD3 y antiCD28 (Figura 3). La proliferación de células T de ratones tratados con el protocolo de Edmonton se suprimía claramente cuando se comparaba con la de células T de ratones de control sin trasplantes. La supresión de la proliferación de células T no era tan intensa en ratones tratados con el protocolo de IL-10 (Figura 3). A continuación, 280 días después del trasplante (250 días después del cese del tratamiento) los ratones se inmunizaron con CFA más OVA en la almohadilla plantar posterior y se midieron las respuestas proliferativas de células T aisladas de los ganglios linfáticos de drenaje (Figura 4). Las células T de ratones tratados con el protocolo de Edmonton no proliferaron en respuesta a OVA, mientras que las células T de ratones tratados con el protocolo de IL-10 tenían respuestas similares a las de los ratones de control sin trasplantes inmunizados (Figura 4).
Para determinar si el reemplazo de FK506 por IL-10 promovía potencialmente la expansión de células Tr1, se aislaron células T CD4^{+} infiltrantes del lugar de trasplante de los islotes de ratones 200 días después del trasplante y se examinó su producción de citocinas. Las células T CD4^{+} aisladas de ratones tratados con el protocolo de IL-10 producían cantidades significativamente mayores de IL-10 después de la estimulación con mAb antiCD3 y antiCD28 que los ratones tratados con el protocolo de Edmonton (Figura 5). Después, se estimularon células T de bazo purificadas con mAb antiCD3 y antiCD28 y las células secretoras de IL-10 se enriquecieron usando perlas de captura de IL-10 (Figura 6A). Se examinó el perfil de citocinas IL-10/IL-4 mediante tinción intracitoplasmática (Figura 6B). De forma interesante, se identificó una población diferente de células IL-10^{+} IL-4^{-} (es decir, que reflejaban el perfil de citocinas de células Tr1) sólo en los ratones tratados con el protocolo de IL-10.
Las células infiltrantes de ratones tratados con rapamicina + antiTac en ausencia de IL-10 no producían IL-10, indicando que la producción de IL-10 in vitro aumentada se debía a la administración in vivo de IL-10 (Figura 7).
En su conjunto, estos datos indican que:
1. La combinación de rapamicina + antiTac + FK506 (protocolo de Edmonton) protege a los ratones del rechazo de aloinjertos, pero induce un estado de inmunosupresión crónica de larga duración.
2. La combinación de rapamicina + antiTac + IL-10 (protocolo de IL-10) proporciona una protección a largo plazo frente al rechazo de aloinjertos. Este tratamiento da como resultado la expansión de una población diferente de células T, con perfiles de citocinas que concuerdan con los de células Tr1, y la protección se mantiene después de la retirada del fármaco, a pesar de la recuperación de la inmunocompetencia de células T.
Ejemplo 2
1. Resultados preliminares en diabetes de tipo I. También se evaluó el efecto tolerogénico de rapamicina + IL-10 en un entorno de diabetes de tipo I.
Se piensa que la prevención de la destrucción de células \beta, que se asocia con la evolución de la diabetes de tipo I y se encuentra al comienzo de la enfermedad, puede prevenirse mediante:
1. Regulación negativa de la inflamación "testigo" general dentro del páncreas.
2. Bloqueo de la expansión de células T efectoras específicas de islotes.
3. Inducción y expansión de células Tr específicas de antígeno.
En el protocolo propuesto, debería conseguirse la regulación negativa de la inflamación mediante IL-10 y el bloqueo de la expansión de células T efectoras debería conseguirse mediante la rapamicina. Ni la IL-10 ni la rapamicina impiden la sensibilización de células T y, por lo tanto, deberían permitir la inducción de células T reguladoras específicas de antígeno y, como se describe a continuación, la IL-10 debería promover la inducción y la expansión de células Tr1. Se investigó el efecto de la rapamicina sola o en combinación con IL-10 en el tratamiento de la autoinmunidad en el ratón NOD, un modelo para la diabetes de tipo I. El ratón NOD desarrolla una enfermedad patente a las 15-30 semanas de edad, con destrucción de las células \beta de los islotes y elevaciones de la glucosa en sangre, y comparte muchas características clave con la enfermedad humana (Tisch y col. 1996, Delovitch y col. 1997). Se evaluó la inhibición de la diabetes de tipo I mediante el tratamiento de ratones NOD diariamente, comenzando a las 11 semanas de edad (es decir, ratones prediabéticos con periinsulitis), con rapamicina, rapamicina + IL-10 o IL-10 sola. Seis semanas después del tratamiento, el 33% de los ratones de control sin tratar comenzaban a desarrollar diabetes, mientras que los ratones tratados con rapamicina + IL-10 todavía eran normoglucémicos (Figura 8).
También se ensayó la eficacia del protocolo en un modelo de transferencia adoptiva. Los ratones NOD.SCID, que carecen de células T y B endógenas y, por lo tanto, no desarrollan diabetes espontáneamente, desarrollan diabetes en 15-20 días después de la transferencia de 5 x 10^{6} esplenocitos de un ratón NOD diabético. Los ratones receptores NOD.SCID se dejaron sin tratar o se trataron durante 40 días después de la transferencia de células diabéticas con rapamicina + antiTac + FK506 (protocolo de Edmonton), rapamicina + antiTac + IL-10 (protocolo de IL-10) y rapamicina + antiTac (Figura 9). Los ratones de control comenzaron a desarrollar diabetes 15 días después de la transferencia. Todos los ratones tratados con el protocolo de Edmonton y el 75% de los ratones tratados con rapamicina + antiTac se volvieron diabéticos a los 33 días después de la transferencia. De forma interesante, solo un ratón de los tres tratados con el protocolo de IL-10 (el 33%) se volvió diabético a los 35 días después de la transferencia.
En su conjunto, estos datos preliminares proporcionan fuertes razones para el uso de rapamicina + IL-10 para inhibir el desarrollo completo de la diabetes de tipo I.
2. La terapia con rapamicina + IL-10 inhibe la diabetes autoinmune e induce una tolerancia a largo plazo. En base a los prometedores resultados preliminares obtenidos en el modelo de ratón NOD (Figura 8) se trataron ratones NOD durante 20 semanas con rapamicina \pm IL-10, comenzando a las 11 semanas de edad, un momento en el que la autoinmunidad celular pancreática está claramente establecida, a juzgar por la insulitis y los anticuerpos auto-insulina. La administración de rapamicina sola redujo la incidencia de diabetes desde el 95% hasta el 46% (Figura 10A). Las observaciones previas indicaban que los efectos de la terapia de IL-10 en ratones NOD varían dependiendo de la vía, la dosis y el momento de la administración (Roncarolo y col. 2003). Sin embargo, aquí se demuestra que la administración de IL-10 sola a lo largo del mismo periodo de tiempo no tiene un efecto significativo sobre el desarrollo de la diabetes. El efecto protector de la rapamicina se mejoraba significativamente cuando se añadía IL-10 al tratamiento, reduciendo adicionalmente la incidencia de diabetes hasta el 13% (Figura 10A). De forma interesante, la protección se mantenía durante 30 semanas adicionales después de que se interrumpiera el tratamiento, demostrando el establecimiento de una inmunomodulación a largo plazo.
El mecanismo por el que la rapamicina o la rapamicina + IL-10 previenen el desarrollo de la diabetes autoinmune se investigó adicionalmente en experimentos de transferencia con células de ratones tolerantes. La transferencia de esplenocitos de ratones NOD diabéticos sin tratar a ratones NOD.SCID inmunodeficientes inducía rápidamente la diabetes, mientras que la transferencia de esplenocitos de ratones tratados con rapamicina daba como resultado un retraso significativo en el comienzo de la enfermedad. De forma interesante, la transferencia de esplenocitos de ratones tratados con la combinación de rapamicina + IL-10 retrasaba aun más la transferencia de la diabetes (Figura 10B). Estos datos indican que el tratamiento con rapamicina regula negativamente la capacidad de células T autorreactivas esplénicas para transferir la diabetes y que este efecto se potencia enormemente cuando se añade IL-10 al tratamiento.
Los mecanismos que subyacen a la tolerancia a largo plazo se analizaron en ratones tolerantes de 50 semanas de edad o mayores. Aunque los bazos de ratones NOD diabéticos sin tratar o ratones tratados con rapamicina \pm IL-10 contenían números de células comparables y la misma proporción de células T CD4^{+} y CD8^{+}, sus perfiles de producción de citocinas eran diferentes. Una elevada proporción de células Tr1 CD4^{+}, como se determinaba por su perfil de producción de citocinas (es decir, IL-10^{++} IL-5^{+} TGF-\beta^{+}) estaba presente en bazos de ratones tolerantes tratados con rapamicina + IL-10, pero no en bazos de ratones tratados con rapamicina sola o ratones NOD diabéticos sin tratar (Figura 11). Sin embargo, la proporción de células T CD4^{+} esplénicas que producían IL-4 era la misma en ratones tanto sin tratar como tratados. Además, los porcentajes de células T CD4^{+} CD25^{+} esplénicas eran superiores en los ratones tanto tratados con rapamicina sola como con rapamicina + IL-10, en comparación con ratones NOD diabéticos sin tratar (Figura 11). Por el contrario, no pudieron detectarse células Tr1 en ganglios linfáticos pancreáticos (PLN) y células infiltrantes en los islotes (IIC) (Figura 11), indicando que no están presentes células Tr1 en el lugar de la autoinmunidad. Por otro lado, se observaron células T CD4^{+} CD25^{+} en números elevados en PLN y representaban casi el 100% de las células T CD4^{+} aisladas de las IIC de ratones tratados con rapamicina sola o con rapamicina + IL-10, pero no en ratones diabéticos sin tratar (Figura 11). Estas células T CD4^{+} CD25^{+} de IIC eran anérgicas y no producían niveles significativos de citocinas, con excepción de TGF-\beta.
A continuación, se determinó si las células Tr1 presentes en bazos de ratones tratados con rapamicina + IL-10 y las células CD4^{+} CD25^{+} de bazos, PLN e IIC de ratones tratados con rapamicina y con rapamicina + IL-10 tenían actividad supresora in vitro. Las células Tr1 de bazos de ratones tratados con rapamicina + IL-10 suprimieron moderadamente las respuestas proliferativas de células CD4^{+} obtenidas de ratones NOD (Figura 12). También se observó supresión con células T CD4^{+} CD25^{+} purificadas de bazos de ratones NOD diabéticos tanto tratados como sin tratar (Figura 12), que indica que también están presentes células Tr CD4^{+} CD25^{+} en bazos de ratones NOD diabéticos, pero a frecuencias mucho menores (se muestra en la Figura 11). De forma interesante, se observó una fuerte supresión con células CD4^{+} CD25^{+} aisladas de PLN e IIC de ratones tratados tanto con rapamicina como con rapamicina + IL-10. Por el contrario, células T CD4^{+} CD25^{+} aisladas de ratones NOD diabéticos sin tratar no tenían ninguna actividad supresora medible (Figura 12). Estos datos indican que el tejido pancreático de NOD diabéticos contiene en su mayoría células T efectoras activadas que células Tr, mientras que PLN e IIC de ratones tratados contienen predominantemente células Tr entre el subconjunto de CD4^{+} CD25^{+}.
En su conjunto, estos datos demuestran la tolerancia en fase estable observada después del tratamiento con rapamicina + IL-10 se asocia con la acumulación de células Tr1 en el bazo y de células Tr CD4^{+} CD25^{+} en los ganglios linfáticos y en el páncreas.
Materiales y procedimientos
Ratones. Se adquirieron ratones hembra Balb/c, C57BL/6, NOD/Lt y NOD.SCID de Charles River Laboratories (Calco, Italia). Todos los ratones se mantuvieron en condiciones libres de patógenos específicos. Se cuantificaron los niveles de glucosa en la sangre venosa de la cola usando el sistema Glucometer Elite (Bayer, Wuppertal, Alemania). Se indujo una diabetes en ratones Balb/c mediante inyección intravenosa de estreptozotocina (Sigma, St. Louis, MO) a 170 mg/kg. Se realizó un diagnóstico de diabetes después de dos mediciones de glucosa secuenciales superiores a 250 mg/dl.
Trasplante de islotes. Se trasplantaron islotes pancreáticos de C57BL/6 escogidos a mano (300 islotes/ratones) después de cultivos de una noche a 37ºC, bajo la cápsula renal de ratones diabéticos Balb/c, como se ha descrito anteriormente (Davalli y col. 1996).
Tratamiento de ratones trasplantados. El tratamiento de ratones Balb/c trasplantados comenzó el día después del trasplante y duraba 30 días. Se diluyó la rapamicina (Rapamune, Wyeth-Ayerst Research, Pearl River, NY) en aceite de cacahuete (Sigma) y se administró una vez al día a una dosis de 1 mg/kg mediante sonda. Se diluyó IL-10 humana (BD Biosciences, Mountain View, CA) en PBS y se administró dos veces al día a una dosis de 0,05 mg/kg IP. Se diluyó FK506 (Prograf, Fujisawa, Milano) en solución salina y se administró una vez al día a una dosis de 0,3 mg/kg IP. Se diluyó mAb anti-cadena \alpha de IL-2R (antiTac) (clon 7D4, BD) en solución salina y se administró IP los días 0 y 4 después del trasplante, hasta alcanzar una dosis final de 1 mg/ratón. Se controló la incidencia de diabetes mediante los niveles de glucosa en sangre.
Estudio de inhibición de la diabetes. Se trataron ratones NOD hembra desde las 11 semanas de edad hasta las 31 semanas de edad con rapamicina, rapamicina + IL-10 o IL-10 sola a las mismas dosis usadas en los ratones trasplantados. Se controló la incidencia de la diabetes mediante los niveles de glucosa en sangre.
Estudio de transferencia de diabetes. Se recogieron esplenocitos de ratones hembra NOD diabéticos y se inyectaron IV en NOD.SCID a una dosis de 5 x 10^{6} por ratón. Los ratones receptores se dejaron sin tratar o se trataron con rapamicina + anti-Tac + FK506 o rapamicina + antiTac + IL-10 o con rapamicina + antiTac durante 40 días después de la transferencia, a las mismas dosis usadas en ratones trasplantados. Se controló la incidencia de diabetes mediante los niveles de glucosa en sangre.
Transferencia de células adoptivas en ratones NOD.SCID. Se extirparon bazos de ratones NOD de control y tratados después de interrumpir el tratamiento. Cinco millones de esplenocitos totales se transfirieron de forma adoptiva mediante inyección IV en ratones NOD.SCID. Se controló el desarrollo de la diabetes mediante los niveles de glucosa.
Inmunización in vivo . Se inyectó péptido 323-339 de ovoalbúmina (OVA) (Primm, Milano, Italia) emulsionado en CFA (Difco, Detroit, MI) a una dosis de 100 \mug/ratón una vez S. C. en las almohadillas plantares posteriores de ratones Balb/c trasplantados. Se extirparon ganglios linfáticos de drenaje y se usaron en los ensayos in vitro.
Selección de células. Se aislaron las células infiltrantes del páncreas como se ha descrito (Gregori y col., 2003). La población celular obtenida se incubó con microperlas recubiertas con mAb antiCD90 y se aplicaron sobre columnas MiniMacs (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Alemania) para obtener células T purificadas. Se seleccionaron células T CD4^{+}CD25^{+} con un kit Multisort (Miltenyi) (pureza media \geq 75%). En algunos experimentos, se seleccionaron células T CD4^{+} CD25^{+} asépticamente en un clasificador de células FACStar (BD) (pureza media = 99%). Se seleccionaron células productoras de IL-10 con el kit de detección y enriquecimiento por ensayo de secreción de IL-10 murina (Miltenyi) (pureza media \geq 40%).
Enriquecimiento de células positivas para IL-10. Se enriquecieron células que producían IL-10 por medio de un kit disponible en el mercado (Miltenyi). Se cultivaron células T purificadas a una concentración de 10^{6}/ml en presencia de antiCD3 inmovilizado y antiCD28 soluble. Después de 3 horas de cultivo, se recogieron las células y se marcaron durante 10 minutos a 4ºC con un diacuerpo que consistía en un mAb dirigido contra CD45 y otro mAb que captura la IL-10 murina. Después, las células se diluyeron hasta una concentración final de 10^{5}/ml y se dejó que secretaran citocinas durante 45 minutos a 37ºC. Después del periodo de captura de citocinas, las células se recogieron, se resuspendieron a 10^{8}/ml en PBS que contenía BSA al 0,5% y EDTA 5 nM (tampón) y se tiñeron durante 10 minutos a 4ºC con mAb de \alphaIL-10 conjugado con PE (BD). Las células se lavaron en tampón una vez, se resuspendieron a 10^{8}/ml y se tiñeron con microperlas anti-PE durante 10 minutos a 4ºC. Se aisló una población de células enriquecidas para IL-10 en columnas magnéticas. Se analizaron las muestras de células en un citómetro de flujo FACScalibur (BD).
Cultivos celulares. Para los experimentos de supresión, se tiñeron células T NOD CD4^{+} sin tratar con CFSE (Molecular Probes, Eugene, OR), como se describe en otro sitio (Lyons y col. 1994) y se cultivaron en placas de 96 pocillos (1 X 10^{5}/pocillo) en presencia de mAb antiCD3 10 \mug/ml (BD). Se añadieron células T CD4^{+} obtenidas de ratones NOD tratados durante 20 semanas con rapamicina o rapamicina + IL-10 en una proporción 1:1 al cultivo y se evaluó el porcentaje de células sin tratar divididas y se comparó con el porcentaje de células divididas en ausencia de cualquier célula añadida. Las células divididas se evaluaron por división de los acontecimientos contenidos en la población proliferante por los acontecimientos totales de CFSE^{+}. Para la medición de las citocinas liberadas en el medio, se cultivaron células T purificadas (1 X 10^{5}/pocillo) en placas de 96 pocillos estimuladas con antiCD3 inmovilizado 10 \mug/ml (BD) y antiCD28 soluble 1 \mug/ml (BD). Los sobrenadantes se recogieron después de 48 horas (para la detección de IL-5) y 96 horas (para la detección de IL-10 y TFG-\beta) de cultivo.
Citometría de flujo. Las células se tiñeron con los Ab indicados (todos de BD) y se analizaron con un citómetro de flujo FACScan equipado con un programa informático CellQuest (BD).
Medición de citocinas. Se cuantificaron las citocinas presentes en los sobrenadantes recogidos mediante ELISA de sándwich o ensayo basado en citometría de flujo (CBA) usando kits convencionales disponibles en el mercado (BD). Se midió el porcentaje de células que producían citocinas específicas mediante tinción intracelular. Se estimularon células T purificadas durante 6 horas con antiCD3 inmovilizado 10 \mug/ml y antiCD28 soluble 1 \mug/ml (BD) a una concentración de 1 X 10^{6}/ml. Se añadió brefeldina A durante las 3 horas finales del cultivo. Se realizó la tinción intracelular como se ha descrito anteriormente (Trembleau y col. 2000).
Bibliografía
Bacchetta, R., M. Bigler, y col. (1994). "High levels of interleukin 10 production in vivo are associated with tolerance in SCID patients trasplanted with HLA mismatched hematopoietic stem cells. Growth and expansion of human T regulatory type 1 cells are independent from TCR activation but require exogenous cytokines". Journal of Experimental Medicine 179 (2): 493-502.
Bacchetta R., Parkman R., y col. (1995) "Dysfunctional cytokine production by host-reactive T-cell clones isolated from a chimeric severe combined immunodeficiency patient trasplanted with haploidentical bone marrow". Blood 85: 1944-1953.
Baker, K. S., M. G. Roncarolo, y col. (1999). "High spontaneous IL-10 production in unrelated bone marrow trasplant recipients is associated with fewer trasplant-related complications and early deaths". Bone Marrow Trasplant 23 (11): 1123-9.
Battaglia, M., B. R. Blazar, y col. (2002). "The puzzling world of murine T regulatory cells". Microbes Infect 4 (5): 559-66.
Blaha, P. Bigenzahn, S., y col. (2003). "The influence of immunosuppressive drugs on tolerance induction through bone marrow trasplantation with costimulation blockade". Blood 101: 2886-2893.
Blazar, B. R., P. A. Taylor, y col. (1998). "Interleukin-10 dose-dependent regulation of CD4+ and CD8+ T cell-mediated graft-versus-host disease". Trasplantation 66 (9): 1220-9.
Davalli, A. M., L. Scaglia, y col. (1996). "Vulnerability of islets in the immediate posttrasplantation period. Dynamic changes in structure and function". Diabetes 45 (9): 1161-7.
Delovitch, T. L., B. Singh. (1997) "The nonobese diabetic mouse as a model of autoimmune diabetes: immune dysregulation gets the NOD"Immunity 6 (7): 727-738.
Gregori S., Giarratana N., y col. (2003) "Dynamics of pathogenic and suppressor T cells in development of autoimmune diabetes" J. Immunol 171: 4040-4047.
Groux, H., A. O'Garra, y col. (1997). "A CD4+ T-cell subset inhibits antigen-specific T-cell responses and prevents colitis". Nature 389 (6652): 737-42.
Hackstein, H., T. Taner, y col. (2002). "Rapamycin inhibits macropinocytosis and mannose receptor-mediated endocytosis by bone marrow-derived dendritic cells". Blood 100 (3): 1084-7.
Hempel, L., D. Korholz, y col. (1997), "High interleukin-10 serum levels are associated with fatal outcome in patients after bone marrow trasplantation". Bone Marrow Trasplant 20 (5): 365-8.
Hojo, M., T. Morimoto, y col. (1999). "Cyclosporine induces cancer progression by a cell-autonomous mechanism". Nature 397 (6719): 530-4.
Li, W., F. Fu, y col. (1999). "Recipient pretreatment with mammalian IL-10 prolongs mouse cardiac allograft survival by inhibition of anti-donor T cell responses". Trasplant Proc 31 (1-2): 115.
Lyons, A. B. Parish, C. R. (1994) "Determination of Iymphocyte division by flow cytometry"J Immunol Methods 171: 131-137.
Moore, K. W., R. de Waal Malefyt, y col. (2001). "Interleukin-10 and the interleukin-10 receptor". Annu Rev Immunol 19: 683-765.
Roncarolo M. G., Battaglia M., y col. (2003) "The role of interleukin 10 in the control of autoimmunity" J. Autoimm 4: 269-272
Sehgal, S. N. (1998). "Rapamune (RAPA, Rapamycin, sirolimus): mechanism of action immunosuppressive eftect results from blockade of signal transduction and inhibition of cell cycle progression". Clin Biochem 31 (5): 335-40.
Shapiro, A. M., J. R. Lakey, y col. (2000). "Islet trasplantation in seven patients with type 1 diabetes mellitus using a glucocorticoid-free immunosuppressive regimen". N Engl J Med 343 (4): 230-8.
Taylor, P. A., C. J. Lees, y col. (2002). "The infusión of ex vivo activated and expanded CD4(+) CD25(+) immune regulatory cells inhibits graft-versus-host disease lethality". Blood 99 (10): 3493-9.
Tisch, R. y H. McDevitt (1996). "Insulin-dependent diabetes mellitus". Cell 185 (3): 291-7.
Trembleau, S., G. Penna, y col. (2000). "Early Th1 response in unprimed nonobese diabetic mice to the tyrosine phosphatase-like insulinoma-associated protein 2, an autoantigen in type 1 diabetes". J Immunol 165 (12): 6748-55.
Wells, A. D., X. C. Li, y col. (1999). "Requirement for T-cell apoptosis in the induction of peripheral trasplantation tolerance". Nat Med 5 (11): 1303-7.
Yu, X., P. Carpenter, y col. (2001). "Advances in trasplantation tolerance". Lancet 357 (9272): 1959-63.

Claims (7)

1. El uso de una preparación farmacéutica combinada que contiene IL-10 y rapamicina como los ingredientes activos únicos para la fabricación de un medicamento para inducir una tolerancia inmune específica de antígeno en un sujeto afectado por una enfermedad autoinmune.
2. El uso de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicha enfermedad autoinmune se selecciona de artritis reumatoide, esclerosis múltiple, lupus eritematoso sistémico y diabetes de tipo I.
3. El uso de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la IL-10 es de origen humano o viral.
4. El uso de acuerdo con la reivindicación 3, en el que la IL-10 se conjuga con polietilenglicol (PEG).
5. El uso de acuerdo con las reivindicaciones 1-3, en el que la IL-10 y la rapamicina se administran simultáneamente, por separado o secuencialmente al sujeto.
6. El uso de acuerdo con las reivindicaciones 1-3, en el que la tolerancia inmune específica de antígeno está mediada por células Tr1 y/o células Tr CD4+ CD25+.
7. El uso de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la preparación farmacéutica está en forma de una solución, suspensión, comprimido o cápsula.
ES03767682T 2002-11-29 2003-11-27 Paramicina e il-10 para el tratamiento de enfermedades autoinmunes. Expired - Lifetime ES2312820T3 (es)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US42956102P 2002-11-29 2002-11-29
US429561P 2002-11-29

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2312820T3 true ES2312820T3 (es) 2009-03-01

Family

ID=32469339

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES03767682T Expired - Lifetime ES2312820T3 (es) 2002-11-29 2003-11-27 Paramicina e il-10 para el tratamiento de enfermedades autoinmunes.

Country Status (10)

Country Link
US (2) US20060127357A1 (es)
EP (2) EP1992356A3 (es)
JP (1) JP4628792B2 (es)
AT (1) ATE404196T1 (es)
AU (1) AU2003292137A1 (es)
CA (1) CA2507530C (es)
DE (1) DE60322937D1 (es)
DK (1) DK1565183T3 (es)
ES (1) ES2312820T3 (es)
WO (1) WO2004050090A1 (es)

Families Citing this family (34)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2367891T3 (es) 2000-09-29 2011-11-10 Schering Corporation Interleucina-10 pegilada.
GB0503936D0 (en) 2005-02-25 2005-04-06 San Raffaele Centro Fond Method
WO2006101972A2 (en) * 2005-03-17 2006-09-28 Elan Pharma International Limited Injectable compositions of nanoparticulate immunosuppressive compounds
EP1930415A4 (en) * 2005-09-30 2009-05-13 Univ Kyoto SCREENING METHOD FOR A COMPOUND CAPABLE OF IMPROVING THE PRODUCTION OF REGULATORY T CELLS AND PROCESS FOR PRODUCING REGULATORY T CELLS USING AN IMMUNOSUPPRESSE MACROLIDE ANTIBIOTIC
GB0603081D0 (en) * 2006-02-15 2006-03-29 Dynal Biotech Asa Oslo Method
EP2468293B1 (en) 2006-09-28 2014-10-22 Merck Sharp & Dohme Corp. Use of pegylated il-10 to prevent metastasis of a cancer or tumor to the lung
WO2008138017A2 (en) * 2007-05-08 2008-11-13 Beth Israel Deaconess Medical Center, Inc. Methods and compositions for modifying t cell immune responses and inflammation
WO2009145238A1 (ja) * 2008-05-27 2009-12-03 国立大学法人名古屋大学 免疫調節剤及びその利用
US8840899B2 (en) * 2008-08-05 2014-09-23 Emory University Use of mTOR inhibitors to enhance T cell immune responses
CA2937492C (en) 2008-11-11 2019-08-13 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Inhibition of mammalian target of rapamycin
CA2745443C (en) 2008-12-17 2017-02-21 Schering Corporation Mono- and di-peg il-10 production; and uses
US9283211B1 (en) 2009-11-11 2016-03-15 Rapamycin Holdings, Llc Oral rapamycin preparation and use for stomatitis
EA027410B1 (ru) 2011-04-29 2017-07-31 Селекта Байосайенсиз, Инк. Наноносители, вызывающие иммунную толерантность, для снижения ответной реакции цитотоксических t-лимфоцитов
EP2906214A1 (en) 2012-10-12 2015-08-19 The Board of Regents of The University of Texas System Use of mtor inhibitors to treat vascular cognitive impairment
WO2014160328A1 (en) 2013-03-13 2014-10-02 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Mtor inhibitors for prevention of intestinal polyp growth
RU2679889C2 (ru) 2013-04-18 2019-02-14 Армо Байосайенсиз, Инк. Способы применения интерлейкина-10 для лечения заболеваний и расстройств
CN105338968A (zh) 2013-05-03 2016-02-17 西莱克塔生物科技公司 降低或预防响应于非变应原性抗原的过敏反应的致耐受性合成纳米载体
CA2914837A1 (en) 2013-06-17 2014-12-24 Armo Biosciences, Inc. Method for assessing protein identity and stability
US10010588B2 (en) 2013-08-30 2018-07-03 Armo Biosciences, Inc. Methods of using pegylated interleukin-10 for treating hyperlipidemia
WO2015070060A1 (en) 2013-11-11 2015-05-14 Armo Biosciences, Inc. Methods of using interleukin-10 for treating diseases and disorders
ES2900426T3 (es) 2013-12-31 2022-03-16 Rapamycin Holdings Llc Preparaciones orales y uso de nanopartículas de rapamicina
US9700544B2 (en) 2013-12-31 2017-07-11 Neal K Vail Oral rapamycin nanoparticle preparations
CA2968049A1 (en) 2014-04-16 2015-10-22 Rapamycin Holdings, Llc Oral rapamycin preparation and use for stomatitis
CN106573072A (zh) 2014-06-02 2017-04-19 阿尔莫生物科技股份有限公司 降低血清胆固醇的方法
CA2957737A1 (en) 2014-09-07 2016-03-10 Selecta Biosciences, Inc. Methods and compositions for attenuating gene expression modulating anti-viral transfer vector immune responses
EP3206713A4 (en) 2014-10-14 2018-06-27 Armo Biosciences, Inc. Interleukin-15 compositions and uses thereof
CN107106655A (zh) 2014-10-22 2017-08-29 阿尔莫生物科技股份有限公司 使用白细胞介素‑10治疗疾病和病症的方法
WO2016126615A1 (en) 2015-02-03 2016-08-11 Armo Biosciences, Inc. Methods of using interleukin-10 for treating diseases and disorders
EP3302547A1 (en) 2015-05-28 2018-04-11 Armo Biosciences, Inc. Pegylated interleukin-10 for use in treating cancer
AU2016312510A1 (en) 2015-08-25 2018-03-08 Armo Biosciences, Inc. Methods of using Interleukin-10 for treating diseases and disorders
BR112019018748A2 (pt) 2017-03-11 2020-04-07 Selecta Biosciences Inc métodos e composições relacionados ao tratamento combinado com anti-inflamatórios e nanocarreadores sintéticos compreendendo um imunossupressor
EP3848065B1 (en) 2017-05-15 2023-07-26 C. R. Bard, Inc. Medical device with drug-eluting coating and intermediate layer
US11541152B2 (en) 2018-11-14 2023-01-03 Lutonix, Inc. Medical device with drug-eluting coating on modified device surface
US20220176084A1 (en) 2019-04-08 2022-06-09 Bard Peripheral Vascular, Inc. Medical device with drug-eluting coating on modified device surface

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5624823A (en) 1991-11-22 1997-04-29 The General Hospital Corporation DNA encoding procine interleukin-10
US6277635B1 (en) 1992-03-04 2001-08-21 Schering Corporation Use of interleukin-10 to produce a population of suppressor cells
US5368854A (en) * 1992-08-20 1994-11-29 Schering Corporation Use of IL-10 to treat inflammatory bowel disease
WO1994017773A2 (en) * 1993-02-01 1994-08-18 Université Libre de Bruxelles Use of a pharmaceutical composition comprising an effective amount of interleukin-10, an analog and/or an agonist of interleukin-10
US6022536A (en) 1995-08-09 2000-02-08 Schering Corporation Combined use of interleukin 10 and cyclosporin for immunosuppression therapy
JPH09165339A (ja) 1995-10-27 1997-06-24 American Home Prod Corp ラパマイシンを付与したドナー脾細胞を用いる臓器移植の延長
US6083919A (en) 1996-12-05 2000-07-04 University Of Florida Materials and methods for treating autoimmune disease
US6428985B1 (en) * 1998-12-02 2002-08-06 The Regents Of The University Of Michigan Immunosuppressive structural definition of IL-10
ES2367891T3 (es) * 2000-09-29 2011-11-10 Schering Corporation Interleucina-10 pegilada.
FR2824567B1 (fr) * 2001-05-11 2003-08-08 Inst Nat Sante Rech Med Procede d'obtention de lymphocytes tr1 regulateurs specifiques d'antigene

Also Published As

Publication number Publication date
EP1565183A1 (en) 2005-08-24
US20080069797A1 (en) 2008-03-20
JP4628792B2 (ja) 2011-02-09
CA2507530C (en) 2012-06-05
AU2003292137A1 (en) 2004-06-23
EP1565183B1 (en) 2008-08-13
WO2004050090A1 (en) 2004-06-17
EP1992356A2 (en) 2008-11-19
CA2507530A1 (en) 2004-06-17
ATE404196T1 (de) 2008-08-15
DK1565183T3 (da) 2008-12-01
US8329637B2 (en) 2012-12-11
JP2006511510A (ja) 2006-04-06
US20060127357A1 (en) 2006-06-15
DE60322937D1 (de) 2008-09-25
EP1992356A3 (en) 2010-06-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2312820T3 (es) Paramicina e il-10 para el tratamiento de enfermedades autoinmunes.
ES2765884T3 (es) Métodos de expansión y evaluación de linfocitos B y uso de linfocitos B expandidos para el tratamiento de enfermedades
ES2205792T3 (es) Celulas madre mesenquimatosas como inmunosupresores.
RU2531936C2 (ru) Средство, предназначенное для лечения и/или профилактики аутоиммунного заболевания и для образования регуляторных т-клеток
Sykes Immune tolerance: mechanisms and application in clinical transplantation
Gagliani et al. Transplant tolerance to pancreatic islets is initiated in the graft and sustained in the spleen
ES2769778T3 (es) Composiciones inmunomoduladoras
US9018006B2 (en) Stable Tregs and related materials and methods
ES2341341T3 (es) Anticuerpos terapeuticos humanizados contra las isoformas cd45.
JP2008500812A (ja) 免疫抑制サイトカイン
KR20200006985A (ko) 인간 알파 태아단백-특이적 t 세포 수용체 및 이의 용도
Verma et al. CD4+ CD25+ T cells alloactivated ex vivo by IL-2 or IL-4 become potent alloantigen-specific inhibitors of rejection with different phenotypes, suggesting separate pathways of activation by Th1 and Th2 responses
ES2423481T3 (es) Métodos de tratamiento de enfermedades autoinmunes
MX2008015395A (es) Uso de cd83 en terapias de combinacion.
Alvarez‐Fernández et al. Memory stem T cells modified with a redesigned CD30‐chimeric antigen receptor show an enhanced antitumor effect in Hodgkin lymphoma
BG64976B1 (bg) Сd154 блокадна терапия при трансплантация на тъкан от панкреатични острови
US9624469B2 (en) Regulatory immune cells with enhanced targeted cell death effect
Ciccocioppo et al. Concise review: Cellular therapies: The potential to regenerate and restore tolerance in immune-mediated intestinal diseases
Cannon et al. Cellular immunotherapy for ovarian cancer
Koreth et al. Low-dose interleukin-2 in the treatment of autoimmune disease
E Dumitriu et al. The role of T and B cells in atherosclerosis: potential clinical implications
ES2553267T3 (es) Timosina alfa 1 para uso en el tratamiento de la enfermedad de injerto contra huésped
JPH11510806A (ja) 免疫抑制治療のためのインターロイキン１０およびシクロスポリンの併用
ES2252970T3 (es) Tratamiento ex vivo de linfocitos t alogenicos y xenogenicos con la ayuda de antagonistas de gp39.
Chae et al. T Cell-specific immunosuppression using tautomycetin or PTD-conjugated protein drugs