RU2169009C2 - Способы индуцирования т-клеточной толерантности к тканевому или органному трансплантату - Google Patents
Способы индуцирования т-клеточной толерантности к тканевому или органному трансплантату Download PDFInfo
- Publication number
- RU2169009C2 RU2169009C2 RU96122475/14A RU96122475A RU2169009C2 RU 2169009 C2 RU2169009 C2 RU 2169009C2 RU 96122475/14 A RU96122475/14 A RU 96122475/14A RU 96122475 A RU96122475 A RU 96122475A RU 2169009 C2 RU2169009 C2 RU 2169009C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- cell
- cells
- tissue
- monoclonal antibody
- organ
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 82
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 title claims abstract description 49
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 title claims description 19
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims abstract description 43
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims abstract description 43
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims abstract description 43
- 239000003446 ligand Substances 0.000 claims abstract description 34
- 230000003993 interaction Effects 0.000 claims abstract description 21
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 claims abstract description 19
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 claims abstract description 17
- 239000002464 receptor antagonist Substances 0.000 claims abstract description 8
- 229940044551 receptor antagonist Drugs 0.000 claims abstract description 8
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 151
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 91
- 230000000735 allogeneic effect Effects 0.000 claims description 70
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 claims description 51
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 claims description 45
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 43
- 230000000284 resting effect Effects 0.000 claims description 22
- 239000012636 effector Substances 0.000 claims description 18
- 210000004153 islets of langerhan Anatomy 0.000 claims description 16
- 102100040245 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 5 Human genes 0.000 claims description 15
- 101150013553 CD40 gene Proteins 0.000 claims description 14
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 claims description 14
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 claims description 14
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 14
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 claims description 11
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 claims description 10
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 claims description 7
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 claims description 5
- 210000002216 heart Anatomy 0.000 claims description 4
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 claims description 4
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 claims description 4
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 claims description 4
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 claims description 4
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 claims description 4
- 210000000944 nerve tissue Anatomy 0.000 claims description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 7
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 4
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 abstract description 3
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 abstract 1
- 101000868215 Homo sapiens CD40 ligand Proteins 0.000 description 103
- 102100032937 CD40 ligand Human genes 0.000 description 102
- 101000759376 Escherichia phage Mu Tail sheath protein Proteins 0.000 description 101
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 21
- 230000006870 function Effects 0.000 description 18
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 15
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 14
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 14
- 230000003393 splenic effect Effects 0.000 description 13
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 11
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 11
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 10
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 10
- 230000000961 alloantigen Effects 0.000 description 10
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 10
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 10
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 9
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 9
- 102000018704 Chitinase-3-Like Protein 1 Human genes 0.000 description 8
- 108010066813 Chitinase-3-Like Protein 1 Proteins 0.000 description 8
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 8
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 8
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 8
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 8
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 8
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 8
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 7
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 7
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 6
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 6
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 6
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 6
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 6
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 6
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 5
- 108090000978 Interleukin-4 Proteins 0.000 description 5
- 230000006044 T cell activation Effects 0.000 description 5
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 5
- 230000000139 costimulatory effect Effects 0.000 description 5
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 5
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 5
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 5
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 5
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 5
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 4
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 4
- 210000000612 antigen-presenting cell Anatomy 0.000 description 4
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 4
- 230000000721 bacterilogical effect Effects 0.000 description 4
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 4
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 4
- 210000005104 human peripheral blood lymphocyte Anatomy 0.000 description 4
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 4
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 4
- 230000001506 immunosuppresive effect Effects 0.000 description 4
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- 241000894007 species Species 0.000 description 4
- 210000004988 splenocyte Anatomy 0.000 description 4
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 4
- NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 2,3-bis(butanoylsulfanyl)propyl butanoate Chemical compound CCCC(=O)OCC(SC(=O)CCC)CSC(=O)CCC NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 3
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 3
- 206010062016 Immunosuppression Diseases 0.000 description 3
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 3
- DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N Propylene glycol Chemical compound CC(O)CO DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 3
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 3
- 238000011316 allogeneic transplantation Methods 0.000 description 3
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 3
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- 239000002612 dispersion medium Substances 0.000 description 3
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 3
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 3
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 3
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 3
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 3
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 3
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 3
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 3
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 description 2
- PMATZTZNYRCHOR-CGLBZJNRSA-N Cyclosporin A Chemical compound CC[C@@H]1NC(=O)[C@H]([C@H](O)[C@H](C)C\C=C\C)N(C)C(=O)[C@H](C(C)C)N(C)C(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)CN(C)C1=O PMATZTZNYRCHOR-CGLBZJNRSA-N 0.000 description 2
- 229930105110 Cyclosporin A Natural products 0.000 description 2
- 108010036949 Cyclosporine Proteins 0.000 description 2
- 102100039498 Cytotoxic T-lymphocyte protein 4 Human genes 0.000 description 2
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101000889276 Homo sapiens Cytotoxic T-lymphocyte protein 4 Proteins 0.000 description 2
- 101000914514 Homo sapiens T-cell-specific surface glycoprotein CD28 Proteins 0.000 description 2
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 2
- 108700018351 Major Histocompatibility Complex Proteins 0.000 description 2
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 2
- NWIBSHFKIJFRCO-WUDYKRTCSA-N Mytomycin Chemical compound C1N2C(C(C(C)=C(N)C3=O)=O)=C3[C@@H](COC(N)=O)[C@@]2(OC)[C@@H]2[C@H]1N2 NWIBSHFKIJFRCO-WUDYKRTCSA-N 0.000 description 2
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 2
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 2
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 2
- ZSJLQEPLLKMAKR-UHFFFAOYSA-N Streptozotocin Natural products O=NN(C)C(=O)NC1C(O)OC(CO)C(O)C1O ZSJLQEPLLKMAKR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091008874 T cell receptors Proteins 0.000 description 2
- 230000005867 T cell response Effects 0.000 description 2
- 102000016266 T-Cell Antigen Receptors Human genes 0.000 description 2
- 102100027213 T-cell-specific surface glycoprotein CD28 Human genes 0.000 description 2
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 2
- 239000000556 agonist Substances 0.000 description 2
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 2
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 229940121375 antifungal agent Drugs 0.000 description 2
- 239000003429 antifungal agent Substances 0.000 description 2
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 2
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 2
- OSASVXMJTNOKOY-UHFFFAOYSA-N chlorobutanol Chemical compound CC(C)(O)C(Cl)(Cl)Cl OSASVXMJTNOKOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960001265 ciclosporin Drugs 0.000 description 2
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 2
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 2
- 230000004940 costimulation Effects 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 2
- WZPMZMCZAGFKOC-UHFFFAOYSA-N diisopropyl hydrogen phosphate Chemical compound CC(C)OP(O)(=O)OC(C)C WZPMZMCZAGFKOC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 2
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 2
- 239000007972 injectable composition Substances 0.000 description 2
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 2
- 239000007951 isotonicity adjuster Substances 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 2
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 2
- 210000005105 peripheral blood lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 230000036647 reaction Effects 0.000 description 2
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 2
- 230000004044 response Effects 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 2
- ZSJLQEPLLKMAKR-GKHCUFPYSA-N streptozocin Chemical compound O=NN(C)C(=O)N[C@H]1[C@@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O ZSJLQEPLLKMAKR-GKHCUFPYSA-N 0.000 description 2
- 229960001052 streptozocin Drugs 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 230000001960 triggered effect Effects 0.000 description 2
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 2
- IIZPXYDJLKNOIY-JXPKJXOSSA-N 1-palmitoyl-2-arachidonoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCC\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/CCCCC IIZPXYDJLKNOIY-JXPKJXOSSA-N 0.000 description 1
- 108010039627 Aprotinin Proteins 0.000 description 1
- 206010003445 Ascites Diseases 0.000 description 1
- 108090001008 Avidin Proteins 0.000 description 1
- 230000003844 B-cell-activation Effects 0.000 description 1
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 108010029697 CD40 Ligand Proteins 0.000 description 1
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 1
- 102000029816 Collagenase Human genes 0.000 description 1
- 108060005980 Collagenase Proteins 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N D-glucitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N 0.000 description 1
- 206010011968 Decreased immune responsiveness Diseases 0.000 description 1
- 102000016911 Deoxyribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010053770 Deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 238000012286 ELISA Assay Methods 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 208000007241 Experimental Diabetes Mellitus Diseases 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- 229920001917 Ficoll Polymers 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- 102400000321 Glucagon Human genes 0.000 description 1
- 108060003199 Glucagon Proteins 0.000 description 1
- 208000023105 Huntington disease Diseases 0.000 description 1
- 208000035150 Hypercholesterolemia Diseases 0.000 description 1
- 235000003332 Ilex aquifolium Nutrition 0.000 description 1
- 235000002296 Ilex sandwicensis Nutrition 0.000 description 1
- 235000002294 Ilex volkensiana Nutrition 0.000 description 1
- 102000001706 Immunoglobulin Fab Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010054477 Immunoglobulin Fab Fragments Proteins 0.000 description 1
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 1
- 108700005091 Immunoglobulin Genes Proteins 0.000 description 1
- 102000006496 Immunoglobulin Heavy Chains Human genes 0.000 description 1
- 108010019476 Immunoglobulin Heavy Chains Proteins 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 108010002616 Interleukin-5 Proteins 0.000 description 1
- 108010074338 Lymphokines Proteins 0.000 description 1
- 102000008072 Lymphokines Human genes 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- 101710126321 Pancreatic trypsin inhibitor Proteins 0.000 description 1
- 208000018737 Parkinson disease Diseases 0.000 description 1
- 102000057297 Pepsin A Human genes 0.000 description 1
- 108090000284 Pepsin A Proteins 0.000 description 1
- 102000007079 Peptide Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010033276 Peptide Fragments Proteins 0.000 description 1
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 1
- 241000276498 Pollachius virens Species 0.000 description 1
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 1
- 101100497639 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) CYR1 gene Proteins 0.000 description 1
- 230000006052 T cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 210000000447 Th1 cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 210000000628 antibody-producing cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000012062 aqueous buffer Substances 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 229960005070 ascorbic acid Drugs 0.000 description 1
- 235000010323 ascorbic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000011668 ascorbic acid Substances 0.000 description 1
- 210000001130 astrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 239000003855 balanced salt solution Substances 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000003915 cell function Effects 0.000 description 1
- 238000003163 cell fusion method Methods 0.000 description 1
- 238000003320 cell separation method Methods 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 230000036755 cellular response Effects 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 229960004926 chlorobutanol Drugs 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- -1 coatings Substances 0.000 description 1
- 229960002424 collagenase Drugs 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 230000009260 cross reactivity Effects 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 229930182912 cyclosporin Natural products 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- UGMCXQCYOVCMTB-UHFFFAOYSA-K dihydroxy(stearato)aluminium Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)O[Al](O)O UGMCXQCYOVCMTB-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 1
- 239000002532 enzyme inhibitor Substances 0.000 description 1
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 1
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 230000005714 functional activity Effects 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 102000054766 genetic haplotypes Human genes 0.000 description 1
- MASNOZXLGMXCHN-ZLPAWPGGSA-N glucagon Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O)C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC=1NC=NC=1)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)C1=CC=CC=C1 MASNOZXLGMXCHN-ZLPAWPGGSA-N 0.000 description 1
- 229960004666 glucagon Drugs 0.000 description 1
- 208000024908 graft versus host disease Diseases 0.000 description 1
- 210000002443 helper t lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000004727 humoral immunity Effects 0.000 description 1
- 201000001421 hyperglycemia Diseases 0.000 description 1
- 210000003297 immature b lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 1
- 239000012133 immunoprecipitate Substances 0.000 description 1
- 239000007943 implant Substances 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 239000003701 inert diluent Substances 0.000 description 1
- 230000008595 infiltration Effects 0.000 description 1
- 238000001764 infiltration Methods 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000003914 insulin secretion Effects 0.000 description 1
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 210000002510 keratinocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000000787 lecithin Substances 0.000 description 1
- 229940067606 lecithin Drugs 0.000 description 1
- 235000010445 lecithin Nutrition 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 210000003519 mature b lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N methamphetamine Chemical compound CN[C@@H](C)CC1=CC=CC=C1 MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 229960004857 mitomycin Drugs 0.000 description 1
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000005087 mononuclear cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000000663 muscle cell Anatomy 0.000 description 1
- 201000006938 muscular dystrophy Diseases 0.000 description 1
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 238000013059 nephrectomy Methods 0.000 description 1
- 230000001537 neural effect Effects 0.000 description 1
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 1
- 210000004248 oligodendroglia Anatomy 0.000 description 1
- 238000011275 oncology therapy Methods 0.000 description 1
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 229940111202 pepsin Drugs 0.000 description 1
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 1
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- 229960003742 phenol Drugs 0.000 description 1
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 229920005862 polyol Polymers 0.000 description 1
- 150000003077 polyols Chemical class 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 230000002335 preservative effect Effects 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 1
- 210000001082 somatic cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 1
- 239000000021 stimulant Substances 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 1
- 150000005846 sugar alcohols Polymers 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000020382 suppression by virus of host antigen processing and presentation of peptide antigen via MHC class I Effects 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 230000004797 therapeutic response Effects 0.000 description 1
- RTKIYNMVFMVABJ-UHFFFAOYSA-L thimerosal Chemical compound [Na+].CC[Hg]SC1=CC=CC=C1C([O-])=O RTKIYNMVFMVABJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229940033663 thimerosal Drugs 0.000 description 1
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 1
- 210000001541 thymus gland Anatomy 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 1
- 229940108519 trasylol Drugs 0.000 description 1
- 238000011269 treatment regimen Methods 0.000 description 1
- 238000001291 vacuum drying Methods 0.000 description 1
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 1
- 230000003442 weekly effect Effects 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/0005—Vertebrate antigens
- A61K39/001—Preparations to induce tolerance to non-self, e.g. prior to transplantation
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
- A61K35/14—Blood; Artificial blood
- A61K35/17—Lymphocytes; B-cells; T-cells; Natural killer cells; Interferon-activated or cytokine-activated lymphocytes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
- A61K35/37—Digestive system
- A61K35/39—Pancreas; Islets of Langerhans
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/46—Cellular immunotherapy
- A61K39/461—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/46—Cellular immunotherapy
- A61K39/462—Cellular immunotherapy characterized by the effect or the function of the cells
- A61K39/4621—Cellular immunotherapy characterized by the effect or the function of the cells immunosuppressive or immunotolerising
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/46—Cellular immunotherapy
- A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
- A61K39/4643—Vertebrate antigens
- A61K39/46433—Antigens related to auto-immune diseases; Preparations to induce self-tolerance
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/46—Cellular immunotherapy
- A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
- A61K39/4643—Vertebrate antigens
- A61K39/46434—Antigens related to induction of tolerance to non-self
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
- A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
- A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/2875—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the NGF/TNF superfamily, e.g. CD70, CD95L, CD153, CD154
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
- A61K2239/26—Universal/off- the- shelf cellular immunotherapy; Allogenic cells or means to avoid rejection
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
- A61K2239/31—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterized by the route of administration
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
- A61K2239/38—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterised by the dose, timing or administration schedule
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
- C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
Abstract
Изобретение относится к медицине и касается способов индуцирования Т-клеточной толерантности к тканевому или органному трансплантату. Сущность изобретения: способы включают введение субъекту 1) аллогенной или ксеногенной клетки, которая экспрессирует донорские антигены и которая имеет лиганд на клеточной поверхности, который взаимодействует с рецептором на поверхности реципиентной клетки, которая опосредует контакт-зависимую хелпер-эффекторную функцию и 2) антагониста рецептора, который ингибирует взаимодействие лиганда с рецептором. Преимущество изобретения состоит в индукции толерантности к донорским антигенам и создает возможность для успешной трансплантации донорской ткани или органа без иммуноопосредованного отторжения донорского трансплантата. 3 с. и 35 з.п. ф-лы, 2 табл., 7 ил.
Description
Для индуцирования антиген-специфической T-клеточной активации и клональной экспансии к поверхности покоящихся T-лимфоцитов должны быть доставлены два сигнала, обеспеченных антигенпредставляющими клетками (АПК) (Jenkins M. and Schwartz R. (1987) J.Exp.Med. 165, 302-319; Mueller D.L. et al. (1990) J. Immunol. 144, 3701-3709; Williams I.R. and Unnanue E.R. (1990) J. Immunol. 145, 85-93). Первый сигнал, который представляет специфичность иммунной реакции, передается через T-клеточный рецептор (TCR) после распознавания инородного атигенного пептида, представленного в связи с главным комплексом гистосовместимости (ГКГС). Второй сигнал, называемый костимуляцией, индуцирует T-клетки к пролиферации и появлению функциональности (Schwartz R. H. (1990) Science 248, 1349-1356). Костимуляция не является ни антиген-специфической, ни ограниченной ГКГС и, полагают, обеспечивается одной или несколькими отдельными молекулами клеточной поверхности, экспрессированными АПК (Jenkins M. K. et al. (1988) J. Immunol. 140, 3324-3330; Linsley P. S. et al. (1991) J. Exp. Med. 173, 721-730; Gimmi C.D. et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 88, 6575-6579; Yong J.W. et al. (1992) J. Clin. Invest. 90, 229-237; Koulova L. et al. (1991) J. Exp. Med. 173, 759-762; Reiser H. et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89, 271-275; van-Seventer G.A. et al. (1990) J. Immunol. 144, 4579-4586; LaSalle J.M. et al. (1991) J. Immunol. 147, 774-780; Dustin M.I. et al. (1989) J. Exp. Med. 169, 503; Armitage R.J. et al. (1992) Nature 357, 80-82; Liu Y. et al. (1992) J. Exp. Med. 175, 437-445). Один костимуляторный каскад, включенный в T-клеточную активацию, включает молекулу CD28 на поверхности T-клеток. Эта молекула может получить костимуляторный сигнал, доставленный лигандом на B-клетках или других АПК. Лиганды для CD28 включают членов семейства B7 B-лимфоцитных активационных антигенов, таких как B7-1 и/или B7-2 (Freedman A.S. et al. (1987) J. Immunol. 137, 3260-3267; Freeman G.J. et al. (1989) J. Immunol. 143, 2714-2722; Freeman G.J. et al. (1991) J. Exp. Med. 174, 625-631; Freeman G. J. et al. (1993) Science 262, 909-911; Azuma M. et al. (1993) Nature 366, 76-79; Freeman G.J. et al. (1993) J. Exp. Med. 178, 2185-2192). B7-1 и B7-2 также являются лигандами для другой молекулы - CTLA4, присутствующей на поверхностях активированных T-клеток, хотя роль CTLA4 при костимуляции неясна.
Доставка к T-клетке антиген-специфического сигнала костимуляторным сигналом ведет к активности T-клеток, которая может включать как пролиферацию T-клеток, так и секрецию цитокинов. В противоположность этому, полагают, что доставка к T-клетке антиген-специфичного сигнала в отсутствии костимуляторного сигнала индуцирует в T-клетке состояние иммунологической неотвечаемости или анергии, индуцируя, таким образом, антиген-специфическую толерантность в T-клетке.
Взаимодействие между T-клетками и B-клетками играет центральную роль в иммунных реакциях. Индукция гуморального иммунитета к тимус-зависимым антигенам требует "помощи", обеспечиваемой T-клетками-хелперами (далее - Th-клетками). Хотя некоторая помощь, обеспеченная B-лимфоцитами, передается растворимыми молекулами, выделяемыми Th-клетками (например, лимфокинами, такими как IL-4 и IL-5), активация B-клеток также требует контакт-зависимого взаимодействия между B-клетками и Th-клетками. См. Hirohata et al. J. Immunol. , 140: 3736-3744 (1988); Barlett et al., J. Immunol., 143: 1745-1754 (1989). Это указывает, что активация B-клеток включает обязательное взаимодействие молекул клеточной поверхности B-клеток и Th-клеток. Следовательно, молекула (молекулы) на T-клетке опосредуют контакт-зависимые хелпер-эффекторные функции T-клетки. Контакт-зависимое взаимодействие между молекулами на B-клетках и T-клетках также поддерживает наблюдение, что изолированные плазматические мембраны активированных T-клеток могут обеспечивать хелперные функции, необходимые для активации B-клеток. См. Brian, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 564-568 (1988); Hodgkin et al., J. Immunol., 145: 2025-2034 (1990); Noelle et al., J. Immunol., 146: 1118-1124 (1991).
Молекула CD40 идентифицирована на поверхностях незрелых и зрелых B-лимфоцитов и при перекрестном сшивании антителами индуцирует пролиферацию B-клеток. См. Valle et al., Eur. J. Immunol., 19: 1463-1467 (1989); Gordon et al., J. Immunol., 140: 1425-1430 (1988); Gruber et al., J. Immunol., 142: 4144-4152 (1989). Молекулы CD40 клонированы и охарактеризованы. См. Stamenkovic et al. , EMBO J. , 8: 1403-1410 (1989). Лиганд для CD40 - gp39 (называемый также CD40-лигандом или CD4OL) - также клонирован молекулярно и охарактеризован. См. Armitage et al., Nature, 357: 80-82 (1992); Lederman et al. , J. Exp. Med., 175: 1091-1101 (1992); Hollenbaugh et al., EMBO J., 11: 4313-4319 (1992). Белок gp39 экспрессируется на активированных, а не на покоящихся, CD4+ - Th-клетках. См. Spriggs et al., J. Exp. Med., 176: 1543-1550 (1992); Lane et al., Eur. J. Immunol., 22: 2573-2578 (1992); Roy et al., J. Immunol. , 151: 1-14 (1993). Клетки, трансфицированные геном gp39, и экспрессирующие белок gр39 на своей поверхности, могут вызывать B-клеточную пролиферацию и вместе с другими стимуляторными сигналами могут индуцировать продуцирование антител. См. Armitage et al., Nature, 357: 80-82 (1992); Hollenbaugh et al., EMBO J., 11: 4313-4319 (1992).
Краткое изложение сущности изобретения
Молекулы клеточной поверхности, которые опосредуют контакт-зависимые хелпер-эффекторные функции T-клеток, важны для индуцирования иммунных реакций, которые требуют помощи T-клеток. Например, взаимодействие gp39 на T-клетках с CD40 на B-клетках играет центральную роль при активации реакций B-клеток на антиген. Настоящее изобретение основывается, по крайней мере частично, на открытии, что молекулы клеточной поверхности, которые опосредуют контакт-зависимые хелпер-эффекторные функции T-клеток, также играют критическую роль в реакции T-клеток к аллоантигенам. В частности, обнаружено, что при определенных условиях вмешательство во взаимодействии gр39 с лигандом на аллогенной клетке, которая представляет аллоантигены T-клетке, может индуцировать толерантность в T-клетке. Предпочтительно, аллогенная клетка, которая представляет аллоантигены T-клетке, требует взаимодействия между лигандом gp39 на T-клетке, чтобы иметь возможность обеспечить сигналы, необходимые для активации T-клетки. Ингибирование взаимодействия лиганда gp39 на аллогенной клетке с gp39 на T-клетке предотвращает активацию T-клеток и индуцирует, скорее, аллоантиген-специфическую толерантность T-клеток. Индуцирование T-клеточной толерантности к аллоантигенам, как описывается в настоящем изобретении, может использоваться в качестве препаративной схемы для пересадки ткани или органа.
Молекулы клеточной поверхности, которые опосредуют контакт-зависимые хелпер-эффекторные функции T-клеток, важны для индуцирования иммунных реакций, которые требуют помощи T-клеток. Например, взаимодействие gp39 на T-клетках с CD40 на B-клетках играет центральную роль при активации реакций B-клеток на антиген. Настоящее изобретение основывается, по крайней мере частично, на открытии, что молекулы клеточной поверхности, которые опосредуют контакт-зависимые хелпер-эффекторные функции T-клеток, также играют критическую роль в реакции T-клеток к аллоантигенам. В частности, обнаружено, что при определенных условиях вмешательство во взаимодействии gр39 с лигандом на аллогенной клетке, которая представляет аллоантигены T-клетке, может индуцировать толерантность в T-клетке. Предпочтительно, аллогенная клетка, которая представляет аллоантигены T-клетке, требует взаимодействия между лигандом gp39 на T-клетке, чтобы иметь возможность обеспечить сигналы, необходимые для активации T-клетки. Ингибирование взаимодействия лиганда gp39 на аллогенной клетке с gp39 на T-клетке предотвращает активацию T-клеток и индуцирует, скорее, аллоантиген-специфическую толерантность T-клеток. Индуцирование T-клеточной толерантности к аллоантигенам, как описывается в настоящем изобретении, может использоваться в качестве препаративной схемы для пересадки ткани или органа.
Соответственно, способы настоящего изобретения в особенности пригодны для индуцирования T-клеточной толерантности к донорской ткани или органу у реципиента ткани или органа. Упомянутые способы включают введение реципиенту трансплантата 1) аллогенных или ксеногенных клеток, которые экспрессируют по крайней мере один донорский антиген и которые имеют лиганд на клеточной поверхности, который взаимодействует с рецептором на поверхности реципиентной T-клетки, которая опосредует контакт-зависимые хелпер-эффекторные функции; 2) антагониста молекулы на поверхности реципиентной T-клетки, которая опосредует контакт-зависимые хелпер-эффекторные функции. Антагонист ингибирует взаимодействие между молекулой на T-клетке и ее лигандом на аллогенной или ксеногенной клетке.
В предпочтительном варианте осуществления изобретения рецептор на поверхности T-клетки, которая опосредует контакт-зависимые хелпер-эффекторные функции, представляет собой gp39. При таком варианте осуществления изобретения антагонист представляет собой молекулу, которая ингибирует взаимодействие gp39 на T-клетке с лигандом gp39 на аллогенной или ксеногенной клетке. Особенно предпочтительный антагонист gp39 представляет собой антитело против gp39. В другом варианте осуществления настоящего изобретения антагонист gp39 представляет собой растворимую форму лиганда gp39, например растворимый CD40. Аллогенные или ксеногенные клетки, которые вводятся реципиенту, представляют собой предпочтительно лимфоидные клетки, например B-клетки. Альтернативно, аллогенные или ксеногенные клетки представляют собой малые покоящиеся B-клетки. Аллогенные или ксеногенные клетки и антагонист обычно вводят реципиенту перед пересадкой реципиенту ткани или органа. Например, лимфоидные клетки (например, B-клетки) от донора ткани или органа вводят реципиенту вместе с антагонистом до трансплантации реципиенту ткани или органа.
Способы настоящего изобретения могут применяться, например, для индуцирования T-клеточной толерантности к пересаженным тканям или органам, таким как печень, почка, сердце, легкое, кожа, мышца, нервная ткань, желудок и кишки. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения трансплантированная ткань содержит панкреатические островки. Соответственно, изобретение относится к способу лечения диабета, включающему введение пациенту, нуждающемуся в таком лечении, 1) аллогенных или ксеногенных клеток, которые экспрессируют донорские антигены; 2) антагониста рецептора на поверхности T-клеток реципиента, которые опосредуют контакт-зависимые хелпер-эффекторные функции, такого как антагонист gp39 (например, антитело против gp39); и 3) донорских панкреатических островков.
Краткое описание рисунков
На фиг. 1 приводится графическое изображение срока жизнеспособности аллотрансплантатов панкреатических островков, пересаженных мышам с "химическим" диабетом, которым предварительно ввели одно антитело против gp39 или предварительно ввели одни нефракционированные или фракционированные аллогенные клетки селезенки.
На фиг. 1 приводится графическое изображение срока жизнеспособности аллотрансплантатов панкреатических островков, пересаженных мышам с "химическим" диабетом, которым предварительно ввели одно антитело против gp39 или предварительно ввели одни нефракционированные или фракционированные аллогенные клетки селезенки.
Фиг. 2А и фиг. 2Б являются графическими изображениями срока жизнеспособности трансплантатов панкреатических островков, пересаженных мышам с "химическим" диабетом, которые предварительно получали однократную дозу фракционированных аллогенных клеток селезенки вместе с лечением антителом против gp39 (MR1) либо в течение 2 недель (фиг. 2А), либо в течение 7 недель (фиг. 2Б), при этом срок жизнеспособности определяют по снижению концентрации глюкозы в плазме. Каждая кривая представляет результаты, полученные для отдельной мыши. Незаштрихованные значки относятся к реципиентам, у которых островковые аллотрансплантаты самопроизвольно переставали действовать. Заштрихованные значки относятся к мышам, у которых трансплантаты функционировали при окончании эксперимента.
На фиг. 3А, 3Б и 3В изображаются профили проточной цитометрии при окрашивании активированных в течение 6 часов человеческих лимфоцитов периферической крови с одним из CD40g (фиг. 3А), mAb (монокл. антитело) 4D9-8 (фиг. 3Б) или mAb 4D9-9 (фиг. 3В).
На фиг. 4А, 4Б и 4В изображаются профили проточной цитометрии при окрашивании активированных в течение 6 часов человеческих лимфоцитов периферической крови, выращенных в присутствии циклопорина А, окрашенных одним из mAb 4D9-8 (фиг. 4а), mAb 4D9-9 (фиг. 4Б) или CD40Ig (фиг. 4В).
На фиг. 5А и 5Б изображаются профили проточной цитометрии при окрашивании активированных в течение 6 часов человеческих лимфоцитов периферической крови CD40Ig в присутствии немеченного mAb 4D9-8 (фиг. 5А) или немеченного mAb 4D9-9 (фиг. 5Б).
На фиг. 6 приводятся графики ингибирования пролиферации человеческих B-клеток растворимым gp39 и IL-4, когда клетки выращиваются в присутствии моноклональных антител 4D9-8, 4D9-9, 24-31, 24-43, 89-76 или 89-79 к человеческому gp39.
На фиг. 7 графически изображается ингибирование реакции алло-специфической смешанной культуры лимфоцитов, когда клетки выращиваются в присутствии моноклональных антител 24-31 или 89-79 против человеческого gp39.
Подробное описание изобретения
Настоящее изобретение относится к способам индуцирования in vivo T-клеточной толерантности к донорскому трансплантату ткани или органа у реципиента трансплантата. Упомянутые способы включают введение реципиенту трансплантат 1) аллогенных или ксеногенных клеток, которые экспрессируют донорские антигены и которые имеют лиганд на клеточной поверхности, который взаимодействует с рецептором на поверхности реципиентной T-клетки, которая опосредует контакт-зависимые хелпер-эффекторные функции; 2) антагониста рецептора на поверхности T-клетки, который ингибирует взаимодействие лиганда и рецептора. Как здесь установлено, термин "реципиент" относится к субъекту, которому должны пересаживаться ткань или орган, пересаживаются ткань или орган или пересажены ткань или орган. Как здесь установлено, "аллогенные" клетки получают от различных индивидуумов того же вида, что и реципиент, и они экспрессируют "аллоантигены", которые отличаются от антигенов, экспрессированных клетками реципиента. "Ксеногенные" клетки получают от видов, иных, чем реципиент, и они экспрессируют "ксеноантигены", которые отличаются от антигенов, экспрессированных клетками реципиента. Как здесь установлено, термин "донорские антигены" относится к антигенам, экспрессированным донорской тканью или донорским органом, которые трансплантируют реципиенту. Донорские антигены могут быть аллоантигенами или ксеноантигенами, в зависимости от источника трансплантата. Аллогенные или ксеногенные клетки, введенные реципиенту как часть схемы вызывания толерантности, экспрессируют донорские антигены, т. е. экспрессируют некоторые или все те же антигены, присутствующие на донорской ткани или органе, которые трансплантируют. Аллогенные или ксеногенные клетки получают предпочтительно от донора тканевого или органного трансплантата, но их можно получать из одного или нескольких источников, имеющих с донором общие антигенные детерминанты.
Настоящее изобретение относится к способам индуцирования in vivo T-клеточной толерантности к донорскому трансплантату ткани или органа у реципиента трансплантата. Упомянутые способы включают введение реципиенту трансплантат 1) аллогенных или ксеногенных клеток, которые экспрессируют донорские антигены и которые имеют лиганд на клеточной поверхности, который взаимодействует с рецептором на поверхности реципиентной T-клетки, которая опосредует контакт-зависимые хелпер-эффекторные функции; 2) антагониста рецептора на поверхности T-клетки, который ингибирует взаимодействие лиганда и рецептора. Как здесь установлено, термин "реципиент" относится к субъекту, которому должны пересаживаться ткань или орган, пересаживаются ткань или орган или пересажены ткань или орган. Как здесь установлено, "аллогенные" клетки получают от различных индивидуумов того же вида, что и реципиент, и они экспрессируют "аллоантигены", которые отличаются от антигенов, экспрессированных клетками реципиента. "Ксеногенные" клетки получают от видов, иных, чем реципиент, и они экспрессируют "ксеноантигены", которые отличаются от антигенов, экспрессированных клетками реципиента. Как здесь установлено, термин "донорские антигены" относится к антигенам, экспрессированным донорской тканью или донорским органом, которые трансплантируют реципиенту. Донорские антигены могут быть аллоантигенами или ксеноантигенами, в зависимости от источника трансплантата. Аллогенные или ксеногенные клетки, введенные реципиенту как часть схемы вызывания толерантности, экспрессируют донорские антигены, т. е. экспрессируют некоторые или все те же антигены, присутствующие на донорской ткани или органе, которые трансплантируют. Аллогенные или ксеногенные клетки получают предпочтительно от донора тканевого или органного трансплантата, но их можно получать из одного или нескольких источников, имеющих с донором общие антигенные детерминанты.
Кроме аллогенных и ксеногенных клеток, реципиенту в качестве части схемы вызывания толерантности вводят антагонист молекулы на T-клетках, которая опосредует контакт-зависимые хелпер-эффекторные функции. Как установлено здесь, молекула или рецептор, который опосредует контакт-зависимые хелпер-эффекторные функции, представляет собой молекулу или рецептор, который экспрессируется на Th-клетке и взаимодействует с лигандом на эффекторной клетке (например, на B-клетке), при этом взаимодействие молекулы с ее лигандом является необходимым для генерации реакции эффекторной клетки (т.е. активации B-клетки). Теперь обнаружено, что, помимо вовлечения в реакции эффекторных клеток, такая молекула или рецептор вовлекается в реакцию T-клетки к антигену. Предпочтительно молекула на T-клетке, которая опосредует контакт-зависимую хелпер-эффекторную функцию, представляет собой gp39. Соответственно, в предпочтительных вариантах осуществления изобретения способы изобретения включают введение реципиенту трансплантата аллогенных или ксеногенных клеток и антагониста gp39. Активация реципиента T-клеток аллогенными и ксеногенными клетками включает взаимодействие между gp39 на реципиентных T-клетках и gp39 на аллогенных или ксеногенных клетках. При ингибировании этого взаимодействия антагонистом gp39 T-клетки реципиента не активируются донорскими антигенами, экспрессированными аллогенными и ксеногенными клетками, но скорее в них вызывается толерантность к донорским антигенам. Индукция толерантности к донорским антигенам у реципиента создает возможность, таким образом, для успешной трансплантации донорской ткани или органа без иммуноопосредованного отторжения донорского трансплантата.
Различные аспекты настоящего изобретения подробнее описываются в следующих разделах.
I. Антагонисты gp39
В соответствии со способами изобретения, реципиенту вводят антагонист gp39, чтобы воспрепятствовать взаимодействию gp39 на T-клетках реципиента с лигандом gp39 на аллогенных и ксеногенных клетках, таких как B-клетки, введенных реципиенту. Агонист gp39 определяется как молекула, которая препятствует этому взаимодействию. Агонист gp39 может представлять собой антитело, направленное против gp39 (например, моноклональное антитело против gp39), фрагмент или производное антитела, направленного против gp39 (например, фрагменты Fab или F(ab')2, химерные антитела или очеловеченные антитела) растворимые формы лиганда gp39 (например, растворимый CD40), растворимые формы слитого белка лиганда gp39 (например, растворимый CD40Ig), или фармацевтические средства, которые разрушают или препятствуют взаимодействию gp39 - CD40.
В соответствии со способами изобретения, реципиенту вводят антагонист gp39, чтобы воспрепятствовать взаимодействию gp39 на T-клетках реципиента с лигандом gp39 на аллогенных и ксеногенных клетках, таких как B-клетки, введенных реципиенту. Агонист gp39 определяется как молекула, которая препятствует этому взаимодействию. Агонист gp39 может представлять собой антитело, направленное против gp39 (например, моноклональное антитело против gp39), фрагмент или производное антитела, направленного против gp39 (например, фрагменты Fab или F(ab')2, химерные антитела или очеловеченные антитела) растворимые формы лиганда gp39 (например, растворимый CD40), растворимые формы слитого белка лиганда gp39 (например, растворимый CD40Ig), или фармацевтические средства, которые разрушают или препятствуют взаимодействию gp39 - CD40.
А. Антитела
Млекопитающее (например, мышь, хомяк или кролик) может быть иммунизировано иммуногенной формой белка gp39 или фрагментом белка (например, пептидным фрагментом), которая выявляет образование антител у млекопитающего. Клетка, которая экспрессирует gp39 на своей поверхности, может также использоваться в качестве иммуногена. Альтернативные иммуногены включают очищенный белок gp39 или фрагменты белка. Очистку gp39 от экспрессирующей gp39 клетки можно осуществить стандартными методами очистки. Кроме того, в клетке-хозяине может быть экспрессирована кДНК gp39 (Armitage et al., Nature, 357: 80-82 (1992); Lederman et al., J. Exp. Med., 175: 1091-1101 (1992); Hollenbaugh et al., EMBO J., 11: 4313-4319 (1992)), например, в линии бактериальных клеток или клеток млекопитающего, и gp39 очищают от клеточных культур стандартными методами. Альтернативно, с использованием известных методов (например, F-moc или T-boc химического синтеза) на основе аминокислотной последовательности gp39 (описанной в Armitage et al., Nature, 357: 80-82 (1992); Lederman et al., J. Exp. Med., 175: 1091-1101 (1992); Hollenbaugh et al. , EMBO J., 11: 4313-4319 (1992)) могут быть синтезированы пептиды gp39. Методы предоставления иммуногенности белку включают конъюгирование с носителями или другие технические приемы, хорошо известные в технике. Например, белок может быть введен в присутствии адъюванта. Развитие иммунизации может быть проконтролировано путем обнаружения титров антител в плазме или сыворотке. Для оценки уровней антител могут использоваться стандартные ELISA или другие методы иммуноанализа с иммуногеном в качестве антигена.
Млекопитающее (например, мышь, хомяк или кролик) может быть иммунизировано иммуногенной формой белка gp39 или фрагментом белка (например, пептидным фрагментом), которая выявляет образование антител у млекопитающего. Клетка, которая экспрессирует gp39 на своей поверхности, может также использоваться в качестве иммуногена. Альтернативные иммуногены включают очищенный белок gp39 или фрагменты белка. Очистку gp39 от экспрессирующей gp39 клетки можно осуществить стандартными методами очистки. Кроме того, в клетке-хозяине может быть экспрессирована кДНК gp39 (Armitage et al., Nature, 357: 80-82 (1992); Lederman et al., J. Exp. Med., 175: 1091-1101 (1992); Hollenbaugh et al., EMBO J., 11: 4313-4319 (1992)), например, в линии бактериальных клеток или клеток млекопитающего, и gp39 очищают от клеточных культур стандартными методами. Альтернативно, с использованием известных методов (например, F-moc или T-boc химического синтеза) на основе аминокислотной последовательности gp39 (описанной в Armitage et al., Nature, 357: 80-82 (1992); Lederman et al., J. Exp. Med., 175: 1091-1101 (1992); Hollenbaugh et al. , EMBO J., 11: 4313-4319 (1992)) могут быть синтезированы пептиды gp39. Методы предоставления иммуногенности белку включают конъюгирование с носителями или другие технические приемы, хорошо известные в технике. Например, белок может быть введен в присутствии адъюванта. Развитие иммунизации может быть проконтролировано путем обнаружения титров антител в плазме или сыворотке. Для оценки уровней антител могут использоваться стандартные ELISA или другие методы иммуноанализа с иммуногеном в качестве антигена.
После иммунизации могут быть получены антисыворотки и, если желательно, из сывороток можно выделить поликлональные антитела. Для получения моноклональных антител продуцирующие антитела клетки (лимфоциты) могут быть собраны у иммунизированного животного и слиты с миеломными клетками стандартными методами слияния соматических клеток, при этом эти клетки иммортализируются и образуются клетки гибридомы. Такие методы хорошо известны в технике. Например, гибридомная техника, первоначально разработанная Kohler и Milstein (Nature (1975) 256: 495-497), а также разработаны другие технические приемы, такие как гибридомный метод с человеческими B-клетками (Kozbar et al., Immunol. Today (1983) 4:72), EBV-гибридомный способ для продуцирования человеческих моноклональных антител (Cole et al., Monoclonal Antibodies in Cancer Therapy (1985) (Allen R. Bliss, Inc., pages 77-96), и скрининг библиотек химерных антител (Huse et al., Science (1989) 246: 1275). Клетки гибридом для получения антител, специфически реактивных к белку или пептиду, могут быть скринированы иммунохимическим способом, и моноклональные тела выделены.
Используемый здесь термин "антитело" предполагается и для обозначения его фрагментов, которые являются специфически реактивными в отношении белка gp39, или его пептида, или слитного белка gp39. Антитела могут быть фрагментированы с использованием известных методов, и фрагменты скринируют для применения таким же способом, какой описан выше для целых антител. Например, фрагменты F(ab')2 могут быть генерированы обработкой антител пепсином. Получающийся в результате фрагмент F(ab')2 может быть обработан для восстановления дисульфидных мостиков с образованием фрагментов Fab'. Также предполагается, что антитела в настоящем изобретении включают биспецифические и химерные молекулы, имеющие часть анти-gp39.
Когда антитела, продуцированные в субъектах, не относящихся к человеку, используются для лечения людей, они распознаются с переменным успехом как инородные, и у пациента может быть вызвана иммунная реакция. Один из подходов для снижения до минимума или устранения этой проблемы, которому следует отдать предпочтение при общей иммуносупрессии, состоит в продуцировании производных химерных антител, т.е. молекул антител, которые комбинируют вариабельную область животного, не относящегося к человеку, и человеческую константную область. Молекулы химерных антител могут включать, например, антиген-связывающий домен из антитела мыши, крысы или другого вида, и человеческие константные области. Описано множество подходов к получению химерных антител, и они могут применяться для получения химерных антител, содержащих вариабельную область иммуноглобулина, которая распознает gp39. См., например, Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A. 81: 6851 (1985); Takeda et al., Nature 314: 452 (1985), Cabilly et al., патент США N 4 816 557; Boss et al. , патент США N 4 816 397; Tanaguchi et al., публикация европейского патента EP 1 711 496; публикация европейского патента 0 173 494, патент Соединенного королевства GB 2 177 096B. Ожидается, что такие химерные антитела будут у человека менее иммуногенными, чем соответствующие нехимерные антитела.
Для целей лечения людей моноклональные или химерные антитела, специфически реакционноспособные с белком gp39 или пептидом, затем могут быть очеловечены посредством продуцирования химер человеческой вариабельной области, в которых части вариабельных областей, особенно консервативные остовные области антиген-связывающего домена, имеют человеческое происхождение, и только гипервариабельные участки имеют нечеловеческое происхождение. Такие измененные иммуноглобулиновые молекулы могут быть получены любым из нескольких методов, известных в технике (см., например. Teng et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 80: 7308-7312 (1983); Kozbor et al., Immunology Today, 4: 7279 (1983); Olsson et al., Meth. Enzymol., 92: 3-16 (1982)), и предпочтительно их получают по рекомендациям публикации PCT ВОИС 92/06193 или EP 0 239 400. Очеловеченные антитела могут быть произведены коммерчески, например Scotgen Limited, 2 Holly Road, Twickencham, Middlesex, Великобритания.
Другой способ генерирования специфических антител, или фрагментов антител, реактивных против белка или пептида gp39, состоит в скринировании библиотек экспрессии кодирующих иммуноглобулиновых генов или их частей, экспрессированных в бактериях, белком или пептидом gp39. Например, полные Fab-фрагменты, VH-области и FV-области могут быть экспрессированы в бактериях с использованием фаговых библиотек экспрессии. См., например, Ward et al., Nature, 341: 544-546 (1989); Huse et al., Science, 246: 1275-1281 (1989); и McCafferty et al., Nature, 348: 552-554 (1990). Скринирование таких библиотек, например пептидом gp39, может идентифицировать фрагменты иммуноглобулина, реагирующие с gp39. Альтернативно, для продуцирования антител или их фрагментов может быть использована SCID-hu-мышь (доступны от Genpharm).
Методология продуцирования моноклональных антител, направленных против gp39, включая человеческий gp39 и мышиный gp39, и моноклональных антител, подходящих для применения в способах настоящего изобретения, описывается подробнее в примере 2.
Моноклональные антитела против человеческого gp39 по настоящему изобретению являются предпочтительными для использования при индуцировании толерантности антигенспецифических T-клеток. Предпочтительными антителами являются моноклональные антитела 3E4, 2H5, 2H8, 4D9-8, 4D9-9, 24-31, 24-43, 89-76 и 89-79, описанные в примере 2. Особенно предпочтительными антителами являются моноклональные антитела 89-76 и 24-31. Гибридомы 89-76 и 24-31, продуцирующие антитела 89-76 и 24-31, соответственно, депонированы по условиям Будапештсткого договора, в Американской коллекции типовых культур, Parklawn Drive, Роквилл, Мэриленд, 2 сентября 1994. Гибридоме 89-76 присвоен инвентарный номер ATCC HB117-13, и гибридоме 24-31 присвоен инвентарный номер ATCC HB11712. Антитела 24-31 и 89-76 являются изотипом IgG1.
В другом варианте осуществления изобретения для использования в способах настоящего изобретения mAb против человеческого gp39 связывает эпитоп, распознаваемый моноклональным антителом, выбранным из группы, состоящей из 3E4, 2H5, 2H8, 4D9-8, 4D9-9, 24-31, 89-76 и 89-79. Предпочтительнее mAb против человеческого gp39 связывает эпитоп, распознаваемый моноклональным антителом 24-31 или моноклональным антителом 89-76. Способность mAb связывать эпитоп, указанный любым из вышеупомянутых антител, может быть определена стандартными проверками перекрестной конкуренции. Например, антитело, которое связывает те же эпитопы, которые узнаны mAb 24-31, будет конкурировать со связыванием меченного 24-31 с активированными Т-клетками, в то время как антитело, которое связывает другой, не узнанный mAb 24-31 эпитоп, не будет конкурировать при связывании меченного 24-31 с активированными Т-клетками.
Б. Растворимые лиганды для gp39
Другие антагонисты gp39, которые можно вводить для индуцирования толерантности T-клеток, включают растворимые формы лиганда gp39. Одновалентный растворимый лиганд gp39, такой как растворимый CD40, может связываться с gp39, ингибируя, таким образом, взаимодействие gp39 с CD40 на B-клетках. Термин "растворимый" указывает, что лиганд не ассоциируется постоянно с клеточной мембраной. Растворимый лиганд gp39 можт быть получен химическим синтезом или предпочтительно методом рекомбинантных ДНК, например, путем экспрессии только внеклеточного домена лиганда (при отсутствии трансмембранных и цитоплазматических доменов). Предпочтительным растворимым лигандом gp39 является растворимый CD40. Альтернативно, растворимый лиганд gp39 может находиться в форме слитого белка. Такой слитый белок содержит по крайней мере часть лиганда gp39, присоединенную ко второй молекуле. Например, CD40 может быть экспрессирован в виде слитого белка с иммуноглобулином (т.е. слитый белок CD40Ig). В одном из вариантов осуществления изобретения продуцируется слитый белок, содержащий аминокислотные остатки внеклеточного домена части CD40, связанные с аминокислотными остатками последовательности, соответствующей шарнирам CH2 и CH3 тяжелой цепи иммуноглобулина, т.е. Cyl, с образованием слитого белка CD40Ig (см., например, LinsLey et al., (1991) J. Exp. Med. 1783: 721-730; Capon et al., (1989) Nature 337: 525-531; и Capon, патент США 5 116 964). Слитый белок может быть получен путем химического синтеза или предпочтительно методом рекомбинантных ДНК на основе кДНК CD40 (Stamenkovic et al., EMBO J., 8: 1403-1410 (1989)).
Другие антагонисты gp39, которые можно вводить для индуцирования толерантности T-клеток, включают растворимые формы лиганда gp39. Одновалентный растворимый лиганд gp39, такой как растворимый CD40, может связываться с gp39, ингибируя, таким образом, взаимодействие gp39 с CD40 на B-клетках. Термин "растворимый" указывает, что лиганд не ассоциируется постоянно с клеточной мембраной. Растворимый лиганд gp39 можт быть получен химическим синтезом или предпочтительно методом рекомбинантных ДНК, например, путем экспрессии только внеклеточного домена лиганда (при отсутствии трансмембранных и цитоплазматических доменов). Предпочтительным растворимым лигандом gp39 является растворимый CD40. Альтернативно, растворимый лиганд gp39 может находиться в форме слитого белка. Такой слитый белок содержит по крайней мере часть лиганда gp39, присоединенную ко второй молекуле. Например, CD40 может быть экспрессирован в виде слитого белка с иммуноглобулином (т.е. слитый белок CD40Ig). В одном из вариантов осуществления изобретения продуцируется слитый белок, содержащий аминокислотные остатки внеклеточного домена части CD40, связанные с аминокислотными остатками последовательности, соответствующей шарнирам CH2 и CH3 тяжелой цепи иммуноглобулина, т.е. Cyl, с образованием слитого белка CD40Ig (см., например, LinsLey et al., (1991) J. Exp. Med. 1783: 721-730; Capon et al., (1989) Nature 337: 525-531; и Capon, патент США 5 116 964). Слитый белок может быть получен путем химического синтеза или предпочтительно методом рекомбинантных ДНК на основе кДНК CD40 (Stamenkovic et al., EMBO J., 8: 1403-1410 (1989)).
II. Клетки для индукции антиген-специфической толерантности
Настоящее изобретение основано, по крайней мере частично, на открытии, что представление аллоантигенов T-клеткам аллогенными клетками в присутствии антагониста gp39 приводит в результате к T-клеточной толерантности к аллоантигенам. Клетки, которые способны индуцировать толерантность по такому механизму, включают клетки, которые представляют антиген и активируют T-клетки путем взаимодействия с gp39 (т.е. для доставки соответствующих сигналов к T-клетке для активации T-клеток необходимо взаимодействие между gp39 на T-клетке и лигандом gp39 на клетке, представляющей антиген). Ингибирование взаимодействия лиганда на аллогенной или ксеногенной клетке с gp39 на реципиентных T-клетках предотвращает T-клеточную активацию алло- или ксеноантигенами и, скорее, индуцирует T-клеточную толерантность к антигенам. Препятствование активации T-клетки через gp39 может предотвратить индукцию костимуляторных молекул на аллогенной или ксеногенной клетке (например, молекул семейства B7 на B-клетке), и таким образом клетка доставляет к T-клетке только антигенный сигнал в отсутствие костимуляторного сигнала, индуцируя, таким образом, толерантность.
Настоящее изобретение основано, по крайней мере частично, на открытии, что представление аллоантигенов T-клеткам аллогенными клетками в присутствии антагониста gp39 приводит в результате к T-клеточной толерантности к аллоантигенам. Клетки, которые способны индуцировать толерантность по такому механизму, включают клетки, которые представляют антиген и активируют T-клетки путем взаимодействия с gp39 (т.е. для доставки соответствующих сигналов к T-клетке для активации T-клеток необходимо взаимодействие между gp39 на T-клетке и лигандом gp39 на клетке, представляющей антиген). Ингибирование взаимодействия лиганда на аллогенной или ксеногенной клетке с gp39 на реципиентных T-клетках предотвращает T-клеточную активацию алло- или ксеноантигенами и, скорее, индуцирует T-клеточную толерантность к антигенам. Препятствование активации T-клетки через gp39 может предотвратить индукцию костимуляторных молекул на аллогенной или ксеногенной клетке (например, молекул семейства B7 на B-клетке), и таким образом клетка доставляет к T-клетке только антигенный сигнал в отсутствие костимуляторного сигнала, индуцируя, таким образом, толерантность.
Соответственно, по способам настоящего изобретения реципиенту вводят аллогенные или ксеногенные клетки. Аллогенная или ксеногенная клетка способна представить антиген Т-клеткам реципиента и представляет собой, например, B-лимфоцит - клетку, "профессионально" представляющую антиген (например, моноцит, дендритную клетку, клетку Лагерганса), или другую клетку, которая представляет антиген имунным клеткам (например, кератиноцит, эндотелиальную клетку, астроцит, фибробласт, олигодендроцит). Более того, предпочтительно, чтобы аллогенная или ксеногенная клетка имела пониженную способность стимулировать костимуляторный сигнал в реципиентных T-клетках. Например, аллогенная или ксеногенная клетка может утратить экспрессию или экспрессировать только на низком уровне, костимуляторных молекул, таких как белков семейства B7 (например, B7-1 и B7-2). Экспрессия костимуляторных молекул на потенциальных аллогенных или ксеногенных клетках, которые используются в способах настоящего изобретения, может быть оценена стандартными методами, например проточной цитометрией, с использованием антител, направленных против костимуляторных молекул.
Предпочтительными аллогенными или ксеногенными клетками для индуцирования T-клеточной толерантности являются лимфоидные клетки, например лимфоциты периферической крови или селезеночные клетки. Предпочтительными лимфоидными клетками для индуцирования T-клеточной толерантности являются B-клетки. B-клетки могут быть выделены в чистом виде из смешанной популяции клеток (например, клеток других типов в периферической крови или селезенке) стандартными способами разделения клеток. Например, прилипающие клетки можно удалить путем культивирования селезеночных клеток в пластиковых чашках и извлечения популяции неприлипающих клеток. T-клетки можно удалить из смешанной популяции клеток путем обработки антителом против T-клеток (например, анти-Thy1.1 и/или анти-Thy1.2) и комплементом. В одном из вариантов осуществления изобретения в качестве антиген-представляющих клеток используются покоящиеся лимфоидные клетки, предпочтительно покоящиеся B-клетки. Покоящиеся лимфоидные клетки, такие как покоящиеся B-клетки, можно выделить методами, известными в технике, например, основываясь на их малом размере и плотности. Покоящиеся лимфоидные клетки можно выделить, например, проточным элютриационным центрифугированием, как описано в примере 1. При использовании проточного элютриационного центрифугирования популяция малых, покоящихся лимфоидных клеток, очищенная от клеток, которые могут активировать T-клеточные реакции, может быть получена путем собирания фракции (фракций) при 14-19 мл/мин, предпочтительно при 19 мл/мин (при 3200 об/мин). С другой стороны, малые покоящиеся лимфоциты (например, B-клетки) могут быть выделены путем центрифугирования в прерывистом градиенте плотности, например при использовании градиента фиколла или перколла, и после центрифугирования может быть получен слой, содержащий малые покоящиеся лимфоциты. Малые покоящиеся B-клетки также можно отличить от активированных B-клеток путем проверки стандартными методами (например, иммунофлюоресценцией), экспрессии костимуляторных молекул, таких как B7-1 и/или В7-2, на поверхности активированных B-клеток.
Аллогенные или ксеногенные клетки, введенные реципиенту, функционируют, по крайней мере частично, как представляющие донорские антигены реципиентным Т-клеткам. Таким образом, клетки экcпрессируют антигены, которые также экспрессируются донорской тканью или органом. Обычно это может осуществляться посредством использования аллогенных или ксеногенных клеток, полученных от донора тканевого или органного трансплантата. Например, от донора ткани или органа могут быть выделены периферические лимфоидные клетки, B-клетки или селезеночные клетки, и использованы в способах настоящего изобретения. Альтернативно, аллогенные или ксеногенные клетки могут быть получены из источника иного, чем донор ткани или органа, если такие клетки имеют антигенные детерминанты, общие с тканью или органом донора. Например, могут использоваться аллогенные или ксеногенные клетки, которые экспрессируют (по большей части или все) такие же антигены главного комплекса гистосовместимости, что и донорская ткань или орган. Таким образом, могут использоваться аллогенные или ксенгенные клетки из источника, который является гаплотипом ГКГС, совместимым с донором ткани или органа (Например, ближайший родственник донора трансплантата).
III. Введение клеток и антагонистов gp39
T-клеточная толерантность к органному или тканевому трансплантату может быть индуцирована путем введения реципиенту трансплантата антагониста gp39 в сочетании с аллогенной или ксеногенной клеткой, которые экспрессируют донорские антигены и взаимодействуют с реципиентными T-клетками через gp39. В предпочтительном варианте осуществления изобретения аллогенную или ксеногенную клетку и антагонист gp39 вводят реципиенту совместно или одновременно. С другой стороны, антагонист gp39 можно вводить до введения аллогенных или ксеногенных клеток, например, когда антагонист представляет собой антитело с длительным временем полужизни. В предпочтительном варианте осуществления изобретения антагонист и аллогенные или ксеногенные клетки вводят реципиенту перед трансплантацией реципиенту органа или ткани (т.е. реципиент предварительно получает антагонист и клетки). Например, введение аллогенных и ксеногенных клеток и антагониста может быть осуществлено за несколько дней (например, за пять-восемь дней) перед пересадкой ткани или органа.
T-клеточная толерантность к органному или тканевому трансплантату может быть индуцирована путем введения реципиенту трансплантата антагониста gp39 в сочетании с аллогенной или ксеногенной клеткой, которые экспрессируют донорские антигены и взаимодействуют с реципиентными T-клетками через gp39. В предпочтительном варианте осуществления изобретения аллогенную или ксеногенную клетку и антагонист gp39 вводят реципиенту совместно или одновременно. С другой стороны, антагонист gp39 можно вводить до введения аллогенных или ксеногенных клеток, например, когда антагонист представляет собой антитело с длительным временем полужизни. В предпочтительном варианте осуществления изобретения антагонист и аллогенные или ксеногенные клетки вводят реципиенту перед трансплантацией реципиенту органа или ткани (т.е. реципиент предварительно получает антагонист и клетки). Например, введение аллогенных и ксеногенных клеток и антагониста может быть осуществлено за несколько дней (например, за пять-восемь дней) перед пересадкой ткани или органа.
Обнаружено, что введение однократной дозы аллогенных клеток (в сочетании с антагонистом) является достаточным для индукции T-клеточной толерантности к донорской ткани или органу (см. пример 1). Число вводимых клеток может изменяться в зависимости от типа используемых клеток, типа тканевого или органного трансплантата, массы реципиента, общего состояния реципиента и других переменных, известных специалисту. Подходящее число клеток для использования в способе настоящего изобретения может быть определено специалистом в этой области техники обычными способами (например, как описано в примере 1). Клетки вводят в форме и путем, которые подходят для индукции T-клеточной толерантности у реципиента. Клетки могут быть введены в физиологически приемлемом растворе, таком как забуференный фосфатом физиологический раствор, или в подобном носителе. Предпочтительно клетки вводят внутривенно.
Антагонист по изобретению вводят субъекту в биологически совместимой форме, пригодной для фармацевтического введения in vivo для индуцирования T-клеточной толерантности. "Биологически совместимая форма, пригодная для введения in vivo" означает форму антагониста, в которой любые токсические эффекты определяются лечебным действием соединения. Термин "субъект" предполагается для обозначения живых организмов, в которых может быть вызвана иммунная реакция, например, млекопитающих. Примерами субъектов являются люди, собаки, кошки, мыши, крысы и их трансгенные виды. Антагонист gp39 может вводиться в любой фармакологической форме, необязательно, с фармацевтически приемлемым носителем. Введение терапевтически активного количества антагониста определяется как введение количества, эффективного при дозах и в течение времени, необходимых для достижения нужного результата (например, T-клеточной толерантности). Например, терапевтически активное количество антагониста gp39 может изменяться в соответствии с такими факторами, как стадия заболевания, возраст, пол и масса особи и способность антагониста вызывать нужную реакцию у особи. Схемы дозировки могут быть скорректированы для обеспечения оптимального терапевтического ответа. Например, могут вводиться несколько небольших доз ежедневно, или доза может быть пропорционально снижена, в соответствии с потребностями терапевтической ситуации. Как описано в примере 1, для лечения антителом против gp39 схема эффективного лечения может включать установление введения антитела перед трансплантацией ткани или органа (например, за пять-восемь дней до трансплантации) с последующим повторяющимся введением антитела (например, каждый второй день) в течение нескольких недель (например, двух-семи недель) после пересадки.
Активное соединение (например, антагонист, такой как антитело) может вводиться обычным способом, таким как инъекция (подкожная, внутривенная и т. п.), пероральное введение, ингаляция, трансдермальная аппликация или ректальное введение. В зависимости от способа введения активное соединение может быть покрыто материалом для защиты соединения от действия ферментов, кислот и других естественных условий, которые могут инактивировать соединение. Предпочтительным способом введения является внутривенная инъекция.
Чтобы ввести антагонист gp39 способом, иным, чем парентеральное введение, может понадобиться нанести на антагонист покрытие из материала или ввести этот материал вместе с антагонистом, который предупредит его инактивацию. Например, антагонист может вводиться особи в соответствующем носителе или разбавителе, вводиться вместе с ферментными ингибиторами или в соответствующем носителе, таком как липосомы. Фармацевтически приемлемыми разбавителями являются физиологический раствор и водные буферные растворы. Ферментными ингибиторами являются ингибитор панкреатического трипсина, диизопропилфосфат (DEP) и тразилол. Липосомы включают эмульсии "вода в масле в воде", а также обычные липосомы (Strejan et al. (1984) J. Neuroimmunol. 7:27).
Активное соединение также может быть введено парентерально или интраперитонеально. Также могут быть получены дисперсии в глицерине, жидких полиэтиленгликолях, в их смесях и в маслах. При обычных условиях хранения и применения эти препараты могут содержать консервант для предупреждения развития микроорганизмов.
Фармацевтические композиции, пригодные для применения в инъекциях, включают стерильные водные растворы (когда все растворено в воде) или дисперсии и стерильные порошки для приготовления стерильных растворов для инъекций или дисперсии для немедленного применения. Во всех случаях композиция должна быть стерильной и должна быть жидкой в такой степени, чтобы можно было легко использовать шприц. Она должна быть устойчивой в условиях изготовления и хранения и должна быть предохранена от загрязнения микроорганизмами, такими как бактерии или грибы. Носитель должен представлять собой растворитель или дисперсионную среду, содержащую, например, воду, этанол, полиол (например, глицерин, пропиленгликоль и жидкий полиэтиленгликоль, и т.п.), и их подходящие смеси. Подходящая текучесть может поддерживаться, например, с помощью покрытия, такого как лецитин, путем поддержания требуемого размера частиц в случае дисперсии, и с применением поверхностно-активных веществ. Предупреждение действия микроорганизмов может быть достигнуто с помощью различных антибактериальных и противогрибковых средств, например парабенов, хлорбутанола, фенола, аскорбиновой кислоты, тимеросала и подобных средств. Во многих случаях предпочтительно включать в композицию изотонические агенты, например сахара, многоатомные спирты, такие как маннит, сорбит, хлорид натрия. Пролонгированное поглощение инъецируемых композиций может вызываться включением в композиции средства, которое замедляет абсорбцию, например, моностеарата алюминия или желатина.
Стерильные инъецируемые композиции можно получить путем включения активного соединения (например, антагониста gp39) в требуемом количестве в соответствующий растворитель, в сочетании с одним или несколькими ингредиентами, перечисленными выше, в соответствии с требованиями, с последующей стерилизацией фильтрацией. Вообще, дисперсии готовят путем введения активного соединения в стерильный носитель, который содержит основную дисперсионную среду и требуемые другие ингредиенты из числа перечисленных выше. В случае стерильных порошков для приготовления стерильных растворов для инъекций предпочтительными способами получения являются вакуумная сушка и сушка вымораживанием, которые дают порошок активного ингредиента (например, антагониста) плюс любой дополнительный желательный ингредиент из их раствора, предварительно стерилизованного фильтрацией.
Когда активное соединение соответствующим образом защищено, как описано выше, белок можно вводить орально, например, с инертным разбавителем или усвояемым съедобным носителем. Используемый здесь термин "фармацевтически приемлемый носитель" включает любые растворители, дисперсионные среды, покрытия, антибактериальные и противогрибковые средства, изотонические агенты и замедлители и т.п. Применение таких сред и агентов с фармацевтически активными веществами хорошо известны в технике. Применение любых обычных сред или агентов в лекарственных композициях рассматривается во всех случаях, за исключением их несовместимости с активным соединением. В композиции также могут включаться дополнительные активные соединения.
Особенно выгодно составлять парентеральные композиции в виде единиц лекарственной формы для облегчения введения и равномерности дозировки. Под единицей лекарственной формы здесь подразумевается физически разделенные единицы, пригодные для лечения особей млекопитающих в качестве стандартных доз; причем каждая единица содержит заранее установленное количество активного соединения, рассчитанное на получение нужного лечебного действия, в сочетании с требуемым фармацевтическим носителем. Определение единиц лекарственной формы по изобретению диктуются и напрямую зависят от (а) особых свойств активного соединения и конкретного терапевтического эффекта, которого нужно достичь, и (б) ограничений, присущих технике приготовления составов такого активного соединения для лечения чувствительных особей.
После или вместе с описанной здесь схемой вызывания толерантности, донорскую ткань или орган пересаживают реципиенту трансплантата обычными способами.
IV. Применение способов изобретения
Способы настоящего изобретения могут использоваться в самых разных ситуациях при пересадке ткани и органов. Упомянутые способы могут применяться для индуцирования T-клеточной толерантности у реципиента трансплантата ткани или органа, такого как печень, почка, сердце, легкое, кожа, мышца, нервная ткань, желудок и кишки. Таким образом, способы настоящего изобретения могут применяться при лечении заболеваний иди состояний, которые влекут за собой пересадку ткани или органа (например, пересадка печени при лечении гиперхолестеринемии, пересадка мышечных клеток при лечении мышечной дистрофии, пересадка нервной ткани при лечении болезни
Юнтингтона или болезни Паркинсона, и т.п.). В предпочтительном варианте осуществления изобретения трансплантированная ткань содержит панкреатические островки. Соответственно, изобретение касается способа лечения диабета посредством трансплантации клеток панкреатических островков. Упомянутый способ включает введение субъекту, нуждающемуся в таком лечении, 1) аллогенных или ксеногенных клеток, которые экспрессируют донорские антигены, 2) антагониста молекулы, экспрессированной на T-клетках реципиента, которая опосредует контакт-зависимую хелпер-эффекторную функцию, такого как антагонист gp39 (например, антитела против gp39), и 3) донорских клеток панкреатических островков. Предпочтительно, аллогенные или ксеногенные клетки и антагонист вводят реципиенту перед введением ему панкреатических островков.
Способы настоящего изобретения могут использоваться в самых разных ситуациях при пересадке ткани и органов. Упомянутые способы могут применяться для индуцирования T-клеточной толерантности у реципиента трансплантата ткани или органа, такого как печень, почка, сердце, легкое, кожа, мышца, нервная ткань, желудок и кишки. Таким образом, способы настоящего изобретения могут применяться при лечении заболеваний иди состояний, которые влекут за собой пересадку ткани или органа (например, пересадка печени при лечении гиперхолестеринемии, пересадка мышечных клеток при лечении мышечной дистрофии, пересадка нервной ткани при лечении болезни
Юнтингтона или болезни Паркинсона, и т.п.). В предпочтительном варианте осуществления изобретения трансплантированная ткань содержит панкреатические островки. Соответственно, изобретение касается способа лечения диабета посредством трансплантации клеток панкреатических островков. Упомянутый способ включает введение субъекту, нуждающемуся в таком лечении, 1) аллогенных или ксеногенных клеток, которые экспрессируют донорские антигены, 2) антагониста молекулы, экспрессированной на T-клетках реципиента, которая опосредует контакт-зависимую хелпер-эффекторную функцию, такого как антагонист gp39 (например, антитела против gp39), и 3) донорских клеток панкреатических островков. Предпочтительно, аллогенные или ксеногенные клетки и антагонист вводят реципиенту перед введением ему панкреатических островков.
Настоящее изобретение также иллюстрируется следующими далее примерами, которые не следует рассматривать, как ограничивающие. Все ссылки, патенты и опубликованные заявки на патенты, цитируемые в настоящей заявке, включаются в нее в качестве ссылок.
Пример 1. Индукция толерантности к аллотрансплантатам панкреатических островков посредством введения реципиенту аллогенных клеток и анти-39
В настоящее время установлено, что аллотрансплантация зависит от общей иммуносупресии, которая неспецифически отсекает иммуноэффекторные функции. Однако иммуносупрессивные фармацевтические препараты могут вызвать значительные побочные эффекты. Кроме того, такой подход отражает аллотрансплантация островков Лангерханса для лечения диабета (см., например, Robertson R. P, (1992) N. Engl. J. Med. 327, 1861). Терапия с антителами, направленными против T-клеток, может дать возможность для успешной аллотрансплантации островков грызунам, но такой подход дает слишком одинаковые результаты при общей иммуносупрессии (Carpenter C.B. (1990) N. Engl. Med. 322, 1224; Roark J. H. et al. (1992) Transplantation 54, 1098; Kahan B.D. (1992) Curr. Opin. Immunol. 4, 553). В этом примере толерантность к островковым трансплантатам индуцируется у реципиента трансплантата посредством манипулирования презентацией аллоантигена T-клеткам с целью предотвращения их активации. Срок клеток жизнеспособности аллотрансплантатов у мышей C57BL/6 (H-2b) с "химическим" диабетом проверяют, используя методологию, описанную ниже.
В настоящее время установлено, что аллотрансплантация зависит от общей иммуносупресии, которая неспецифически отсекает иммуноэффекторные функции. Однако иммуносупрессивные фармацевтические препараты могут вызвать значительные побочные эффекты. Кроме того, такой подход отражает аллотрансплантация островков Лангерханса для лечения диабета (см., например, Robertson R. P, (1992) N. Engl. J. Med. 327, 1861). Терапия с антителами, направленными против T-клеток, может дать возможность для успешной аллотрансплантации островков грызунам, но такой подход дает слишком одинаковые результаты при общей иммуносупрессии (Carpenter C.B. (1990) N. Engl. Med. 322, 1224; Roark J. H. et al. (1992) Transplantation 54, 1098; Kahan B.D. (1992) Curr. Opin. Immunol. 4, 553). В этом примере толерантность к островковым трансплантатам индуцируется у реципиента трансплантата посредством манипулирования презентацией аллоантигена T-клеткам с целью предотвращения их активации. Срок клеток жизнеспособности аллотрансплантатов у мышей C57BL/6 (H-2b) с "химическим" диабетом проверяют, используя методологию, описанную ниже.
Индукция диабета
Самцов мышей C57B1/6J (H-2b) приводят в состояние диабета посредством внутривенного введения стрептозотоцина (140 мг/кг). Постоянный диабет подтверждается демонстрацией концентрации глюкозы в плазме, ≥400 мг/мл, в трех случаях в течение одной недели.
Самцов мышей C57B1/6J (H-2b) приводят в состояние диабета посредством внутривенного введения стрептозотоцина (140 мг/кг). Постоянный диабет подтверждается демонстрацией концентрации глюкозы в плазме, ≥400 мг/мл, в трех случаях в течение одной недели.
Фракционирование аллогенных селезеночных клеток
Донорские аллогенные клетки для предварительного введения реципиентам трансплантатов получают от гибридных животных (C57хBALB/c) (H-2b/d)F1 для предотвращения реакции "трансплантат против хозяина". Чтобы выделить малые лимфоцитные клетки, суспензии селезеночных клеток от 8-недельных самок мышей (C57хBALB/c)F1 очищают от эритроцитов и затем фракционируют по размеру посредством элютрации, как описано в Tony H.P. et al. (1985) J. Exp. Med. 161, 223; и в Gosselin E.J et al. (1988) J. Immunol. 140, 1408. Вкратце, малые лимфоциты выделяют посредством проточного эдютриацинного центрифугирования, используя, например, центрифугу модели J-6В (Beckman Instruments, Palo Alto CA). Приблизительно 1-5 • 108 клеток в 8 мл культурной среды или в уравновешенном солевом растворе с 1,5% фетальной бычьей сыворотки обрабатывают дезоксирибонуклеазой, помещают в элютрационную камеру при исходной скорости противотока 13,5 мл/мин, и вращают при 4oC с постоянной скоростью 3200 об/мин. Фракция малых клеток с очень незначительной примесью больших клеток элюируется, как правило, при 14-19 мл/мин хотя точная скорость потока может зависеть от среды, в которой суспендируются клетки. В экспериментах, описанных здесь, фракцию малых клеток собирают при 19 мл/мин (при 3200 об/мин). Эта фракция полностью очищена, по данным о вспомогательной клеточной функции устойчивости к излучению (3000 рад), при анализе с T-клеточными линиями, специфическими либо для кроличьего IgG и H2d (CDC35), либо для аллореактивных к H2b(D10.G4). Малые клетки и нефракционированные клетки дважды промывают в безсывороточной среде перед инъекцией в хвостовую вену реципиентам аллотрансплантатов. Получают приблизительно 40-100 • 106 нефракционированных селезеночных клеток (C57хBALB/c)F1(H-2b/d) или 40-100 • 106 элютриированных малых селезеночных клеток (C57хBALB/c)F1(H-2b/d).
Донорские аллогенные клетки для предварительного введения реципиентам трансплантатов получают от гибридных животных (C57хBALB/c) (H-2b/d)F1 для предотвращения реакции "трансплантат против хозяина". Чтобы выделить малые лимфоцитные клетки, суспензии селезеночных клеток от 8-недельных самок мышей (C57хBALB/c)F1 очищают от эритроцитов и затем фракционируют по размеру посредством элютрации, как описано в Tony H.P. et al. (1985) J. Exp. Med. 161, 223; и в Gosselin E.J et al. (1988) J. Immunol. 140, 1408. Вкратце, малые лимфоциты выделяют посредством проточного эдютриацинного центрифугирования, используя, например, центрифугу модели J-6В (Beckman Instruments, Palo Alto CA). Приблизительно 1-5 • 108 клеток в 8 мл культурной среды или в уравновешенном солевом растворе с 1,5% фетальной бычьей сыворотки обрабатывают дезоксирибонуклеазой, помещают в элютрационную камеру при исходной скорости противотока 13,5 мл/мин, и вращают при 4oC с постоянной скоростью 3200 об/мин. Фракция малых клеток с очень незначительной примесью больших клеток элюируется, как правило, при 14-19 мл/мин хотя точная скорость потока может зависеть от среды, в которой суспендируются клетки. В экспериментах, описанных здесь, фракцию малых клеток собирают при 19 мл/мин (при 3200 об/мин). Эта фракция полностью очищена, по данным о вспомогательной клеточной функции устойчивости к излучению (3000 рад), при анализе с T-клеточными линиями, специфическими либо для кроличьего IgG и H2d (CDC35), либо для аллореактивных к H2b(D10.G4). Малые клетки и нефракционированные клетки дважды промывают в безсывороточной среде перед инъекцией в хвостовую вену реципиентам аллотрансплантатов. Получают приблизительно 40-100 • 106 нефракционированных селезеночных клеток (C57хBALB/c)F1(H-2b/d) или 40-100 • 106 элютриированных малых селезеночных клеток (C57хBALB/c)F1(H-2b/d).
Предварительная обработка реципиентов трансплантатов
Реципиентам трансплантатов предварительно вводят либо нефракционированные аллогенные селезеночные клетки (C57хBALB/c)F1(H-2b/d), либо элютриированную "фракцию 19" селезеночных клеток малого диаметра, которые очищены от активности АПК (выделены так, как описано выше), либо моноклональное антитело против gp39 (MR1, см. пример 2, опыт 3); либо комбинацию аллогенных клеток и антитела против gp39. Клетки фракции 19 проверяют при двух различных интервалах доз - при малой дозировке в 40-44 • 106 клеток или при высокой дозе - 77-88 • 106 клеток. Контрольным животным не вводят ни аллогенные клетки, ни антитело. Аллогенные клетки вводят реципиентам трансплантата посредством инъекции в хвостовую вену за пять-восемь суток до трансплантации островкового трансплантата. Антитело MR1 вводят при дозе 250 мкг/мышь дважды в неделю, начиная за 7 дней до трансплантации островков и продолжая в течение 2-7 недель или до неблагоприятного исхода трансплантации. Первую инъекцию антитела обычно дают в тот же день, что и первую инъекцию аллогенных селезеночных клеток.
Реципиентам трансплантатов предварительно вводят либо нефракционированные аллогенные селезеночные клетки (C57хBALB/c)F1(H-2b/d), либо элютриированную "фракцию 19" селезеночных клеток малого диаметра, которые очищены от активности АПК (выделены так, как описано выше), либо моноклональное антитело против gp39 (MR1, см. пример 2, опыт 3); либо комбинацию аллогенных клеток и антитела против gp39. Клетки фракции 19 проверяют при двух различных интервалах доз - при малой дозировке в 40-44 • 106 клеток или при высокой дозе - 77-88 • 106 клеток. Контрольным животным не вводят ни аллогенные клетки, ни антитело. Аллогенные клетки вводят реципиентам трансплантата посредством инъекции в хвостовую вену за пять-восемь суток до трансплантации островкового трансплантата. Антитело MR1 вводят при дозе 250 мкг/мышь дважды в неделю, начиная за 7 дней до трансплантации островков и продолжая в течение 2-7 недель или до неблагоприятного исхода трансплантации. Первую инъекцию антитела обычно дают в тот же день, что и первую инъекцию аллогенных селезеночных клеток.
Трансплантация островкового трансплантата
Аллогенные островки BALB/c(H-2d) выделяют модифицированным способом коллагеназного переваривания (Gottlieb P.A., et al. (1990) Diabets 39, 643). Островки при дозе 30 островков на г массы тела имплантируют в субренальную капсулу реципиентной мыши (C57B1/6J(Н-2b) сразу же после выделения. Срок жизнеспособности трансплантата определяют по сохранению концентрации глюкозы в плазме на уровне ≅ 200 мг/мл.
Аллогенные островки BALB/c(H-2d) выделяют модифицированным способом коллагеназного переваривания (Gottlieb P.A., et al. (1990) Diabets 39, 643). Островки при дозе 30 островков на г массы тела имплантируют в субренальную капсулу реципиентной мыши (C57B1/6J(Н-2b) сразу же после выделения. Срок жизнеспособности трансплантата определяют по сохранению концентрации глюкозы в плазме на уровне ≅ 200 мг/мл.
Результаты
В первой серии экспериментов реципиентам островковых трансплантатов предварительно вводили либо одни аллогенные селезеночные клетки, либо одно антитело против gp39. Как видно на фиг. 1, при отсутствии предварительно введенных селезеночных клеток, все островковые трансплантаты отторгаются в пределах 13 суток после пересадки (9±2 сут; интервал 5-13 сут; N=23). Недостаточный срок жизнеспособности островков также наблюдается у животных, которым вводили только нефракционированные селезеночные клетки, содержащие нормальную активность АПК (6±3 сут; интервал 4-12 сут; N=7), или низкие дозы (40-44 • 106 клеток) фракции 19, очищенных от АПК, селезеночных клеток (7±3 сут; интервал 3-14 сут, N=16). Напротив, инъекция более высокой дозы фракции 19, очищенных от АПК, малых спленоцитов (75-88 • 106 клеток) продлевает срок жизнеспособности аллотрансплантатов (19±10 сут; интервал 7-40 сут; N=16). Этот эффект продолжительности срока жизнеспособности трансплантата статистически довольно значителен (F3,58=17,3, p < 0,001, при сравнении с группами, не получавшими ничего, получавшими нефракционированные селезеночные клетки или меньшую дозу селезеночных клеток фракции 19), но не был постоянным. Протяженный, но ограниченный срок жизнеспособности аллогенных островков у реципиентов с диабетом, получивших малые клетки фракции 19, очищенной от АПК, приводит к мысли, что одни эти клетки не могут поддерживать срок жизнеспособности трансплантата. Дополнительным группам реципиентов трансплантатов ввели 77-88 • 106 клеток фракции 20. Эту фракцию также, в подавляющем большинстве, составляют малые лимфоциты, но их популяция отличается от популяции фракции 19 тем, что содержит доступную измерению функцию АПК. Реципиенты этих клеток (N= 6) быстро отторгают свои трансплантаты (среднее = 8,5 сут; интервал 6-12). Другой группе реципиентов трансплантатов вводили только моноклональное антитело против gp39 - MR1. Фиг. 1 показывает, что островковые аллотрансплантаты выходят из строя в пределах 15 дней у 7/11 мышей, получивших только анти-gp39 mAb. Остальные четыре мыши имели фукционирующие трансплантаты при завершении эксперимента на 48 сутки. Результаты показывают, что введение реципиенту одного антитела против gp39 MR1 может продлить срок жизнеспособности островкового трансплантата (среднее = 20-19 сут; интервал 9-неопредел., N=5). Степень пролонгации статистически подобна степени, достигнутой с применением более высокой дозы одних селезеночных клеток фракции 19, и существенно выше степени, достигнутой в трех других группах (p < 0,05).
В первой серии экспериментов реципиентам островковых трансплантатов предварительно вводили либо одни аллогенные селезеночные клетки, либо одно антитело против gp39. Как видно на фиг. 1, при отсутствии предварительно введенных селезеночных клеток, все островковые трансплантаты отторгаются в пределах 13 суток после пересадки (9±2 сут; интервал 5-13 сут; N=23). Недостаточный срок жизнеспособности островков также наблюдается у животных, которым вводили только нефракционированные селезеночные клетки, содержащие нормальную активность АПК (6±3 сут; интервал 4-12 сут; N=7), или низкие дозы (40-44 • 106 клеток) фракции 19, очищенных от АПК, селезеночных клеток (7±3 сут; интервал 3-14 сут, N=16). Напротив, инъекция более высокой дозы фракции 19, очищенных от АПК, малых спленоцитов (75-88 • 106 клеток) продлевает срок жизнеспособности аллотрансплантатов (19±10 сут; интервал 7-40 сут; N=16). Этот эффект продолжительности срока жизнеспособности трансплантата статистически довольно значителен (F3,58=17,3, p < 0,001, при сравнении с группами, не получавшими ничего, получавшими нефракционированные селезеночные клетки или меньшую дозу селезеночных клеток фракции 19), но не был постоянным. Протяженный, но ограниченный срок жизнеспособности аллогенных островков у реципиентов с диабетом, получивших малые клетки фракции 19, очищенной от АПК, приводит к мысли, что одни эти клетки не могут поддерживать срок жизнеспособности трансплантата. Дополнительным группам реципиентов трансплантатов ввели 77-88 • 106 клеток фракции 20. Эту фракцию также, в подавляющем большинстве, составляют малые лимфоциты, но их популяция отличается от популяции фракции 19 тем, что содержит доступную измерению функцию АПК. Реципиенты этих клеток (N= 6) быстро отторгают свои трансплантаты (среднее = 8,5 сут; интервал 6-12). Другой группе реципиентов трансплантатов вводили только моноклональное антитело против gp39 - MR1. Фиг. 1 показывает, что островковые аллотрансплантаты выходят из строя в пределах 15 дней у 7/11 мышей, получивших только анти-gp39 mAb. Остальные четыре мыши имели фукционирующие трансплантаты при завершении эксперимента на 48 сутки. Результаты показывают, что введение реципиенту одного антитела против gp39 MR1 может продлить срок жизнеспособности островкового трансплантата (среднее = 20-19 сут; интервал 9-неопредел., N=5). Степень пролонгации статистически подобна степени, достигнутой с применением более высокой дозы одних селезеночных клеток фракции 19, и существенно выше степени, достигнутой в трех других группах (p < 0,05).
Ряд экспериментов, описанных выше, показывает, что одно введение высоких доз фракции 19 селезеночных клеток, очищенных от АПК, или анти-gp39 mAb может увеличить срок жизнеспособности трансплантатов панкреатических островков при сравнении с отсутствием такого введения. Однако, любая обработка только одним препаратом не является эффективной при индуцировании у реципиента длительной толерантности к островковым трансплантатам. Обнаружено, что комбинированное введение аллогенных селезеночных клеток и анти-gp39 является более эффективным, чем введение одного каждого реагента. Результаты приводятся на фиг. 2, при этом каждая кривая представляет данные для отдельной мыши. Незаштрихованные значки относятся к реципиентам, у которых трансплантаты разрушаются самопроизвольно. Заштрихованные значки относятся к мышам, у которых островковые трансплантаты функционировали при окончании эксперимента. Фиг. 2 показывает, что неопределенный срок жизнеспособности достигается у всех животных, получавших в течение 7 недель анти-gp39 mAb и однократную инъекцию фракции 19 - селезеночных клеток, очищенных от АПК (N= 6). Изменение этой схемы путем снижения длительности введения анти-gp39 ослабляет, но не отменяет, благоприятное действие на срок жизнеспособности трансплантата. Неопределенный срок жизнеспособности трансплантата достигается у 6/8 реципиентов, когда анти-gp39 mAb вводят только в течение 2 недель в сочетании с фракцией 19 селезеночных клеток (фиг. 2А). Неопределенный срок жизнеспособности трансплантатов также наблюдается у реципиентов, получавших анти-gp39 в течение 2-7 недель в сочетании с одной инъекцией нефракционированных аллогенных селезеночных клеток.
Для подтверждения функции трансплантата и отсутствия инсулиновой секреции оставшимися нативными островками, неразрушенными при введении стрептозотоцина, удаляют почки, несущие субренальные имплантаты. Во всех случаях односторонняя нефрэктомия дает в результате рецидив гипергликемии (>300 мг/мл) в пределах 3 суток.
Островковые аллотрансплантаты и природная поджелудочная железа исследовались гистологически у всех животных либо когда трансплантат разрушался, либо по окончании эксперимента. Гистологические срезы островковых аллотрансплантатов в почках реципиентов фракционированных аллогенных малых лимфоцитов и продолжительного (7 недель) введения mAb MR1 показывает обильные интактные островки, видимые ниже ренальной капсулы, которые лишены мононуклеарной инфильтрации и содержат хорошо гранулированные инсулин- и глюкагон-положительные клетки. Напротив, гистологические срезы островковых аллотрансплантатов в почках реципиентов, получавших одно анти-gp39 mAb, показывают характерное интенсивное воспаление с мононуклеарными клетками и разрушение сопутствующих островковых клеток. Во всех поджелудочных железах хозяев морфология островков едина со стрептозотоциновым диабетом.
Пример 2. Продуцирование и исследование антител против gp39
Опыт 1. Антитела, направленные против человеческого gp39
Для индукции антиген-специфической T-клеточной толерантности у человека предпочтительно вводить антитело, направленное против человеческого gp39. Для продуцирования мышиных моноклональных антител против человеческого gp39 используют следующую методологию. Мышей BALB/c иммунизируют растворимым слитым белком gp39 gp39-CD8 в полном адъюванте Фрейнда (CFA). Затем, спустя 6 недель, мышам вводят растворимый gp39-CD8 в неполном адъюванте Фрейнда (IFA). Растворимый gp39-CD8 дают в растворимой форме через 4 недели после второй иммунизации. Затем, 2 неделями позже, мышей ревакцинируют активированными человеческими лимфоцитами периферической крови, и еще через 2 недели их окончательно ревакцинируют растворимым gp39-CD8. Спленоциты сливались с партнерными клетками слияния NS-1 на 4 сутки после последней иммунизации по протоколам иммунизации.
Опыт 1. Антитела, направленные против человеческого gp39
Для индукции антиген-специфической T-клеточной толерантности у человека предпочтительно вводить антитело, направленное против человеческого gp39. Для продуцирования мышиных моноклональных антител против человеческого gp39 используют следующую методологию. Мышей BALB/c иммунизируют растворимым слитым белком gp39 gp39-CD8 в полном адъюванте Фрейнда (CFA). Затем, спустя 6 недель, мышам вводят растворимый gp39-CD8 в неполном адъюванте Фрейнда (IFA). Растворимый gp39-CD8 дают в растворимой форме через 4 недели после второй иммунизации. Затем, 2 неделями позже, мышей ревакцинируют активированными человеческими лимфоцитами периферической крови, и еще через 2 недели их окончательно ревакцинируют растворимым gp39-CD8. Спленоциты сливались с партнерными клетками слияния NS-1 на 4 сутки после последней иммунизации по протоколам иммунизации.
Клоны, продуцирующие антитела против человеческого gp39, выделяют на основе процесса многократного скрининга. Сначала клоны скринируют методом фиксации на бактериологических чашках, используя gp39-CD8. Затем положительные клоны скринируют против контрольного слитого белка CD8 - CD72-CD8. Клоны, которые отмечены как положительные при анализе фиксации на бактериологических чашках, удаляются. Остающиеся клоны затем скринируют с покоящимися и активированными в течение 6 часов человеческими лимфоцитами периферической крови (PBL) с помощью проточного цитометрического анализа. Положительными считаются гибридомы, окрашивающие активированные, а не покоящиеся PBL. Наконец, остающиеся клоны проверяют на их способность блокировать связывание CD40Ig с зафиксированным на бактериологических чашках gp39.
Приблизительно 300 клонов скринируют сначала против gp39-CD8 и CD72-CD8 при анализе фиксации на бактериологических чашках. Обнаружено, что из этих клонов 30 находят фиксированный на чашках gp39, но не CD8. Эти клоны затем скринируют для обнаружения gp39 на активированных человеческих PBL. Приблизительно 15 клонов находят молекулу на активированных PBL, но не покоящихся клетках. Далее специфичность подтверждается путем определения способности клонов блокировать связывание CD40Ig при таком анализе. Такими клонами стали 3E4, 2H5 и 2H8. Такие клоны являются предпочтительными для применения в описанных здесь способах. Клоны, которые положительны на активированных, а не на покоящихся PBL, также скринируют на реакционноспособность с клоном активированных крысиных T-клеток POMC8. Клон 2H8 выражает перекрестную реактивность с этой линией крысиных T-клеток.
Опыт 2. Антитела, направленные против человеческого gp39
Процедуру иммунизации, подобную процедуре, описанной в примере 1, используют для получения дополнительных антител, направленных против человеческого gp39. Одну мышь BALB/c иммунизируют растворимым gp39-CD8 в CFA, и впоследствии, 4 недели спустя, ей вводят активированные в течение 6 часов человеческие лимфоциты периферической крови. Впоследствии мышь ревакцинируют растворимым gp39-CD8 за 4 дня перед слиянием спленоцитов с клетками слияния NS-1 по стандартным протоколам. Скрининг гибридомных клонов осуществляют с помощью проточной цитометрии при окрашивании активированных в течение 6 часов PBL. Отбирают клоны, окрашивающие активированные, но не покоящиеся, человеческие PBL. Для дальнейшего анализа отбирают 6 клонов - 4D9-8, 4D9-9, 24-31, 24-43, 89-76 и 89-79.
Процедуру иммунизации, подобную процедуре, описанной в примере 1, используют для получения дополнительных антител, направленных против человеческого gp39. Одну мышь BALB/c иммунизируют растворимым gp39-CD8 в CFA, и впоследствии, 4 недели спустя, ей вводят активированные в течение 6 часов человеческие лимфоциты периферической крови. Впоследствии мышь ревакцинируют растворимым gp39-CD8 за 4 дня перед слиянием спленоцитов с клетками слияния NS-1 по стандартным протоколам. Скрининг гибридомных клонов осуществляют с помощью проточной цитометрии при окрашивании активированных в течение 6 часов PBL. Отбирают клоны, окрашивающие активированные, но не покоящиеся, человеческие PBL. Для дальнейшего анализа отбирают 6 клонов - 4D9-8, 4D9-9, 24-31, 24-43, 89-76 и 89-79.
Специфичность выбранных антител подтверждается несколькими анализами. Сначала анализ методом проточной цитометрии показывает, что все 6 mAb окрашивают активированные, но не покоящиеся, T-клетки периферической крови (см., как характерный пример, фиг. 3Б и 3В, показывающие окрашивание активированных T-клеток 4D9-8 и 4D9-9 соответственно). Экспрессия молекулы, распознаваемой каждым из шести антител, обнаруживается в пределах 4 часов после активации, является максимальной через 6-8 часов после активации и не обнаруживается через 24 часа после активации. Все шесть mAb распознают молекулу, выраженную на активированных CD3+PBL, в основном, фенотипа CD4+, но часть CD8+T-клеток также экспрессируют молекулу. Экспрессия молекулы, распознаваемой этими шестью антителами, ингибируется присутствием в культуральной среде циклоспорина А, как и экспрессия gp39 (см., например, фиг. 4А и 4Б, показывающие окрашивание T-клеток, обработанных циклоспорином, 4D9-8 и 4D9-9 соответственно). Кинетика и распространение экспрессии молекулы, распознаваемой этими mAb, идентичны этим параметрам gp39, который находит слитый белок человеческого CD40Ig. Кроме того, все шесть моноклональных антител блокируют окрашивание gp39 CD40Ig (см., например, фиг. 5А и 5Б, на которых показывается ингибирование окрашивания gp39 CD40Ig в присутствии 4D9-8 и 4D9-9 соответственно). При анализе по методу ELISA все шесть mAb распознают gp39-CD8, растворимую слитую форму молекулы gp39. Кроме того, все шесть mAb образуют иммунопреципитат молекулы приблизительно в 36 кд из меченых 35S-метионином активированных человеческих PBL. Иммунопреципитированная молекула идентична молекуле, преципитированной слитым белком человеческого CD40Ig.
Функциональную активность шести выбранных моноклональных антител (4D9-8, 4D9-9, 24-31, 24-43, 89-76 и 89-79) проверяют следующим образом. Сначала определяют способность mAb ингибировать пролиферацию очищенных человеческих B-клеток, выращенных с IL-4 и растворимым gp39. Очищенные человеческие T-клетки выращивают с gp39 и IL-4 в присутствии или в отсутствии очищенных моноклональных антител или CD40Ig при дозах от 0 до 12,5 мкг/мл. Пролиферацию B-клеток определяют через 3 дня после введения в культуру тимидина. Результаты (приводятся на фиг. 6) показывают, что все шесть mAb могут ингибировать пролиферацию B-клеток, индуцированную gp39 и IL-4. Наиболее эффективными при ингибировании индуцированной пролиферации B-клеток, являются mAb 89-76 и 24-31.
Затем проверяют способность mAb ингибировать B-клеточную дифференцировку при измерении по продуцированию Ig, индуцированного анти-CD3 активированными Т-клетками и IL-2. Очищенные IgD+ человеческие B-клетки получают позитивной селекцией с клеточным сортером с возбуждением флуоресценции (FACS), и затем культивируют с анти-CD3 активированными человеческими Т-клетками (обработанными митомицином C) и IL-2 в течение 6 суток в присутствии или в отсутствии очищенных моноклональных антител против gp39 при дозировке от 0 до 10 мкг/мл. На 6 сутки методом ELISA проверяют продуцирование IgM, IgG и IgA. Результаты (даются ниже в табл. 1) показывают, что все шесть антител могут ингибировать T-клеточно-зависимую B-клеточную дифференцировку, при измерении по продуцированию IgM, IgG и IgA.
Чтобы проверить влияние mAb против gp39 на T-клеточные реакции, моноклональные антитела включают в стандартные реакции смешанной культуры лимфоцитов (СКЛ). Культивируют 300000 человеческих лимфоцитов периферической крови (респондеры = P) со 100000 облученных аллогенных лимфоцитов периферической крови (стимуляторы = С) в присутствии или в отсутствии mAb против gp39 (10 мкг/мл). Культуры метят импульсно 3H-тимидином на 4, 5 и 6 сутки и через 18 часов собирают клетки, выросшие в культуре. Все шесть mAb против человеческого gp39 ингибируют аллоспецифические реакции при измерении по СКЛ (см., как характерный пример, фиг. 7, показывающий ингибирование аллоспецифических реакций, когда Р и С инкубируются в присутствии 24-31 или 89-76; для положительного контроля используют слитый белок CTLA4-иммуноглобулин и mAb против CD28).
Чтобы определить, распознают ли все шесть моноклональных антител определенные эпитопы на молекуле человеческого gp39, осуществляют эксперименты с перекрестным блокированием. Сначала активированные человеческие PBL блокируют каждым из шести mAb (25 мкг/мл). Клетки промывают и затем окрашивают 10 мкг/мл биотинилированного антитела, после чего следует реакция с фитоэритринилированным авидином (PE-Av). Окрашивание клеток PE-Av анализируют FACS. Результаты приводятся ниже в табл. 2.
Все антитела блокируют связывание CD40Ig с активированными человеческими PBL. Однако данные, приведенные в табл. 2, ясно показывают неэффективность некоторых антител при блокировке связывания других антител с активированными человеческими PBL, что приводит к предположению, что они распознают отдельные эпитопы на молекулах человеческого gp39.
Гибридомы 89-76 и 24-31, продуцирующие антитела 89-76 и 24-31 соответственно, депонированы в соответствии с Будапештским договором в Американской коллекции типовых культур, Parklawn Drive, Роквилл, Мэриленд, 2 сентября 1994. Гибридоме 89-76 присвоен инвентарный номер ATCC HB11713 и гибридоме 24-31 присвоен инвентарный номер ATCC HB11712.
Опыт 3. Антитела, направленные против мышиного gp39
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения антагонистом gp39 является моноклональное антитело против мышиного gp39 - MR1. Для продуцирования моноклонального антитела MR1 применяется описанный ниже способ, и его можно использовать для генерации других антител, направленных на gp39.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения антагонистом gp39 является моноклональное антитело против мышиного gp39 - MR1. Для продуцирования моноклонального антитела MR1 применяется описанный ниже способ, и его можно использовать для генерации других антител, направленных на gp39.
Хомяков иммунизируют интраперитонально 5-106 активированных Th1-клеток (d1.6) с недельными интервалами в течение шести недель. Когда сывороточный титр против мышиных Th1 превышает 1:10000, осуществляют слияние клеток с полиэтиленгликолем, используя иммунные хомячьи спленоциты и NS-1. Супернатант от клеток, содержащих растущие гибридомы, скринируют проточной цитометрией на покоящихся и активированных Th1. Одну особую гибридому, которая продуцирует Mab, которое селективно распознает активированные Th, затем тестируют и субклонируют, чтобы получить MR1. MR1 получают в асците и очищают ионообменной ВЭЖХ. Гибридома MR1 депонирована Американской коллекцией типовых культур, и ей присвоен инвентарный номер HB11048.
Эквиваленты
Специалисты в этой области техники увидят или смогут осуществить, используя самые обычные экспериментальные методы, много эквивалентов конкретных вариантов осуществления настоящего изобретения, описанных здесь. Такие эквиваленты рассматриваются как входящие в объем приведенной ниже формулы изобретения. Все ссылки и опубликованные заявки на патенты, цитированные в настоящей заявке, включены в нее в качестве ссылок.
Специалисты в этой области техники увидят или смогут осуществить, используя самые обычные экспериментальные методы, много эквивалентов конкретных вариантов осуществления настоящего изобретения, описанных здесь. Такие эквиваленты рассматриваются как входящие в объем приведенной ниже формулы изобретения. Все ссылки и опубликованные заявки на патенты, цитированные в настоящей заявке, включены в нее в качестве ссылок.
Claims (38)
1. Способ индуцирования Т-клеточной толерантности ткани или органа у реципиента к донорской ткани или органу, включающий в себя введение упомянутому реципиенту а) аллогенной или ксеногенной клетки, которая экспрессирует, по меньшей мере, один донорский антиген и которая имеет лиганд на клеточной поверхности, взаимодействующий с рецептором на поверхности реципиентной Т-клетки, которая опосредует контакт-зависимую хелпер-эффекторную функцию, и б) антагониста рецептора на поверхности Т-клетки, который ингибирует взаимодействие лиганда с рецептором.
2. Способ по п.1, отличающийся тем, что рецептор на поверхности реципиентной Т-клетки, которая опосредует контактзависимую хелпер-эффекторную функцию, представляет собой gp 39.
3. Способ по п.2, отличающийся тем, что антагонист рецептора представляет собой моноклональное антитело против gp 39.
4. Способ по п.3, отличающийся тем, что антитело против gp 39 представляет собой антитело против gp 39 человека.
5. Способ по п.3, отличающийся тем, что моноклональное антитело представляет собой MRI.
6. Способ по п.3, отличающийся тем, что моноклональное антитело представляет собой химерное моноклональное антитело.
7. Способ по п.3, отличающийся тем, что моноклональное антитело представляет собой гуманизированное моноклональное антитело.
8. Способ по п. 1, отличающийся тем, что аллогенная или ксеногенная клетка представляет собой лимфоидную покоящуюся В-клетку.
9. Способ по п. 1, отличающийся тем, что аллогенную или ксеногенную клетку и антагонист рецептора вводят реципиенту перед трансплантацией ткани или органа.
10. Способ по п.1, отличающийся тем, что ткань или орган включает в себя панкреатические островки.
11. Способ по п. 1, отличающийся тем, что ткань или орган выбирают из группы, в которую входят печень, почка, сердце, легкое, кожа, мышца, нервная ткань, желудок и кишка.
12. Способ индуцирования Т-клеточной толерантности ткани или органа у реципиента к донорской ткани или органу, включающий в себя введение упомянутому реципиенту а) аллогенной или ксеногенной клетки, которая экспрессирует, по меньшей мере, один донорский антиген, и б) антагониста gp 39.
13. Способ по п.12, отличающийся тем, что антагонист gp 39 представляет собой моноклональное антитело против gp 39.
14. Способ по п.13, отличающийся тем, что антитело против gp 39 представляет собой антитело против gp 39 человека.
15. Способ по п.13, отличающийся тем, что моноклональное антитело представляет собой MRI.
16. Способ по п.13, отличающийся тем, что моноклональное антитело представляет собой химерное моноклональное антитело.
17. Способ по п.13, отличающийся тем, что моноклональное антитело представляет собой гуманизированное моноклональное антитело.
18. Способ по п.12, отличающийся тем, что антагонистом gp 39 является растворима форма лиганда gp 39, представляющая собой белок СД40.
19. Способ по п. 12, отличающийся тем, что аллогенная или ксеногенная клетка представляет собой лимфоидную покоящуюся В-клетку.
20. Способ по п. 12, отличающийся тем, что аллогенную или ксеногенную клетку и антагонист рецептора вводят реципиенту перед трансплантацией ткани или органа.
21. Способ по п.12, отличающийся тем, что ткань или орган включает в себя панкреатические островки.
22. Способ по п.12, отличающийся тем, что ткань или орган выбирают из группы, в которую входят печень, почка, сердце, легкое, кожа, мышца, нервная ткань, желудок или кишка.
23. Способ индуцирования Т-клеточной толерантности к донорской ткани или органу у реципиента ткани или органа по п.1, отличающийся тем, что при лечении диабета дополнительно вводят донорские клетки панкреатических островков.
24. Способ по п.23, отличающийся тем, что антитело против gp 39 представляет собой моноклональное антитело.
25. Способ по п.23, отличающийся тем, что антитело против gp 39 представляет собой антитело против gp 39 человека.
26. Способ по п.24, отличающийся тем, что моноклональное антитело представляет собой MRI.
27. Способ по п.24, отличающийся тем, что моноклональное антитело представляет собой химерное моноклональное антитело.
28. Способ по п.24, отличающийся тем, что моноклональное антитело представляет собой гуманизированное моноклональное антитело.
29. Способ по п.23, отличающийся тем, что антагонистом gp 39 является растворимая форма лиганда gp 39, представляющая собой слитый белок СД40.
30. Способ по п. 23, отличающийся тем, что аллогенная или ксеногенная клетка представляет собой лимфоидную покоящуюся В-клетку.
31. Способ по п. 23, отличающийся тем, что аллогенную или ксеногенную клетку и антагонист рецептора вводят реципиенту перед трансплантацией клеток панкреатических островков.
32. Способ индуцирования Т-клеточной толерантности ткани или органа у реципиента к донорской ткани или органу, включающий в себя введение упомянутому реципиенту а) донорской аллогенной клетки, и б) антитела против gp 39, при этом донорскую аллогенную клетку и антитело против gp 39 вводят реципиенту перед трансплантацией ткани или органа.
33. Способ по п.32, отличающийся тем, что антитело против gp 39 представляет собой моноклональное антитело.
34. Способ по п.32, отличающийся тем, что антитело против gp 39 представляет собой антитело против gp 39 человека.
35. Способ по п.,33 отличающийся тем, что моноклональное антитело представляет собой MRI.
36. Способ по п.34, отличающийся тем, что моноклональное антитело представляет собой химерное моноклональное антитело.
37. Способ по п.34, отличающийся тем, что моноклональное антитело представляет собой гуманизированное моноклональное антитело.
38. Способ по п.35, отличающийся тем, что донорская аллогенная клетка представляет собой лимфоидную покоящуюся В-клетку.
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US08/234,987 US5683693A (en) | 1994-04-25 | 1994-04-25 | Method for inducing T cell unresponsiveness to a tissue or organ graft with anti-CD40 ligand antibody or soluble CD40 |
US08/234987 | 1994-04-25 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU96122475A RU96122475A (ru) | 1999-01-20 |
RU2169009C2 true RU2169009C2 (ru) | 2001-06-20 |
Family
ID=22883593
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU96122475/14A RU2169009C2 (ru) | 1994-04-25 | 1995-04-25 | Способы индуцирования т-клеточной толерантности к тканевому или органному трансплантату |
Country Status (34)
Country | Link |
---|---|
US (4) | US5683693A (ru) |
EP (2) | EP1530973A3 (ru) |
JP (1) | JP2974415B2 (ru) |
KR (1) | KR100468330B1 (ru) |
CN (1) | CN1134266C (ru) |
AP (1) | AP764A (ru) |
AT (1) | ATE288281T1 (ru) |
AU (1) | AU710925B2 (ru) |
BG (1) | BG62121B1 (ru) |
BR (1) | BR9507509A (ru) |
CA (1) | CA2188672A1 (ru) |
CZ (1) | CZ291266B6 (ru) |
DE (1) | DE69533984T2 (ru) |
DK (1) | DK0757557T3 (ru) |
EE (1) | EE03516B1 (ru) |
ES (1) | ES2237757T3 (ru) |
FI (1) | FI118792B (ru) |
GE (1) | GEP20022648B (ru) |
HU (1) | HU221752B1 (ru) |
IS (1) | IS2118B (ru) |
LT (1) | LT4309B (ru) |
LV (1) | LV11785B (ru) |
MD (1) | MD1444B2 (ru) |
NO (2) | NO319787B1 (ru) |
NZ (1) | NZ284905A (ru) |
OA (1) | OA10591A (ru) |
PL (1) | PL180031B1 (ru) |
PT (1) | PT757557E (ru) |
RO (1) | RO114743B1 (ru) |
RU (1) | RU2169009C2 (ru) |
SI (1) | SI9520057A (ru) |
SK (1) | SK136996A3 (ru) |
UA (1) | UA44892C2 (ru) |
WO (1) | WO1995028957A2 (ru) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2445975C2 (ru) * | 2006-03-02 | 2012-03-27 | Алексион Фармасьютикалз, Инк. | Продление срока выживаемости аллотрансплантата путем ингибирования активности комплемента |
RU2580640C1 (ru) * | 2014-12-25 | 2016-04-10 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Федеральный научный центр трансплантологии и искусственных органов имени академика В.И. Шумакова" Министерства здравоохранения Российской Федерации | Способ профилактики гуморального отторжения при аво-несовместимой трансплантации печени детям раннего возраста |
Families Citing this family (39)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5474771A (en) | 1991-11-15 | 1995-12-12 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Murine monoclonal antibody (5c8) recognizes a human glycoprotein on the surface of T-lymphocytes, compositions containing same |
US7070777B1 (en) * | 1991-11-15 | 2006-07-04 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Method for inhibiting inflammation with an antibody that binds the 5C8 protein |
US6472510B1 (en) | 1992-02-14 | 2002-10-29 | Bristol-Myers Squibb Company | CD40 receptor ligands |
CN100341896C (zh) * | 1993-09-02 | 2007-10-10 | 达特茅斯学院理事 | 抗gp39抗体及其应用 |
ZA946765B (en) * | 1993-09-02 | 1996-02-15 | Dartmouth College | Methods of prolonged suppression of humoral immunity |
US5683693A (en) * | 1994-04-25 | 1997-11-04 | Trustees Of Dartmouth College | Method for inducing T cell unresponsiveness to a tissue or organ graft with anti-CD40 ligand antibody or soluble CD40 |
US5876950A (en) * | 1995-01-26 | 1999-03-02 | Bristol-Myers Squibb Company | Monoclonal antibodies specific for different epitopes of human GP39 and methods for their use in diagnosis and therapy |
US6440418B1 (en) | 1995-11-07 | 2002-08-27 | Idec Pharmaceuticals Corporation | Methods of treating autoimmune diseases with gp39-specific antibodies |
US6001358A (en) | 1995-11-07 | 1999-12-14 | Idec Pharmaceuticals Corporation | Humanized antibodies to human gp39, compositions containing thereof |
US6340459B1 (en) | 1995-12-01 | 2002-01-22 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Therapeutic applications for the anti-T-BAM (CD40-L) monoclonal antibody 5C8 in the treatment of reperfusion injury in non-transplant recipients |
IL125928A (en) * | 1996-03-20 | 2002-11-10 | Bristol Myers Squibb Co | The use of soluble ligands that react with CTLA4, B7, CD40, gp39 and / or CD28 for the preparation of pharmaceutical preparations |
BR9807471A (pt) * | 1997-01-10 | 2000-03-21 | Biogen Inc | Uso do composto anti-cd40l |
ATE339966T1 (de) * | 1997-06-20 | 2006-10-15 | Biogen Idec Inc | Cd154-blockadetherapie der pankreasinselzelltransplantation bei primaten |
EP1754490A3 (en) * | 1997-06-20 | 2010-01-20 | Biogen Idec MA Inc. | CD 154 blockage therapy for pancreatic islet tissue transplantation in primates |
US20050031611A1 (en) * | 1998-05-08 | 2005-02-10 | Beth Israel Deaconess Medical Center | Transplant tolerance by costimulation blockade and T-cell activation-induced apoptosis |
WO2000006178A1 (en) * | 1998-07-30 | 2000-02-10 | Regents Of The University Of Minnesota | EX VIVO TREATMENT OF ALLOGENEIC AND XENOGENEIC T-CELLS WITH gp39 ANTAGONISTS |
US20020199218A1 (en) * | 1999-08-19 | 2002-12-26 | Daphne Goring | Proline-rich extensin-like receptor kinases |
RU2162297C1 (ru) * | 1999-11-25 | 2001-01-27 | Камакин Владислав Владимирович | Способ индивидуального подбора оптимального питания человека |
WO2001079555A2 (en) | 2000-04-14 | 2001-10-25 | Millennium Pharmaceuticals, Inc. | Roles of jak/stat family members in tolerance induction |
AU2001261585B2 (en) | 2000-05-12 | 2006-08-31 | Beth Israel Deaconess Medical Center, Inc. | Compositions and methods for achieving immune suppression |
EP1289554A4 (en) * | 2000-06-02 | 2004-05-26 | Univ Minnesota | IMMUNOTHERAPEUTIC PROCESS FOR PREVENTING REJECTION OF ISLAND CELLS |
EP1299542A2 (en) * | 2000-06-06 | 2003-04-09 | Idec Pharmaceuticals Corporation | Non-agonistic antibodies to human gp39, compositions containing, and therapeutic use thereof |
DE60135029D1 (de) | 2000-07-03 | 2008-09-04 | Bristol Myers Squibb Co | Verwendung von löslichen ctla4-mutanten zur behandlung von rheumatoider arthritis |
US20040022787A1 (en) | 2000-07-03 | 2004-02-05 | Robert Cohen | Methods for treating an autoimmune disease using a soluble CTLA4 molecule and a DMARD or NSAID |
CA2364983A1 (en) * | 2000-12-13 | 2002-06-13 | John R. Coleman | Nucleic acid molecules and polypeptides for catabolism of abscisic acid |
WO2002078743A1 (en) * | 2001-02-16 | 2002-10-10 | University Of Rochester | Compositions and methods for reducing tranfusion reactions |
US7556807B2 (en) | 2001-02-20 | 2009-07-07 | Kane Biotech, Inc. | Signal peptides, nucleic acid molecules and methods for treatment of caries |
US7597895B2 (en) * | 2001-02-20 | 2009-10-06 | The Governing Council Of The University Of Toronto | Signal peptides, nucleic acid molecules and methods for treatment of caries |
DK1397153T3 (da) | 2001-05-23 | 2008-05-26 | Bristol Myers Squibb Co | Fremgangsmåde til beskyttelse af allogent ö-celle-transplantat ved anvendelse af oplöselige CTLA4-mutantmolekyler |
US7498171B2 (en) | 2002-04-12 | 2009-03-03 | Anthrogenesis Corporation | Modulation of stem and progenitor cell differentiation, assays, and uses thereof |
JP2006512895A (ja) * | 2002-06-28 | 2006-04-20 | ドマンティス リミテッド | リガンド |
WO2005006949A2 (en) * | 2003-07-07 | 2005-01-27 | Wagner David H | Methods for predicting development of auto-immune diseases and treatment of same |
US7563443B2 (en) | 2004-09-17 | 2009-07-21 | Domantis Limited | Monovalent anti-CD40L antibody polypeptides and compositions thereof |
EP1795587A1 (en) * | 2005-12-07 | 2007-06-13 | Schuler, Gerold, Prof. Dr. | Method for the direct culture of dendritic cells without a preceding centrifugation step |
FR2934140B1 (fr) * | 2008-07-25 | 2010-09-03 | Seb Sa | Couvercle d'appareil electromenager de cuisson comportant un sous-ensemble de filtration |
WO2010148501A1 (en) | 2009-06-26 | 2010-12-29 | Soricimed Biopharma Inc. | Soricidin derived peptides and methods for the detection of trpv-6 cancers and drug delivery |
WO2013013708A1 (en) | 2011-07-26 | 2013-01-31 | Fundació Institut D'investigació Biomèdica De Bellvitge | Treatment of acute rejection in renal transplant |
KR102656470B1 (ko) | 2014-12-10 | 2024-04-09 | 리전츠 오브 더 유니버스티 오브 미네소타 | 질환을 치료하기 위한 유전적으로 변형된 세포, 조직 및 장기 |
RU2688172C1 (ru) * | 2018-04-05 | 2019-05-20 | Государственное бюджетное учреждение здравоохранения Московской области "Московский областной научно-исследовательский клинический институт им. М.Ф. Владимирского" (ГБУЗ МО МОНИКИ им. М.Ф. Владимирского) | Способ профилактики отторжения трансплантата трупной почки |
Family Cites Families (13)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP0585963A1 (en) * | 1989-05-23 | 1994-03-09 | Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd. | Monoclonal antibodies to CMP-170 antigen on activated endothelial cells |
US5690933A (en) * | 1989-05-31 | 1997-11-25 | Glaxo Wellcome Inc. | Monoclonal antibodies for inducing tolerance |
AU661360B2 (en) * | 1991-10-25 | 1995-07-20 | Immunex Corporation | Novel cytokine |
US5474771A (en) * | 1991-11-15 | 1995-12-12 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Murine monoclonal antibody (5c8) recognizes a human glycoprotein on the surface of T-lymphocytes, compositions containing same |
IL104684A0 (en) * | 1992-02-14 | 1993-06-10 | Bristol Myers Squibb Co | The cd40cr receptor and ligands therefor |
WO1994004570A1 (en) * | 1992-08-21 | 1994-03-03 | Schering Corporation | Cd40 ligand, anti cd40 antibodies, and soluble cd40 |
US5540926A (en) * | 1992-09-04 | 1996-07-30 | Bristol-Myers Squibb Company | Soluble and its use in B cell stimulation |
US5597563A (en) * | 1992-09-04 | 1997-01-28 | Beschorner; William E. | Method induction of antigen-specific immune tolerance |
CA2109398A1 (en) * | 1992-10-30 | 1994-05-01 | Alejandro A. Aruffo | Extracellular matrix receptor ligands that modulate leukocyte function |
CN100341896C (zh) * | 1993-09-02 | 2007-10-10 | 达特茅斯学院理事 | 抗gp39抗体及其应用 |
ZA946765B (en) * | 1993-09-02 | 1996-02-15 | Dartmouth College | Methods of prolonged suppression of humoral immunity |
US5869049A (en) * | 1993-09-02 | 1999-02-09 | Trustees Of Dartmouth College | Methods of inducing T cell unresponsiveness to bone marrow with gp39 antagonists |
US5683693A (en) | 1994-04-25 | 1997-11-04 | Trustees Of Dartmouth College | Method for inducing T cell unresponsiveness to a tissue or organ graft with anti-CD40 ligand antibody or soluble CD40 |
-
1994
- 1994-04-25 US US08/234,987 patent/US5683693A/en not_active Expired - Lifetime
-
1995
- 1995-04-25 RU RU96122475/14A patent/RU2169009C2/ru not_active IP Right Cessation
- 1995-04-25 RO RO96-02051A patent/RO114743B1/ro unknown
- 1995-04-25 EE EE9600162A patent/EE03516B1/xx not_active IP Right Cessation
- 1995-04-25 CA CA002188672A patent/CA2188672A1/en not_active Abandoned
- 1995-04-25 AU AU23585/95A patent/AU710925B2/en not_active Ceased
- 1995-04-25 PL PL95317022A patent/PL180031B1/pl unknown
- 1995-04-25 JP JP7527745A patent/JP2974415B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1995-04-25 AT AT95917593T patent/ATE288281T1/de not_active IP Right Cessation
- 1995-04-25 AP APAP/P/1996/000906A patent/AP764A/en active
- 1995-04-25 CZ CZ19963125A patent/CZ291266B6/cs unknown
- 1995-04-25 EP EP05075209A patent/EP1530973A3/en not_active Withdrawn
- 1995-04-25 GE GEAP19953439A patent/GEP20022648B/en unknown
- 1995-04-25 BR BR9507509A patent/BR9507509A/pt not_active Application Discontinuation
- 1995-04-25 NZ NZ284905A patent/NZ284905A/en not_active IP Right Cessation
- 1995-04-25 MD MD97-0009A patent/MD1444B2/ru unknown
- 1995-04-25 UA UA96114392A patent/UA44892C2/uk unknown
- 1995-04-25 EP EP95917593A patent/EP0757557B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1995-04-25 DK DK95917593T patent/DK0757557T3/da active
- 1995-04-25 ES ES95917593T patent/ES2237757T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1995-04-25 KR KR1019960705968A patent/KR100468330B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1995-04-25 CN CNB951935623A patent/CN1134266C/zh not_active Expired - Fee Related
- 1995-04-25 SK SK1369-96A patent/SK136996A3/sk unknown
- 1995-04-25 PT PT95917593T patent/PT757557E/pt unknown
- 1995-04-25 SI SI9520057A patent/SI9520057A/sl unknown
- 1995-04-25 WO PCT/US1995/004832 patent/WO1995028957A2/en active IP Right Grant
- 1995-04-25 HU HU9602924A patent/HU221752B1/hu not_active IP Right Cessation
- 1995-04-25 DE DE69533984T patent/DE69533984T2/de not_active Expired - Fee Related
-
1996
- 1996-10-18 NO NO19964440A patent/NO319787B1/no unknown
- 1996-10-22 IS IS4378A patent/IS2118B/is unknown
- 1996-10-23 FI FI964272A patent/FI118792B/fi active
- 1996-10-24 OA OA60909A patent/OA10591A/en unknown
- 1996-11-19 BG BG100991A patent/BG62121B1/bg unknown
- 1996-11-25 LT LT96-165A patent/LT4309B/lt not_active IP Right Cessation
- 1996-11-25 LV LVP-96-440A patent/LV11785B/en unknown
-
1997
- 1997-08-05 US US08/906,332 patent/US5902585A/en not_active Expired - Lifetime
-
1999
- 1999-01-05 US US09/227,081 patent/US6375950B1/en not_active Expired - Lifetime
-
2004
- 2004-10-07 US US10/962,033 patent/US7501124B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2005
- 2005-03-04 NO NO20051182A patent/NO20051182L/no not_active Application Discontinuation
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
Гауровиц Ф. Иммунохимия и биосинтез антител. - М.: Мир, 1963, с. 316-334. * |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2445975C2 (ru) * | 2006-03-02 | 2012-03-27 | Алексион Фармасьютикалз, Инк. | Продление срока выживаемости аллотрансплантата путем ингибирования активности комплемента |
RU2580640C1 (ru) * | 2014-12-25 | 2016-04-10 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Федеральный научный центр трансплантологии и искусственных органов имени академика В.И. Шумакова" Министерства здравоохранения Российской Федерации | Способ профилактики гуморального отторжения при аво-несовместимой трансплантации печени детям раннего возраста |
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
RU2169009C2 (ru) | Способы индуцирования т-клеточной толерантности к тканевому или органному трансплантату | |
JP3098739B2 (ja) | 抗原特異的なt細胞寛容の誘導剤 | |
KR100353639B1 (ko) | 항원-특이적t세포의내성을유도하는방법 | |
US20010033840A1 (en) | Methods for inducing T cell tolerance to a tissue or organ graft | |
MXPA96005051A (en) | Methods to induce tolerance to t cells for a tissue grafting uórg | |
WO2001000679A2 (en) | Methods for inducing t cell non-responsiveness to a tissue or organ graft |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20090426 |