UA44892C2 - Спосіб індукування т-клітинної толерантності до донорської тканини або органа (варіанти), спосіб лікування діабету - Google Patents

Abstract

Описано способи індукування Т-клітинної толерантності до тканинного або органного трансплантата у реципієнта трансплантата. Способи включають в себе введення суб’єкту алогенних або ксеногенних клітин, які експресують донорські антигени та містять на клітинній поверхні ліганд, що взаємодіє з рецептором на поверхні реципієнтної Т-клітини, яка опосередковує контакт-залежну хелпер-ефекторну функцію, і антагоніста рецептора, який інгібує взаємодію ліганда з рецептором. Крім того описано спосіб лікування діабету, який полягає у введенні суб’єкту алогенних або ксеногенних клітин, які експресують донорські антигени, антагоніста gp39 та панкреатичних острівців.

Description

Опис винаходу

Для индуцирования антиген-специфической Т-клеточной активации и клональной зкспансии к поверхности 2 покоящихся Т-лимфоцитов должнь! бьіть доставленьі два сигнала, обеспеченньїх антигенпредставляющими клетками (АПК) (ЧепКіп5, М. апа Зспуагіг, К. (1987) 9У.Ехр.Мей. 165, 302 - 319; Миейег,О.Ї. еї а. (1990) ..

Іттипої. 144, 3701 - 3709; УМІШатв, І.К. апа Оппапце, Е.К. (1990) 9. Іттипої. 145, 85 - 93). Первьйй сигнал, которьій представляет специфичность иммунной реакции, передается через Т-клеточньіїй рецептор (ТОК) после распознавания инородного атигенного пептида, представленного в связи с оглавньм комплексом 70 гистосовметимости (ГКГО). Второй сигнал, назьіваемьй костимуляцией, индуцирует Т-клетки к пролиферации и появлению функциональности (Зспуагіг, К.Н. (1990) Зсіепсе 248, 1349 - 1356). Костимуляция не является ни антиген-специфической, ни ограниченной ГКГС, и, полагают, обеспечивается одной или несколькими отдельньми -молекулами клеточной поверхности, зкспрессированньми АПК (депКіп5, М.К. еї аїЇ. (1988) 3.

Іпттипої. 140, 3324 - 3330; ІіпвІіеу, Р.5. еї аі). (1991) 9. Ехр. Мей. 173, 721 - 730; Сітті, С.О., еї аї. 19 (1991) Ргос. Май. Асад. Зсі. ОБА. 88, 6575 - 6579; Мопо9ОП, 9.МУ., еї аї. (1992) 9. Сііп. Іпмеві. 90, 229 - 237; Коціома, Ї., ек аії. (1991) 9. Ехр. Мей. 173, 759 - 762; Кеївег, Н., еї аЇ. (1992) Ргос. Май). Асай. збі.

ОБА. 89, 271 - 275; мап-Земепіеєг, О.А., еї аі). (1990) У. ІттипоїЇ. 144, 4579 - 4586; Іазаїе, 9.М., еї аї. (1991) 9. Іттипої. 147, 774 - 780; ЮБивііп, М. !., еї аїЇ. (1989) У. Ехр. Мей. 169, 503; Аптйаде, К.)., еї а). (1992) Маїцге 357, 80 - 82; ім, у., еї аІ. (1992) У. Ехр. Мей. 175, 437 - 445). Один костимуляторньїй каскад, 20 включенньй в Т-клеточную активацию, включает молекулу СЮО28 на поверхности Т-клеток. Зта молекула может получить костимудяторньїй сигнал, доставленньій лигандом на В-клетках или других АПК. Лигандьі для СО28 включают членов семейства В7 В-лимфоцитньїх активационньїх антигенов, таких как В7-1 и/или В7-2 (Егегедтап,

А.5., еї аї. (1987) 9дУІттипої 137, 3260 - 3267; Егеетап, О.9У., ей а). (1989) 9. ІттипоїЇ. 143, 2714 - 2722;

Егеетап, с.)., еї аі). (1991) У. Ехр. Меа. 174, 625 - 631; ЕРгеетап, 0.)., ег аЇ. (1993) Зсіепсе 262, 909 - с 25 911; Агита, М., еї аІ). (1993) Мате 366, 76 - 79; ЕРгеетап, со.)., ег аЇ. (1993) 9). Ехр. Меа. 178, 2185 - Ге) 2192). В7-1 и В7-2 также являются лигандами для другой молекуль - СТІ А4, присутствующей на поверхностях активированньмх Т-клеток, хотя роль СТІ А4 при костимуляции неясна.

Доставка к Т-клетке антиген-специфического сигнала костимуляторньмм сигналом ведет к активности

Т-клеток, которая может включать как пролиферацию Т-клеток, так и секрецию цитокинов. В противоположность сч 30 зтому, полагают, что доставка к Т-клетке антиген-специфичного сигнала в отсутствий костимуляторного сигнала д) индуцирует в Т-клетке состояние иммунологической неотвечаемости или анергии, индуцируя, таким образом, антиген-специфическую толерантность в Т-клетке. 09

Взаиймодействие между Т-клетками и В-клетками играет центральную роль в иммунньїх реакциях. Индукция «І гуморального иммунитета Кк тимус-зависимьім антигенам требует "помощи", обеспечиваемой

Зо Т-клетками-хелперами (далее - Ти-клетками). З

Хотя некоторая помощь, обеспеченная В-лимфоцитами, передаєется растворимьми молекулами, вьіделяемьми Ти-клетками (например, лимфокинами, такими как І! -4 и ІІ -5), активация В-клеток также требует контакт-зависимого взаймодействия между В-клетками и Ти-клетками. См. Нігонаїйа еї аї/., у. Іттипої,, 140:3736 - « 3744 (1988); Вапекф еї аїЇ.,, 9У. Іттипої, 143:1745 - 1754 (1989). Зто указьшвает, что активация В-клеток З7З 70 включает обязательноеє взаймодействие молекул клеточной поверхности В-клеток и Тп-клеток. Следовательно, с молекула (молекуль) на Т-клетке опосредуют контакт-зависимье хелпер-зффекторнье функции Т-клетки. "з Контакт-зависимое взаймодействие между молекулами на В-клетках и Т-клетках также поддерживает наблюдение, что изолированнье плазматические мембраньі активированньїх Т-клеток могут обеспечивать хеллернье функции, необходимье для активации В-клеток. См. Вгіап, Ргос. Май Асай. Зсі. ОБА, 85:564 - 568 (1988); Нодокіп еї аї., У. Іттипої, 145:2025 - 2034 (1990); Моеге еї а/., 9У. Іттипо/!., 146:1118 - 1124 (1991). т Молекула СО40 идентифицирована на поверхностях незрельїх и зрельїх В-лимфоцитов, и при перекрестном т» сшиваниий антителами индуцирует пролиферацию В-клеток. См. МайПМе еї аї., Еиг. У. Іттипої., 19:1463 - 1467 (1989); Согдоп еї аї., У. Іттипої, 140:1425 - 1430 (1988); Сгибрег еї аї., 9У. Іттипої, 142:4144 - 4152 (1989). со Молекуль! СЮО40 клонировань и охарактеризовань. См. З(атепкоміс еї. аі., ЕМВО .., 8:1403 - 1410 (1989). Лиганд (Се) 50 для СО40 - др39 (назьіваемьій также СО40-лигандом или СО40І) - также клонирован молекулярно и охарактеризован. См. Агтіаде еї аї., Майшге, 357:80 - 82 (1992); І едегптап еї аї., У. Ехр. Мейд., 175:1091 - їз 1101 (1992); НоПепрацуй ей аі., ЕМВО 3). 11: 4313 - 4319 (1992). Белок одр39 озкспрессируется на активированньїх, а не на покоящихся, СО4 "-Тр-клетках. См. Зргіддз еї аї., У. Ехр. Мей., 176: 1543 - 1550 (1992); Гапе еї аїЇ., Еицг. У. Іттипої, 22:2573 - 2578 (1992); Коу еї аї., 9. Іттипої., 151: 1 - 14 (1993).

Клетки, трансфицированньсе геном дрзе, и зкспрессирующие белок др39 на своей поверхности, могут вьізьівать (Ф) В-клеточную пролиферацию и, вместе с другими стимуляторньми сигналами, могут индуцировать з продуцирование антител. См. Апгті(аде еї а!., Маїшге, 357:80 - 82 (1992); НоПепрацоп еї аІЇ., ЕМВО .., 11:4313 - 4319 (1992). во Молекуль! клеточной поверхности, которне опосредуют контакт-зависимье хелпер-зффекторнье функции

Т-клеток, важньї для индуцирования иммунньїх реакций, которье требуют помощи Т-клеток. Например, взаймодействие др39 на Т-клетках с СО40 на В-клетках играет центральную роль при активации реакций

В-клеток на антиген. Настоящее изобретение основьіваєтся, по крайней мере частично, на открьітии, что молекульї клеточной поверхности, которье опосредуют контакт-зависимье хелпер-зффекторнье функции в Т-клеток, также играют критическую роль в реакции Т-клеток к аллоантигенам. В частности, обнаружено, что при определенньїх условиях вмешательство во взаимодействии др39 с лигандом на аллогенной клетке, которая представляет аллоантигеньі Т-клетке, может индуцировать толерантность в Т-клетке. Предпочтительно, аллогенная клетка, которая представляет аллоантигень! Т-клетке, требует взаимодействия между лигандом 9рЗО на Т-клетке, чтобьі иметь возможность обеспечить сигнальі, необходимье для активации Т-клетки.

Ингибирование взаймодействия лиганда ор39 на аллогенной клетке с одр39 на Т-клетке предотвращаєт активацию Т-клеток и индуцирует, скорее, аллоантиген-специфическую толерантность Т-клеток. Индуцирована

Т-клеточной толерантности к аллоантигенам, как описьівается в настоящем изобретении, может использоваться в качестве препаративной схемь! для пересадки ткани или органа.

Соответственно, способь! настоящего изобретения в особенности пригоднь! для индуцировать Т-клеточной 7/0 толерантности к донорской ткани или органу у реципиента ткани или органа. Упомянутье способь! включают введение реципиенту трансплантата 1) аллогенньїх или ксеногенньїх клеток, которне зкспрессируют по крайней мере один донорский антиген, и которье имеют лиганд на клеточной поверхности, которьій взаимодействует с рецептором на поверхности реципиентной Т-клетки, которая опосредуеєет контакт-зависимье хелпер-зффекторнье функции; 2) антагониста молекульь на поверхности реципиентной Т-клетки, которая 7/5 опосредует контакт-зависимье хелпер-зффекторнье функции. Антагонист ингибирует взаймодействие между молекулой на Т-клетке и ее лигандом на аллогенной или ксеногенной клетке.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения рецептор на поверхности Т-клетки, которая опосредует контакт-зависимье хелпер-зффекторнье функции, представляет собой др39. При таком варианте осуществления изобретения антагонист представляет собой молекулу, которая ингибирует взаймодействие 2о 9рЗО на Т-клетке с лигандом орЗ9 на аллогенной или ксеногенной клетке. Особенно предпочтительньй антагонист др39 представляет собой антитело против др39. В другом варианте осуществления настоящего изобретения антагонист др39 представляет собой растворимую форму лиганда одрз39, например, растворимьй

СО40. Аллогеннье или ксеногеннье клетки, которье вводятся реципиенту, представляют собой, предпочтительно, лимфоидньсе клетки, например, В-клетки. Альтернативно, аллогеннье или ксеногеннье клетки с г представляют собой малье покоящиеся В-клетки. Аллогеннье или ксеногеннье клетки и антагонист обьічно вводят реципиенту перед пересадкой реципиенту ткани или органа. Например, лимфоидньсе клетки (например, і)

В-клетки) от донора ткани или органа вводят реципиенту, вместе с антагонистом, до трансплантации реципиенту ткани или органа.

Способьї настоящего изобретения могут применяться, например, для индуцирования Т-клеточной с зо топерантности к пересаженньм тканям или органам, таким как печень, почка, сердце, легкое, кожа, мьішца, нервная ткань, желудок и кишки. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения б» трансплантированная ткань содержит панкреатические островки. Соответственно, изобретение относится к со способу лечения диабета, включающему введение пациенту, нуждающемуся в таком лечениий, 1) аллогенньїх или ксеногенньїх клеток, которье зкспрессируют донорские антигень/; 2) антагониста рецептора на поверхности - зв Т-клеток реципиента, которье опосредуют контакт-зависимье хелпер-зффекторнье функции, такого как о «у антагонист др39 (например, антитело против дрЗ9); и 3) донорских панкреатических островков.

Краткое описание рисунков

На Фиг. 1 оприводится графическое )изображение осрока жизнеспособности аллотрансплантатов панкреатических островков, пересаженньїх мьішам с "химическим" диабетом, которьім предварительно ввели « одно антитело против др39, или предварительно ввели одни нефракционированнье или фракционированньюе З) с аллогеннье клетки селезенки.

Фиг. 2А и Фиг. 2Б являются графическими изображениями срока жизнеспособности трансплантатов ;» панкреатических островков, пересаженньх мьшам с "химическим" диабетом, которье предварительно получали однократную дозу фракционированньїх аллогенньїх клеток селезенки вместе с лечением антителом против др (МК) либо в течение 2 недель (Фиг. 2А), либо в течение 7 недель (Фиг. 2Б), при зтом срок ї5» жизнеспособности определяют по снижению концентрации глюкозьії в плазме. Каждая кривая представляет результатьі, полученнье для отдельной мьіши. Незаштрихованнье значки относятся к реципиентам, у которьх о островковье аллотрансплантатьь самопроизвольно переставали действовать. Заштрихованнье значки о относятся к мьішам, у которьїх трансплантатьї функционировали при окончаний зксперимента.

На Фигурах ЗА, ЗБ и ЗВ изображаются профили проточной цитометрии при окрашиваний активированньмх в ік течение 6 часов человеческих лимфоцитов периферической крови с одним из СО409 (Фиг. ЗА), тАБ (монокл.

Ге антитело) 409-8 (Фиг. ЗБ) или тАбБ 409-9 (Фиг. ЗВ).

На Фигурах 4А, 4В и 48 изображаются профили проточной цитометрии при окрашиваний активированньх в течение 6 часов человеческих лимфоцитов периферической крови, вьіращенньїх в присутствии циклопорина А, в окрашенньх одним из тАбБ 409-8 (Фиг. 4А), тАБ 409-9 (Фиг. 4Б) или СО4019 (Фиг. 48).

На Фигурах 5А и 5Б изображаются профили проточной цитометрии при окрашиваний активированньх в

Ф) течение б часов человеческих лимфоцитов периферической крови СО40І9Ов присутствий немеченного тАБ ка 409-8 (Фиг. БА) или немеченного тАбБ 409-9 (Фиг. 5Б).

На Фиг. 6 приводятся графики ингибирования пролиферации человеческих В-клеток растворимьім др39 и во І--4, когда клетки вьиіращиваются в присутствии моноклональньх антител 409-8, 409-9, 24 - 31, 24 - 43, 89 - 76 или 89 - 79 к человеческому арз9.

На Фиг. 7 графически изображается ингибирование реакции алло-специфической смешанной культурь лимфоцитов, когда клетки виіращиваются в присутствий моноклональньїх антител 24 - 31 или 89 - 79 против человеческого дро. 65 Настоящее изобретение относится к способам индуцирова-ния іп мімо Т-клеточной толерантности к донорскому трансплантату ткани или органа у реципиента трансплантата. Упомянутье способь! включают введение реципиенту трансплантат 1) аллогенньїх или ксеногенньїх клеток, которье зкспрессируют донорские антигеньї, и которне имеют лиганд на клеточной поверхности, которьій взаймодействует с рецептором на поверхности реципиентной Т-клетки, которая опосредует контакт-зависимье хелпер-зффекторнье функции; 2) антагониста рецептора на поверхности Т-клетки, которьій ингибирует взаймодействие лиганда и рецептора. Как здесь установлено, термин "реципиент" относится к субьекту, которому должнь! пересаживаться ткань или орган, пересаживаются ткань или орган или пересажень! ткань или орган. Как здесь установлено, "алло-генньре" клетки получают от различньїх индивидуумов того же вида, что и реципиент, и они зкспрессируют "аллоантигеньі", которне отличаются от антигенов, зкспрессированньїх клетками реципиента. "Ксеногенньре" 7/0 клетки получают от видов, иньх, чем реципиент, и они зкспрессируют "ксеноантигень", которне отличаются от антигенов, зкспрессированньїх клетками реципиента. Как здесь установлено, термин "донорские антигень" относится ок антигенам, зкспрессированньм донорской отканью или донорским органом, которье трансплантируют реципиенту. Донорские антигеньй могут бьть аллоантигенами или ксеноантигенами, в зависимости от источника трансплантата. Аллогеннье или ксеногеннье клетки, введеннье реципиенту как часть /5 схемь! вьізьівания толерантности, зкспрессируют донорские антигень, т.е., зекспрессируют некоторье или все те же антигеньі, присутствующие на донорской ткани или органе, которне трансплантируют. Аллогенньюе или ксеногеннье клетки получают, предпочтительно, от донора тканевого или органного трансплантата, но их можно получать из одного или нескольких источников, имеющих с донором общие антигеннье детерминанть!.

Кроме аллогенньїх и ксеногенньїх клеток, реципиенту в качестве части схемь! вьізьівания толерантности го вводят антагонист молекульй на Т-клетках, которая опосредует контакт-зависимье хелпер-зффекторнье функции. Как установлено здесь, молекула или рецептор, которьй опосредует контакт-зависимье хелпер-зффекторнье функции, представляет собой молекулу или рецептор, которьій зкспрессируются на

Ти-клетке и взаймодействует с лигандом на зффекторной клетке (напимер, на В-клетке), при зтом взаймодействие молекуль! с ее лигандом является необходимь!м для генерации реакции зффекторной клетки с оре (т.е., активации В-клетки). Теперь обнаружено, что, помимо вовлечения в реакции зффекторньх клеток, такая молекула или рецептор вовлекается в реакцию Т-клетки к антигену. Предпочтительно, молекула на Т-клетке, і) которая опосредуеєет контакт-зависимую хелпер-зффекторную функцию, представляет собой орзо.

Соответственно, в предпочтительньїх вариантах осуществления изобретения, способь! изобретения включают введение реципиенту трансплантата аллогенньїх или ксеногенньїх клеток и антагониста др39. Активация с зо реципиента Т-клеток аллогенньми и ксеногенньми клетками включаеєет взаймодействие между орЗ3У на реципиентньїх Т-клетках и дрЗО на аллогенньїх или ксеногенньїх клетках. При ингибировании зтого б» взаймодействия антагонистом орЗО Т-клетки реципиента не активируются донорскими антигенами, со зкспрессираванньми аллогенньми и ксеногенкьіми клетками, но скорее в них вьізьівается толерантность к донорским антигенам. Индукция толерантности к донорским антигенам у реципиента создает возможность, - зв таким образом, для успешной трансплантации донорской ткани или органа без иммуноопосредованного «г отторжения донорского трансплантата.

Различньсе аспектьї настоящего изобретения подробнее описьваются в следующих разделах.

І. Антагонистьі др39

В соответствии со способами изобретения, реципиенту вводят антагонист др39, чтобь! воспрепятствовать « взаймодействию ор39 на Т-клетках реципиента с лигандом 9рЗ9 на аллогенньх и ксеногенньїх клетках, таких как 7-3) с В-клетки, введенньїх реципиенту. Агонист 9др39 определяется как молекула, которая препятствует зтому

Й взаймодействию, Агонист 9р39 может представлять собой антитело, направленное против ор39 (например, а моноклональное антитело против др39), фрагмент или производное антитела, направленного против др39 (например, фрагменть! Раб или К(аб)2, химернье антитела или очеловеченнье антитела) растворимье формь! лиганда др39 (например, растворимьій СО40), растворимье формьі! слитого белка лиганда одр39 (например, їх растворимьй СО401д), или фармацевтические средства, которне разрушают или препятствуют взаймодействию арзе - СО40. о А. Антитела о Млекопитающее (например, мьішь, хомяк или кролик) может бьїть иммунизировано иммуногенной формой белка др39 или фрагментом белка (например, пептидньім фрагментом), которая вніявляет образование антител і, у млекопитающего. Клетка, которая зкспрессирует 9р39 на своей поверхности, может также использоваться в

Із качестве иммуногена. Альтернативнье иммуногеньї включают очищенньій белок 9039 или фрагменть! белка.

Очистку 9р39 от зкспрессирующей одр3О клетки можно осуществить стандартньми методами очистки. Кроме того, в клетке-хозяине может бьть зкспрессирована кКДНК доро (Агтійаде еї аїЇ., Маїшге, 357:80 - 82 (1992); дв Іедегтап еї аї., У.Ехр. Мей., 175: 1091 - 1101 (1992); НоПепрацоп еї аі., ЕМВО 3., 11:4313 - 4319 (1992), например, в линии бактериальньїх клеток или клеток млекопитающего, и др39 очищают от клеточньїх культур (Ф, стандартньми методами. Альтернативно, с использованием известньїх методов (например, Б-тос или Т-рос ка химического синтеза) на основе аминокислотной последовательности др39 (описанной в Агтіїаде еї аї., Майиге, 357:80 - 82 (1992); І едеппап еї аї., У. Ехр. Мей., 175:1091 - 1101 (1992); НоПепрацой еї аІ., ЕМВО 3., 11: бо 4313 - 4319 (1992)) могут бьїть синтезированьі пептидьі др39. Методьі! предоставления иммуногенности белку включают коньюгирование с носителями или другие технические приемь!, хорошо известнье в технике.

Например, белок может бьть введен в присутствий адьюванта. Развитие иммунизации может бьть проконтролировано путем обнаружения титров антител в плазме или сьіворотке. Для оценки уровней антител могут использоваться стандартнье ЕГІЗА или другие методьь иммуноанализа с иммуногеном в качестве б5 антигена.

После иммунизации могут бьїіть получень антисьіворотки, и, если желательно, из сьівороток можно вьіделить поликлональнье антитела. Для получения моноклональньх антител продуцирующие антитела клетки (лимфоцить) могут бьть собрань у иммунизированного животного и слитьі с миеломньми клетками стандартньмми методами слияния соматических клеток, при зтом зти клетки иммортализируются, и образуются

Кклетки гибридомь!. Такие методь! хорошо известнь! в технике. Например, гибридомная техника первоначально разработанная Копіег и Міївівїп (Маїиге (1975) 256:495 - 497), а также разработань! другие технические приемьі, такие как гибридомньй метод с человеческими В-клетками (Кораг еї аїЇ., ІттипоЇї. Тодау (1983) 4:72),

ЕВМ-гибридомньіїй способ для продуцирования человеческих моноклональньїхх антител (Соїйе еї аї., Мопосіопаї

Апіїродіез іп Сапсег Тпегару (1985) (Аеп МК. Віївв, Іпс., радез 77 - 96), и скрининг библиотек химерньх /о антител (Ниве еї аї., Зсіепсе (1989) 246: 1275). Клетки гибридом для получения антител, специфически реактивньїх к белку или пептиду, могут бьіть скринированьї иммунохимическим способом, и моноклональнье тела вьіделень.

Используемьй здесь термин "антитело" предполагается и для обозначения его фрагментов,. которье являются специфически реактивньми в отношений белка др39 или его пептида или слитного белка одрзо. 7/5 Антитела могут бьіть фрагментированьї с использованием известньїх методов, и фрагменть! скринируют для применения таким же способом, какой описан вьіше для цельїх антител. Например, фрагменть! К(аб)2 могут бьїть генерированьі обработкой антител пепсином. Получающийся в результате фрагмент К(аб)2 может бьть обработан для восстановления дисульфидньх мостиков с ообразованием фрагментов Бар. Также предполагается, что антитела в настоящем изобретений включают биспецифические и химернье молекульі, имеющие часть анти-ор39.

Когда антитела, продуцированнье в субьектах, не относящихся к человеку, используются для лечения людей, они распознаются, с переменньїм успехом, как инородньсе, и у пациента может бьїіть вьізвана иммунная реакция. Один из подходов для снижения до минимума или устранения зтой проблемь!, которому следует отдать предпочтение при общей иммуносупрессии, состоит в продуцирований производньїх химерньх антител, с оре т.е. молекул антител, которне комбинируют вариабельную область животного, не относящегося к человеку, и человеческую константную область. Молекульь химерньїх антител могут включать, например, і) антиген-связьивающий домен из антитела мьіши, крьісьі! или другого вида, и человеческие константнье области.

Описано множество подходов к получению химерньїх антител, и они могут применяться для получения химерньїх антител, содержащих вариабельную область иммуноглобулина, которая распознаєет одр39. См., с зо Например, Моггтізоп еї аі., Ргос. Май. Асай. Зсі 0О.5.А. 81:6851 (1985); Такеда еї аЇ., Маїшге 314:452 (1985),

СаршШу еї аІ., патент США Мо 4 816 567; Возз еї аІ., патент США Мо 4 816 397; Тападиспі еї аІ., публикация Ме) европейского патента ЕР 1 711 496; публикация европейского патента 0 173 494, патент Соединенного со королевства ОВ 2 177 0968. Ожидается, что такие химернье антитела будут у человека менее иммуногенньми, чем соответствующие нехимернье антитела. -

Для целей лечения людей моноклональнье или химернье антитела, специфически реакционноспособнье с «г белком др39 или пептидом, затем могут бьіть очеловеченьі посредством продуцирования химер человеческой вариабельной области, в которьїх части вариабельньїх областей, особенно, консервативнье остовнье области антиген-связьвающего домена, имеют человеческое происхождение, и только гипервариабельнье участки имеют нечеловеческое происхождение. Такие измененнье иммуноглобулиновье молекуль могут бьть « получень любьм из нескольких методов, известньїх в технике (см., например, ТепоПеї а!., Ргос. Май. Асад. Зсі. пт») с О.5.А., 80:7308 - 7312 (1983); Когрог еї аіІ., ІттипоЇоду Тодау, 4:7279 (1983); ОІвзоп еї аіЇ., Мей. Епгутої, 92:3 - 16 (1982)), и, предпочтительно, их получают по рекомендациям публикациий РСТ ВОЙИСО92/06193 или ЕР 0 ;» 239 400. Очеловеченнье антитела могут бьіть произведеньі коммерчески, например, Зсоїдеп І ітйей, 2 НоїПу

Коад, Тміскепспат, Мідааіезех, Великобритания.

Другой способ генерирования специфических антител, или фрагментов антител, реактивньїх против белка ї5» или пептида одр39, состоит в скринирсваниий библиотек зкспрессий кодирующих иммуноголбулиновьїх генов или их частей, зкспрессированньїх в бактериях, белком или пептидом 9р39. Например, полньіе Рар-фрагментиь, ве МЖН-области и ЕМ-области могут бьїть зкспрессированьі в бактериях с использованием фаговьїх библиотек

Го! зкспрессии. См., например, УМага еї аїЇ., Майшге, 341:544 - 546 (1989); Низе еї аї., Зсіепсе, 246:1275 - 1281 (1989); и МеСайепу еї а!., Майиге, 348:552 - 554 (1990). Скринирование. таких библиотек, например пептидом ік о9рЗО, может идентифицировать фрагментьї иммуноглобулина, реагирующие с др39. Альтернативно, для

Ге продуцирования антител или их фрагментов может бьіть использована ЗСІО-пи-мьішь (доступньї от сепрпагт)і).

Методология продуцирования моноклональньїх антител, направленньїх против др39, включая человеческий 9рЗО и мьішиньй 9р39, и моноклинальньїх антител, подходящих для применения в способах настоящего МЗзобретения, описьввается подробнее в примере 2.

Моноклональнье антитела против человеческого одрЗзО по настоящему изобретению являются (Ф, предпочтительньми для использования при индуцированиий толерантности антигенспецифических Т-клеток. ка Предпочтительньми антителами являются моноклональнье антитела ЗЕ4, 2Н5, 2Н8, 409-8, 409-9, 24 - 31, 24 - 43, 89 - 76 и 89 - 79, описаннье в примере 2. Особенно предпочтительньмми антителами являются бо Моноклональньсе антитела 89 - 75 и 24 - 31. Гибридомьі 89 - 76 и 24 - 31, продуцирующие антитела 89 - 75 и 24 - 31, соответственно, депонированьї, по условиям Будапештсткого договора, в Американской коллекции типовьїх культур, РагкІам/п Огіме, Роквилл, Мзриленд, 2 сентября 1994. Гибридоме 89 - 76 присвоен инвентарньій номер

АТСС НВІ11713, и гибридоме 24 - 31 присвоен инвентарньій номер АТСС НВ11712. Антитела 24 - 31 и 89 - 76 являются изотипом ІДдОІ. 65 В другом варианте осуществления изобретения для использования в способах настоящего изобретения тАБ против человеческого др39 связьівает зпитоп, распознавемь!й моноклональньїм антителом, вьібраннь!м из группьі, состоящей из ЗЕ4, 2Н5, 2Нв8, 409-8, 409-9, 24 - 31, 89 - 76 и 89 - 79. Предпочтительнее, тАб против человеческого ерзЗО связьшваеєт зпитоп, распознаваемьй моноклональньм оантителом 24 - 31 или моноклональньїм антителом 89 - 76. Способность тАБ связьівать зпитоп, указанньій любьім из вьішеупомянутьх антител, может бьіть определена стандартньми проверками перекрестной конкуренции.

Например, антитело, которое связьіваєт те же зпитопьї, которне узнань!і тАБ 24 - 31, будет конкурировать со связьиванием меченного 24 - 31 с активированньмми Т-клетками, в то время как антитело, которое связьівает другой, не узнанньй тАр 24 - 31 зпитоп, не будет конкурировать при связьшвшаниий меченного 24 - 31 с активированньїми Т-клетками. 70 Б. Растворимьсе лигандь для др39

Другие антагонистьі! др39, которне можно вводить для индуцирования толерантности Т-клеток, включают растворимье формьї лиганда др39. Одновалентньій растворимьй лиганд др39, такой как растворимьій СО40, может связьваться с др39, ингибируя, таким образом, взаимодействие д9р39 с СО40 на В-клетках. Термин "растворимьій" указьівает, что лиганд не ассоциируется постоянно с клеточной мембраной. Растворимьїй лиганд 7/5 УрЗО может бьть получен химическим синтезом или, предпочтительно, методом рекомбинантньх ДНК, например, путем зкспрессии только внеклеточного домена лиганда (при отсутствий трансмембранньх и цитоплазматических доменов). Предпочтительньїм растворимь!м лигандом др39 является растворимьй СО40.

Альтернативно, растворимьій лиганд 9039 может находиться в форме слитого белка. Такой слитьй белок содержит по крайней мере часть лиганда др39, присоединенную ко второй молекуле. Например, СО40 может бьїть зкспрессирован в виде слитого белка с иммуноглобулином (т.е., слитьій белок СО40Ід). В одном из вариантов осуществления изобретения продуцируется слитьій белек, содержащий аминокислотнье остатки внеклеточного домена части СО40, связаннье с аминокислотньми остатками последовательности, соответствующей шарнирам СН2 и СНЗ тяжелой цепи иммуноглобулина, т.е., СуЇ, с образованием слитого белка СО401Ід (см., например, І іпвіеу еї аї., (1991) У. Ехр. Мед. 1783: 721 - 730; Сароп еї аї., (1989) Майшге сч ово ЗЗ1:525 - 531; и Сароп, патент США 5 116 964). Слитьй белок может бьіть получен путем химического синтеза, или, предпочтительно, методом рекомбинантньїх ДНК на основе кКДНК СО40 (5іатепкоміс еї а!., ЕМВО .)., 8:1403 (8) - 1410 (1989)).

ІІ. Клетки для индукции антиген-специфической толерантности

Настоящее изобретение основано, по крайней мере частично, на открьтии, что представление с зо аллоантигенов Т-клеткам аллогенньмми клетками в присутствий антагониста 9р39 приводит в результате к

Т-клеточной толерантности к аллоантигенам. Клетки, которне способньі индуцировать толерантность по такому б» механизму, включают клетки, которне представляют антиген и активируют Т-клетки путем взаймодействия с со орЗО (те. для доставки соответствующих сигналов к Т-клетке для активации Т-клеток необходимо взаймодействие между одр39 на Т-клетке и лигандом одрз39 на клетке, представляющей антиген). Ингибирование «

Зз5 вЗаймодействия лиганда на аллогенной или ксеногенной клетке с орЗО на реципиентньх Т-клетках «г предотвращаєт Т-клеточную активацию алло- или ксеноантигенами и, скорее, индуцирует Т-клеточную толерантность к антигенам. Препятствовал: активации Т-клетки Через 9039 может предотвратить индукцию костимуляторньїх молекул на аллогенной или ксеногенной клетке (например, молекул семейства В7 на

В-клетке), и таким образом, клетка доставляет к Т-клетке только антигенньй сигнал в отсутствие « Костимуляторного сигнала, индуцируя, таким образом, толерантность. в с Соответственно, по способам настоящего изобретения реципиенту вводят аллогеннье или ксеногеннье клетки. Аллогенная или ксеногенная клетка способна ГП представить антиген Т-клеткам реципиента, и ;» представляет собой, например, В-лимфоцит - клетку, "профессионально" представляющую антиген (например, моноцит, дендритную клетку, клетку Лагерганса), или другую клетку, которая представляет антиген имунньм

Кклеткам (например, кератиноцит, зндотелиальную клетку, астроцит, фибробласт, олигодендроцит). Более того, ї5» предпочтительно, чтобьї аллогенная или ксеногенная клетка имела пониженную способность стимулировать костимуляторньй сигнал в реципиентньїх Т-клетках. Например, аллогенная или ксеногенная клетка может о утратить зкспрессию, или зкспрессировать только на низком уровне, костимуляторньїх молекул, таких как

Го! белков семейства В7 (например, В7-1 и В7-2). Зкспрессия костимуляторньїх молекул на потенциальньх аллогенньїх или ксеногенньїх клетках, которне используются в способах настоящего изобретения, может бьть і, оценена стандартньіми методами, например, проточной цитометрией, с использованием антител, направленньх

Із против костимуляторньїх молекул.

Предпочтительньми аллогенньми или ксеногенньми клетками для индуцирования Т-клеточной толерантности являются лимфоидньсе клетки, например, лимфоцить! периферической крови или селезеночнье Кклетки. Предпочтительньіми лимфоидньми клетками для индуцирования Т-клеточной толерантности являются

В-клетки. В-клетки могут бьіть вьіделеньі в чистом виде из смешанной популяции клеток (например, клеток (Ф, других типов в периферической крови или селезенке) стандартньмми способами разделения клеток. Например, ка прилипающие клетки можно удалить путем культивирования селезеночньїх клеток в пластиковьхх чашках и извлечения популяции неприлипающих клеток. Т-клетки можно удалить из смешанной популяции клеток путем во обработки антителом против Т-клеток (например, анти-ТНуїЇ. 1 и/или анти-ТНуУїЇ. 2) и комплементом. В одном из вариантов осуществления изобретения в качестве антиген- представляющих клеток используются покоящиеся лимфоиднье клетки, предпочтительно, покоящиеся В-клетки. Покоящиеся лимфоиднье клетки, такие как покоящиеся В-клетки, можно вьіделить методами, известньіми в технике, например, основьіваясь на их малом размере и оплотности. Покоящиеся лимфоиднье о клетки можно вьіделить, например, проточньім 6в5 Ззлютриационньм центрифугированием, как описано в опримере 1. При использований проточного злютриационного центрифугирования популяция мальїх, покоящихся лимфоидньх клеток, очищенная от клеток,

которьіе могут активировать Т-клеточнье реакции, может бьіть получена путем собирания фрации (фракций) при 14 - 19мл/мин, предпочтительно - при 19мл/мин (при 3200об/мин). С другой стороньї, малье покоящиеся лимфоцить! (например, В-клетки) могут бьіть вьіделеньі путем центрифугирования в прерьівистом градиенте плотности, например, при использований градиента фиколла или перколла, и после центрифугирования может бьіть получен слой, содержащий малье покоящиеся лимфоцитьі. Малье покоящиеся В-клетки также можно отличить от активированньїх В-клеток путем проверки, стандартньми методами (например, иммунофлюоресценцией), зкспрессии костимуляторньїх молекул, таких как В7-1 и/или В7-2, на поверхности активированньїх В-клеток. 70 Аллогенкье или ксеногеннке клетки, введенньіе реципиенту, функционируют, по крайней мере частично, как представляющие донорские антигеньь реципиентньм Т-клеткам. Таким образом, клетки зкспрессируют антигеньї, которье также зкспрессируются донорской тканью или органом. Обьічно, зто может осуществляться посредством использования аллогенньх или ксеногенньх клеток, полученньїх от донора тканевого или органного трансплантата. Например, от донора ткани или органа могут бьїть вьіделеньї периферические 7/5 лимфоидньсе клетки, В-клетки или селезеночнье клетки, и использовань! в способах настоящего изобретения.

Альтернативно, аллогеннье или ксеногеннье клетки могут бьіть получень! из источника иного, чем донор ткани или органа, если такие клетки имеют антигеннье детерминанть, общие с тканью или органом донора.

Например, могут использоваться аллогеннье или ксеногенньюе клетки, которье зкспрессируют (по большей части или все) такие же антигеньі главного комплекса гистосовместимости, что и донорская ткань или орган.

Таким образом, могут использоваться аллогеннье или ксенгеннье клетки из источника, которьій является гаплотипом ГКГС, совместимьмм с донором ткани или органа (Например, ближайший родственник донора трансплантата).

І. Введение клеток и антагонистов др39

Т-клеточная толерантность к органному или тканевому трансплантату может бьїть индуцирована путем с ов введения реципиенту трансплантата антагониста 9р3О в сочетаний с аллогенной или ксеногенной клеткой, которье зкспрессируют донорские антигеньї и взаймодействуют с реципиентньми Т-клетками через др39. В і) предпочтительном варианте осуществления изобретения аллогенную или ксеногенную клетку и антагонист др39 вводят реципиенту совместно или одновременно. С другой стороньі), антагонист 9р39 можно вводить до введения аллогенньїх или ксеногенньїх клеток, например, когда антагонист представляет собой антитело с с зо длительньм временем полужизни. В предпочтительном варианте осуществления изобретения антагонист и аллогеннье или ксеногеннье клетки вводят реципиенту перед трансплантацией реципиенту органа или ткани б» (т.е., реципиент -предварительно получает антагонист и клетки). Например, введение аллогенньх и ксеногеяньїх (ду клеток и антагониста может бьіть осуществлено за несколько дней (например, за пять-восемь дней) перед пересадкой ткани или органа. -

Обнаружено, что введение однократной дозьі аллогенньіїх клеток (в сочетании с антагонистом) является «г достаточньм для индукции Т-клеточной толерантности к донорской ткани или органу (см. пример 1). Число вводимьїх клеток, может изменяться в зависимости от типа используемьїх клеток, типа тканевого или органного трансплантата, массьї реципиента, общего состояния реципиента и других переменньмх, известньїх специалисту.

Подходящее число клеток для использования в способе настоящего изобретения может бьіть определено « специалистом в зтой области техники обьічньіми способами (например, как описано в примере 1). Клетки вводят 7-3) с в форме и путем, которне подходят для индукции Т-клеточной толерантности у реципиента. Клетки могут бьіть введень в физиологически приемлемом растворе, таком как забуференньй фосфатом физиологический ;» раствор, или в подобном носителе. Предпочтительно, клетки вводят внутривенно.

Антагонист по изобретению вводят субьекту в биологически совместимой форме, пригодной для фармацевтического введения іп мімо для индуцирования Т-клеточной толерантности. "Биологически їх совместимая форма, пригодная для введения іп мімо" означает форму антагониста, в которой любье токсические зффекть! превешиваются лечебньім действием соединения. Термин "субьект" предполагаєтся для о обозначения живьїх организмов, в которьїх может бьіть вьізвана иммунная реакция, например, млекопитающих. о Примерами субьектов являются люди, собаки, кошки, мьіши, крьісь! и их трансгеннье видьї. Антагонист др39 5р Может вводиться в любой фармакологической форме, необязательно, с фармацевтически приемлемьм і, носителем. Введение терапевтически активного количества антагониста определяется как введение

Із количества, аффективного при дозах и в течение времени, необходимьїх для достижения нужного результата (например, Т-клеточной толерантности). Например, терапевтически активное количество антагониста др39 может изменяться в соответствии с такими факторами, как стадия заболевания, возраст, пол и масса особи, и дв способность антагониста вьізьівать нужную реакцию у особи. Схемь! дозировки могут бьіть скорректировань! для обеспечения оптимального терапевтического ответа. Например., могут вводиться несколько небольших доз (Ф, ежедневно, или доза может бьіть пропорционально снижена, в соответствии с потребностями терапевтической ка ситуации. Как описано в примере 1, для лечения антителом против др39, схема зффективного лечения может включать установление введения антитела перед трансплантацией ткани или органа (например, за пять - бо восемь дней до трансплантации), с последующим повторяющимся введением антитела (например, каждьй второй день) в течение нескольких недель (например, двух - семи недель) после пересадки.

Активное соединение (например, антагонист, такой как антителе) может вводиться обьічньм способом, таким как иньекция (подкожная, внутривенная и т.п.), пероральное введение, ингаляция, трансдермальная аппликация или ректальное введение. В зависимости от способа введения, активное соединение может бьть 65 покрьто материалом для защить! соединения от действия ферментов, кислот и других естественньх условий, которье могут инактивировать соединение. Предпочтительньім способом введения является внутривенная иньекция.

Чтобьї ввести антагонист 9р39 способом иньім, чем парентеральное введение, может понадобиться нанести на антагонист покрьїтие из материала, или ввести зтот материал вместе с антагонистом, которьій предупредит его инактивацию. Например, антагонист может вводиться особи в соответствующем носителе или разбавителе, вводиться вместе с ферментньми ингибиторами или в соответствующем носителе, таком как липосомь!.

Фармацевтически приемлемьми разбавителями являются физиологический раствор и воднье буфернье растворьі. Ферментньми ингибиторами являются ингибитор панкреатического трипсина, диизопропилфосфат (СЕР) и тразилол. Липосомь! включают змульсий "вода в масле в воде", а также обьічнье липосомьі (5ігездап еї /о 81, (1984) 3. Меигоїттипої! 7:27).

Активное соединение также может бьіть введено парентерально или интраперитонеально. Также могут бьіть полученьії дисперсии в глицерине, жидких полизтиленгликолях. и в их смесях, и в маслах. При обьічньх условиях хранения и применения зти препарать! могут содержать консервант для предупреждения развития микроорганизмов.

Фармацевтические композиции, пригодньіе для применения в иньекциях, включают стерильнье воднье растворь! (когда все растворено в воде) или дисперсии и стерильнье порошки для приготовления стерильньх растворов для иньекции или дисперсии для немедленного применения. Во всех случаях композиция должна бьїть стерильной и должна бьїть жидкой в такой степени, чтобьї можно бьіло легко использовать шприц. Она должна бьіть устойчивой в условиях изготовления и хранения, и должна бьіть предохранена от загрязнения 2о Ммикроорганизмами, такими как бактерий или грибь). Носитель должен представлять собой растворитель или дисперсионную среду, содержащую, например, воду, зтанол, полиол (например, глицерин, пропиленгликоль и жидкий полизтиленгликоль, и т.п.), и их подходящие смеси. Подходящая текучесть может поддерживаться, например, с помощью покрьтия, такого как лецитин, путем поддержания требуемого размера частиц в случає дисперсии, и с применением поверхностно-активньїх веществ. Предупреждение действия микроорганизмов с об Может бьть достигнуто с помощью различньїх антибактериальньх и противогрибковьїх средств, например, парабенов, хлорбутанола, фенола, аскорбиновой кислотьї, тимеросоала, и подобньїх средств. Во многих случаях і) предпочтительно включать в композицию изотонические агентьї, например, сахара, многоатомнье спирть, такие как маннит, сорбит, хлорид натрия. Пролонгированное поглощение иньецируемьїх композиций может вьізьшаться включением в композиции средства, которое замедляет абсорбцию, например, моностеарата с зр алюминия или желатина.

Стерильнье иньецируемье композиции можно получить путем включения активного соединения (например, б» антагониста 9др39) в требуемом количестве в соответствующий растворитель, в сочетаний с одним или (3 несколькими ингредиентами, перечисленньми вьше, в соответствии с требованиями, с последующей стерилизацией фильтрацией. Вообще, дисперсии готовят путем введения активного соединения 2 стерильньй - з5 Носитель, которьій содержит основную дисперсионную среду и требуемье другие ингредиенть! из числа «г перечисленньїх вьіше. В случае стерильньїх порошков для приготовления стерильньїх растворов для иньекций предпочтительньми способами получения являются вакуумная сушка и сушка вьімораживанием, которне дают порошок активного ингредиента (например, антагониста) плюс любой дополнительньй желательньй ингредиент из их раствора, предварительно стерилизованного фильтрацией. «

Когда активное соединение соответствующим образом защищено, как описано вьіше, белок можно вводить пт») с орально, например, с инертньм разбавителем или усвояемьм сьедобньм носителем. Используемьй здесь

Й термин "фармацевтически приемлемьй носитель" включает любье растворители, дисперсионнье средь,, а покрьїтия, антибактериальнье и противогрибковье средства, изотонические агентьь и замедлители, и т.п.

Применение таких сред и агентов с фармацевтически активньмми веществами хорошо известнь! в технике. Применение любьх обьічньхх сред или агентов в лекарственньїх композициях рассматривается во всех случаях, ї5» за исключением их несовместимости с активньм соединением. В композиции также могут включаться дополнительнье активнье соединения. о Особенно вьгодно составлять парентеральнье композиции в виде единиц лекарственной формь! для о облегчения введения и равномерности дозировки. Под единицей лекарственной формь! здесь подразумевается физически разделеннье единиць, пригоднье для лечения особей млекопитающих в качестве стандартньх дев; і, причем каждая единица содержит заранее установленное количество активного соединения, рассчитанное на

Із получение нужного лечебного действия, в сочетании с требуемьм фармацевтическим носителем. Определение единиц лекарственной формь! по изобретению диктуются и напрямую зависят от (а) особьїх свойств активного соединения и конкретного терапевтического зффекта, которого нужно достичь, и (б) ограничений, присущих дв технике приготовления составов такого активного соединения для лечения чувствительньх особей.

После или вместе с описанной здесь схемой вьізьшшания толерантности, донорскую ткань или орган (Ф, пересаживают реципиенту трансплантата обьічньмми способами. ка ІМ. Применение способов изобретения

Способьї настоящего изобретения могут использоваться в самьїх разньїх ситуациях при пересадке ткани и бор органов. Упомянутье способь! могут применяться для индуцирования Т-клеточной толерантности у реципиента трансплантата ткани или органа, такого как печень, почка, сердце, легкое, кожа, мьішца, нервная ткань, желудок и кишки. Таким образом, способь! настоящего изобретения могут применяться при лечении заболеваний или состояний, которьіе влекут за собой пересадку ткани или органа (например, пересадка печени при лечений гиперхолестеринемии, пересадка мьшечньїх клеток при лечений мьшечной дистрофии, пересадка нервней б5 ткани при лечений болезни Юнтингтона или болезни Паркинсока, и т.п.) В предпочтительном варианте осуществления изобретения трансплантированная ткань содержит панкреатические островки. Соответственно,

изобретение касается способа лечения диабета посредством трансплантации клеток панкреатических островков. Упомянутьій способ включает введение субьекту, нуждающемуся в таком лечении, 1) аллогенньїх или ксеногенньїх клеток, которье зкспрессируют донорские антигень, 2) антагониста молекуль,, зкспрессированной на Т-клетках реципиента, которая опосредует контакт-зависимую хелпер-зффекторную функцию, такого как антагонист др39 (например, антитела против одрЗ39), и 3) донорских клеток панкреатических островков. Предпочтительно, аллогеннье или ксеногеннье клетки и антагонист вводят реципиенту перед введением ему панкреатических островков.

Настоящее изобретение такие иллюстрируется следующими далее примерами, которье не следует /о рассматривать, как ограничивающие. Все ссьілки, патенть! и опубликованньсе заявки на патенть, цитируемье в настоящей заявке, включаются в нее в качестве ссьлок.

Пример 1. Индукция толерантности к аллотрансплантатам панкреатических островков посредством введения реципиенту аллогенньх клеток и анти-39

В настоящее время установлено, что аллотрансплантация зависит от общей иммуносупресии, которая /5 неспецифически отсекает иммукозффекторнье функции. Однако, иммуносупрессивнье фармацевтические препаратьії могут вьізвать значительнье побочнье зффекть. о Кроме того, такой подход страдает аллотрансплантация островков Лангерханса для лечения диабета (см., например, Кобегізоп, К.Р, (1992) М. Епаї.

У. Мед. 227, 1861). Терапия с антителами, направленньми против Т-клеток, может дать возможность для успешной аллотрансплантации островков грьізунам, но такой подход дает слишком одинаковье результать! при общей иммунссупрессии (Сагрепієг, С.В. (1990). М. ЕпоЇ. Мей. 322, 1224; КоаЖ, У.Н., ей аї. (1992)

Тгапзріапіайоп 54, 1093; Канап, В.О. (1992) Сит. Оріп. Іттипої. 4, 553). В зтом примере толерантность к островковьім трансплантатам индуцируется у реципиента трансплантата посредством манипулирования презентацией аллоантигена Т-клеткам с целью предотвращения их активации. Срок клеток жизнеспособности аллотрансплантатов у мьішей С57ВІ/6 (Н-22У) с "химическим" диабетом проверяют, используя методологию, Га описанную ниже.

Индукция диабета і)

Самцов мьшей С57ВІ/6.) (Н-22) приводят в состояние диабета посредством внутривенного введения стрептозотоцина (14Омг/кг). Постоянньій диабет подтверждаєтся демонстрацией концентрации глюкозь! в плазме, » 400Омг/мл, в трех случаях в течение одной недели. сем

Фракционирование аллогенньїх селезеночньїх клеток

Донорские аллогеннье клетки для предварительного введення реципиентам трансплантатов получают от Ф гибридньїх животньх (С57ХВАЇ В/с) (Н-229)є), для предотвращения реакции "трансплантат против хозяина". г)

Чтобьі вьіделить малье лимфоцитнье клетки, суспензий селезеночньїх клеток от 8-недельньїх самок мьішей « (С57ХВАЇ В/с)Еі очищают от зритроцитов и затем фракционируют по размеру посредством злютрации, как описано в Топу Н.Р., аї аі. (1985) у. Ехр. Мей. 161, 223; и в Совзеїїп Е.)., еї аї. (1988) У. Іттіпої 140. 1408. Вкратце, малье лимфоцить! вьбіделяют посредством проточного здютриацинного центрифугирования, используя, например, центрифугу модели 9-68 (Весктап Іпвігитепів, Раю А СА). Приблизительно 1 - 5 х 1089 клеток в мл культурной средьі или в уравновешенном долевом растворе с 1,596 фетальной бьічьей сьіворотки « обрабатьвают дезоксирибонуклеазой, помещают в злютрационную камеру при исходной скорости противотока 13,Бмл/мин, и вращают при 47С с постоянной скоростью 3200об/мин. Фракция мальх клеток с очень т с незначительной примесью больших клеток злюируется, как правило, при 14 - 19мл/мин, хотя точная скорость "з потока может зависеть от средь, в которой суопендируются клетки. В зкспериментах, описанньїх здесь, " фракцию мальїх клеток собирают при 19мл/мин (при 3200об/мин). Зта фракция полностью очищена, по данньім о вспомогательной клеточной функции устойчивости к излучению (З00Орад); при анализа с Т-клеточньіми линиями, специфическими либо для кроличьего ІДС и Н2 З (СОСЗ5), либо для аллореактивньх к Н2 (010.54). те Малье клетки и нефракционированньсе клетки дваждь! промьіївают в безвьівороточной среде перед иньекцией в «г» хвостовую вену реципиєнтам аллотрансплантатов. Получают приблизительно 40 - 100х105 нефракционированньх селезеночньїх клеток (С57ХВАЇ В/с)Е(Н-229) или 40 - 100х109 злютриированньїх мальх со селезеночньїх клеток (С57ХВАЇ В/ОЕ 4 (Н-2519), се) 20 Предварительная обработка реципиентов трансплантатов "з Реципиентам трансплантатов предварительно вводят либо нефракционированнье аллогеннье селезеночньюе клетки (С57ХВАЇ В/ОБ(Н-229), либо злютриированную "фракцию 19" селезеночньїх клеток малого диаметра, которье очищень от активности АПК (вьіделеньі так, как описано вьіше), либо Моноклональное антитело против 9рзЗо (МК, см, пример 2, опьїт 2); либо комбинацию аллогенньїх клеток и антитела против др39. Клетки фракции 19 проверяют при двух различньїх интервалах доз - при малой (Ф) дозировке в 40 - 44х105 клеток или при вьісокой дозе - 77 - 88х105 клеток. Контрольньїм животньім не вводят ка ни аллогенньюе клетки, ни антитело. Аллогеннье клетки вводят реципиентам трансплантата посредством иньекции в хвостовую вену за пять - восемь суток до трансплантации островкового трансплантата. Антитело во МАК1 вводят при дозе 250мкг/мьішь дваждь в неделю, начиная за 7 дней до трансплантации островков и продолжая в течение 2 - 7 недель или до неблагоприятного исхода трансплантации. Первую иньекцию антитела обьічно дают в тот же день, что и первую иньекцию аллогенньїх селезеночньх клеток.

Трансплантация островкового трансплантата

Аллогеннье островки ВАЇ В/с(Н-29) вьіделяют модифицированньім способом коллагеназного переваривания 65 (Сошіер, Р.А., еї аі(1990) Оіареїв 39, 643). Островки при дозе 30 островков на г массь! тела имплантируют в субренальную капсулу реципиентной мьши (С5781/6У (Н-22)) сразу же после вьіделения. Срок жизнеспособности трансплантата определяют по сохранению концентрации глюкозьі в плазме на уровне « 200мг/мл.

Результать

В первой серии зкспериментов реципиентам островковьїх трансплантатов предварительно вводили либо одни аллогеннье селезеночнье клетки, либо одно антитело против дрі9. Как видно на фиг. 1, при отсутствий предварительно введенньїх селезеночньїх клеток, все островковне трансплантать! отторгаются в пределах 13 суток после пересадки (9 «з 2сут; интервал 5 - 1Зсут. М - 23). Недостаточньій срок жизнеспособности островков также наблюдаєтся у животньїх, которьм вводили только нефракционированнье селезеночнье клетки, 70 содержащие нормальную активность АПК (6 ж Зсут; интервал 4 - 12сут; М :- 7), или низкие дозь (40 - 44х105 клеток) фракции 19, очищенньх от АПК, селезеночньїх клеток (7 - Зсут; интервал З - 14сут, М - 16). Напротив, иньекция более вьісокой дозьі фракции 19, очищеннье от АПК, мальх спленоцитов (75 - 88х10 5 клеток) продлеваєт срок жизнеспособности аллотрансплантатов (19 х 1Осут; интервал 7 - 40сут; М - 16). Зтот зффект продолжительности срока жизнеспособности трансплантата статистически довольно значителен (Езвб - 75. 17,2, р х 0,001, при сравнениий с группами, не получавшими ничего, получавшими нефракционированнье селезеночнье клетки или меньшую дозу селезеночньх клеток фракции 19), но не бьл постоянньм.

Протяженньій, но ограниченньй срок жизнеспособности аллогенньїх островков у реципиентов с диабетом, получивших малье клетки фракции 19, очищенной от АПК, приводит к мьісли, что одни зти клетки не могут поддерживать срок жизнеспособности трансплантата. Дополнительньм группам реципиентов трансплантатов

Ввели 77 - 88х1059 клеток фракции 20. Зту фракцию также, в подавляющем большинстве, составляют малье лимфоцить, но их популяция отличается от популяции фракции 19 тем, что содержит доступную измерению функцию АПК. Реципиенть зтих клеток (М - 6) бьістро отторгают свои трансплантать! (среднее - 8,5сут; интервал 6 - 12). Другой группе реципиентов трансплантатов вводили только моноклональное антитело против ор39 - МК. Фиг. 1 показьіваєт, что островковье аллотрансплантать! вьіходят из строя в пределах 15 дней у 7/11 с

Мьішей, получивших только 9р39 тАбБ. Остальнье четьіре мьіши имели фукционирующие трансплантать! при о завершений зксперимента на 43 сутки. Результать! показьівают, что введение реципиенту одного антитела против др39 МК1 может продлить срок жизнеспособности островкового трансплантата (среднее - 20 - 19сут; интервал З-неопредел., М - 5). Степень пролонгации статистически подобна степени, достигнутой с применением более вьісокой дозьі одних селезеночньїх клеток фракции 19, и существенно вьіше степени, С достигнутой в трех других группах (р « 0,05).

Ряд зкспериментов, описанньх вьіше, показьваєт, что одно введение вьісоких доз фракции 19 селезеночньх Ф клеток, очищенньїх от АПК, или анти-др39 тАБр может увеличить срок жизнеспособности трансплантатов с панкреатических островков при сравнений с отсутствием такого введения. Однако, любая обработка только одним препаратом не является зффективной при индуцировании у реципиента длительной толерантности к ч островковьім трансплантатам. Обнаружено, что комбинированное введение автогенньіїх селезеночньїх клетоки ч«ФЕ анти-др39 является более зффективнь!м, чем введение одного каждого реагента. Результата приводятся на фиг. 2, при зтом каждая кривая представляет даннье для отдельной мьіши. Незаштрихованнье значки относятся к реципиентам, у которьїх трансплантать! разрушается самопроизвольно. Заштрихованнье значки « относятся к мьішам, у которьїх островковніе трансплантатьї функционировали при окончаний зксперимента. Фиг. 2 показьвваєт, что неопределенньй срок жизнеспособности достигаєтся у всех животньїх, получавших в течениє /-- с 7 недель анти-др39 тАБ и однократную иньекцию фракции 19 - селезеночньїх клеток, очищенньх от АПК (М - б). а Изменение зтой схемьй путем снижения длительности введения анти-др39 ослабляет, но не отменяет, ,» благоприятнее действие на срок жизнеспособности трансплантата. Неопределенньій срок жизнеспособности трансплантата достигается у 6/8 реципиентов, когда анти-др3З9 тА вводят только в течение 2 недель в сочетаний с о фракцией 19 селезеночньх клеток (фиг. 2А). Неопределенньй срок жизнеспособности т. трансплантатов также наблюдается у реципиентов, получавших анти-др39 в течение 2 - 7 недель в сочетаний с їз одной иньекцией нефракционированньх аллогенньїх селезеночньх клеток.

Для подтверждения функции трансплантата и отсутствия инсулиновой секреции оставшимися нативнь!ми (ее) островками, неразрушенньми при введений стрептовотоцина, удаляют почки, несущие субренальнье с 50 имплантать Во всех случаях односторонняя нефрактомия дает в результате рецидив гипергликемиий ( »

ЗЗОмг/мл) в пределах З суток. що) Островковьне аллотрансплантать! и природная поджелудочная железа исследовались гистологически у всех животньїх, либо когда трансплантат разрушался, либо по окончаний зксперимента. Гистологические срезь островковьїх аллотрансплантатов в почках реципиентов фракционированньїх аллогенньїх мальїх лимфоцитов и продолжительного (7 недель) введения тАбБ МК1 показьівает обильнье интактнье островки, видимье ниже ренальной капсульі, которне лишень! мононуклеарной инфильтрации и содержат хорошо гранулированнье о инсулин- и глюкагон-положительньсе клетки. Напротив, гистологические срезь! островковьіх аллотрансплантатов іме) в почках реципиентов, получавших одно анти-др39 тАбБ, показьшвают характернее интенсивное воспаление с мононуклеарньіми клетками и разрушение сопутствующих островковьїх клеток. Во всех поджелудочньїх железах бо хозяев морфология островков едина со стрептовотоциновьім диабетом.

Пример 2. Продуцирование и исследование антител против др39

Опьїт 1. Антитела, направленнье прожив человеческого др39

Для индукции антиген-специфической Т-клеточкой толерантности у человека предпочтительно вводить антитело, направленное против человеческого др39. Для продуцирования мьішиньїх моноклинальньїх антител 65 против человеческого др39 используют следующую методологию. Мьішей ВАГ В/с иммунизируют растворимьм слитьім белком др39 др39-СО8 в полном адьюванте Фрейнда (СЕРА). Затем, спустя б недель, мишам вводят растворимьй др39-СО08 в неполном адьюванте Фрейнда (ІРА). Растворимьій др39-СО8 дают в растворимой форме через 4 недели после второй иммунизации. Затем, 2 неделями позже, мьішей ревакцинируют активированньіми человеческими лимфоцитами периферической крови, и еще через 2 недели их окончательно

Девакцинируют растворимьм ар39-СО08. Спленоцить! сливались с партнерньіми клетками слияния М5-1 на 4 сутки после последней иммунизации по протоколам иммунизации.

Клоньі, продуцирующие антитела против человеческого др-39, вьіделяют на основа процесса многократного скрининга. Сначала клоньї скринируют методом фиксации на бактериологических чашках, используя др39-СО8.

Затем положительнье клоньі скринируют против контрольного слитого белка СО8 - СЮ72 - СОВ8. Клонь, которье 7/0 отмеченьї как положительнье при анализе фиксации на бактериологических чашках, удаляются. Остающиеся клоньі! затем скринируют с покоящимися и активированньми в течение 5 часов человеческими лимфоцитами периферической крови (ЕВІ) с помощью проточного цитометрического анализа. Положительньми считается гибридомьї, окрашивающие активированньєе, а не покоящиеся РВІ. Наконец, остающиеся клонь! проверяют на их способность блокировать связьівание СО40Ід с зафиксированньїм на бактериологический чашках др39.

Приблизительно 300 клонов скринируют сначала против др39-СО8 и СО72 - СО8 при анализе фиксации на бактериологических чашках. Обнаружено, что из зтих клонов 30 находят фиксированньйй на чашках дрзое, но не

СО8. Зти клоньі затем скринируют для обнаружения одрЗО на активированньїх человеческих ЕВІ.

Приблизительно 15 клонов находят молекулу на активированньхх РВІ, но не покоящихся клетках. Далее специфичность подтверждается путем определения способности клонов блокировать связььвание СО401І9 при го таком анализе. Такими клонами стали ЗЕ4, 2Н5, 2Н8. такие клоньї являются предпочтительньми для применения в описанньх здесь способах. Клонь), которье положительньій на активированньїх, а не на покоящихся РВІ, также скринируют на реакционноспособность с клоном активированньїх крьісиньїх Т-клеток

РОМСЗ8. Клон 2Н8 вьіражаєт перекрестную реактивность с зтой линией крьісиньїх Т-клеток.

Опьїт 2. Антитела, направленнье против человеческого др39 сч

Процедуру иммунизации, подобную процедуре, описанной в примере 1, используют для получения дополнительньїх антител, направленньх против человеческого др39. Одну мьшь Ваїр/с иммунизируют і) растворимьм ар39-СО8 в СЕА, и впоследствии, 4 недели спустя, ей вводят, активированньєе в течение 5 часов, человеческие лимфоцить! периферической крови. Впоследствиий мьішь ревакцинируют растворимьім др39-СО8 за 4 дня перед слиянием спленоцитов с клетками слияния М5-1 по стандартньм протоколам. Скрининг с зо гпибридомньх клонов осуществляют с помощью проточкой цитометрии при окрашиваний, активированньх в течение 6 часов, РВІ. Отбирают клоньії, окрашивающие активированньсєе, но не покоящиеся, человеческиеєе РВІ. Ме

Для дальнейшего анализа отбирают 6 клонов - 409-8, 4009-9, 24 - 31, 24 - 43, 89- 7б и 89 - 79. со

Специфичность вьібранньїх антител подтверждаєется несколькими анализами. Сначала анализ методом проточной цитометрии показьвает, что все б тАБ скрашивают активированнье, но не покоящиеся, Т-клетки - периферической крови (см., как характерньіїй пример, фиг. ЗБ и ЗВ, показьівавшие окрашивание активированньйх «Е

Т-клеток 409-8 и 409-9, соответственно).

Зкспрессия молекульі, распознаваемой каждьм из шести антител, обнаруживаеєтся в пределах 4 часов после активации, является максимальной через 6 - 8 часов после активации, и не обнаруживается через 24 часа поле активации. Все шесть тАб распознают молекулу, вніраженную на активированньїх СО8'РВІ, в основном., « фенотипа СО4", но часть СЮОВ8"Т-клеток также зкспрессируют молекулу. Зкспрессия молекульі, распознаваємой - с зтими шестью антителами; ингибируются присутствием в культуральной среде циклоспорина А, как и а зкспрессия доро (см., например, фиг. 4А и 4Б, показьвающих, окрашивание Т-клеток, обработанньх "» циклоспорином, 409-8 и 409-9, соответственно). Кинетика и распространение зкспрессии молекульі, распознаваемой зтими тАб, идентичньії зтим параметрам о9рзЗе, которьій находит слитьій белок человеческого СО4019. Кроме того, все шесть моноклинальньїх антител блокируют окрашивание др39 СО4019д (см., например, т» фиг. 5А и 58, на которьїх показьівается ингибирование окрашивания др39 СО40ІдОв присутствий 409-8 и 409-9, 1» соответственно). При анализе по методу ЕГІЗА все шесть тАБ распознают др39-СО8, растворимую слитую форму молекульі др39. Кроме того, все шесть тАБ образуют иммунопреципитат молекуль! приблизительно в со ЗБкд из меченьх 355-метионином активированньїх человеческих РВІ. Иммунопреципитированная молекула о 50 идентична молекуле, преципитированной слитьім белком СО101д.

Функциональную активность шести вьібранньїх моноклональньїх антител (409-8, 409-9, 24 - 31, 24 - 43, 89 -

ІК) 76 и 89 - 79) проверяют следующим образом. Сначала определяют способность тАБ ингибировать пролиферацию очищенньїх человеческих В-клеток, вьіращенньїх с І/-4 и растворимьм одр39. Очищеннье человеческие Т-клетки вьіращивают с дрзе и 1-4 в присутствии или в отсутствий очищенньїх моноклональньх 22 антител или СО40Ід при дозах от 0 до 12,5мкг/мл. Пролиферацию В-клеток определяют через З дня после

Ге! введения в культуру тимидина. Результать! (приводятся на фиг. 6) показьвают, что все шесть тАбБ могут ингибировать пролиферацию В-клеток являются тА 89 - 75 и 24 - 31. де Затем проверяют способность тАБр ингибирсвать В-клеточную дифференцировку при измерениий по продуцированию Ід, индуцированного анти-СО8 активированньми Т-клетками и 1-2. Очищеннье до" бо человеческие В-клетки получают позитивной селекцией с клеточньім сортером с возбуждением флюоресценции (ГАС5), и затем культивируют с анти-СО8 активированньми человеческими Т-клетками (обработанньми митомицином С) и 1-2 в течение 6 суток в присутствий или в отсутствий очищенньїх моноклональньх антител против 9р39 при дозировке от 0 до 1Омкг/мл. На б сутки методом ЕГІЗА проверяют продуцирование І9М, ІДС и

ІДА. Результатьь (даются ниже в табл. 1) показьвают, что все шесть антител могут ингибировать 65 Т-клеточно-зависимою В-клеточную дифференцировку, при измерений по продуцированию Іо9М, Ідс и ІдА.

Ргодисіоп ої Іттиподіориїїп рон нет то аз оввві тво об) лові, зво зов, ді 11110 вве 1233 во. ор зм лав овв, зорову зм лев, й волю вв оз то зез|влвої тво тво том пово лові ю

Сто оіво| звіт юр вів вві тв, 1 гм яво ів сч зв лою зва зві ям о

Чтобьї проверить влияние тАьЬ против др39 на Т-клеточнье реакции, моноклональнье антитела включает в стандартнье реакции смешанной культурьї лимфоцитов (СКЛ). Культивируют 300000 человеческих лимфоцитов периферической крови (респондерь! - Р) со 100000 облученньїх аллогенньїх лимфоцитов периферической крови сч 30 (стимуляторьі - С) в присутствиий или в отсутствий тАБб против одр39 (1Омкг/мл). Культурьї метят импульсно

ЗН-тимидином на 4, 5 и 6 сутки, и через 18 часов собирают клетки, вьіросшие в культуре. Все шесть тАБ против.у--./-Ф человеческого 9р39 ингибируют аллоспецифические реакции при измерений по СКЛ (см., как характерньй со пример, фиг. 7, показьивающий ингибирование аллоспецифических реакций, когда Р и С инкубируются в присутствий 24 - 31 или 89 - 76; для положительного контроля используют слитьій белок « 35 СТІ А4-иммуноглобулин и тАБ против СО28). «

Чтобьї определить, распознают ли все шесть моноклональньїх антител определеннье зпитопь! на молекуле человеческого др39, осуществляют зксперименть! с перекрестньім блокированием. Сначала активированнье человеческие РВІ блокируют каждьм из шести тАБ (25мкг/мл). Клетки промьівают и затем окрашивают 10мкг/мл биотинилированного антитела, после чего следует реакция с фитозритринилированньм авидином « (РЕ-Ам). Окрашивание клеток РЕ-Ам анализируют ЕРАС5. Результать! приводятся ниже в табл. 2. ш-в с- :» в" яю кб совно з» со ян ю

Ф

Ко)

Интенсивность окрашивания и процент положительньїх клеток обозначаются знаком ж (ння - МІ » 200; нь т МІ» 125; -- - МІ » 25; - - нет окрашивания вьіше средь!). МО - не определялось.

Все антитела блокируют связьвание СО40ІдОс активированньми человеческими РВІ. Однако, данньєе, приведеннье в табл. 2, ясно показьівают незффективность некоторьїх антител при блокировке связьівания

ГФ) других антител с активированньми человеческими РВІ, что приводит к предположению, что они распознают

ГФ отдельнье зпитопьї на молекулах человеческого др39.

Гибридомь! 89 - 76 и 24 - 31, продуцирующие антитела 89 - 75 и 24 - 31, соответственно, депонировань! в соответствии с Будапештским договором в Американской коллекции типовьіїх культур, Рагкіажп Огіме, Роквилл, бо Мзриленд, 2 сентября 1994. Гибридоме 89 - 76 присвоен инвентарньій номер АТСС НВ11713, и гибридоме 24 - 31 присвоен ивентарньійй номер АТСС НВ11712.

Опьїт 3. Антитела, направленнье против мьішиного др39

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения антагонистом орЗО является моноклональное антлтело против мьішиного др39 - МК1. Для продуцирования монокленального антитела МК1 65 применяется описанньій ниже способ, и его можно использовать для генерации других антител, направленньх на ар39.

Хомяков иммунизируют интраперитонально 5010 5 активированньх Тп1-клеток (4І.б) с недельньми интервалами в течение шести недель. Когда сьівороточньій титр против мьішиньїх ТИ1 превьішает 1:10000, осуществляют слияниє клеток с полизтиленгликолем, используя иммуннье хомячьи спленсцить! и М5-1.

Супернатант от клеток, содержащих растущие гибридомь, скринируют проточной цитометрией на покоящихся и активированньїх ТАТ. Одну, особую гибридому, которая продуцирует Маб, которое селективно распознаєт активированньсе Ти, затем тестируют и субклонируют, чтобьї получить МК1. МК1 получают в асците и очищают ионообменной ВЗЖХ. Гибридома МК1 депонирована Американской коллекцией типовьїх культур, и 70 ей присвоен инвентарньй номер НВ11048.

Зквиваленть

Специалистьі в зтой области техники увидят или смогут осуществить, используя самье обьічнье зкспериментальнье методь, много зквивалентов конкретньїх вариантов осуществления настоящего изобретения, описанньїх здесь. Такие зквиваленть! рассматриваются как входящие в обьем приведенной ниже 75 Фформуль изобретения. Все ссьілки и опубликованнье заявки на патентьї, цитированнье в настоящей заявке, включень в нее в качестве ссьлок.

Claims (47)

Формула винаходу

1. Способ индуцирования Т-клеточной толерантности к донорской ткани или органу у реципиента ткани или органа, включающий введение упомянутому реципиенту а) аллогенной или ксеногенной клетки, которая зкспрессирует по, крайней мере один донорский антиген и которая имеет лиганд на клеточной поверхности, взаймодействующий с рецептором на поверхности сч об реципиентной Т-клетки, которьій опосредует контакт зависимую хелпер-зффекторную функцию и представляет собой одр39, и б) антагониста рецептора на поверхности Т-клетки, которьій ингибирует взайимодействие лиганда о с рецептором.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что антагонист представляет собой антитело против др39.

З. Способ по п. 2, отличающийся тем, что антитело против 9р39 представляет собой моноклональное с зо антитело.

4. Способ по п. 2, отличающийся тем, что антитело против 90939 представляет собой антитело против Ме. человеческого дро. со

5. Способ по п. 3, отличающийся тем, что моноклональное антитело представляет собой МК1, полученное из гибридомьї, зарегистрированной в Американской Коллекции Культур Клеток под Мо НВ 11048. -

б. Способ по п. З, отличающийся тем, что моноклональное антитело представляет собой химерное «г моноклональное антитело.

7. Способ по п. З, отличающийся тем, что моноклональное антитело представляет собой очеловеченное моноклональное антитело.

8. Способ по п. 1, отличающийся тем, что аллогенная или ксеногенная клетка представляет собой « лимфоидную клетку. шщ с

9. Способ по п. 8, отгличающийся тем, что лимфоидная клетка представляет собой В-клетку.

10. Способ по п. 9, отличающийся тем, что В-клетка представляет собой покоящуюся В-клетку. ;з»

11. Способ по п. 1, отличающийся тем, что аллогенную или ксеногенную клетку, и антагонист вводят реципиенту перед трансплантацией ткани или органа.

12. Способ по п. 1, отличающийся тем, что ткань или орган включает панкреатические островки. їх

13. Способ по п. 1, отличающийся тем, что ткань или орган вьібирают из группьі, в которую входят печень, почка, сердце, легкое, кожа, мьішца, нервная ткань, желудок и кишка. т-

14. Способ индуцирования Т-клеточной толерантности к донорской ткани или органу у реципиента ткани или Го! органа, включающий введение упомянутому реципиенту а) аллогенмой или ксеногенной клетки, которая зкспрессирует по крайней мере один донорский антиген, и і, б) антитела против др39. з

15. Способ по п. 14, отличающийся тем, что антитело против 9039 представляет собой моноклональное антитело.

16. Способ по п. 14, отличающийся тем, что антитело против др39 представляет собой антитело против человеческого др39.

17. Способ по п. 14, огличающийся тем, что моноклональное антитело представляет собой МК1. Ф)

18. Способ по п. 15, отличающийся тем, что моноклональное антитело представляет собой химерное ка моноклональное антитело.

19. Способ по п. 15, отличающийся тем, что моноклональное антитело представляет собой очеловеченное бо Моноклональное антитело.

20. Способ по п. 14, отличающийся тем, что антагонист 9р39 представляет собой растворимую фазу лиганда одр39.

21.Способ по п. 20, отличающийся тем, что растворимая фаза лиганда 9д9р39 представляет собой слитьй белок СО40. 65

22. Способ по п. 14, отличающийся тем, что аллогенная или ксеногенная клетка представляет собой лимфоидную клетку.

23. Способ по п. 22, отличающийся тем, что лимфоидная клетка представляет собой В-клетку.

24. Способ по п. 23, отличающийся тем, что В-клетка представляет собой покоящуюся В-клетку.

25. Способ по п. 14, отличающийся тем, что аллогенную или ксеногенную клетку и антагонист вводят реципиенту перед трансплантацией ткани или органа.

26. Способ по п. 14, отличающийся тем, что ткань или орган включает панкреатические островки.

27. Способ по п. 14, отличающийся тем, что ткань или орган вьібирают из группьї, в которую входят печень, почка, сердце, легкое, кожа, мьішца, нервная ткань, желудок и кишка.

28. Способ лечения диабета, включающий введение субьекту, нуждающемуся в таком лечении, 70 а) аллогенной или ксеногенной клетки, которая зкспрессирует по крайней мере один донорский антиген, б) антитела против др39, в) донорских клеток панкреатических островков.

29. Способ по п. 28, отличающийся тем, что антитело против др39 представляет собой моноклональное антитело.

30. Способ по п. 28, отличающийся тем, что антитело против 9р39 представляет собой антитело против человеческого дро.

31. Способ по п. 29, отличающийся тем, что моноклональное антитело представляет собой МКА1, полученное из гибридомь!ї, зарегистрированной в Американской Коллекции Культур Клеток под Мо НВ 11048.

32. Способ по п. 29, отличающийся тем, что моноклональное антитело представляет собой химерное го Моноклональное антитело.

33. Способ по п. 29, отличающийся тем, что моноклональное антитело представляет собой очеловеченное моноклональное антитело.

34. Способ по п. 28, отличающийся тем, что антагонист 9р39 представляет собой растворимую фазу лиганда одр39. сч

35. Способ по п. 34, отличающийся тем, что растворимая фаза лиганда др39 представляет собой слитьй белок СО40. і)

36. Способ по п. 28, отличающийся тем, что аллогенная или ксеногенная клетка представляет собой лимфоидную клетку.

37. Способ по п. 36, отличающийся тем, что лимфоидная клетка представляет собой В-клетку. с зо

38. Способ по п. 37, отличающийся тем, что В-клетка представляет собой покоящуюся В-клетку.

39. Способ по п. 28, отличающийся тем, что аллогенную или ксеногенную клетку и антагонист вводят б» реципиенту перед трансплантацией клеток панкреатических островков. со

40. Способ индуцирования Т-клеточной толератности к донорской ткани или органу у реципиента ткани или органа, включающий введение упомянутому реципиенту - а) донорской аллогенной клетки, «г б) моноклонального антитела против др39, при зтом донорскую аллогенную клетку и антитело против др39 вводят реципиенту перед трансплантацией ткани или органа.

41. Способ по п. 40, отличающийся тем, что моноклональное антитело против д9р39 представляет собой « антитело против человеческого дрзо. в с

42. Способ по п. 41, отличающийся тем, что моноклональноег антитело представляет собой МК1, . полученное из гибридомь!ї, зарегистрированной в Американской Коллекции Культур Клеток под Мо НВ 11048. а

43. Способ по п. 42, отличающийся тем, что моноклональное антитело представляет собой химерное моноклональное антитело.

44. Способ по п. 43, отличающийся тем, что моноклональное антитело представляет собой очеловеченное ї5» моноклональное антитело.

45. Способ по п. 40, отличающийся тем, что аллогенная или ксеногенная клетка представляет собой о лимфоидную клетку. Го!

46. Способ по п. 45, отличающийся тем, что лимфоидная клетка представляет собой В-клетку.

47. Способ по п. 46, отличающийся тем, что В-клетка представляет собой покоящуюся В-клетку. се) Ко) Ф) іме) 60 б5