ES2252970T3 - Tratamiento ex vivo de linfocitos t alogenicos y xenogenicos con la ayuda de antagonistas de gp39. - Google Patents
Tratamiento ex vivo de linfocitos t alogenicos y xenogenicos con la ayuda de antagonistas de gp39.Info
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Abstract
Un método para inducir tolerancia a células T o la no reactividad de las células T de donante hacia aloantígenos o xenoantígenos ex vivo, comprendiendo lo siguiente: (i) proporcionar un cultivo conteniendo células T de donante; (ii)producir un cultivo de reacción linfocitaria mixta añadiendo células que portan aloantígenos o xenoantígenos a dicho cultivo de células T de donante; (iii) añadir al cultivo de reacción linfocitaria mixta un antagonista del gp39; y (iv)mantener estas células en cultivo durante tiempo suficiente para que las células T de donante se vuelvan sustancialmente no reactivas hacia dichos aloantígenos o xenoantígenos en el trasplante en un huésped conteniendo células portando tales aloantígenos o xenoantígenos.
Description
Tratamiento ex vivo de linfocitos T
alogénicos y xenogénicos con la ayuda de antagonistas de gp39.
Se proporcionan métodos para tratar tejido u
órganos trasplantados (alogénicos o xenogénicos) ex vivo
para hacer tolerantes las células T, contenidas allí dentro, hacia
antígenos del donante (xenoantígenos o aloantígenos). El tejido u
órgano tratado puede ser trasplantado a un receptor, con riesgo
reducido de enfermedad de injerto contra huésped.
Para inducir la activación de células T antígeno
específicas y la expansión clonal, se tienen que liberar dos
señales, proporcionadas por células presentadoras de antígenos
(CPA), hacia la superficie de linfocitos T en reposo [Jenkins, M. y
Schwartz, R. (1987) J. Exp. Med. 165,
302-319; Mueller, D. L. y col. (1990) J.
Immunol. 144, 3.701-3.709; Williams, I. R. y
Unanue, E. R. (1990) J. Immunol. 145, 85-93].
La primera señal, que otorga especificidad a la respuesta
inmunológica, está mediada vía el receptor de células T (TCR)
después de la identificación del péptido antigénico extraño
representado en el contexto del complejo mayor de
histocompatibilidad (MHC). La segunda señal, denominada
coestimulación, induce a que las células T proliferen y lleguen a
ser funcionales [Schwartz, R. H. (1990) Science 248,
1.349-1356]. La coestimulación no es ni
antígeno-específica ni restringida por MHC, y se
cree que está proporcionada por una o más diferentes moléculas de
la superficie celular expresadas por CPA [Jenkins, M. K. y col.
(1988) J. Immunol. 140, 3.324-3.330;
Linsley, P. S. y col. (1991) J. Exp. Med. 173,
721-730; Gimmi, C. D. y col. (1991) Proc. Natl.
Acad. Sci. USA, 88, 6.575-6.579; Young, J. W. y
col. (1992) J. Clin. Invest. 90, 229-237;
Koulova, L. y col. (1991) J. Exp. Med. 173,
759-762; Reiser, H. y col. (1992) Proc. Natl.
Acad. Sci. USA, 89, 271-275;
van-Seventer, G. A. y col. (1990) J. Immunol.
144, 4.579-4.586; LaSalle, J. M. y col. (1991) J.
Immunol. 147, 774-80; Dustin, M. I. y col.
(1989) J. Exp. Med. 169, 503; Armitage, R. J. y col. (1992)
Nature 357, 80-82; Liu, Y. y col. (1992)
J. Exp. Med. 175, 437-445]. Una vía
coestimuladora involucrada en la activación de células T implica a
la molécula CD28 en la superficie de las células T. Esta molécula
puede recibir una señal coestimuladora liberada por un ligando en
las células B u otras CPA. Los ligandos para CD28 incluyen miembros
de la familia B7 de antígenos de la activación linfocitaria B tales
como B7-1 y/o B7-2 [Freedman, A. S.
y col. (1987) J. Immunol. 137, 3.260-3.267;
Freeman, G. J. y col. (1989) J. Immunol. 143,
2.714-2.722; Freeman, G. J. y col. (1991) J.
Exp. Med. 174, 625-631; Freeman, G. J. y col.
(1993) Science 262, 909-911; Azuma, M. y
col. (1993) Nature 366, 76-79; Freeman, G. J.
y col. (1993) J. Exp. Med. 178,
2.185-2.192]. El B7-1 y el
B7-2 son también ligandos para otra molécula, CTLA4,
presente en la superficie de células T activadas, aunque no está
claro el papel de la CTLA4 en la coestimulación.
La liberación a una célula T de una señal
antígeno específica, con una señal coestimuladora, conduce a la
activación de células T, la cual puede incluir la proliferación de
células T y la secreción de citoquinas. Por contraste, se cree que
la liberación a una célula T de una señal antígeno específica, en
ausencia de una señal coestimuladora, induce un estado de no
reactividad o anergia en la célula T, de ese modo induciendo
tolerancia antígeno-específica en la célula T.
Las interacciones entre las células T y las
células B juegan un papel central en las respuestas inmunológicas.
La inducción de inmunidad humoral hacia antígenos timodependientes
requiere la "ayuda" proporcionada por células T ayudadoras (Th
en lo sucesivo). Mientras que alguna ayuda proporcionada a los
linfocitos B está mediada por moléculas solubles liberadas por
células Th (por ejemplo, linfoquinas tales como IL-4
e IL-5), la activación de las células B también
requiere una interacción dependiente del contacto entre células B y
células Th. Hirohata y col., J. Immunol. 140,
3.736-3.744 (1988); Bartlett y col., J.
Immunol., 143, 1.745-1.754 (1989). Este indica
que la activación de las células B implica una interacción
obligatoria entre las moléculas de la superficie celular en las
células B y las células Th. La molécula(s) en la célula T,
por lo tanto, media las funciones efectoras ayudadoras,
dependientes del contacto, de la célula T. Una interacción
dependiente del contacto entre moléculas en las células B y las
células T está apoyada además por la observación de que las
membranas plasmáticas de células T activadas pueden proporcionar
funciones ayudadoras necesarias para la activación de las células
B. Brian, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:
564-568 (1988); Hodgkin y col., J. Immunol.,
145: 2.025-2.034 (1990); Noelle y col., J.
Immunol., 146: 1.118-1.124 (1991).
Se ha identificado una molécula, CD40, en la
superficie de linfocitos B inmaduros y maduros que, cuando se
reticula mediante anticuerpos, induce la proliferación de células B.
Valle y col., Eur J. Immunol., 19:
1.463-1.467 (1989); Gordon y col., J.
Immunol., 140: 1.425-1.430 (1988); Gruber y
col., J. Immunol., 142: 4.144-4.152 (1989).
La CD40 ha sido clonada y caracterizada molecularmente. Stamenkovic
y col., EMBO J., 1.403-1.410 (1989). También
ha sido clonado y caracterizado molecularmente un ligando para CD40,
gp39 (también llamado ligando CD40 o CD40L y, recientemente,
CD154). Armitage y col., Nature, 357: 80-82 (1992);
Lederman y col., J. Exp. Med., 175:
1.091-1.101 (1992); Hollenbaugh y col., EMBO
J., 11: 4.313-4.319 (1992). La proteína gp39 se
expresa en células CD4^{+} Th activadas pero no en reposo. Spriggs
y col., J. Exp. Med. 176: 1.543-1.550
(1992); Lane y col., Eur. J. Immunol., 22:
2.573-2.578 (1992); Roy y col., J. Immunol.,
151: 1-14 (1993). Células transfectadas con el gen
gp39, y expresando la proteína gp39 en su superficie, pueden
desencadenar la proliferación de células B y, junto con otras
señales estimuladoras, pueden inducir la producción de anticuerpos.
Armitage y col., Nature, 357: 80-82 (1992);
Hollenbaugh y col., EMBO J., 11: 4.313-4.319
(1992).
La enfermedad de injerto contra huésped (EICH) es
un proceso destructivo del sistema multiorgánico causado por la
infusión de células T alogénicas de donante en receptores. Debido a
que la enfermedad grave de injerto contra huésped ocurre en el
20-40% de los receptores de injertos de donante
hermano con HLA idéntico, y hasta en el 70-80% de
receptores de injertos de donante no afín, se necesitan enfoques
para prevenir esta complicación del trasplante de médula ósea.
Hasta la fecha, se han utilizado dos tipos generales de
estrategias. La primera implica la infusión in vivo de
agentes inmunosupresores tales como la metatricida, la ciclosporina
A, y los esteroides. Los casos anteriores de enfermedad grave de
injerto contra huésped son aquellos observados durante la infusión
in vivo de estos agentes inmunosupresores. Además de sus
efectos protectores incompletos, estos agentes inmunosupresores
conducen a periodos prolongados de inmunodeficiencia después del
trasplante de médula ósea, de ese modo exponiendo al receptor a
complicaciones infecciosas y aumentando potencialmente la
incidencia de recaída después del trasplante de médula ósea. Un
segundo enfoque general ha implicado la eliminación ex vivo
de las células T del injerto del donante. Este enfoque, aunque
razonablemente eficaz en prevenir la enfermedad grave de injerto
contra huésped produce una mayor incidencia de fracaso del injerto,
recaída, complicaciones infecciosas, y retrasa el tiempo de
reconstitución inmunológica.
Por contraste, la presente invención está
dirigida a un método para tratar ex vivo células T de
donante, para hacer tales células T sustancialmente no reactivas a
antígenos alogénicos o xenogénicos en el trasplante dentro de un
huésped. Más específicamente, la presente invención está dirigida a
un método para tratar ex vivo células T de donante con una
cantidad de al menos un antagonista del gp39 (CD154) y células o
tejidos alogénicos o xenogénicos, para hacer tales células T
sustancialmente no reactivas a antígenos de donante (aloantígenos o
xenoantígenos) en el trasplante dentro de un huésped conteniendo
tales células alogénicas o xenogénicas.
La presente invención proporciona, de este modo,
un medio eficaz para prevenir o inhibir las respuestas de la
enfermedad de injerto contra huésped que, de otra manera, ocurrirían
potencialmente en el trasplante de células T de donante, o tejidos
u órganos conteniendo, por ejemplo, células de médula ósea o
sanguíneas periféricas de donante dentro de un receptor.
Preferentemente, las células T de donante serán
incubadas ex vivo con una cantidad suficiente de anticuerpo
anti-gp39 y células del receptor del trasplante,
durante tiempo suficiente, para hacer las células T de donante
sustancialmente no reactivas a células del receptor en el
trasplante.
Esto será llevado a cabo, generalmente,
conduciendo una reacción linfocitaria mixta in vitro
utilizando células T de donante y estimuladores portando
aloantígenos o xenoantígenos mermados de células T del huésped. A
este cultivo se añadirá un antagonista del gp39, preferentemente un
anticuerpo o fragmento de anticuerpo que se una específicamente a
gp39 (CD154). Alternativamente, el antagonista del gp39 puede
constar de CD40 soluble o proteína de fusión CD40 soluble, por
ejemplo, CD40Ig.
La Figura 1 muestra el efecto del tratamiento con
mAb anti-CD40L de células T de donante en un cultivo
MLR primario.
La Figura 2A muestra el efecto de la adición de
mAb anti-CD40L (gp39) en la producción de
IL-2 en un cultivo MLR primario.
La Figura 2B muestra el efecto de mAb
anti-CD40L hacia la producción de interferones gamma
en un cultivo MLR primario.
La Figura 3A demuestra que la inducción de
hiporreactividad anti- aloantígenos del huésped, por mAb
anti-CD40L en cultivos secundarios, es reversible
mediante IL-2 exógeno.
La Figura 3B demuestra que las células T de
donante, expuestas a mAb anti-CD40 en un cultivo MLR
primario, tienen respuestas íntegras a IL-2 en un
cultivo secundario.
La Figura 4A demuestra que la adición de mAb
anti-CD40L a un cultivo MLR primario inhibe la
producción de IL-1, como se midió en un cultivo MLR
secundario.
La Figura 4B demuestra que la adición de mAb
anti-CD40L a un cultivo MLR primario inhibe la
producción de interferones gamma, como se midió en un cultivo MLR
secundario.
La Figura 5A demuestra que el tratamiento con mAb
anti-CD40L de células T de donante, en un cultivo
MLR, redujo notablemente in vivo la capacidad de EICH.
La Figura 5B muestra el efecto del tratamiento
anti-CD40L en el peso corporal medio después del
trasplante.
Se entenderá que los términos siguientes tienen
las definiciones siguientes:
Célula alogénica: se refiere a una célula
obtenida a partir de un individuo diferente de la misma especie que
el receptor.
Aloantígeno: se refiere a una célula
obtenida a partir de un individuo diferente de la misma especie que
el receptor.
Célula xenogénica: se refiere a una célula
obtenida de una especie diferente con respecto a otra especie,
típicamente un receptor de trasplante (por ejemplo, las células T de
mandril estarían incluidas en células xenogénicas si se
trasplantasen en un receptor humano).
Xenoantígeno: se refiere a un antígeno
expresado mediante una célula obtenida a partir de una especie
diferente con respecto a otra especie, típicamente un receptor de
trasplante.
Antagonista del gp39: se refiere a una
molécula que interfiere con la interacción gp39
(CD154)-CD40. Preferentemente, un antagonista del
gp39 será un anticuerpo dirigido contra el gp39 (por ejemplo, un
anticuerpo monoclonal específico para gp39 humano), o un fragmento
o derivado del mismo (por ejemplo, Fab, fragmento
F(ab')_{2}, anticuerpo quimérico, anticuerpo humano o
anticuerpo humanizado). También, los antagonistas del gp39 incluyen
formas solubles de una proteína de fusión de un ligando gp39 (por
ejemplo, CD40Ig soluble) o agentes farmacéuticos que interfieren
con la interacción go39-CD40.
Gp39 o CD154 o CD40 o CD40CR es una
molécula expresada en la superficie de una célula T que interactúa
con una molécula, CD40, identificada en la superficie de linfocitos
B inmaduros y B maduros, que está implicada en inducir la
proliferación de células B. Específicamente, la interacción con gp39
en células T con CD40 en células B juega un papel central al
activar las respuestas de las células B hacia un antígeno. También,
se ha descubierto que el gp39 juega un papel importante en la
respuesta de las células T hacia antígenos, por ejemplo, alo y
xenoantígenos.
No reactividad de las células T o tolerancia
de las células T en la presente invención se refiere a la
respuesta inmunológica reducida (respuesta de injerto contra
huésped) obtenida por células T de donante contra células portando
alo o xenoantígenos, en el trasplante de estás células T de donante
en un receptor después de que hayan sido puestas en contacto ex
vivo con un agonista del gp39 (anticuerpo
anti-gp39) y células portando xeno o
aloantígenos.
Como se comentó, la presente invención
proporciona un enfoque alternativo para la prevención de la
enfermedad de injerto contra huésped en el trasplante de
composiciones conteniendo células T de donante, por ejemplo,
células de médula ósea o sanguíneas periféricas alogénicas o
xenogénicas.
Se sabe que una proporción muy pequeña de las
células T de donante poseen la capacidad de identificar el
aloantígeno del huésped (se estima que es inferior al 0'0%). La
presente invención busca eliminar esta respuesta (hacer tales
células no reactivas o tolerantes al aloantígeno o xenoantígeno)
alterando funcionalmente la población de células T con capacidades
reactivas a alo o xenoantígenos.
Se hipotetizó por los presentes inventores que
esto se podría llevar a cabo potencialmente iniciando una reacción
linfocitaria mixta de células T de donante y estimuladores portando
aloantígenos o xenoantígenos mermados de células T irradiadas, y
añadiendo a este cultivo de la reacción linfocitaria mixta un
antagonista del gp39, en particular un anticuerpo
anti-gp39. La esperanza fue que éste interfiriese
con las interacciones gp39-CD40 in vitro
(entre la célula T de donante y células portando aloantígenos o
xenoantígenos), y hacer tolerantes o no reactivas a tales células
hacia las células portando aloantígenos o xenoantígenos en el
trasplante dentro de un receptor del trasplante. Se hipotetizó que
esto sería potencialmente posible basado en los informes previos
con éxito en la bibliografía, incluyendo los de los presentes
inventores, acerca de inducir tolerancia a las células T hacia el
tejido alogénico o xenogénico in vivo mediante el tratamiento
del receptor del trasplante con antagonista del gp39 (anticuerpo
anti-gp39), solo o en combinación con células
alogénicas o xenogénicas, antes de, contemporáneamente o posterior
al trasplante de tejido u órgano xenogénico o alogénico. Se ha
demostrado que este enfoque in vivo es sumamente eficaz para
indicar tolerancia a las células T hacia diversos tejidos u
órganos, por ejemplo, hígado, piel, tejido cardíaco, y
siguientes.
Sin embargo, era impredecible que esta
metodología pudiera ser extendida a la inducción de tolerancia o no
reactividad in vitro a las células T. Este resultado no era
razonablemente previsible porque estudios previos relatados en la
bibliografía han demostrado que no hay necesidad de que el gp39 esté
presente para la inducción de la activación de células T in
vitro. Por ejemplo, Flavel y colegas [Nature, 378:
617-620 (1995)] han demostrado que células T
transgénicas para el receptor de células T, que eran genéticamente
deficientes en expresión de gp39, respondieron normalmente a
células presentadoras de antígenos y al antígeno. Esto demostró que
la activación de las células T no requiere gp39 y, en efecto, puede
ocurrir normalmente en ausencia de gp39 in vitro.
Específicamente, lo datos reportados por Grewal,
J. S. y col., Nature, 378: 617-620 (1995),
"Impairment of antigen-specific
T-cell priming in mice lacking CD40 ligand",
demostraron que no hay necesidad de que esté presente gp39 para la
activación in vitro a corto plazo de células T, y que se
puede generar la tolerancia de las células T aloespecíficas in
vitro, en ausencia de gp39.
Por lo tanto, ha sido bastante inesperado
demostrar que la tolerancia de las células T o la no reactividad de
las células T de donante puede ser inducida eficazmente in
vitro incubando tales células con un antagonista del gp39 y
células alogénicas o xenogénicas del receptor, las cuales están
mermadas de células T del receptor. Esta técnica proporciona un
tremendo potencial en el tratamiento de receptores de trasplantes
puesto que da un método sumamente eficaz no invasivo de hacer las
células T trasplantadas, contenidas en el tejido u órgano
trasplantado, tolerantes o no reactivas a aloantígenos o
xenoantígenos del receptor. Por consiguiente, este tejido u órgano
trasplantado, esto es, la médula ósea xenogénica o alogénica no
debería obtener una respuesta adversa de injerto contra huésped en
el trasplante. Además, el hecho de que la tolerancia sea inducida
in vitro es además ventajoso ya que este tratamiento puede
ser utilizado conjuntamente con otras estrategias antirrechazo,
esto es, ciclosporina u otros inmunosupresores. También, puede ser
combinado con la administración de anticuerpo
anti-gp39 (u otro ligando) antes, contemporáneamente
o posterior al trasplante.
De hecho, el método objeto puede eliminar la
necesidad de otros fármacos antirrechazo que, dada su actividad
inmunosupresora, pueden producir efectos secundarios adversos, por
ejemplo, riesgo incrementado de infección o cáncer.
En la forma de realización preferida, las células
T del donante, por ejemplo, un donante alogénico o xenogénico,
serán cultivadas in vitro con tejido alogénico o xenogénico
del receptor que ha sido tratado (por ejemplo, irradiado) para
mermar la células T del huésped. A este cultivo se añadirá una
cantidad eficaz de un antagonista del gp39, típicamente un
anticuerpo anti-gp39 (por ejemplo anticuerpo
24-31 ó 89-76
anti-gp39 humano revelado en la Patente U.S. Nº
5.876.718). Este cultivo será mantenido durante un tiempo suficiente
para inducir tolerancia a las células T. Típicamente, este tiempo
oscilará desde aproximadamente 1-2 días hasta 30
días, más típicamente unos 5-15 días, y muy
típicamente, unos 10 días.
Después de cultivar, se pueden comprobar las
células T de donante para determinar si logran una
anti-alo o xenorrespuesta del huésped. También, se
puede determinar si tales células permanecen viables y, de otra
manera, obtienen una actividad normal de las células T después del
tratamiento, por ejemplo, respuestas a IL-2.
Como se muestra en los Ejemplos que siguen, se ha
descubierto que las células T de donante, cuando son tratadas según
la invención, exhiben respuestas anti-xeno o
aloantígenos del huésped notablemente romas, mantuvieron la
viabilidad, y además mantienen respuestas íntegras a
IL-2. También, en la reestimulación, las células T
de donante mantuvieron su hiperreactividad
anti-aloantígeno del huésped.
También se observó que, en el MLR primario, se
redujo fuertemente la producción de citoquinas de las T ayudadoras
Tipo 1 (Th 1). De manera similar, en cultivos de reestimulación
secundarios, también se redujo notablemente la producción de
citoquinas Th 1.
Además, se descubrió que la administración in
vivo de números equivalentes de células T de control o tratadas
con anticuerpo monoclonal anti-gp39 (CD154) tenían
propiedades de enfermedad de injerto contra huésped notablemente
diferentes. Específicamente, los receptores de números tres veces
superiores de células T de donante en los controles tuvieron un
índice de supervivencia actuarial del 50% comparado con el 0% en los
controles. En otros experimentos, se observó hasta una diferencia
de 30 veces en los potenciales de enfermedad de injerto contra
huésped utilizando células T tratadas con anticuerpo monoclonal
anti-gp39 (CD154). Basados en esto, hemos concluido
de manera sorprendente que las células T de donante pueden ser
hechas tolerantes eficazmente ex vivo mediante una reacción
linfocitaria mixta. Esto proporcionaría un nuevo enfoque importante
para invocar la tolerancia de las células T de donante hacia
células y xenoantígenos del huésped.
El método proporciona un potencial significante
en el área de las terapias de trasplante de médula ósea o de
células sanguíneas periféricas. El trasplante de médula ósea y de
células madre se utiliza, convencionalmente, para el tratamiento de
diversas enfermedades tales como la leucemia y otras enfermedades
que impliquen inmunodeficiencias celulares. Además, el trasplante
de médula ósea también puede proporcionar beneficios en el
tratamiento de otras enfermedades tales como en el tratamiento de
enfermedades autoinmunes. Sin embargo, un riesgo frecuente asociado
con la terapia convencional por trasplante de médula ósea es el
riesgo de obtener una respuesta de EICH. El método objeto debería
reducir o incluso eliminar tal riesgo y, de ese modo, ampliar las
indicaciones clínicas para las terapias del trasplante de médula
ósea.
Esencialmente, estos métodos comprenderán el
tratar células de médula ósea o sanguíneas periféricas ex
vivo como se describió antes, y la introducción de las células
tratadas de médula ósea o sanguíneas periféricas en el receptor
necesitado de tal tratamiento, por ejemplo, un paciente con cáncer o
persona padeciendo una enfermedad autoinmune necesitado de
reconstitución inmunológica, debido a que sus propias células
linfoides han sido mermadas a consecuencia de la enfermedad o
tratamiento de la enfermedad (por ejemplo, debido a un tratamiento
de radiación).
El presente método se puede combinar con otros
tratamientos antirrechazo, por ejemplo, la infusión in vivo
de agentes de inmunosupresión tales como la metatricida, la
ciclosporina A, los esteroides, o la administración de antagonista
del gp39.
Idealmente, el presente método proporcionará en
un receptor la reconstitución inmunológica de las células T de
donante tratadas, sin obtener ninguna respuesta de EICH. Sin
embargo, en algunos casos esta terapia puede necesitar ser repetida
si el tejido trasplantado no "agarra" en el receptor del
trasplante. Alternativamente, puede ser necesario si el sistema
linfoide del receptor del trasplante llega a ser deteriorado
nuevamente a consecuencia de la enfermedad o tratamiento de la
enfermedad, por ejemplo, el posterior tratamiento con radiación. En
tales casos, células T de donante adecuadas serán puestas nuevamente
en contacto ex vivo con anticuerpo anti-gp39
o células del receptor portando alo o xenoantígenos mermadas de
células T, para inducir la tolerancia de las células T, y después
infundidas en el receptor del trasplante.
En la Figura 1 se muestra que los resultados de
una reacción linfocitaria mixta (MLR) entre células T CD4+ de nodos
linfáticos del donante y MHC clase II disparan las células
estimuladoras que portan aloantígenos. En este experimento, se
plaquearon células T CD4+ de nodos linfáticos muy purificadas, de
C.H2^{bm12}, a una concentración de 0'5 x 10^{6} por ml de
concentración final, en pocillos de microtitulación o en un cultivo
en masa en placas de 24 pocillos. Las células estimuladoras eran
células de bazo irradiadas, mermadas de células T C57BL/6,
utilizadas a una concentración final de 1 x 10^{6} por ml. Los
medios de MLR constaban de 10% de suero de ternero fetal, 5% de
suplementos, y 2-ME. Se añadió mAb
anti-gp39 a una concentración final de 50
microgramos por ml. Donde se indica en la Figura 2, se añadió
IL-2 a una concentración final de 50 unidades por
ml. Los pocillos de microtitulación fueron pulsados con un
microcurio de timidina tritiada por pocillo, durante un periodo de
tiempo de dieciocho horas antes de recolectar. Las \Delta CPM
medias (CPM de experimental – CPM de solo respondedoras) están
mostradas en el eje y, y los días de cultivo MLR primario en
el eje x. Estos datos demuestran una profunda
hiporreactividad en cultivos tratados con mAb
anti-gp39, la cual es reversible por la adición de
IL-2 exógena.
Los sobrenadantes de las células cultivadas en
boga, del experimento mostrado en la Figura 1, fueron analizados
para la concentración de interleuquina 2 (IL-2).
Estos resultados están contenidos en la Figura 1. Los sobrenadantes
fueron analizados mediante ELISA (R&D Systems, Minneapolis, MN).
En el eje y se muestra la concentración del sobrenadante en
pg por ml, y los días de cultivo MLR en el eje x. El
adicional de mAb anti-gp39 inhibió la producción de
IL-2 de células T de donante en un cultivo MLR
primario.
En los mismos cultivos utilizados en el
experimento, los resultados de los cuales están contenidos en la
Figura 2A, se analizó la concentración de interferón gamma del
sobrenadante mediante ELISA. Estos resultados están contenidos en
la Figura 2B. Se puede ver que la adición de mAb
anti-gp39 conduce a una profunda reducción de la
producción de interferón gamma en un cultivo MLR primario.
Al final del periodo del cultivo celular del
décimo día, las células fueron fenotipadas mediante citometría de
flujo en dos colores. Como se puede ver en la Tabla 1 (después de
los ejemplos), la adición de mAb anti-gp39 no evitó
la activación de las células T, como se evidenció por los altos
niveles de CD25, OX40, CTLA-4, B7-1
y B7-2. La adición de mAb anti-gp39,
sin embargo, inhibió la conversión de las células T ingenuas en
células T efectoras, como se demostró por los altos niveles de
L-selectina, ICAM-1, y los bajos
niveles de CD45. Las células en el cultivo tratado no
experimentaron apoptosis, que está evidenciado por la positividad
relativamente más baja para 7-AAD.
Al final del cultivo MLR primario, las células
fueron lavadas y vueltas a plaquear a una concentración de 3 x
10^{4} por placa de 96 pocillos. A cada pocillo se añadieron
esplenocitos irradiados de ratones C57BL/6, a una concentración de
10^{5} células por pocillo. Estos resultados están contenidos en
la Figura 3A. Donde se indicó, se añade IL-2 a una
concentración final de 50 unidades por ml. Los medios constaban de
10% de suero de ternero fetal, 5% de suplementos, y
2-ME. Los pocillos de microtitulación fueron
marcados con un microcurio por pocillo, en los momentos indicados,
durante un periodo de dieciocho horas antes de la recolección. En
el eje y están los valores de proliferación medios (\Delta
CPM), y los días de cultivo MLR secundario están en el eje
x. Como se puede ver a partir de los resultados en la Figura
3H, células T de donante expuestas a mAb anti-gp39,
en un cultivo primario pero no secundario, mantuvieron la
hiperreactividad aloantígeno-específica en un
cultivo secundario. Esta fue reversible por la adición de
IL-2 exógena en el cultivo secundario solamente.
En cultivos independientes, células T de donante
de cultivos tratados de control o de cultivos MLR primarios
tratados con mAb anti-gp39 fueron expuestas a
IL-2 exógena, a 50 unidades por ml de concentración
final. Estos resultados están contenidos en la Figura 3B. Se puede
ver que existe una respuesta equivalente de las células T de
donante de control tratadas comparada con la de cultivos MLR
primarios tratados con mAb anti-gp39, como se
valoró bajo las condiciones secundarias.
Sobrenadantes obtenidos de los cultivos MLR en
masa secundarios fueron comprobados mediante ELISA para la
producción de IL-2 (Figura 4A) o interferón gamma
(Figura 4B), como se midió en un cultivo MLR secundario. Por lo
tanto, se puede ver que las células T de donante expuestas a mAb
anti-gp39, en cultivos MLR primarios pero no
secundarios, continúan teniendo en el sobrenadante una concentración
de IL-2 (Figura 4A) y de interferón gamma (Figura
4B) notablemente baja.
Al final del cultivo MLR primario, se
administraron células T de donante a receptores C57BL/6 irradiados
subletalmente (600 cGy de irradiación corporal total). Se ensayaron
dosis de dos dosis de células (10^{5} ó 3 x 10^{5}). Estos
resultados están contenidos en la Figura 5. A partir de la Figura 5
se puede ver que los receptores de células cultivadas controladas,
a cualquier dosis celular, sucumbieron uniformemente a la EICH letal
antes de las cuatro semanas postrasplante. Por contraste, los
receptores de 10^{5} células T de donante expuestas a mAb
anti-CD40L ex vivo tuvieron un índice de
supervivencia del 88%. Los receptores de 3 x 10^{5} células T de
donante expuestas a mAb anti-CD40L tuvieron un
índice de supervivencia del 50%, en periodos de tiempo mayores de
dos meses postrasferencia. Cuando se compararon a receptores de
células T de donante obtenidas de cultivos de control, los índices
de supervivencia actuariales de receptores de un número igual de
células T de donante tratadas, expuestas a mAb
anti-CD40L, fueron significativamente superiores (p
<0'001) a ambas dosis celulares.
Los animales en el experimento, los resultados
del cual están contenidos en la Figura 5A, fueron supervisados para
la evidencia de EICH mediante curvas de peso medio. Estos resultados
están contenidos en la Figura 5B. Por lo tanto, se puede ver que
los receptores de células de control tuvieron una disminución
acusada en las curvas de peso medio (eje y), empezando 2'5
semanas postransferencia, lo que produjo letalidad por EICH antes
de las 4 semanas postransferencia. Por contraste, los receptores de
células tratadas con mAb anti-gp39 tuvieron curvas
de peso que sobrepasaron sus pesos corporales medios
pretransferencia. También, los receptores de 10^{5} ó 3 x
10^{5} células de cultivos de control tuvieron una reducción
acusada en el peso corporal medio, coherente con una reacción de
EICH. Esto demostró que la letalidad por EICH fue inhibida mediante
el tratamiento con mAb anti-gp39.
Además, en otros experimentos, se ha observado
una reducción de 30 veces en la mortalidad por EICH en receptores
recibiendo cultivos tratados con mAb anti-gp39
comparada con los controles.
Se examinó la expansión in vivo de células
T de donante alorreactivas. Células T de donante del experimento
mostrado en las Figuras 1-5, y Tablas 1 y 2, fueron
infundidas dentro de ratones con inmunodeficiencia combinada grave.
Estos receptores eran dispares con el donante en el loci del
MHC clase I + clase II. En el sexto día postransferencia, se dio a
los ratones una infusión intravenosa continua de 1 ml por hora
(representando aproximadamente 1/4-1/3 del agua
corporal total de los animales por hora) de líquidos. Los conductos
linfáticos torácicos fueron canulados, y se recogieron los
linfocitos de los conductos torácicos durante un procedimiento de
recolección durante la noche. Aproximadamente se recoge 1 ml por
hora y animal antes de la muerte. Después, se puede cuantificar el
número de células T CD4+ producidas por día. Se puede ver que los
receptores de células cultivadas de control produjeron un promedio
de 2 x 10^{6} células T CD4+ por ml de efluente de los conductos
torácicos. Por contraste, los receptores de cultivos tratados con
mAb anti-gp39 produjeron únicamente 0'3 x 10^{6}
células T CD4+ por ml, representando una reducción aproximada de 7
veces en la generación de células T alorreactivas in vivo.
Estos datos proporcionan la evidencia adicional de que el mAb
anti-gp39 reduce la capacidad de las células T de
donante in vivo para mediar la EICH letal.
En resumen, los resultados de los experimentos
anteriores proporcionan la evidencia decisiva de que el mAb
anti-gp39 redujo fuertemente la capacidad de EICH
in vivo. Esto representa una nueva metodología para hacer
tolerantes ex vivo las células T de donante hacia antígenos o
aloantígenos del huésped, como medio para prevenir la EICH letal
in vivo.
Claims (19)
1. Un método para inducir tolerancia a células T
o la no reactividad de las células T de donante hacia aloantígenos
o xenoantígenos ex vivo, comprendiendo lo siguiente:
- (i)
- proporcionar un cultivo conteniendo células T de donante;
- (ii)
- producir un cultivo de reacción linfocitaria mixta añadiendo células que portan aloantígenos o xenoantígenos a dicho cultivo de células T de donante;
- (iii)
- añadir al cultivo de reacción linfocitaria mixta un antagonista del gp39; y
- (iv)
- mantener estas células en cultivo durante tiempo suficiente para que las células T de donante se vuelvan sustancialmente no reactivas hacia dichos aloantígenos o xenoantígenos en el trasplante en un huésped conteniendo células portando tales aloantígenos o xenoantígenos.
2. Un método según la Reivindicación 1, en donde
las células T de donante están contenidas en una muestra de tejido
de médula ósea o células sanguíneas periféricas de donante.
3. Un método según la Reivindicación 1 ó
Reivindicación 2, en donde el antagonista del gp39 se selecciona
del grupo que se compone de un anticuerpo anti-gp39,
CD40 soluble y proteína de fusión CD40 soluble.
4. Un método según la Reivindicación 3, en donde
el antagonista del gp39 es un anticuerpo
anti-gp39.
5. Un método según la Reivindicación 4, en donde
dicho anticuerpo anti-gp39 es un anticuerpo
monoclonal anti-gp39 humano.
6. Un método según alguna reivindicación
precedente, en donde las células T de donante son cultivadas con
dicho antagonista del gp39, durante un tiempo que varía desde
aproximadamente 1 hasta 30 días.
7. Un método según la Reivindicación 6, en donde
dicho tiempo oscila de 5 a 15 días.
8. Un método según alguna reivindicación
precedente, en donde las células que portan aloantígenos o
xenoantígenos comprenden células o tejido obtenidos de un potencial
receptor de trasplante que ha sido tratado para mermar las células
T del receptor.
9. Un método según la Reivindicación 8, en donde
la reducción de células T se efectúa mediante irradiación.
10. Un método según alguna reivindicación
precedente, comprendiendo además la etapa de ensayar las células T
de donante para la obtención de una respuesta
anti-huésped contra aloantígenos o
xenoantígenos.
11. Un método según la Reivindicación 10, en
donde la etapa de ensayar comprende el medir la concentración de
interleuquina-2 (IL-2) en los
sobrenadantes del medio de cultivo celular de las células T de
donante.
12. Un método según la Reivindicación 11, en
donde el añadir antagonista del gp39 inhibe la producción de
IL-2.
13. Un método según la Reivindicación 10, en
donde la etapa de ensayar comprende el medir la concentración de
interferón gamma en los sobrenadantes del medio de cultivo celular
de las células T de donante.
14. Un método según la Reivindicación 13, en
donde el añadir antagonista del gp39 reduce la producción de
interferón gamma.
15. Un método según la Reivindicación 10, en
donde la etapa de ensayar comprende el medir los niveles de
L-selectina, ICAM-1 y CD45 en las
células T de donante.
16. Un método según la Reivindicación 15, en
donde el añadir antagonista del gp39 produce niveles altos de
L-selectina, niveles altos de
ICAM-1, o niveles bajos de CD45.
17. Un método para preparar un agente terapéutico
para tratar a un receptor necesitado del trasplante de células T,
comprendiendo un método como se definió en alguna reivindicación
precedente para producir células T de donante tratadas, y
utilizando las células T de donante tratadas como principio activo
en el agente terapéutico.
18. Un método según la Reivindicación 17, en
donde el receptor está necesitado de una reconstrucción
inmunológica a consecuencia de una enfermedad o tratamiento de la
enfermedad.
19. Un método según la Reivindicación 18, en
donde dicha enfermedad es cáncer o una enfermedad autoinmune.
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