CN1319019A - 用gp39拮抗剂离体处理同种异体和异种T－细胞 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了用于诱导T－细胞对移植组织中包含的供体T－细胞的T－细胞非反应性的方法。该方法包括离体用gp36拮抗剂处理供体T－细胞的步骤。
Description
发明领域
本发明提供了离体处理移植组织或器官(同种异体或异种的)以便使其中包含的T-细胞耐受供体抗原(异种抗原或同种异体抗原)的方法。可以以一种带有降低的移植物抗宿主疾病风险的形式将所处理的组织或器官移植入受体。
发明背景
为了诱导抗原特异性T-细胞的激活和克隆扩充，必须将抗原呈递细胞(APCs)提供的两种信号转运至静息T淋巴细胞的表面(Jenkins,M.和Schwartz,R.(1987)《药物实验杂志》(J.Exp.Med.)165,302-319；Mueller,D.L.等(1990)《免疫学杂志》(J.Immunol.)144,3701-3709；Williams,I.R.和Unanue,E.R.(1990)《免疫学杂志》(J.Immunol.)145,85-93)。为免疫反应提供特异性的第一种信号在识别存在于主要组织适合性复合物(MHC)中的外源性抗原肽后通过T-细胞受体(TCR)介导。称作共同刺激的第二种信号诱导T细胞增殖并起作用(Schwartz,R.H.(1990)《科学》(Science)248,1349-1356)。共同刺激既不是抗原特异性的也不是MHC限制的且认为它由APCs表达的一种或多种不同的细胞表面分子所产生(Jenkins,M.K.等(1988)《免疫学杂志》(J.Immunol.)140,3324-3330；Linsley,P.S.等(1991)《药物实验杂志》(J.Exp.Med.)173,721-730；Cimmi,C.D.等(1991)《美国国家科学院学报》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)88:6575-6579；Young,J.W.等(1992)《临床研究杂志》(J.Clin.Invest.)90,229-237；Koulova,L.等(1991)《药物实验杂志》(J.Exp.Med.)173,759-762；Reiser,H.等(1992)《美国国家科学院学报》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)89:271-275；van-Seventer,G.A.等(1990)《免疫学杂志》(J.Immuno1.)144,4579-4586；LaSalle,J.M.等(1991)《免疫学杂志》(J.Immunol.)147,774-80；Dustin,M.I.等(1989)《药物实验杂志》(J.Exp.Med.)169,503；Armitage,R.J.等(1992)《自然》(Nature)357,80-82；Liu,Y.等(1992)《药物实验杂志》(J.Exp.Med.)175,437-445)。涉及T细胞激活的一种共同刺激途径与在T-细胞表面上的分子CD28有关。这种分子可以接受由B-细胞或其它APCs上的配体转运的共同刺激信号。用于CD28的配体包括大量的B淋巴细胞激活抗原的B7族诸如B7-1和/或B7-2(Freedman,A.S.等(1987)《免疫学杂志》(J.Immunol.)137,3260-3267；Freeman,G.J.等(1989)《免疫学杂志》(J.Immunol.)143,2714-2722；Freeman,G.J.等(1991)《药物实验杂志》(J.Exp.Med.)174,625-631；Freeman,G.J.等(1991)《科学》(Science)262,909-911；Azuma,M.等(1993)《自然》(Nature)366,76-79；Freeman,G.J.等(1993)《药物实验杂志》(J.Exp.Med.)178,2185-2192)。B7-1和B7-2也是另一种分子的配体。尽管CTLA4在共同刺激中的作用还不清楚，但是CTLA4存在于所激活T细胞的表面上。
用共同刺激信号转运至抗原特异性信号的T细胞导致T-细胞激活，这种激活包括T-细胞增殖和细胞因子分泌。相反，认为在没有共同刺激信号存在的情况下转运至抗原特异性信号的T-细胞可诱导T-细胞中非反应性或无变性状态，由此诱导T-细胞中的抗原特异性耐受性。
T-细胞与B-细胞之间的相互作用在免疫反应中起中心作用。体液免疫对胸腺依赖抗原的诱导作用需要T辅助(下文称作Th)细胞提供的“帮助”。当对B淋巴细胞所提供的某些帮助通过由Th细胞释放的可溶性分子(例如淋巴因子诸如IL-4和IL-5)介导时，B细胞的激活也需要B细胞与Th细胞之间的接触依赖性相互作用。参见Hirohata等《免疫学杂志》(J.Immunol.)140,3736-3744(1988)；Bartlett等《免疫学杂志》(J.Immuno1.)143,1745-1754(1988)。这表明B-细胞的激活包括B-细胞与Th细胞上的细胞表面分子之间的转性相互作用。T-细胞上的分子由此介导T-细胞的接触依赖性辅助效应子功能。B-细胞与T-细胞上的分子之间的触依赖性相互作用进一步得到了观察结果的支持,所述的观察结果是所激活T-细胞的分离质膜可以提供B-细胞激活所必须的辅助功能。参见Brian《美国国家科学院学报》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)85:564-568(1988)；Hodgkin等《免疫学杂志》(J.Immunol.)145,2025-2034(1990)；Noelle等《免疫学杂志》(J.Immunol.)146,1118-1124(1991)。
已经在未成熟和成熟B淋巴细胞表面上鉴定的分子CD40在被抗体交联时可诱导B-细胞增殖。参见Valle等《欧洲免疫学杂志》(Eur J.Immunol.)19,1463-1467(1989)；Gordon等《免疫学杂志》(J.Immunol.)140,1425-1430(1988)；Gruber等《免疫学杂志》(J.Immunol.)142,4144-4152(1989)。已经以分子方法克隆了CD40并使其特征化。参见Stamenkovic等《欧洲分子生物学协会杂志》(EMBOJ.)8:1403-1410(1989)。用于CD40的配体gp39(也称作CD40配体或CD40L和当前的CD154)也是以分子方法克隆和特征化的。参见Armitage等《自然》(Nature)357,80-82(1992)；Lederman等《药物实验杂志》(J.Exp.Med.)175,1091-1101(1992)；Hollenbaugh等《欧洲分子生物学协会杂志》(EMBO J.)11:4313-4319(1992)。在激活而非静息的CD4+Th细胞上表达gp39蛋白质。参见Spriggs等《药物实验杂志》(J.Exp.Med.)176,1543-1550(1992)；Lane等《欧洲免疫学杂志》(Eur J.Immunol.)22,2573-2578(1992)；Roy等《免疫学杂志》(J.Immunol.)151,1-14(1993)。用gp39基因转染并在其表面上表达gp39蛋白质的细胞可以引起B-细胞增殖并可以诱导抗体与其它刺激信号。参见Armitage等《自然》(Nature)357,80-82(1992)；Hollenbaugh等《欧洲分子生物学协会杂志》(EMBO J.)11:4313-4319(1992)。
发明简述
移植物抗宿主疾病(GVHD)是一种由将供体同种异体T-细胞输注入受体所导致的多器官系统破坏性过程。因为急性移植物抗宿主疾病在20-40％的HLA-相同胞亲供体移植物受体和达到70-80％的无关供体移植物受体中发生，所以需要防止这种骨髓移植并发症的手段。迄今为止使用了两种一般类型的策略。第一种包括体内输注免疫抑制剂诸如methatrycide、环孢素A和类固醇。上述急性移植物抗宿主疾病的实例是那些在体内输注这些免疫抑制剂的过程中观察到的疾病。除不完全的保护性作用外，这些免疫抑制剂还可导致骨髓移植后的免疫缺陷时间期限延长，由此使受体与感染的并发症重新接触并可能增加骨髓移植后的复发率。第二种一般手段包括离体从供体移植物中除去T-细胞。这种手段尽管可适度有效预防急性移植物抗宿主疾病，但可导致移植物衰竭、复发、感染并发症的高发生率并可延缓免疫重建时间。
相反，本发明涉及一种离体处理供体T-细胞的方法以便在植入宿主时使这类T-细胞对同种异体或异种抗原基本上无反应。更具体地说，本发明涉及一种离体用一定量的至少一种gp39(CD154)拮抗剂和同种异体或异种细胞或组织处理供体T-细胞的方法以便在植入含有这类同种异体或异种细胞的宿主时使这类T-细胞对供体抗原(同种抗原或异种抗原)基本上无反应。
本发明由此提供了一种预防或抑制可能另外在将含有例如供体骨髓或外周血细胞的供体T-细胞或组织或器官植入受体时发生的移植物抗宿主疾病反应的有效方法。
优选的情况是，将供体T-细胞离体用足量的抗-gp39抗体和来自移植受体的细胞培养足够的时间，从而在移植时使供体T-细胞对受体细胞基本上无反应。
该方法一般通过使用供体T-细胞和经照射的T-细胞缺失的含宿主同种异体抗原或异种抗原的刺激物在体外进行混合淋巴细胞反应而完成。向该培养物中添加gp39拮抗剂、优选特异性结合gp39(CD154)的抗体或抗体片段。另一方面，所述的gp39拮抗剂可以包括可溶性CD40或可溶性CD40融合蛋白例如CD40Ig。
附图的简要描述
附图1表示供体T-细胞的抗-CD40LmAb处理在原代MLR培养物中的作用。
附图2A表示在原代MLR培养物中添加抗-CD40L(gp39)mAb对IL-2产生的作用。
附图2B表示抗-CD40LmAb在原代MLR培养物中对γ干扰素的作用。
附图3A表示在继代培养物中由抗-CD40LmAb诱导的抗宿主同种异体抗原反应性过低可由外源性(erogenous)IL-2逆转。
附图3B表示在原代MLR培养物中与抗-CD40 mAb接触的供体T-细胞在继代培养物中具有完整的IL-2反应。
附图4A表示向原代MLR培养物中添加抗-CD40L mAb可抑制作为在继代MLR培养物中确定的IL-1产生。
附图4B表示向原代MLR培养物中添加抗-CD40L mAb可抑制作为在继代MLR培养物中确定的γ干扰素的产生。
附图5A表示在MLR培养物中对供体T-细胞的抗-CD40L mAb处理可显著降低体内GVHD的能力。
附图5B表示抗-CD40L处理对移植后平均体重的影响。
发明详述
将下列术语理解为具有下列定义：
同种异体细胞指的是获自受体的相同种类的不同个体的细胞。
同种异体抗原指的是获自受体的相同种类的不同个体的细胞。
异种细胞指的是获自相对于另一种类，通常是移植受体，不同种类的细胞(例如，如果植入人受体，那么狒狒T-细胞受体包括异种细胞)。
异种抗原指的是由获自相对于另一种类，通常是移植受体，不同种类的细胞表达的抗原。
gp39拮抗剂指的是干扰gp39(CD154)-CD40相互作用的分子。gp39拮抗剂优选是定向于gp39的抗体(例如对人gp39具有特异性的单克隆抗体)或其片段或衍生物(例如Fab、F(ab)’2片段、嵌合抗体、人抗体或人源化抗体)。此外，gp39拮抗剂包括gp39配体的可溶形式的融合蛋白(例如可溶性CD40Ig)或干扰gp39-CD40相互作用的药剂。
gp39或CD154或CD40L或CD40CR是在干扰分子CD40的T-细胞表面上表达的分子，所述的分子CD40是在涉及诱导B-细胞增殖的未成熟B-细胞和成熟B-细胞淋巴细胞表面上鉴定的。特别地，在T-细胞上与gp39在B-细胞上与CD40的相互作用在激活B-细胞对抗原反应方面起中心作用。此外，已经发现gp39在T-细胞对抗原例如同种异体抗原和异种抗原的反应方面起显著作用。
本发明中T-细胞非反应性或T-细胞耐受性指的是供体T-细胞对含同种异体抗原或异种抗原的细胞在这些供体T-细胞植入受体时引起的免疫反应(移植物抗宿主反应)减少，在此前，这些供体T-细胞已经离体与gp39拮抗剂(抗-gp39抗体)和含异种或同种异体抗原的细胞进行了接触。
如上所述，本发明提供了在移植含例如同种异体或异种骨髓或外周血细胞这样组分的外源性供体T-细胞时用于预防移植物抗宿主疾病的另一种手段。
已知极小比例的供体T-细胞具有识别宿主同种异体抗原的能力(估计低于0.0％)。本发明通过功能性地改变具有同种异体或异种抗原反应性能力的T-细胞群体来设法消除这种反应(赋予这类细胞同种异体抗原或异种抗原非反应性或耐受它们)。
本发明者推定通过引起供体T-细胞和经照射的T-细胞缺失的含宿主同种异体抗原或异种抗原的刺激物的混合淋巴细胞反应并向该混合淋巴细胞反应培养物中添加gp39拮抗剂、特别是抗-gp39抗体可能完成上述过程。这种希望在于该过程可干扰体外gp39-CD40的相互作用(供体T-细胞与含同种异体抗原或异种抗原的细胞之间)并使这类细胞在植入移植受体时对含同种异体抗原或异种抗原的细胞具有耐受性或非反应性。据推理这一过程可能以预先在文献中的成功报导为基础、包括本发明者的那些，这些内容涉及在移植异种或同种异体组织或器官之前、同时或之后在体外通过单独或与同种异体或异种细胞一起使用gp39拮抗剂(抗-gp39抗体)处理移植受体来体内诱导T-细胞对同种异体或异种组织的耐受性。已经证实这种体内方法对表明T-细胞对各种组织或器官例如膀胱、皮肤、心脏组织以及下列等的耐受性是非常有效的。
然而，无法断定是否可以将这种方法扩展至体外诱导T-细胞的耐受性或非反应性。这种结果并不可以合理地预测，因为在文献中报导的现有的研究已经证实不需要gp39来诱导体外的T-细胞激活。例如，Flavell及同事(《自然》(Nature)378:617-620(1995))已经证实种属上缺损gp39表达的T-细胞受体转基因T-细胞一般对抗原呈递细胞和抗原起反应。这表明T-细胞的激活不需要gp39且实际上通常可以在没有gp39的体外发生。
特别地，由Grewal,J.S.等在《自然》(Nature)378:617-620(1995)的“缺乏CD40配体的小鼠体内引发抗原特异性T-细胞损害”中所报导的数据证明不需要gp39存在以体外短期激活T-细胞且在体外可以在没有gp39存在的情况下产生同种异体特异性T细胞耐受性。
因此，十分令人意外的是已经证实在体外通过用gp39拮抗剂和缺失受体T细胞的受体同种异体或异种细胞培养这类细胞可以有效地诱导供体T-细胞的T-细胞耐受性或非反应性。这项技术在处理移植物受体的过程中提供了巨大的潜能，这是因为它可提供一种高效、非侵害的方式，这种方式可赋予移植的组织或器官中包含的移植的T-细胞受体同种异体抗原或异种抗原的耐受性或非反应性。结果是这种移植组织或器官即异种或同种异体骨髓不应在移植时引起不良的移植物抗宿主反应。此外，体外诱导耐受性这一事实在可与其它抗排斥策略即环孢素或其它免疫抑制剂共同使用进行处理时是进一步有利的。此外，可以将这种方法在移植之前、同时或之后与抗-gp39抗体的给药(或其它配体)合并使用。
实际上，这种方法可以消除对其它抗排斥药物的需求，所述的抗排斥药物在获得它们的免疫抑制剂活性的同时可以产生不良的副作用例如感染或癌症的危害增加。
在优选的实施方案中，将来自供体例如同种异体或异种供体的T-细胞在体外用已经处理(例如照射)成缺失宿主T-细胞的受体同种异体或异种组织进行培养。向该培养物中加入有效量的gp39拮抗剂、一般加入抗-gp39抗体(例如公开在美国专利No.GET 313#中的24-31或89-76抗人gp39抗体)。将该培养物维持足以诱导T-细胞耐受性的时间。一般来说，这种时间范围约为1-2天至30天、更常见的约为5-15天且最常见的约为10天。
在培养后，可以测试供体T-细胞以确定它们是否引起抗宿主同种异体或异种反应。此外，可以确定在处理后这类细胞是否能够保持存活和另外引起正常的T-细胞活性例如IL-2反应。
正如下列实施例中所证实的，已经发现当按照本发明处理时，供体T-细胞表现出显著钝化的抗宿主异种抗原或同种异体抗原反应、可维持的生存力并进一步维持完全的IL-2反应。此外，在重新刺激时，供体T-细胞可维持其抗宿主同种异体抗原的超反应性。
还观察到：在原代MLR中，1型T-辅助细胞(Th1)细胞因子的产生得到了显著降低。类似地，在继代再刺激培养物中，Th1细胞因子的产生也明显降低。
此外，发现体内给予等数量的对照品或抗-gp39(CD154)单克隆抗体处理的供体T-细胞具有显著不同的移植物抗宿主疾病特性。特别地，在对照组中3倍高数量的供体T-细胞的受体具有的实际存活率与对照组中的0％相比为50％。在其它实验中，使用抗-gp39(CD154)单克隆抗体处理的T-细胞观察到在移植物抗宿主疾病可能中存在达30倍的差异。以此为基础，我们已经令人意外地总结出通过混合的淋巴细胞反应可以离体有效地耐受化供体T-细胞。这为引起供体T-细胞对宿主细胞和异种抗原的耐受性提供了一种重要的新型手段。
本方法在骨髓或外周血细胞移植疗法领域中提供了显著的可能性。通常将骨髓和干细胞移植用于治疗各种疾病诸如白血病和其它涉及免疫细胞缺陷的疾病。此外，骨髓移植可以也在治疗其它疾病如诸如自身免疫疾病过程中提供便利。然而，与常规的骨髓移植疗法相关的普遍性危害是引起GVHD反应的风险。本方法应降低乃至消除这类风险且由此为骨髓移植疗法扩大临床适应证。
这些方法主要包括如上所述离体处理骨髓或外周血细胞并将处理的骨髓或外周血细胞导入需要这类治疗的受体例如癌症患者或患有自身免疫疾病的人体中、导入因其自身淋巴样细胞已经作为疾病或治疗疾病的结果缺失(例如由于放射疗法)而需要免疫重建的受体中。
可以将本方法与其它抗排斥疗法例如体内输注免疫抑制剂诸如给予methatrycide、环孢素A、类固醇或gp39拮抗剂合并使用。
理想的情况是，本方法为所处理供体T-细胞的受体提供免疫重建而不会引起任何GVH反应。然而，在某些情况中，如果移植组织没有装入移植受体中，那么需要重复实施该疗法。另一方面，如果移植受体的淋巴系统作为疾病或治疗疾病的结果例如在放射疗法后再次受到损害，那么上述疗法是必要的。在这类情况中，使合适的供体T-细胞离体再次与抗-gp39抗体和T-细胞缺失的含同种异体抗原或异种抗原的受体细胞接触以便诱导T-细胞的耐受性且然后输注到移植受体中。
本发明通过下列实施例来进一步解释，这些实施例不应用来起限定作用。将贯穿于本申请中的所有参考文献、专利和公开的专利申请的全部技术内容引入作为参考。
实施例1
在供体CD4+淋巴结T细胞与MHC Ⅱ型含不同的同种异体抗原的刺激物细胞之间的混合淋巴细胞反应(MLR)的结果如附图1中所示。在本实验中，以0.5×106/ml的终浓度将来自C.H2bm12的高度纯化的CD4+淋巴结T细胞铺板在微量滴定孔中或24孔平板内的大块培养基中。刺激物细胞是以终浓度为1×106/ml使用的C57BL/6T细胞缺失的经照射的脾细胞。MLR培养基由10％胎牛血清、5％补充剂(supplements)和2-ME组成。以50微克/ml的终浓度添加抗-gp39mAb。如附图1中所示，以50单位/ml的终浓度添加IL-2。在收集前将微量滴定孔用1微居里/孔的含氚胸苷脉冲18小时的时间期限。平均ΔCPM(实验的CPM-反应者单独的CPM)如y轴上所示且原代MLR培养的天数如x轴上所示。这些数据证明抗-gp39 mAb处理的培养物中极度的反应性过低，其可以通过添加外源性IL-2来逆转。
实施例2
对来自附图1中所示实验的常规培养的细胞的上清液分析白细胞介素2(IL-2)的浓度。这些结果包含在附图1A中。通过ELISA(R&DSystem,Minneapolis,MN)来分析上清液。将以pg/ml计的上清液浓度表示在y轴上而将MLR培养的天数表示在x轴上。添加抗-gp39 mAb抑制了IL-2从原代MLR培养物内的供体T细胞中产生。
实施例3
在用于附图2A中所包含结果的实验中的相同培养物中通过ELISA来分析γ干扰素的上清液浓度。这些结果包含在附图2B中。可以看出：观察到添加抗-gp39 mAb可导致γ干扰素的产生极度减少和原代MLR培养物。
实施例4
在10天的细胞培养期限结束时，通过两色流式细胞仪使细胞表型化。正如在表1(在实施例后)中所观察到的，添加抗-gp39mAb没有防止T细胞激活，如高浓度CD25、OX40、CTLA-4、B7-1和B7-2所证明。然而，添加抗-gp39mAb确实抑制了幼稚T细胞转化成效应子T细胞，如高浓度L-选择蛋白、ICAM-1和低浓度CD45所证明。经处理的培养物中的细胞不进行编程性细胞死亡，由对7-AAD相对低的正性(positivity)所证实。
实施例5在原代MLR培养结束时，将细胞洗涤并以3×104/96孔平板的浓度重新进行辅板。以105个细胞/孔的浓度向各孔中加入来自C57BL6小鼠的经照射的脾细胞。这些结果包含在附图3A中。如上所述，以50个单位/ml的终浓度添加IL-2。该培养基由10％胎牛血清、5％补充剂、2-ME组成。在收集前将微量滴定孔用1微居里/孔在指定的时间处标记18小时的期限。y轴上是平均增殖值(ΔCPM)而x轴上是继代MLR培养的天数。正如从附图3H中的结果看出的，供体T细胞在原代而非继代培养物中与抗-gp39 mAb接触在继代培养物中保留了同种异体抗原特异性超反应性。通过在继代培养物中单独添加外源性IL-2可使该过程逆转。
实施例6
在单独的培养物中，使来自对照品处理的培养物或抗-gp39 mAb处理的原代MLR培养物的供体T细胞与50个单位/ml终浓度的外源性IL-2接触。这些结果包含在附图3b中。可以看出：如在继代条件下评价的，与抗-gp39 mAb处理的原代MLR培养物相比，来自经对照处理的供体T细胞有相同反应。
实施例7
正如在继代MLR培养物中测定的，通过ELISA来测试获自继代MLR批量培养物的上清液的IL-2(附图4A)或γ干扰素(附图4B)的产生。由此可以看出：与原代而非继代MLR培养物中的抗-gp39 mAb接触的T细胞持续具有显著低的上清液IL-2浓度(附图4A)和γ干扰素浓度(附图4B)。
实施例8
在原代MLR培养结束时，给予供体T细胞至亚致死照射的(600cGray的总体照射)C57/BL/6受体。测试两种细胞剂量(105或3×105)。这些结果包含在附图5中。从附图5中可以看出：在各细胞剂量下对照的培养细胞的受体在移植后的4周前一律死于致死GVHD。相反，与抗-CD40L mAb离体接触的105供体T细胞的受体具有88％的存活率。与抗-CD40L mAb离体接触的3×105供体T细胞的受体在转移后2个月以上的时间期限时具有50％的存活率。当与获自对照培养物的供体T细胞受体比较时，处理的与抗-CD40L mAb接触的等量供体T细胞的受体的实际存活率在两种细胞剂量下均明显较高(p＜0.001)。
实施例9
对包含有附图5A中结果的本实验中的动物监测按平均重量曲线计的GVHD的证据。这些结果包含在附图5B中。由此可以看出：对照细胞受体具有的平均重量曲线(y-轴)在移植后4周开始明显下降，在移植后4周前导致GVHD致死率。相反，抗-gp39 mAb处理细胞的受体具有超过其移植前平均体重的重量曲线。此外，来自对照培养物的105或3×105细胞的受体在平均体重上显著下降，与GVH反应一致。这证明GVHD致死率受到了用抗-gp39 mAb处理的抑制。
此外，在其它实验中，在接受抗-gp39 mAb处理的培养物的受体中已经观察到了达到比对照组降低30倍的GVHD致死率。
实施例10
检验供体同种异体反应性T细胞的体内扩展。将来自附图1-5和表1和2中所示实验的供体T细胞输注入患有严重合并免疫缺陷的小鼠。这些受体与MHC Ⅰ型+Ⅱ型基因座上的供体完全不同。在移植后的第6天，给小鼠连续静脉输注1ml/小时(代表约1/4-1/3动物总体水/小时)的液体。给胸导管淋巴管插管并在过夜收集过程中收集胸导管淋巴细胞。在死亡前收集约1ml/小时/动物。然后可以对每天产生的CD4+T细胞的数量进行定量。可以观察到产生平均为2×106CD4+T细胞/ml胸导管流出物的对照培养细胞的受体。相反，抗-gp39mAb处理的培养物的受体仅产生0.3×106CD4+T细胞/ml，表示体内产生的同种异体反应性T细胞减少了约7倍。这些数据提供了抗-gp39mAb可降低供体T细胞在体内介导致死GVHD的能力另外的证据。
总之，上述实验结果提供了确定的证据证明抗-gp39 mAb在体内明显降低GVHD能力。这代表了一种用于离体使供体T细胞耐受宿主抗原或同种异体抗原的新型方法，它可作为在体内预防致死性GVHD的方法。表1：在MLR培养物中离体接触抗-CD40L mAb既不会损害T细胞激活抗原的表达也不会诱导早期编程性细胞死亡但确实可抑制幼稚T细胞向效应细胞1的转化
| CD4 | CD25 | OX40 | CTLA-4 | B7-1 | B7-2 | L-选择蛋白 | ICAM-1 | CD45 | 7-AAD | |
| 对照 | 96 | 33 | 5 | 10 | 28 | 39 | 51 | 100(264) | 100(229) | 13 |
| αgp39 mAb | 95 | 58 | 48 | 23 | 33 | 45 | 92 | 100(493) | 100(158) | 7 |
通过2-色FACS分析原代MLR培养10天结束时的1细胞。列举了所示分子阳性的％。激活抗原包括CD25、OX40、CTLA-4、B7-1和B7-2。效应细胞抗原包括L-选择蛋白、ICAM-1和CD45。7-AAD是早期编程性细胞死亡的指示。将平均荧光通道列在()中。表2：在MLR培养物中离体接触抗-CD40L mAb减少了未照射的同种异体受体1中供体T细胞的扩展而不是激活
No.CD4+----------------CD4+T细胞-------------------
| CD4 | T细胞/ml | CD25 | CD40L | OX40 | CTLA-4 | B7-1 | B7-2 | L-选择蛋白 | ICAM-1 | CD45 | CD44 | 7-AAD | |
| 非BMT对照 | 37 | 1.3×106 | 10 | 7 | 12 | 3 | 3 | 22 | 98(950) | 70(76) | 100(375) | 83(215) | 3 |
| BMT后对照 | 92 | 2.0×106 | 27 | 11 | 51 | 2 | 81 | 25 | 4(415) | 100(295) | 82(90) | 100(1415) | 7 |
| αCD40LmAb | 86 | 0.3×106 | 20 | 5 | 52 | 3 | 72 | 45 | 12(522) | 100(356) | 100(103) | 86(1290) | 6 |
从正常供体品系对照(n=3)或从对照(n=4)或抗-gp39 mAb处理的培养物(因细胞数量低而合并由2只小鼠和3只小鼠组成的培养物且然后分别进行分析)的同种异体SCID(重度联合免疫缺陷)受体中收集胸导管淋巴细胞1。在过夜插管过程中收集约1ml/小鼠/小时。通过2-色FACS分析淋巴细胞。列出所示分子的平均％阳性。指出时，门控细胞的CD4正性(positivity)且然后分析所示抗原的共表达。激活抗原包括CD25、OX40、CTLA-4、B7-1和B7-2。效应细胞抗原包括L-选择蛋白，ICAM-1、CD45和CD44。7-AAD是早期编程性细胞死亡的指示。将平均荧光通道列在()中。
本领域技术人员会认识到或能够确定仅使用常规实验方法可以实施与本文所述的本发明特定实施方案相同的许多技术方案。这类相同技术方案也包括在下列权利要求中。
Claims (12)
1．一种用于在体外诱导供体T-细胞对所需含同种抗原或异种抗原的细胞的T-细胞耐受性或非反应性的方法，该方法包括下列步骤：
(ⅰ)提供含有供体组织的培养物，所述的供体组织中含有供体T-细胞；
(ⅱ)通过添加到所述供体T-细胞培养物中含同种抗原或异种抗原的细胞而产生混合淋巴细胞反应培养物；
(ⅲ)向所得的混合淋巴细胞培养物中添加gp39拮抗剂；和
(ⅳ)将这些细胞在培养物中维持足够的时间以便赋予供体T-细胞对所述含同种抗原或异种抗原的细胞的基本上非反应性。
2．权利要求1所述的方法，其中含有供体T-细胞的组织是供体骨髓或外周血细胞。
3．权利要求1所述的方法，其中gp39拮抗剂选自抗-gp39抗体、可溶性CD40和可溶性CD40融合蛋白组成的组。
4．权利要求3所述的方法，其中所述的gp39拮抗剂是抗-gp39抗体。
5．权利要求4所述的方法，其中所述的抗-gp39拮抗剂是抗人gp39单克隆抗体。
6．权利要求1所述的方法，其中用所述的gp39拮抗剂将供体T-细胞培养约1-30天范围的时间。
7．权利要求6所述的方法，其中所述的时间范围在5-15天。
8．权利要求1所述的方法，其中含同种抗原或异种抗原的细胞包括获自已经处理成缺失受体T-细胞的潜在的移植受体的细胞或组织。
9．权利要求8所述的方法，其中T-细胞缺失通过照射来实现。
10．权利要求1所述的方法，其中将供体T-细胞植入需要这类移植的受体中。
11．权利要求10所述的方法，其中所述的受体作为疾病或疾病处理结果而需要免疫重建。
12.权利要求11所述的方法，其中所述的疾病是癌症或自身免疫疾病。
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