CN1134266C - 用于组织或器官移植物诱导t细胞耐受的方法 - Google Patents

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Abstract

一种在移植接受体中诱导对组织或器官移植物的T细胞耐受的方法被揭示。该法包括给予受实验者1)同种的或异种的细胞，这些细胞可表达供体抗原，并在其表面有一种配体，此配体可同接受体T细胞表面上的介导接触依赖性辅助效应物功能的受体相互作用；和2)一种能抑制配体同受体相互作用的受体的拮抗剂。在一个优选实施方案中，同种或异种细胞是B细胞，优选静止期B细胞，T细胞表面的介导接触依赖性辅助效应物功能的分子是gp39。优选的gp39的拮抗剂是抗-gp39抗体。同种细胞或异种细胞和gp39拮抗剂典型的是在组织或器官移植前施用于移植接受体。本发明中的方法可用来诱导对诸如下列移植物的T细胞耐受：肝、肾、心脏、肺、皮肤、肌肉、神经组织、胃和肠。一种用来治疗糖尿病的方法也被揭示，该法包括给予受实验者以能表达供体抗原的同种或异种细胞，gp39的拮抗剂及胰岛。

Description

用于组织或器官移植物 诱导T细胞耐受的方法
发明背景
为了诱导抗原特异性的T细胞活化和克隆扩增，由抗原呈递细胞(APCs)提供的两个信号必须传递至静止的T淋巴细胞表面(Jenkins，M.和Schwartz，R.(1987)《实验医学杂志》，165，302-319；Mueller，D.L，等，(1990)《免疫学杂志》，144，3701-3709；Williams，I.R和Unanue，E.R(1990)《免疫学杂志》，145，85-93)。第一个信号，授与特异性给免疫反应，是由T细胞受体(TCR)介导，接着识别呈现于主要组织相容性复合物(MHC)中的外来抗原多肽。第二个信号称为共刺激，它诱导T细胞增殖和变成功能性的T细胞(Schwartz，R.H(1990)《科学》248，1349-1356)。共刺激既不是抗原特异性的，也不是MHC限制性的，被认为是由APCs表达的一个或多个独特性的细胞表面分子所提供(Jenkins，M.K，等，(1988)《免疫学杂志》，140，3324-3330；Linsley，P.S.，等，(1991)《实验医学杂志》，173，721-730；Gimmi，C.D.，等，(1991)《美国国家科学院院刊》，88，6575-6579；Young，J.W，等，(1992)《临床研究杂志》，90，229-237；Koulova，L，等，(1991)《实验医学杂志》，173，759-762；Reiser，H.，等，(1992)《美国国家科学院院刊》，89，271-275；Van-Seventer，G.A，等，(1990)《免疫学杂志》，144，4579-4586；Lasslle，J.M，等，(1991)《免疫学杂志》，144，774-80；Dustin，M.I.，等，(1989)《实验医学杂志》，169，503；Armitage，R，J，等，(1992)《自然》，357，80-82；Liu，Y.，等，(1992)《实验医学杂志》，175，437-445)。参与T细胞激活的一个共刺激路径包括T细胞表面的CD28分子。此分子能够接受由B细胞或其它APCs细胞上的配体所传递的共刺激信号。CD28分子的配体包括B淋巴细胞激活抗原的B7家族成员，例如B7-1和/或B7-2(Freedman，A.S，等，(1987)《免疫学杂志》，137，3260-3267；Freeman，G.J.等，(1989)《免疫学杂志》，143，2714-2722；Freeman，G.J.等，(1991)《实验医学杂志》，174，625-631；Freeman，G.J.等，(1993)《科学》，262，909-911；Azuma，M.等，(1993)《自然》，366，76-79；Freeman，G.J.等，(1993)《实验医学杂志》，178，2185-2192)。B7-1和B7-2也是另一分子CTLA4的配体，CTLA4呈现于激活的T细胞表面，然而CTLA4在共刺激中的作用并不清楚。
传递给T细胞一个抗原特异性信号和一个共刺激信号导致T细胞激活，它包括T细胞增殖和细胞因子的分泌。相反地，传递给T细胞一个抗原特异性信号而缺少共刺激信号时，则被认为在T细胞中诱导了一种无应答性或无反应性状态，所以在T细胞中诱导了抗原特异性耐受。
T细胞和B细胞的相互作用在免疫反应中起了主要的作用。诱导对胸腺依赖性抗原的体液免疫需要由T辅助细胞(此后称Th)提供的“帮助”。尽管提供给B淋巴细胞的某些帮助是由Th细胞释放的可溶性分子介导的(例如淋巴因子IL-4和IL-5)，B细胞的激活也需要B细胞和Th细胞接触依赖性的相互作用。Hirohata等《免疫学杂志》，140：3736-3744(1988)；Bartlett.等，《免疫学杂志》143：1745-1754(1989)；这表明B细胞的激活包括了B细胞和Th细胞的细胞表面分子之间必需的相互作用。T细胞上的分子因而介导了T细胞的接触依赖性辅助效应物的功能。B细胞和T细胞上的分子之间接触依赖性相互作用被下列观察进一步支持，分离的激活的T细胞的原生质膜，能够提供对B细胞的激活必需的帮助功能。Brian，《美国国家科学院院刊》，85：564-568(1988)；Hodgkin等，《免疫学杂志》，145：2025-2034(1990)；Noelle等，《免疫学杂志》，146：1118-1124(1991)。
一个分子，CD40，已被确认存在于未成熟和成熟的B淋巴细胞表面，当它被抗体交联时，诱导B细胞增殖。Valle等，《欧洲免疫学杂志》，19：1463-1467(1989)；Gordon等，《免疫学杂志》，140：1425-1 430(1988)；Gruber等，《免疫学杂志》，142：4144-4152(1989)。CD40已经被分子克隆和确认特性。Stamenkovic等《欧洲分子生物学组织杂志》，8：1403-1410(1989)。CD40的一个配体，gp39(也称CD40配体和或CD40L)也已被分子克隆和确认特性。Armitage等，《自然》，357：80-82(1992)；Lederman等，《实验医学杂志》175：1091-1101(1992)；Hollenbaugh等，《欧洲分子生物学组织杂志》，11：4313-4319(1992)。gp39蛋白表达是在激活的，而不是静止的CD4+Th细胞上。Spriggs等，《实验医学杂志》176：1543-1550(1992)；Lane等，《欧洲免疫学杂志》，22：2573-2578(1992)；Roy等，《免疫学杂志》，151：1-14(1993)。转染gp39基因并在表面表达gp39蛋白的细胞能启动B细胞的增殖，并与别的刺激信号一起可以诱导抗体的产生。Armitage等《自然》，357：80-82(1992)，Hollenbaugh等，《欧洲分子生物学组织杂志》，11：4313-4319(1992)。
发明简述
细胞表面分子介导T细胞的接触依赖性辅助效应物功能，它对于诱导需要T细胞帮助的免疫反应是重要的。例如，T细胞上的gp39与B细胞上的CD40的相互作用对于激活B细胞对抗原的反应起了关键性的作用。本发明至少是部分依据此发现，即细胞表面介导T细胞接触依赖性辅助效应物功能的分子在T细胞对同种抗原的反应中也起重要作用，特别是已经发现在适宜的条件下，干扰gp39与同种细胞上的配体相互作用能够诱导T细胞耐受，同种的这类细胞向T细胞呈递同种抗原。优选地说，向T细胞呈递同种抗原的同种细胞为了提供T细胞活化所必需的信号，需要此细胞上的gp39配体与T细胞上的gp39相互作用。抑制同种细胞上的gp39配体与T细胞上的gp39相互作用防止了T细胞的激活，也就诱导同种抗原特异性的T细胞耐受，这里说明的诱导T细胞对同种抗原的耐受可以做为组织和器官移植的一种预备性制度。
因此，本发明的方法在组织和器官的受体中诱导对供体组织和器官的T细胞耐受尤其有用。此方法包括施予移植受体：1)一种同种或异种的细胞，它至少表达一种供体抗原，它的细胞表面的配体能与受体T细胞表面的受体相互作用，这种T细胞表面的受体介导了接触依赖性辅助效应物功能；2)一种拮抗剂，它能够拮抗存在于受体T细胞表面的分子，此分子介导了接触依赖性辅助效应物功能。这种拮抗剂抑制了T细胞上的分子与同种或异种细胞上的配体之间的相互作用。
在优选实施方案中，受体T细胞表面介导接触依赖性辅助效应物功能的受体分子是gp39。在此实施方案中，拮抗剂是一种分子，它抑制了T细胞上的gp39与同种或异种细胞上gp39配体相互作用。一个特别优选的gp39拮抗剂是抗-gp39抗体。在另一实施方案中，gp39拮抗剂是gp39配体的一种可溶形式，如可溶性的CD40。给予受体的同种或异种的细胞优选淋巴样细胞，比如B细胞。同种或异种细胞也可选择小的静止期的B细胞。同种或异种细胞和拮抗剂(如抗gp39抗体)一般在移植组织和器官进入受体以前施予受体。例如在移植组织和器官进入受体以前，把从组织或器官的供体中取得的淋巴样细胞(如B细胞)与拮抗剂一起给予受体。
本发明的方法能被用于诱导T细胞对移植的组织和器官的耐受，例如肝、肾、心脏、肺、皮肤、肌肉，神经组织、胃和肠。在一实施方案中，移植的组织包括胰岛。因此，本发明提供了一种治疗糖尿病的方法，包括给予需要治疗的受体：1)表达供体抗原的同种或异种的细胞；2)一种受体T细胞其表面受体的抑制剂，此T细胞表面受体可以介导接触依赖性辅助效应物功能，抑制剂例如gp39抑制剂(如抗-gp39抗体)；3)供体胰岛。
附图简述
图1是图解描述在化学性糖尿病小鼠中移植的胰岛同种移植物的存活，此小鼠或单独用抗-gp39抗体预处理或者单独用全部或部分同种脾细胞预处理。
图2是图解描述在化学性糖尿病小鼠中，通过血浆葡萄糖浓度的降低来测定移植胰岛同种移植物的存活，此小鼠用单一剂量的部分同种的脾细胞和抗gp39抗体提前处理2周(A组)或者7周(B)组，每条曲线示得自一个独立的小鼠的数据开放的符号表明在受体内胰岛同种移植物自发失败，闭合的符号表明小鼠的胰岛移植物在实验结束时是有功能的。
图3A、B和C是流式细胞计数轮廓图，它说明了用CD40Ig(A组)或mAb 4D9-8(B组)或mAb 4D9-9(C组)来染激活6小时的人外周血淋巴细胞。
图4A，B和C是流式细胞计数轮廓图，它说明了用mAb 4D9-8(A组)或mAb 4D9-9(B组)或CD40Ig(C组)来染培养在加有环孢霉素A(cycloporin A)的激活6小时的人外周血淋巴细胞。
图5A和B是流式细胞计数轮廓图，它说明了在加有未标记的mAb4D9-8(A组)或未标记的mAb 4D9-9的条件下，用CD40Ig来染激活6小时的外周血淋巴细胞。
图6是图解描述当细胞培养于加有抗人gp39 mAbs 4D9-8，4D9-9，24-31，24-43，89-76或89-79时，用gp39和I2-4来诱导的B细胞增殖的抑制。
图7是图解描述当细胞培养于加有抗人gp39mAbs 24-31或89-79时，同种特异性混合淋巴细胞反应的抑制。
发明详述
本发明的特色是该方法为在移植接受体内，体内诱导T细胞对供体组织或器官移植物耐受。此方法包括给予移植接受体：1)一种同种或异种的细胞，它表达供体抗原，其细胞表面的配体能与接受体T细胞表面介导接触依赖性辅助效应物功能的受体相互作用；2)一种拮抗剂，它通过拮抗T细胞表面受体来抑制配体与受体的相互作用。这里所用的术语“接受体”指的是组织和器官移植物将要、正在或已移植入的接受治疗者。本文所定义的“同种细胞”是从和接受体同种的不同个体中获取的，它表达的“同种抗原”不同于由接受体细胞表达的抗原，“异种细胞”是从和接受体异种的个体中获取的，它表达的“异种抗原”不同于由接受体细胞表达的抗原。这里所用的术语“供体抗原”指的是移植到接受体内的供体组织或器官移植物所表达的抗原。供体抗原依据移植物的来源可以是同种抗原或异种抗原，给予接受体的同种或异种细胞，做为耐受制度的一部分，表达供体抗原，比如表达呈现于移植的供体组织或器官的部分或全部相同的抗原。同种或异种的细胞优选地从组织或器官移植物的供体中获取，但也可以从与供体有相同的抗原决定簇的一个或更多来源中获取。
除了同种或异种的细胞，做为耐受制度的一部分，T细胞上介导接触依赖性辅助效应物功能的分子的拮抗剂也给予接受体。这里所定义的介导接触依赖性辅助效应物功能的分子或受体是指表达于Th细胞上并与效应物细胞(如B细胞)上的配体相互作用的分子或受体，这里所说的分子与其配体相互作用对于产生效应物细胞反应(如B细胞激活)是必需的。除了参与效应物细胞反应外，目前已经发现这些分子或受体还参与了T细胞对抗原的反应。优选的，T细胞上介导接触依赖性辅助效应物功能的分子是gp39。因此，在优选实施方案中，本发明的方法包括给予移植接受体同种或异种细胞和gp39拮抗剂。由同种或异种细胞来激活接受体T细胞包括接受体T细胞上gp39和同种或异种细胞上gp39配体的相互作用。通过用gp39的拮抗剂来抑制此相互作用，接受体的T细胞就不能被同种或异种细胞所表达的供体抗原所激活，而是对供体抗原耐受。在接受体中诱导对供体抗原的耐受则使得供体组织或器官移植成功，而没有免疫介导的供体移植物的排斥。
本发明的各个方面在下列小节中被更详细说明。I.gp39拮抗剂
依据本发明的方法，gp39拮抗剂施用于接受体，来干扰接受体T细胞上gp39与给予接受体的同种或异种细胞如B细胞上的gp39配体相互作用。gp39的拮抗剂被定义为干扰这种相互作用的一种分子。gp39的拮抗剂可以是gp39的抗体(如gp39的单克隆抗体)，gp39抗体的片段或衍生物(如Fab或F(ab)’2片段，嵌合性抗体或人源化抗体)gp39配体的可溶形式(如可溶性CD40)，gp39配体的融合蛋白的可溶形式(如可溶性CD40Ig)，或能分解或干扰gp39-CD40相互作用的药剂。A.抗体
哺乳动物(如小鼠、仓鼠或家兔)用gp39蛋白或蛋白片段(如多肽片段)的免疫原性形式来免疫，以诱导抗体反应。表面表达gp39的细胞也可以做为免疫原。另一种免疫原包括纯化的gp39蛋白或蛋白片段。通过标准的纯化技术，gp39可以从表达gp39的细胞中纯化出来。此外，gp39的cDNA(Armitage等，《自然》，357：80-82(1992)；Lederman等，《实验医学杂志》，175：1091-1101(1992)；Hollenbaugh等，《欧洲分子生物学组织杂志》，11：4313-4319(1992))也能在宿主细胞中表达，例如细菌或哺乳类细胞系，通过标准技术，gp39蛋白能从细胞培养物中纯化出来。此外，利用已知技术(如F-moc或T-moc化学合成)，gp39多肽依据gp39的氨基酸序列可以合成(说明见于Armitage等，《自然》，357：80-82(1992)；Lederman等，《实验医学杂志》，175：1091-1101(1992)；Hollenbaugh等《欧洲分子生物学组织杂志》，11：4313-4319(1992))给蛋白授予免疫原性的技术包括与载体的结合或此领域已熟知的其它技术。例如，蛋白在佐剂存在下被给药。通过检测血清或血浆中抗体的效价来监视免疫过程的发展。标准ELTSA或其它免疫学测定法与免疫原如抗原一起被用来估计抗体的水平。
免疫作用后，可以得到抗血清，如果想要的话，从血清中可以分离多克隆抗体，为了产生单克隆抗体，抗体产生细胞(淋巴细胞)从被免疫的动物中收获，通过标准体细胞融合技术与骨髓瘤细胞融合，然后使这些细胞不死，产生杂交瘤细胞。此技术在本领域内是熟知的，例如，最初由Kohler和Nilstein所发展的杂交瘤技术(《自然》(1975)256：495-497)以及别的技术，比如人B细胞杂交瘤技术(Kozbar等，《今日免疫学》，(1983)4：72)，EBV-杂交瘤技术来生产人单克隆抗体(Cole等，《肿瘤治疗中的单克隆抗体》(1985)(Allen R Bliss.Inc.77-96页)，和筛选结合的抗体文库，(Huse等，《科学》(1989)246：1275)。杂交瘤细胞可用免疫化学筛选以产生能与蛋白或多肽特异性反应的抗体，单克隆抗体被分离。
这里所用的术语抗体也包括其片段，此片段与gp39蛋白或其多肽或gp39融合蛋白特异性反应。能应用传统技术将抗体片段化，片段能够与上述的完整抗体以同样方式被筛选应用，例如，用胃蛋白酶处理抗体产生F(ab’)2片段，得到的F(ab’)2片段被处理以减少二硫键来产生Fab’片段。本发明的抗体进一步还包括有抗gp39部分的双特异性的和嵌合的分子。
当在非人类实验体中产生的抗体被治疗性地用于人类时，它们被作为外来物不同程度被识别，在病人中可能产生免疫反应。减少或去除此问题的方法是生产嵌合的抗体衍生物，该方法对一般的免疫抑制是可取的如抗体分子是由非人类动物的可变区域和人类的稳定区域联合组成。嵌合的抗体分子包括，比如从小鼠、大鼠或其它种的抗体而来的抗原连结区和人的稳定区。制造嵌合抗体的许多方法已被说明，并且能够用于制造含有免疫球蛋白可变区域的嵌合抗体，此抗体识别gp39。例如，Morrison等，《美国国家科学院院刊》，81：6851(1985)；Takeda，等，《自然》314：452(1985)，Cabilly等，U.S.Patent No.4,816,567Boss等，U.S.Patent No.4,816,397；Tanaguchi等，欧洲专利公开EP171496；欧洲专利公开0173494，英国专利GB 2177096B。期望这些嵌合抗体在人体中比相应的非嵌合抗体会少一些免疫原性。
为了人类治疗的目的，特异性与gp39蛋白或多肽反应的单克隆或嵌合抗体通过产生人的可变区域嵌合体被进一步人源化，其中嵌合体中，可变区的部分，尤其是抗原连结区域的保守框架结构区域是人类来源的，只有超变区是非人类来源的。此种变化的免疫球蛋白分子可以通过本领域已知的几种技术中的任一个被制造，(例如Teng等，《美国国家科学院院刊》，80：7308-7312(1983)；Kozbor等，《今日免疫学》，4：7279(1983)；Olsson等，《酶学方法》，92：3-16(1982))，更优选地可以依据PCT公开WO 92/06193或者EP 0239400上的指导来制造。人源化的抗体能被商业性地生产，例如Scotgen Limited，2 HollyRoad，Twickenham，Middlesex，Great Britain。
产生能与gp39蛋白或多肽反应的特异性抗体或抗体片段的另一方法是用gp39蛋白或多肽来筛选表达于细菌内的表达文库，该文库编码免疫球蛋白基因或其部分。例如，完整的Fab片段，VH区域和FV区域能够用噬菌体表达文库表达于细菌内。例子见于Ward等，《科学》，341：544-546(1989)；Huse等，《科学》，246：1275-1281(1989)；和Mc Cafferty等，《自然》，348：552-554(1990)。用例如gp39多肽来筛选此文库可以确定与gp39反应的免疫球蛋白片段。另外，SCID-hu小鼠(从Genpharm获得)也能用来生产抗体或其片段。
生产gp39，包括人gp39和鼠gp39单克隆抗体的方法学和本发明方法中所用的适宜的单克隆抗体在实例2中进一步作详尽说明。
本发明的抗人gp39单克隆抗体被优选用于诱导抗原特异性T细胞耐受。优选的抗体包括单克隆抗体3E4，2H5，2H8，4D9-8，4D9-9，24-31，24-43，89-76和89-79，在实例2中将被说明。尤其优选的抗体是单克隆抗体89-76和24-31。分别产生89-76和24-31抗体的89-76和24-31杂交瘤在Budapest条约的规定下，于1994年9月2号贮存于美国典型培养物保藏中心，Parklawn Drive，Rockville，Md，89-76杂交瘤被指定为ATCC，登记号HB11713，24-31杂交瘤被指定为登记号HB 11712。24-31和89-76抗体是IgG1同型。
在另一实施方案中，用于本发明的方法中的抗人gp39 mAb结合一个表位，此表位可以被选自3E4，2H5，2H8，4D9-8，4D9-9，24-31，24-43，89-76和89-79的单克隆抗体识别。更优选地，抗人gp39单克隆抗体结合一个由单克隆抗体24-31或89-76所识别的表位。一个mAb结合到一个由前面提到的任一抗体识别的表位的能力可通过标准交叉竞争试验来确定。例如一种抗体，它结合的表位与mAb24-31所识别的表位相同，则该抗体会竞争标记的24-31同已被激活的T细胞的结合，而如果一个抗体结合的表位不同于mAb24-31所识别的表位，则该抗体不会竞争标记的24-31同已被激活T细胞的结合。B.可溶性gp39配体
其它被施用以诱导T细胞耐受的gp39拮抗剂包括gp39配体的可溶形式。单一效价的gp39可溶性配体，如可溶性CD40，能够与gp39连结，因此抑制了gp39与B细胞上CD40的相互作用。术语“可溶的”指的是配体并非永久性结合到细胞膜上。可溶的gp39配体可以通过化学合成来制备，或优选地通过重组DNA技术来制备，例如通过只表达配体细胞外的区域(缺少跨膜和细胞质区域)。优选的可溶性gp39配体是可溶性CD40。此外，可溶性gp39配体可以是融合蛋白的形式，此融合蛋白包括至少gp39配体的一部分，此部分附着于第二种分子上，例如CD40与免疫球蛋白被做为融合蛋白表达(如CD40Ig融合蛋白)。在一实施方案中，融合蛋白的生产，包括CD40细胞外区域部分的氨基酸残基被连结到免疫球蛋白重链例如Crl的对应于铰链CH2和CH3区域的序列的氨基酸残基上，来形成CD40Ig融合蛋白(见Linsley等(1991)《实验医学杂志》，1783：721-730；Capon等，(1989)《自然》337，525-531；和Capon U.S.5,116,964)。融合蛋白可以通过化学合成来生产，或优选地依据CD40的cDNA通过重组DNA技术来生产(Stamenkovic等，《欧洲分子生物学组织杂志》，8：1403-1410(1989))。II.诱导抗原特异性耐受用的细胞
本发明是依据，至少是部分依据此发现，即在gp39拮抗剂存在时，由同种细胞呈递同种抗原给T细胞则诱导了T细胞对同种抗原的耐受。由此机制诱导耐受的细胞包括那些呈递抗原组通过与gp39相互作用来激活T细胞的细胞，(即T细胞上gp39与呈递的细胞上的gp39配体的相互作用对于传递适宜于T细胞激活的信号给T细胞是必须的)。抑制同种或异种细胞上的配体与接受体T细胞上gp39的相互作用阻止由同种或异种抗原引起的T细胞激活，这样，诱导了T细胞对抗原的耐受。通过gp39干扰T细胞的激活也可以阻止同种细胞或异种细胞上共刺激分子的诱导(如B细胞上B7家族分子)，这样在缺少共刺激信号时细胞只传递抗原信号给T细胞，诱导了耐受。
因此，在发明的方法中，同种或异种的细胞被给予接受体受治疗者。同种或异种的细胞能够呈递抗原给受体的T细胞，例如B淋巴细胞，“职业性”的抗原呈递细胞(如单核细胞，树突状细胞，郎格尔汉细胞)或其它呈递抗原给免疫细胞的细胞(如角化细胞、内皮细胞、星形细胞、成纤维细胞、少突神经胶质细胞)。而且，更优的是，同种或异种的细胞有一种减弱的在接受体T细胞中刺激产生共刺激信号的能力。例如，同种或异种的细胞可以不表达，或只低水平表达共刺激分子如蛋白B7家族(如B7-1和B7-2)。用于本发明方法中的可能的同种细胞或异种细胞上共刺激分子的表达能够通过标准技术来估测，例如用共刺激分子的抗体进行流式细胞计数。
诱导T细胞耐受优选的同种或异种的细胞是淋巴样细胞，例如外周血淋巴细胞，或脾细胞。诱导T细胞耐受的优选淋巴样细胞是B细胞。通过标准的细胞分离技术，B细胞可以从混合的细胞群体中纯化出来(如外周血或脾中其它细胞类型)，例如把脾细胞培养于塑料平皿中粘附性细胞被去除，重新获得非粘附性细胞。用抗T细胞抗体(如抗Thy1.1和/或Thy1.2)和补体处理，T细胞可以从混合的细胞群体中去除。在一实施方案中，静止期的淋巴样细胞，优选地用静止期B细胞做为抗原呈递细胞。通过本领域已知技术，静止期的淋巴样细胞，例如静止期的B细胞依据它们较小的大小和密度能够被分离出来。通过例1所说明的对流离心淘洗，静止期的淋巴样细胞能够分离出来。应用对流离心淘洗，通过收集在14-19ml/min的级分，优选19ml/min(3,200rpm)级分，小的、静止期的淋巴样细胞群体可以获得，此群体中排净了能够激活T细胞反应的细胞。此外，通过不连续密度梯度离心比如用Ficoll或Percoll梯度，小的静止期的淋巴细胞(如B细胞)能被分离，离心后一层含有小的静止期的淋巴细胞能被获取。通过标准技术(如免疫荧光)检测激活B细胞表面共刺激分子如B7-1和B7-2的表达，小的静止期的B细胞也能从激活的B细胞中区分出来。
施予接受体的同种或异种的细胞的功能是，至少部分呈递供体抗原给接受体T细胞。这样，供体组织或器官所表达的抗原在细胞中也表达。典型地，这可以用从组织或器官移植物的供体中获取的同种或异种的细胞来完成。例如，从组织或器官供体中来源的外周淋巴样细胞，B细胞或脾细胞能被分离并用于本发明的方法中。此外，同种或异种的细胞也能从除了组织或器官的供体之外的来源获取，只要细胞与组织或器官的供体有相同的抗原决定簇。例如与供体组织或器官表达相同的主要组织相容性复合物抗原的同种或异种的细胞能被使用，这样从组织或器官的供体有着MHC单倍型相匹配的来源而来的同种或异种的细胞可以被使用(如移植供体的近亲)。III.细胞和gp39拮抗剂的施用
依据本发明，通过给移植接受体施用gp39拮抗剂和同种或异种的细胞，此细胞表达供体抗原，并通过gp39与受体T细胞相互作用，这样可诱导了T细胞对组织或器官移植物的耐受。在优选的实施方案中，同种或异种的细胞和gp39拮抗剂被同时给予接受体。另一可选择的方法是在给予同种或异种细胞之前，gp39拮抗剂被给予受体，例如当gp39拮抗剂是一个有着长的半衰期的抗体。在优选的实施方案中，拮抗剂和同种或异种的细胞在组织或器官移植进接受体之前给予受体。(即受体用拮抗剂和细胞提前处理)。例如给予同种或异种的细胞和拮抗剂可以在组织或器官移植之前几天(如5-8天)进行。
给予单剂量的同种的细胞同拮抗剂一起已发现足够诱导T细胞对供体组织或器官的耐受(见例1)给予细胞的数目依据所用细胞类型、组织或器官移植物类型，接受体的重量，接受体总的条件，以及熟练的技术人员已知的其它变量而变化。用于本发明方法中的适宜的细胞数可以通过本领域中一个普通技术人员，通过传统的方法来确定(例如例1中所描述的)细胞以有利于在接受体中诱导T细胞耐受的方式和路径被给予。细胞可以在生理的可接受的溶液中给予受体，象缓冲盐溶液或类似载体。优选地细胞可以静脉注射给接受体。
在适宜于体内给药的生物相容的形式内，本发明的拮抗剂给予受试验体以诱导T细胞耐受。“适宜于体内给药的生物相容的形式”意味着给予拮抗剂的一种形式，其中形式内，任何毒性效应不超过此化合物治疗的效应。术语受试验体包括在其体内免疫反应可以被诱导的活的有机体如哺乳动物，受试验体的例子包括人、狗、猫、小鼠、大鼠、和其转基因种属。gp39拮抗剂能够以任何药理学的形式，可选择和药用载体一起被给予。拮抗剂治疗活性量的给予定义为在剂量和必须的一段时间内，取得想要结果(如T细胞耐受)的有效量。例如，gp39的拮抗剂的治疗活性量可能依据下列因素而变化，例如疾病的状态、年龄、性别、个体重量和拮抗剂在个体内诱导预期反应的能力。为了产生理想的治疗反应，剂量可以调整。例如，几个分开的剂量可以每日给药，或依据治疗情况的紧急状态所显示的量，把剂量成比例降低。就象例1中所说明的用抗gp39抗体来治疗，一个有效的治疗制度包括在组织或器官移植前(如5-8天)开始给予抗体，接着在移植后几周内(如2-7周)再次给予抗体(如每隔一天)。
有活性的化合物(例如拮抗剂如抗体)可以以方便的方式给药，例如注射(皮下的，静脉的等等)，口服给药，吸入给药，经皮肤给药或直肠给药。依据给药的途径，有活性的化合物可以包裹在一种物质内防止化合物遭受可以使此化合物失活的酶，酸或其它自然条件的作用。优选地给药途径是静脉注射。
除去胃肠道外给药，要给予gp39的拮抗剂，则有必要用一物质包裹拮抗剂或与拮抗剂共同给药以防止它的失活。例如拮抗剂能在合适的载体或稀释剂中与酶的抑制剂共同给药，或在合适的载体如脂质体中给予个体。药用稀释剂包括盐以及水性的缓冲溶液。酶的抑制剂包括胰蛋白酶抑制剂，二异丙基氟代磷酸酯(盐)(DEP)和抑肽酶。脂质体包括在水中的油包水乳液以及传统的脂质体(Strejan等，(1984)《神经免疫学杂志》7：27)。
有活性的化合物也可以胃肠道外或腹膜内给药。胶体溶液也可制备于甘油、液体聚乙二醇、其混合物和油中。在通常的贮存和使用条件下，这些制备物可以含有防腐剂以防止微生物的生长。
适用于注射用的药用组合物包括无菌水溶液(水溶的)或胶体溶液、和无菌粉末，这些粉末用于当场制备无菌注射溶液或胶体溶液。在所有情况下，组合物必须无菌，并且必须具有一定程度的流动性到以使之易于注射。在生产和贮存的条件它必须是稳定的，必须能够在保存时防止微生物象细菌和真菌的污染作用。载体可以是溶剂或胶体介质，含有例如水，乙醇、多聚醇(如甘油、丙二醇、液体聚乙二醇和此类物质)及其适宜的混合物。通过使用包膜如卵磷脂，或在胶体溶液的情况下保持所需颗粒大小，或使用表面活性剂可以保持合适的流动性。通过各种抗细菌和抗真菌药剂，例如对羟基苯甲酸酯、氯代丁醇、苯酚、抗坏血酸(asorbic acid)，乙基汞硫代水杨酸钠等等可以防止微生物的作用。在许多情况下，更可取的是在组合物中包括等渗剂，例如糖，多元醇如甘露醇、山梨醇，和氯化钠。通过在组合物中加入延缓吸收的药剂，如一硬脂酸铝和白明胶，能使注射组合物的吸收延长。
无菌注射溶液也能如此制备，把在适宜溶剂中的所需量的活性化合物(如gp39拮抗剂)与上面所例举的一个或多种成份混合，然后按照需要过滤除菌。总的来说，胶体溶液的制备是通过把活性化合物混入一无菌载体，此载体含有基本的胶体介质和上面所枚举的所需的其它成份。如果是制备无菌注射溶液的无菌粉末，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥，这些方法可从以前无菌过滤的溶液中产生一种粉末，包含活性成份(如拮抗剂)及任何所需的其它的添加成份。
当活性化合物按上面描述被适宜保护时，蛋白也可以和惰性稀释剂或可吸收载体一起口服给药。这里所用的“药用载体”包括所有溶剂，胶体溶液介质，外包膜，抗细菌和真菌药剂，等渗剂和吸收延缓剂等等。对于药学活性物质的这些介质和药剂的使用在本领域内是众所周知的。除非一些常规的介质和药剂与活性化合物不相容，都要考虑在治疗组合物中使用这些物质。辅助活性化合物也可以掺入组合物中。
为了易于给药和剂量的统一，以剂量单位形式形成胃肠外组合物是尤其有利的。这里所用的剂量单位形式是指物理的独立的单位，适于做为需要治疗的哺乳动物的单元剂量，每一单位含有已确定的活性化合物数量，此数量已被计算能够和所需的药用载体一起产生想要的治疗效应。本发明中剂量单位形式的规格决定于或直接依赖于(a)活性化合物独特的特征和所要达到的特定治疗效果，(b)化合物领域中内在的限制，如在个体敏感性治疗中用到的这种活性化合物的限制。
继这里所说明的耐受制度之后，或与之同步，用传统技术，将供体的组织或器官移植入接受体中。IV  发明方法的使用
发明的方法可以应用到组织和器官移植的广大范围内。此方法可用于在组织或器官移植的接受体中诱导T细胞耐受，如胰岛、肝、肺、肾、心脏、皮肤、肌肉、神经组织、胃和肠。因此发明的方法能用于治疗必须移植组织或器官的疾病或情况(如肝移植治疗血胆固醇过多，移植骨骼肌细胞治疗骨骼肌营养障碍，移植神经组织治疗亨廷顿疾病或帕金森氏病等等)。在一优选的实施方案中，移植的组织包括胰岛，相对应地，本发明中包括一种方法，可通过胰岛移植来治疗糖尿病。这种方法包括给予需要治疗的受试验体1)表达供体抗原的同种或异种的细胞，2)对一种分子的拮抗剂，此分子表达于接受体T细胞上并介导接触依赖性辅助效应物功能，如gp39的拮抗剂(比如抗-gp39抗体)3)供体胰岛细胞，优选地，在给予胰岛之前，给予接受体以同种或异种的细胞和拮抗剂。
发明通过下列例子被进一步说明，这些例子不应该理解为一种限制。在整个应用中所引用的所有文献、专利和公开的专利申请的内容都在此引入做为参考。实施例1：用同种细胞和抗-gp39处理接受体以诱导其对胰岛同种移植
物的耐受
当前同种移植物的研究依靠非特异去除免疫效应物功能而产生全身免疫抑制。然而免疫抑制药物能引起显著的副作用。此外，郎格尔汉斯细胞的胰岛的同种移植物用于治疗糖尿病对此方法已证实是无效的(见例：Robertson，R.P(1992)《新英格兰医学杂志》327，1861)应用T细胞的直接抗体来治疗，在啮齿动物中也可以成功地同种移植胰岛，但此方法也同样会导致全身免疫抑制(Carpenter，C.B(1990)《新英格兰医学杂志》322，1224，Roark，J.H等(1992)《移植》54，1098；Kahan，B.D.(1992)《当前免疫学见解》(Curr.Opion Immunol)4，553)在本实施例中，通过操纵呈递同种抗原给接受体T细胞以防止它们被激活，而在移植接受体中诱导对胰岛同种移植物的耐受。胰岛同种移植物在化学性糖尿病(57BL/6(H-2b)小鼠中的存活用下面的方法来检测。糖尿病的诱导
通过静脉注射链尿霉素(Strepto gotocin)(140mg/kg)，使得雄性C57BL/6J(H-2b)小鼠产生糖尿病，一周时间内有3次随机机会中显示血浆葡萄糖浓度≥400mg/dl。证明其为永久性糖尿病。同种脾细胞的分级分离
用于预处理移植接受体的供体同种细胞是从(C57×BALB/c)(H-2B/d)杂交F1代动物中获取的，以防止移植物抗宿主的疾病。为了分离小淋巴细胞，来源于8周龄(C57×BALB/C)杂交F1代雌鼠中的脾细胞悬浮液去除红细胞，然后如下的方法用淘洗法进行大小分级分离H.P等(1985)《实验医学杂志》761，223，和Gosselin E.J等(1988)《免疫学杂志》140，1408。简言之，小淋巴细胞通过对流离心淘洗得到分离，例如用J-6B型离心(Beckman Instruments，Palo Alto CA)。存在于带有1.5％的胎牛血清的8毫升培养基或平衡盐溶液中的大约1-5×108细胞用脱氧核糖核酸酶处理，放入淘洗小室，开始对流速度为13.5ml/min，在4℃下以3,200rpm速度旋转。尽管精确的流速依赖于悬浮细胞的介质，一个几乎不带有任何大细胞的小细胞级分一般在14-19ml/min得到洗脱，其中说明的本实验中，小细胞级分在19ml/min(3200rpm)处收集，当用对兔IgG和H2d或对H2b(D10.G4)有同种反应的T细胞系来检测时，此级分已被完全去除了辐射抵抗性(3000rads)辅助细胞功能，在尾静脉注射到同种移植物接受体之前，小细胞和未分级细胞在无血清培养基中洗涤两次。大约使用了40-100×106(C57×BALB/c)F1(H-2b/d)淘洗过的小的脾细胞。移植接受体的预处理
移植接受体用未分级的(C57×BALB/c)F1(H-2b/d)同种脾细胞，或用淘洗的去除了APC活性(按上述说明分离)“19级分”小直径脾细胞，抗-gp39单克隆抗体(MR1见例2，实验3)或同种细胞和抗-gp39抗体的组合来预处理。19级分细胞用两个不同剂量范围来实验，低剂量40-44×106细胞或高剂量77-88×106细胞。对照动物既不接受同种细胞也不接受抗体处理。同种细胞在胰岛同种移植物移植前5-8天通过尾静脉注射给予移植接受体，MR1抗体处理是在胰岛移植前7天，以每周2次，每次剂量为250μg/每只小鼠，连续处理2-7周或直至移植失败。抗体的第一次注射一般和同种脾细胞的第一次注射在同一天。胰岛同种移植物移植
通过已作改良的胶原酶消化方法(Gottlieb，PA等(1990)《糖尿病》39，643)使同种BALB/c(H-2d)胰岛得到分离，分离后，胰岛以30个小岛/每克体重的剂量立即移植进受体C57B1/6J(H-2b)小鼠的直肠下的被膜内，移植物的成活定义为血浆葡萄糖的浓度维持在≤200mg/dl。结果
在第一组实验中，胰岛同种移植物接受体或者单独用同种脾细胞或者用抗gp39抗体预处理。就象图1所显示的，在缺少脾细胞预处理的情况下，所有的胰岛同种移植物在移植的13天内遭到排斥(9±2天，范围5-13天；N＝23)。同样，只用含有正常APC活性的未分级的脾细胞(6±3天，范围4-12天，N＝7)或低剂量的(40-44×106细胞)去除了APC的级分19脾细胞(7±3天，范围3-14天，N＝16)处理动物，也很少能观察到胰岛的生活。相反，注射了高剂量的去除了APC的级分19小的脾细胞(75-88×106细胞)延长了同种移植物的成活(19±10d，范围7-40天；N＝16)，对移植物成活时间的延长的影响有着统计的显著性(当与无任何东西、全部脾细胞，或低剂量的级分19脾细胞处理的小组相比较，F3.58＝17.3 p＜0.001)，但此影响并不持久。在用去除APC的级分19小细胞处理的糖尿病接受体中，同种胰岛延长但有限的成活表明，单独这些细胞不能维持同种移植物的成活。另一组移植接受体用77-88×106个级分20细胞处理。这个级分也含有绝大多数的小淋巴细胞，但不同于级分19细胞群体是其含有可检测的APC功能，这些细胞的接受体(N＝6)全部迅速排斥它们的移植物(平均＝8.5天，范围6-12)。另一组移植物接受体只用抗-gp39单克隆抗体MR1单独处理。图1表明，在只用抗gp39mAb处理的7/11小鼠中，在15天内同种胰岛移植物死亡，剩余的4只小鼠在实验结束时48天有移植物功能。此结果表明，单独把抗-gp39抗体MR1给予接受体可以延长胰岛同种移植物的成活(平均20-19天；范围9-自由度：N＝5)。延长的程度在统计学上类似于单独用高剂量级分19的脾细胞所得到的结果，显著长于其余三组所得到的结果(p＜0.05)。
上面描述的一系列实验表明，高剂量级分19的去除APC的脾细胞或抗gp39 mAb单独处理与无任何处理相比能加强胰岛同种移植物的成活。但是两者中任一种单独处理都不能在接受体中有效诱导对胰岛同种移植物的长期耐受。在下面一系列实验中，同种脾细胞和抗gp39抗体联合处理接受体。同种脾细胞和抗gp39抗体的联合给药被发现比任一单独给药更有效。图2中所显示的结果，其中，每一曲线代表从一个小鼠个体中获取的资料。空心的符号代表胰岛同种移植物自发失败的接受体，实心的符号代表胰岛在实验结束时仍有功能的个体。图2(B组)，表示一次注射级分19的去除APC脾细胞和用gp39 mAb处理7周后在所有动物中取得移植物无限期存活(N＝6)通过降低抗gp39处理延续的时间来修改此方案，会减弱，但不消除移植物成活的良好效果。当抗-gp39mAb只连续两周给药，同时给予19组分脾细胞，在6/8受体中取得了无限期移植物成活(图2，A组)在用抗gp39处理2或7周同时一次注射未分部同种脾细胞的接受体中，也可以观察到移植物的无限期成活。
为了确定胰岛移植物的功能并确定缺乏那些由没有被链尿霉素破坏的天然的残余胰岛分泌的胰岛素，含有肾下移植物的肾被去除。在所有情况下，单侧肾切除术在3天内产生了高血糖(＞300mg/dl)的再次发生。
无论移植失败或在实验最后，在所有动物中用组织学方法研究胰岛同种移植物和天然的胰腺。在用分级的同种小淋巴细胞和连续的(7周)MR1 mAb处理的受体的肾中，胰岛同种移植物组织学切片表明在肾被膜下有大量可见的完整胰岛，它缺少单核细胞的浸润，含有完整颗粒状胰岛  素和胰高血糖素阳性细胞。相反，在只单独用抗gp39 mAb处理的受体的肾中，胰岛同种移植物组织学切片表明的特征性密集的单核细胞炎症和伴随的胰岛细胞的破坏。在所有宿主的胰腺中，胰岛的形态与链尿霉素糖尿病是一致的。实施例2：抗gp39抗体的产生和特征实验1：抗人gp39的抗体
为了在人受试验体中诱导抗原特异性的T细胞耐受，优选地给予抗人gp39抗体。下面的方法用于产生鼠抗人gp39单克隆抗体。Balb/c小鼠用存在于弗氏完全佐剂(CFA)中的可溶性gp39融合蛋白gp39-CD8来免疫。6周以后用存在于弗氏不完全弗氏佐剂(IFA)中的可溶gp39-CD8使小鼠接着被激发。第二次免疫4周以后，可溶性gp39-CD8以可溶性形式被给予。2周以后，小鼠被激活的人外周血淋巴细胞促进，再过2周后，被可溶性gp39-CD8最后一次促进，依照每个标准方法，在最后一次免疫的第4天，脾细胞与NS-1融合。
基于多次筛选过程，挑选出产生抗人gp39抗体的克隆。通过平板结合实验用gp39-CD8来进行克隆的初次筛选，筛选出的阳性克隆接着用对照CD8融合蛋白，CD72-CD8来进行筛选，在CD8-CD72平板结合实验中显示阳性的克隆被除去，通过流式细胞计数分析，剩余的克隆接下来在静止期的和6小时激活的人外周血淋巴细胞(PBL)上筛选。可染色激活的而不是静止期的PBL的杂交被认为是阳性。最后，检测剩下的克隆的封闭CD 40Ig结合同平板结合的gp39的能力。
在平板结合实验中，最初被筛选出来的大约300个克隆是抗gp39CD8和CD72-CD8的，在这些克隆中，30个克隆被发现是检测平皿连结的gp39而不是CD8接下来这些克隆被筛选检测激活的外周血淋巴细胞上的gp39，大约15个克隆能在活化的外周血淋巴细胞上检测到一个分子，在静止的外周血淋巴细胞上则不能。通过决定克隆封闭CD 40Ig检测平板结合的gp39的能力，特异性进一步得到证实，其中实验中，10个克隆中的3个被检测到能封闭CD 40Ig的结合。这三个克隆是3E4，2H5和2H8。这些克隆优选用于此处介绍的方法中。在激活的而非静止的外周血淋巴细胞上检测阳性的克隆也被筛选，筛选是通过其与活化的大鼠T细胞克隆，POMC8的反应性实现的。克隆2H8能与此大鼠T细胞系交叉反应。实验2：人gp39的抗体
一个与实验1类似的免疫方法用于生产另外的人gp39的抗体。Balb/c小鼠用存在于CFA中的可溶的gp39-CD8免疫，4周后用6小时活化的人外周血淋巴细胞激发，每一标准实验方法中，在脾细胞和NS-1融合前4天，小鼠用可溶的gp39-CD8促进。通过流式细胞术检测激活6小时的人外周血淋巴细胞的染色，来筛选杂交瘤克隆。染色激活的而非静止的人外周血淋巴细胞的克隆被挑选，6个克隆，4D9-8，4D9-9，24-31，89-76，和89-79被挑选出来做进一步分析。
选出的克隆的特异性被下列几个实验证实。第一，流式血细胞计数分析表明，所有6个mAb都染激活的，而非静止期的人外周血T细胞。(典型例子见图3B和3C，描述了分别用4D9-8和4D9-9来染色激活的T细胞)，6种抗体中任一种所识别的分子的表达在激活4小时内是可检测到的，激活后6-8小时之间的表达最大，激活后24小时则不能检测到。所有mAb都识别表达在激活的CD3+外周血淋巴细胞上的一种分子，主要是CD4+表型，但一部分CD8+T细胞也表达此分子。6种mAbs所识别的分子的表达，就象gp39的表达一样，被培养基中存在的环孢菌素A所抑制(典型的例子见图4A和4B，描述了分别用4D9-8和4D9-9来染环孢菌素处理过的T细胞)，这些mAbs所识别的分子表达的动力学和分布与gp39的相同，gp39是用人CD40Ig融合蛋白来检测。此外，6种mAbs都能封闭由CD40Ig来进行的gp39的染色(典型的例子见图5A和5B，描述了分别在4D9-8和4D9-9存在下抑制了由CD40Ig来进行的gp39染色)。在ELISA实验中，所有6种mAb都识别gp39-CD8，其为gp39分子的一种可溶的融合形式。而且，所有6种mAbs都能从35S-甲硫氨酸标记的激活的人外周血淋巴细胞中免疫沉淀一个大约36Kd的分子。此免疫沉淀的分子和由人CD40Ig融合蛋白沉淀的分子是相同的。
6种选出的mAbs(4D9-8，4D9-9，24-32，24-43，89-76和89-79)的功能活性照下列方法被检测。首先，检测mAbs抑制纯化的人B细胞增殖的能力，此纯化的B细胞培养于IL-4和可溶的gp39存在的条件下。在加有或不加剂量为0-125μg/ml的纯化的单克隆抗体或CD40Ig条件下，用gp39和IL-4来培养纯化的人B细胞，在培养中通过胸腺嘧啶的掺入，培养3天以后来确定B细胞的增殖。结果(显示于图6)表明6种mAbs都能抑制由gp39和IL-4所诱导的B细胞增殖，mAbs89-76和24-31在抑制诱导的B细胞增殖中最有效。
下一步，通过测量由抗CD3+激活的T细胞和IL-2所诱导的免疫球蛋白的产量，检测mAbs抑制B细胞分化的能力。用FACS来阳性选择，以此制备纯化的IgD+人B细胞，此细胞在加有或不加剂量在0-10μg/ml纯化的抗gp39单克隆抗体的条件下，用抗CD3激活的人T细胞(丝裂霉素C处理)和IL-2培养6天。第6天IgM、IgG和IgA的产量用ELISA检测，结果(显示于表1)表明，通过检测IgM，IgG和IgA的产量，所有6种抗体都能抑制T细胞依赖的B细胞分化。
                表1
                          免疫球蛋白的产量 小鼠抗体   μg/ml         IgM      IgG     IgA
         -              17,500    6710     44714D9-8       0.1             4813      2130     2819
        1.0             4394      2558     1519
        10.0            1081      389      3964D9-9       0.1             3594      919      1731
        1.0             2659      1233     1606
        10.0            374       448      26624-31       0.1             3863      981      344
        1.0             1287      314      165
        10.0            1120      596      2324-43       0.1             6227      4132     432
        1.0             3193      2130     192
        10.0            7021      1232     108189-76       0.1             3783      1069     344
        1.0             2180      352      171
        10.0            818       551      1989-79       0.1             9763      1924     3021
        1.0             2314      460      156
        10.0            183       135      434
为了检查抗-gp39mAbs对T细胞反应的影响，mAbs被引入标准的混合淋巴细胞反应(MLR)。300,000个人外周血淋巴细胞(应答者＝R)在加有或不加抗-gp39mAbs(10μg/ml)的条件下同100,000个照射过的同种外周血淋巴细胞(刺激者＝S)一齐培养。培养物在4，5，6天时间用3H-胸腺嘧啶脉冲掺入，继续培养18小时后收获。通过测量MLR，所有6种抗人gp39都抑制同种特异的反应(典型例子见图7，描述了R和S在加有24-31或89-76的条件下孵育时，同种特异性反应的抑制；CTLA4-免疫球蛋白融合蛋白和抗CD28mAb做为阳性对照)。
为了确定6种mAbs在人gp39分子上是否识别独特的表位，进行了交叉封闭实验，激活的人外周血淋巴细胞首先用6种mAbs中的任一种封闭(25μg/ml未结合的抗体)洗涤细胞，然后用10μg/ml生物素结合的抗体染色，接着同植物赤藓素(phytoerythrin)结合的亲合素(PE-Av)反应。细胞的PE-Av染色用FACS来分析。结果显示于表2中。表2封闭                   抗体染色 抗体    4D9-8     4D9-9    24-31   24-43     89-76     89-79无        +++       +++      +++     ++++      ++++      ++++4D9-8     ND        -        ++++    ++++      +++       +++4D9-9     +++       ND       +++     ++++      +++       +++24-31     +         +        ND      +++       ++        ++24-43     +         +        +++     ND        ++        +89-76     +         +        +++     +++       ND        +++89-79     +         ++       +++     +++       +++       ND染色的强度和阳性细胞百分率用+号代表(++++＝MI＞200；+++＝MI＞125；++＝MI＞50；+＝MI＞25；-＝无高于背景的染色)，ND＝不确定。所有的抗体都封闭了CD40Ig同激活的人外周血淋巴细胞的结合。然而，表2中显示的资料也清楚地表明一些抗体不能封闭别的抗体同激活的人外周血淋巴细胞的结合，说明它们识别位于人gp39分子上的不同表位。
分别产生89-76和24-31抗体的89-76和24-31杂交瘤，在Budapest条约的规定下于1994年9月2号贮存于美国典型培养物保藏中心Parklawn Drive，Rockville，Md.89-76杂交瘤被指定为ATCC增添新成员，序号HB11713，24-31杂交瘤被指定为ATCC增添的新成员，序号HB712。实验3小鼠gp39抗体
在本发明的一个实施方案中，gp39的拮抗剂是抗小鼠gp39的单克隆抗体，MR1。下列方法用于产生MR1单克隆抗体，也可以用于产生其它的抗gp39抗体。
仓鼠用5-106激活的Th1细胞(d1.6)腹腔内免疫，以周为间隔延续6周。当抗小鼠Th1的血清效价大于1∶10,000时，用聚乙二醇对免疫的仓鼠的脾细胞和NS-1进行细胞融合。通过对静止期的和激活的Th1进行流式细胞术，筛选从含有生长的杂交瘤的孔中取出的上清。一个特定的杂交瘤，它能够产生能选择性识别激活的Th的Mab，此杂交瘤被进一步检测并被亚克隆以产生MR1。MR1在腹水中产生，并通过离子交换HPLC纯化。杂交瘤MR1贮存于美国典型培养物保藏中心，保藏号HB11048。类似方案
那些在本领域中有经验的人，仅仅用常规的试验，就能发现或确定许多类似方案，它们类似于此处提及的本发明中的特定的实施方案。这些类似方案将被包括在下面的权利要求中。在整个应用中所引用的所有文献和公开的专利申请的内容在此被引入作为参考。

Claims (38)

1.a)表达至少一种供体抗原的同种或异种细胞和b)T细胞表面受体的拮抗剂在制备用于在组织或器官接受体中诱导对供体组织或器官的T细胞耐受的药物中的应用，所述细胞表面具有配体，该配体能与接受体T细胞表面的介导接触依赖性辅助效应物功能的受体相互作用，所述T细胞表面受体的拮抗剂抑制配体和受体分子的相互作用。
2.权利要求1的应用，其中接受体T细胞表面介导接触依赖性辅助效应物功能的受体分子是gp39。
3.权利要求2的应用，其中拮抗剂是抗-gp39的抗体。
4.权利要求3的应用，其中抗-gp39的抗体是单克隆抗体。
5.权利要求3的应用，其中抗-gp39抗体是抗人gp39的抗体。
6.权利要求4的应用，其中单克隆抗体是MR1。
7.权利要求4的应用，其中单克隆抗体是嵌合的单克隆抗体。
8.权利要求4的应用，其中单克隆抗体是人源化的单克隆抗抗。
9.权利要求1的应用，其中同种或异种细胞是淋巴样细胞。
10.权利要求9的应用，其中淋巴样细胞是B细胞。
11.权利要求10的应用，其中B细胞是静止期的B细胞。
12.权利要求1的应用，其中组织或器官包括胰岛。
13.权利要求1的应用，其中组织或器官选自肝、肾、心脏、肺、皮肤、肌肉、神经组织、胃和肠。
14.a)表达至少一种供体抗原的同种或异种细胞和b)gp39的拮抗剂在制备用于在组织或器官的接受体中诱导对供体组织或器官的T细胞耐受的药物中的应用。
15.权利要求14的应用，其中gp39的拮抗剂是抗-gp39抗体。
16.权利要求15的应用，其中抗-gp39抗体是单克隆抗体。
17.权利要求15的应用，其中抗-gp39抗体是抗人gp39抗体。
18.权利要求16的应用，其中单克隆抗体是MR1。
19.权利要求16的应用，其中单克隆抗体是嵌合的单克隆抗体。
20.权利要求16的应用，其中单克隆抗体是人源化的单克隆抗体。
21.权利要求14的应用，其中gp39的拮抗剂是gp39配体的可溶形式。
22.权利要求21的应用，其中gp39配体的可溶形式是CD-40融合蛋白。
23.权利要求14的应用，其中同种或异种细胞是淋巴样细胞。
24.权利要求23的应用，其中淋巴样细胞是B细胞。
25.权利要求24的应用，其中B细胞是静止期B细胞。
26.权利要求14的应用，其中组织或器官包括胰岛。
27.权利要求14的应用，其中组织或器官选自肝、肾、心脏、肺、皮肤、肌肉、神经组织、胃和肠。
28.a)表达至少一种供体抗原的同种或异种细胞，b)gp39的拮抗剂和c)供体胰岛细胞在制备用于治疗糖尿病的药物中的应用。
29.权利要求28的应用，其中抗-gp39抗体是单克隆抗体。
30.权利要求28的应用，其中抗-gp39抗体是抗人gp39抗体。
31.权利要求29的应用，其中单克隆抗体是MR1。
32.权利要求29的应用，其中单克隆抗体是嵌合的单克隆抗体。
33.权利要求29的应用，其中单克隆抗体是人源化的单克隆抗体。
34.权利要求28的应用，其中gp39的拮抗剂是gp39配体的可溶形式。
35.权利要求34的应用，其中gp39配体的可溶形式是CD40融合蛋白。
36.权利要求28的应用，其中同种或异种细胞是淋巴样细胞。
37.权利要求36的应用，其中淋巴样细胞是B细胞。
38.权利要求37的应用，其中B细胞是静止期的B细胞。
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