HU221752B1 - Kompozíció, amely donor szövet vagy szerv iránti T-sejt tolerancia kiváltására szolgál - Google Patents

Abstract

A találmány az idegen gazdaszervezetbe átültetett szövet vagy szerviránti T-sejt-tolerancia előidézésére szolgáló kompozícióravonatkozik. A találmány szerinti kompozíció a következő anyagokkombinációját tartalmazza: 1) allogén vagy xenogén sejtet, mely donorantigéneket expresszál, és amelynek felszínén olyan ligandum van,amely kapcsolatba lép a recipiens szervezet T-sejtjének felszínén lévőreceptorral, mely kontaktusfüggő segítő-végrehajtó funkciót közvetít;valamint 2) a szóban forgó receptor antagonistáját, amely gátolja aligandum és a receptor kölcsönhatását. A találmány szerinti módszerelőnyös foganatosítási módja, midőn az alkalmazott allogén vagyxenogén sejt B-sejt, előnyösen nyugvó B-sejt, és a T-sejt felszínénlévő, kontaktusfüggő segítő-végrehajtó funkciót közvetítő molekulagp39. A gp39 antagonista előnyösen anti-gp39 antitest. Az allogén vagyxenogén sejtet és a gp39 antagonistát jellemzően a szövet vagy szervátültetése előtt juttatják a recipiens szervezetbe. A találmány sze-rinti kompozíció alkalmas a T-sejt-tolerancia indukálására máj-,vese-, szív-, tüdő-, bőr-, izom-, idegszövet-, gyomor- ésbéltranszplantátumok iránt. Cukorbetegség kezelésére szolgálókompozícióra is vonatkozik a találmány, amely donor antigéneketexpresszáló allogén vagy xenogén sejtek, gp39 antagonista éshasnyálmirigyszigetek kombináció- jából áll. ŕ

Description

Az antigénspecifikus T-sejt-aktiváláshoz és klónexpanzióhoz az antigénprezentáló sejtek (APC) által szolgáltatott két jelzésnek kell a nyugvó T-limfociták felszínéhez eljutniuk [Jenkins, M. & Schwartz, R. (1987) J. Exp. Med. 165, 302-319; Mueller, D. L. et al. (1990)

J. Immunoi. 144, 3701-3709; Williams, I. R. & Unanue, E. R. (1990) J. Immunoi. 145, 85-93]. Az első jelzést, mely az immunválasz specifitásáért felelős, a T-sejt-receptor (TCR) közvetíti azt követően, hogy a nagy hisztokompatibilitási komplex (MHC) értelmében egy idegen, antigén tulajdonságú peptid felismerése megtörtént. A kostimulációnak nevezett második jelzés ösztönzi a T-sejteket arra, hogy szaporodni kezdjenek és funkcionalizálódjanak [Schwartz, R. H. (1990) Science 248, 1349-1356]. A kostimuláció nem antigénspecifikus, nem korlátozza az MHC, és úgy gondolják, hogy az APC sejtek által expresszált egy vagy több meghatározott felszíni molekula szolgáltatja [Jenkins, Μ. K. et al. (1988) J. Immunoi. 140, 3324-3330; Linsey, P. S. et al. (1991) J. Exp. Med. 173, 721-730; Gimmi, C. D. et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 6575-6579; Young, J. W. et al. (1992) J. Clin. Invest. 90, 229-23T, Koulova, L. et al. (1991) J. Exp. Med. 173, 759-762; Reiser, H. et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 271-275; vanSeventer, G. A. et al. (1990) J. Immunoi. 144, 4579-4586; LaSalle, J. M. et al. (1991) J. Immunoi. 147, 774-780; Dustin, Μ. I. et al. (1989) J. Exp. Med. 169, 503; Armitage, R. J. et al. (1992) Natúré 357, 80-82; Liu, Y. et al. (1992) J. Exp. Med. 175, 437-445]. Az egyik T-sejt-aktivációt előidéző kostimulációs út feltételezi a CD28 molekula jelenlétét a T-sejtek felszínén. Ez a molekula képes a B-sejtek vagy más APC sejtek felszínén lévő ligandum által kibocsátott jelzést felfogni. CD28 molekula ligandumai például a B-limfocita aktiváló antigének B7 osztályának tagjai, így például a B7-1 és/vagy a B7-2 [Freedman, A. S. et al. (1987) J. Immunoi. 137, 3260-3267; Freeman, G. J. et al. (1989) J. Immunoi. 143, 2714-2722; Freeman, G. J. et al. (1991) J. Exp. Med. 174, 625-631; Freeman, G. J. et al. (1993) Science 262, 909-911; Ayuma, M. et al. (1993) Natúré 366, 76-79; Freeman, G. J. et al. (1993) J. Exp. Med. 178, 2185-2192]. A B7-1 és B7-2 egyúttal annak a CTLA4 molekulának is ligandumai, amely az aktivált T-sejtek felszínén fordulnak elő, jóllehet a CTLA4 szerepe a kostimulációban nem világos.

Az antigénspecifikus jelzés és a kostimulációs jelzés a T-sejthez eljutva annak aktiválódását idézi elő, ami a T-sejtek proliferációját és a citokinkiválasztást egyaránt jelenti. Abban az esetben azonban, midőn csupán az antigénspecifikus jelzés jut el a T-sejthez, a kostimulációs jelzés nélkül, úgy ez minden bizonnyal a T-sejt válaszképtelen állapotához, energiájához vezet, és így antigénspecifikus toleranciát indukál a Tsejtben.

A T-sejtek és a B-sejtek közötti kölcsönhatások központi szerepet játszanak az immunválaszokban. A csecsemőmirigy-függő antigénekre adott humorális immunválasz indukciója feltételezi a T helper (Th) sejtek segítségét. Míg a B-limfocitáknak nyújtott segítséget a Th-sejtek által kiválasztott vízoldékony molekulák (például limfokinek, mint például az IL-4 és IL-5) közvetítik, a B-sejteknek szükségük van a B-sejtek és a T-sejtek kontaktusfüggő kölcsönhatására is [Hirohata et al. (1988) J. Immunoi. 140, 3736-3744; Bartlett et al. (1989) J. Immunoi. 143, 1745-1754]. Ez azt jelzi, hogy a B-sejtek aktiválásához elengedhetetlen a Bsejtek és a T-sejtek felszínén lévő molekulák kölcsönhatása. Ilyen módon a T-sejten lévő molekulák közvetítik a T-sejt segitő-végrehajtó funkcióit. A T-sejteken és a B-sejteken lévő molekulák kontaktusfüggő kölcsönhatását alátámasztja az a megfigyelés is, miszerint az aktivált T-sejtekből izolált plazmamembrán képes a B-sejt aktiválásához szükséges segítő funkcióra [Brian (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 564-568; Hodgkin et al. (1990) J. Immunoi. 145, 2025-2034; Noelle et al. (1991) J. Immunoi. 146, 1118-1124].

Sikerült azonosítani a CD40 molekulát az éretlen és az érett B-limfociták felszínén, amely az antitestekkel való keresztkötések létrejötte után a B-sejt proliferációját váltja ki [Valié et al. (1989) Eur. J. Immunoi. 79 1463-1467; Gordon et al. (1988) J. Immunoi. 140, 1425-1430; Gruber et al. (1989) J. Immunoi. 142, 4144-4152]. A CD40 molekulát klónozták és jellemezték [Stamenkovic et al. (1989) EMBO J. 8, 1403-1410]. A CD40 molekula gp39 jelű (más néven CD40 ligandum, vagy CD40L) ligandumát is sikerült klónozni és jellemezni [Armitage et al. (1992) Natúrét 357, 80-82; Lederman et al. (1992) J. Exp. Med. 175, 1091-1101; Hollenbaugh et al. (1992) EMBO J. 77/ 4313-4319]. A gp39 fehérjét aktivált, de nem nyugvó CD4+ Th-sejtek expresszálják [Spriggs et al. (1992) J. Exp. Med. 176, 1543-1550; Lane et al. (1992) Eur. J. Immunoi. 22, 2573-2578; Roy et al. (1993) J. Immunoi. 757,1-14]. Az olyan sejtek, amelyekben transzfekcióval bejuttatták a gp39 gént, és amelyek a gp39 fehérjét felszínükön expresszálják, képesek bekapcsolni a Bsejt-proliferációt, valamint más stimulációs jelekkel együtt indukálni tudják az antitesttermelést [Armitage et al. (1992) Natúré 357, 80-82; Hollenbaugh et al. (1992) EMBO J. 77, 4313-4319].

A sejtfelszíni molekulák, amelyek a T-sejtek kontaktusfüggő segitő-végrehajtó funkcióját közvetítik, fontosak az olyan immunválaszok kiváltásában, melyek a Tsejtek segítségét igénylik. így például a T-sejt felszínén lévő gp39 és a B-sejt felszínén lévő CD40 kölcsönhatása központi szerepet játszik az antigénre adott B-sejtválasz előidézésében. A jelen találmány - legalábbis részben - azon a felismerésen alapszik, hogy a T-sejtek kontaktusfüggő segitő-végrehajtó funkcióját közvetítő sejtfelszíni molekulák meghatározó szerepet játszanak az alloantigénekre adott T-sejt-válasz során is. Ez a felismerés közelebbről abban áll, hogy megfelelő körülmények között a gp39 és egy, a T-sejt számára alloantigént jelentő allogén sejt felszínén lévő ligandum kölcsönhatásának megzavarása a T-sejt toleranciáját idézi elő. A T-sejtnek az allogén sejt által történő aktiválásához előnyösen arra van szüksége, hogy a sejten lévő gp39 ligandum és a T-sejten lévő gp39 közötti kölcsön2

HU 221 752 Bl hatás képes legyen szolgáltatni a megfelelő jelzést. Amennyiben az allogén sejten lévő gp39 ligandum és a T-sejten lévő gp39 kölcsönhatását gátoljuk, úgy megakadályozzuk a T-sejt aktiválódását, és inkább a T-sejt alloantigénspecifikus toleranciáját idézzük elő. Az itt is- 5 mertetett T-sejt-tolerancia előidézése az alloantigének iránt eredményesen felhasználható a szövet- és szervátültetés gyakorlatában.

Ennek megfelelően a jelen találmány szerinti módszerek különösen alkalmasak a donor szövet vagy szerv 10 iránti tolerancia kiváltására a befogadó szervezet szövetéten vagy szervében. Ezeknek a módszereknek az alkalmazása során a befogadó szervezette juttatunk: 1) allogén vagy xenogén sejtet, mely legalább egy donor antigént expresszál, és amelynek felszínén olyan ligán- 15 dum van, amely kapcsolatba lép a recipiens szervezet T-sejtjének felszíná) lévő receptorral, mely kontaktusfüggő segítő-végrehajtó funkciót közvetít; valamint 2) a szóban forgó receptor antagonistáját, amely gátolja az allogén vagy xenogén sejten lévő ligandum és a T- 20 sejten lévő receptormolekula kölcsönhatását.

A találmány szerinti módszer előnyös foganatosítási módja, midőn a befogadó szervezet T-sejtjének felszínén lévő, kontaktusfuggó segítő-végrehajtó funkciót közvetítő receptormolekula gp39. Eszerint az antagonis- 25 ta olyan molekula, amely gátolja a T-sejten lévő gp39 és az allogén vagy xenogén sejt felszínén lévő gp39 ligandum kölcsönhatását. Különösen előnyösen a gp39 antagonista anti-gp39 antitest. Egy további előnyös megoldás, amennyiben a gp39 antagonista a 30 gp39 ligandum oldható formája, például oldható CD40.

A befogadó szervezetbe juttatott allogén vagy xenogén sejt előnyösen limfoid sejt, például B-sejt. Alternatív módon a befogadó szervezette juttatott sejt lehet kicsi, nyugvó B-sejt is. Az allogén vagy xenogén sejtet és az 35 antagonistát (például anti-gp39 antitestet) jellemzően a szövet vagy szerv átültetése előtt juttatjuk a recipiens szervezetbe. Példának okáért a szövet- vagy szervdonor limfoid sejtjeit (például B-sejteket) juttatjuk a befogadó szervezette az antagonistával együtt, a szerv- 40 vagy szövetátültetést megelőzően.

A jelen találmány szerinti módszer alkalmas például az olyan átültetett szövetek vagy szervek iránti Tsejt-tolerancia kiváltására, mint a máj, a vese, a szív, a tüdő, a bőr, az izom, az idegszövet, a gyomor és a bél. 45 Az egyik foganatosítási módnak megfelelően az átültetett szövet lehet hasnyálmirigysziget (Langerhans) is. Ebben az esetten a cukorbetegség kezelésére szolgáló módszer során a kezelést igénylő szervezetbe juttatunk: 1) allogén vagy xenogén sejteket, melyek donor 50 antigéneket expresszálnak; 2) a befogadó szervezet kontaktusfuggő segítő-végrehajtó funkcióval rendelkező T-sejtjeinek felszínén lévő receptorokkal antagonista molekulát, amilyen a gp39 antagonista (például antigp39 antitest); valamint 3) a donor hasnyálmirigy- 55 szigetsejteket.

Ábrajegyzék

1. ábra: Beültetett hasnyálmirigy-szigetsejt allograft túlélésének grafikus megjelenítése külön-külön anti-gp39 antitesttel, frakció- 60 nált, illetve frakcionálatlan allogén lépsejttel előkezelt, kémiai úton diabetikussá tett egérben.

2. ábra: A 2A. és 2B. ábra a beültetett hasnyálmirigy-szigetsejt allograftok túlélésá mutatja a plazma glükózkoncentrációjaként mérve kémiai úton diabetikussá tett egérben, melynek előkezelése frakcionált allogén lépsejt és anti-gp39 antitest (MR1) együttes adásával tortáit 2 héten (A), illetve 7 héten át (B). Az egyes görbék azonos egéren mért eredményeket tükröznek. A világos jelek azoknak az alanyoknak az eredményei, melyeknél spontán kilökődést tapasztaltunk. A sötét jelek azokra az egerekre vonatkoznak, melyekben a transzplantátum működött a kísérlet befejezésekor is.

3. ábra: A 3A„ 3B. és 3C. ábrán CD4QIg (A), mAb

4D9-8 (B), illetve mAb 4D9-9 (C) alkalmazásával 6 órán át aktivált, Iramán perifériás vérből származó limfociták festődésének citofluorimetriás kiértékelése látható.

4. ábra: A 4A., 4B. és 4C. ábrán mAb 4D9-8 (A)* mAb 4D9-9 (B), illetve CD4<Mg (C) alkalmazásával ciklosporin-A jelenlétében 6 órán át aktivált, humán perifériás vérből? származó limfociták festődésének cito* fluorimetriás kiértékelése látható.

5. ábra: Az 5A. és 5B. ábrán CD401g alkalmazását val, jelöletlen mAb 4D9-8 (A), illetve jelö* leden mAb 4D9-9 (B) jelenlétében 6 órán? át aktivált, humán perifériás vérből szárma-*⁹ zó limfociták festődésének citofluorimet* riás kiértékelése látható.

6. ábra: A 4D9-8, 4D9-9, 24-31, 24-43,

89-76 és 89-79 anti-humán-gp39 antitestek gátló hatásának grafikus ábrázolása, humán B-sejtek oldható gp39 és IL-4 alkalmazásával indukált proliferációjára.

7. ábra: A 24-31 és 89-79 anti-humán-gp39 antitestek gáüó hatásának grafikus ábrázolása, az allospecifikus kevert limfocita válaszra.

A jelen találmány olyan módszerekre vonatkozik, melyek alkalmasak a donor szövet vagy szerv iránti Tsejt-tolerancia irt vivő előidézésére a befogadó szervezetben. Ezeknek a módszereknek az alkalmazása során a befogadó szervezette a következő anyagokat juttatjuk: 1) allogén vagy xenogén sejtet, mely donor antigéneket expresszál, és amelynek felszínén olyan ligandum van, amely kapcsolatba lép a recipiens szervezet T-sejtjének felszínén lévő receptorral, mely kontaktusfüggő segítő-végrehajtó funkciót közvetít; valamint 2) a szóban forgó receptor antagonistáját, amely gátolja az allogén vagy xenogén sejten lévő ligandum és a Tsejten lévő receptormolekula kölcsönhatását.

Jelen értelemben a „recipiens” kifejezés mindazokra az alanyokra vonatkozik, melyekbe idegen szövetet vagy szervet ültettek te, ültetnek te, vagy fognak beültetni. Jelen értelemben az „allogén” sejt a recipienssel

HU 221 752 Bl megegyező fejhoz tartozó más egyedből származik, és olyan „alloantigéneket” expresszál, amelyek különböznek a recipiens sejtjei által expresszált antigénektől.

A „xenogén” sejt a recipienstől eltérő fajból származik, és „xenoantigéneket” expresszál, amelyek különbőz- 5 nek a recipiens sejtjei által expresszált antigénektől. Jelen értelemben a „donor antigén” kifejezés a recipiensbe beültetendő szövet vagy szerv sejtjei által expresszált antigénekre vonatkozik. A donor antigének lehetnek alloantigének vagy xenoantigének, a transzplan- 10 tátum eredetétől függően. A tolerancia előidézésére irányuló kezelés során a recipiens szervezetbe juttatott allogén vagy xenogén sejtek donor antigéneket expresszálnak, azaz az átültetendő szövet vagy szerv sejtjei által expresszált antigének némelyikét, vagy ezek 15 összességét. Az allogén vagy xenogén sejtek előnyösen ugyanabból a donorszervezetből származnak, mint az átültetendő szövet vagy szerv, de származhatnak más, egy vagy több olyan szervezetből is, amelynek antigén determinánsai megegyeznek a donoréval. 20

A tolerancia előidézésére irányuló kezelés során az allogén vagy xenogén sejteken túl a T-sejteken lévő kontaktusfüggő segitő-végrehajtó funkciót közvetítő molekula antagonistáját is a recipiensbe juttatjuk. Jelen értelemben a kontaktusfiiggő segitő-végrehajtó fűnk- 25 ciót közvetítő molekula, vagy receptor - melyet a Thsejt expresszál - kölcsönhatásba léphet a végrehajtó sejten (például B-sejten) lévő ligandummal, és ez a kölcsönhatás szükséges ahhoz, hogy a végrehajtó sejt válasza kialakuljon (például B-sejt-aktiválódás). Bebizo- 30 nyosodott az is, hogy ezen túlmenően a receptormolekula az antigénre adott T-sejt-válasz kiváltásában is szerephez jut. A T-sejten lévő, kontaktusfiiggő segitővégrehajtó funkciót közvetítő molekula előnyösen gp39. Ennek megfelelően a találmány szerinti módszer 35 egy előnyös foganatosítási módja szerint a recipiens szervezetbe allogén vagy xenogén sejtet és gp39 antagonistát juttatunk. A recipiens szervezet T-sejtjeinek allogén vagy xenogén sejtekkel történő aktiválása feltételezi a recipiens T-sejteken lévő gp39 és az allogén 40 vagy xenogén sejten lévő gp39 ligandum közötti kölcsönhatást. Ha ezt a kölcsönhatást gp39 antagonista alkalmazásával gátoljuk, akkor az allogén vagy xenogén sejt által expresszált donor antigének nem aktiválják a recipiens T-sejteket, hanem a donor antigének iránti to- 45 leranciát idézik elő. A recipiens szervezet donor antigének iránti toleranciájának előidézése lehetővé teszi a donor szövet vagy szerv sikeres átültetését, a transzplantátum immunreakción alapuló kilökődése nélkül.

A találmányt az alábbiakban ismertetjük részle- 50 tesen.

I. gp39 antagonisták

A jelen találmány értelmében eljárva gp39 antagonistát juttatunk a recipiens szervezetbe, hogy megzavarjuk a recipiens T-sejteken lévő gp39 és az allogén vagy 55 xenogén sejten, például B-sejten lévő gp39 ligandum kölcsönhatását. A gp39 antagonistának az olyan molekulát tekintjük, amelyik megzavaija ezt a kölcsönhatást. A gp39 antagonista lehet gp39 elleni antitest (például gp39 elleni monoklonális antitest), gp39 elleni an- 60 titest fragmense vagy származéka (például Fab vagy

F(ab)’2 fragmensek, kiméraantitestek, valamint humanizált antitestek), a gp39 ligandum oldható formái (például oldható CD40) a gp39 ligandum fúziós proteinjének oldható formái (például oldható CD40Ig), vagy egyéb gyógyszerhatóanyagok, amelyek zavaiják vagy lehetetlenné teszik a gp39-CD40 kölcsönhatást.

A. Antitestek

Emlősök (például egér, hörcsög vagy nyúl) immunizálhatók a gp39 fehéije vagy fehéijefragmens (például peptidfragmens) immunogén formájával, mely immunválaszt idéz elő az emlősökben. A felszínükön gp39 molekulát expresszáló sejtek szintén alkalmazhatók immunogénként. Alternatív immunogének a tisztított gp39 fehéije vagy fehéijefragmens. A gp39 tiszta állapotban kinyerhető gp39 molekulát expresszáló sejtekből a szokásos tisztítási eljárásokkal. Ezen túlmenően a gp39-cDNS-molekulát [Armitage et al. (1992)

Natúré 357, 80-82; Lederman et al. (1992) J. Exp.

Med. 175, 1091-1101; Hollenbáugh et al. (1992)

EMBO J. 11, 4313-4319] valamely gazdasejtben (például baktériumban vagy emlős-sejtvonalban) expresszáltathatjuk, és a gp39 fehéijét a tenyészetből a szokásos tisztítási eljárásokkal kinyerhetjük. A gp39 peptidek szintetikusan is előállíthatók a gp39 ami- | nosavszekvenciája alapján [Armitage et al. (1992) Na- j tűre 357, 80-82; Lederman et al. (1992) J. Exp. Med.

175, 1091-1101; Hollenbáugh et al. (1992) EMBO J..

11,4313-4319] ismert eljárásokat alkalmazva (például!?

F-moc vagy T-boc kémiai szintézis). A fehéijéknek immunogén tulajdonságot biztosító megoldások, például·?? egyebek között a hordozókkal való konjugátumképzés, közismertek a szakmában. A fehéije például adjuvánssal együtt is beadható. Az immunizálás menete nyomon követhető a plazma vagy a szérum antitesttiterének mérésével. Az antitestszintek meghatározhatók standard ELISA- vagy más immunkimutatási technikával, antigénként az immunogént alkalmazva. i

Az immunizálás után antiszérum kapható, és kívánt esetben poliklonális antitestek izolálhatók a szérumból.

Monoklonális antitestek előállítása érdekében antitesttermelő sejteket (limfocitákat) nyerhetünk ki immunizált állatokból, melyeket mielómasejtekkel fúzionáltathatunk a szomatikus sejtfúzió jól bevált módszereinek alkalmazásával. Ezáltal a sejteket immortalizáljuk, és hibridómasejteket kapunk. Az ehhez szükséges technikák a szakmában közismertek. Ilyenek például az eredetileg Kohler és Milstein [Natúré 256, 495-497 (1975)] által kidolgozott bibridómatechnika éppúgy, , mint a humán B-sejt technika [Kozbar et al. (1983) Immunoi. Today 4, 72], valamint az EBV-hibridómatechnika humán monoklonális antitestek előállítására [Colé et al. (1985) Monoclonal Antibodies in Cancer Therapy, 77-96, Allén R. Bliss, Inc.], és kombinatorikus antitestkönyvtárak szkrínelésére [Huse et al. (1989) Science 246, 495-497]. A hibridómasejtek immunkémiai módszerekkel szkrinelhetők az adott fehérjével vagy peptiddel specifikus reakciót adó antitesttermelés képességére, és a monoklonális antitestek izolálhatók.

HU 221 752 Bl

Az antitest kifejezés jelen értelmezésben mindazokra a fragmensekre is vonatkozik, amelyek specifikus reakciót adnak a gp39 fehérjével, ennek valamely peptidjével vagy a gp39 fúziós fehérjével. Az antitestek hagyományos módszerekkel fragmentálhatók, és az egyes 5 fragmensek a teljes antitestekkel kapcsolatban korábban leírt technikával szkrinelhetők. A F(ab’)2 fragmensek például az antitest pepszines kezelésével állíthatók elő. Az Így kapott F(ab’)2 fragmensek diszulfidhídjainak redukciójával Fab’ fragmenseket készíthetünk. 10 A jelen találmány értelmében ezenkívül minden olyan bispecifikus és kiméramolekula is antitestnek tekintendő, amelyek anti-gp39 részletet tartalmaznak.

Ha a humánterápiában nem emberben előállított antitesteket használunk fel, akkor azokat különböző mér- 15 fékben idegennek ismeri fel a szervezet, és ez immunválaszt idézhet elő a betegben. Ennek a problémának a minimalizálására vagy megszüntetésére alkalmas az általános immunszuppressziónál kedvezőbb megközelítés, midőn kiméraantitest-származékokat állítunk elő, 20 azaz olyan antitestmolekulákat, melyek állati eredetű változó régióból és emberi eredetű állandó régióból épülnek fel. A kiméraantitest-molekulák tartalmazhatnak például egér, patkány vagy egyéb állati antitestből származó antigénkötő helyet, valamint emberből szár- 25 mazó állandó régiókat. A szakirodalom egy egész sor, kiméraantitest készítésére vonatkozó módszert ismertet, melyek alkalmazhatók a gp39 molekulát felismerő immunglobulin változó régiót tartalmazó kiméraantitest előállítására [Morrison et al. (1985) Proc. Natl. 30 Acad. Sci. USA 81, 6851; Takeda et al. (1985) Natúré 314, 452; Cabilly et al., US 4816567; Boss et al.,

US 4816397; Tanaguchi et al., EP 171496, EP 173494,

GB 2177096B]. Elvárható, hogy az ilyen kiméraantitestek kevésbé legyenek immunogének az emberi szer- 35 vezetben, mint a megfelelő nem kiméraantitest.

A humánterápiás alkalmazás céljából a gp39 fehérjével, illetve peptiddel specifikus reakcióba lépni képes monoklonális vagy kiméraantitestek tovább humanizálhatók. Ennek során humán változó régiót tartalmazó 40 kiméraantitesteket állítunk elő, melyekben a változó régió egyes részei, különösen az antigénkötő hely konzervált vázrégiója, emberi eredetűek, és kizárólag a hipervariábilis régiók nem emberi eredetűek. Az ilyen, megváltoztatott immunglobulinok a szakirodalomban szép 45 számmal előforduló technikák bármelyikével elkészíthetők (Teng et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 7308-7312; Kozbor et al. (1983) Immunology Today 4, 7279; Olsson et al. (1982) Meth. Enzymol. 92, 3-16], előnyösen a WO 92/06193 vagy az 50 EP 239400 számú dokumentumokban leírtak szerint.

A humanizált antitestek kereskedelmileg is beszerezhetők (például Scotgen Ltd., 2 Holly Road, Twickenham, Middlesex, Nagy-Britannia).

A gp39 fehérjével vagy peptiddel specifikus reak- 55 ciót adó antitestek vagy antitestfragmensek oly módon is előállithatók, hogy baktériumsejtben expresszált, immunglobulingéneket vagy azok részleteit kódoló expressziós könyvtárakat gp39 fehérjével vagy peptiddel szkrinelünk. Például komplett Fab fragmenseket, VH 60 régiókat és FV régiókat expresszáltathatunk baktériumsejtekben fágexpressziós könyvtárak alkalmazásával (Ward et al. (1989) Natúré 341, 544-546; Huse et al. (1989) Science 246, 1275-1281; McCafferty et al.

(1990) Natúré 348, 552-554]. Ezeket a könyvtárakat például gp39 peptiddel szkrinelve azonosíthatók a gp39 molekulával reagálni képes immunglobulin-fragmensek. Másfelől a SCID-hu egér (beszerezhető:

Genpharm) szintén felhasználható antitesteknek vagy azok fragmenseinek az előállítására.

A gp39 molekula - mind humán gp39, mind pedig egér gp39 - elleni monoklonális antitestek előállításának technikáit, valamint a találmány szerinti módszer kivitelezésére alkalmas monoklonális antitesteket részletesen ismertetjük a 2. példában.

A találmány szerinti anti-humán-gp39 monoklonális antitestek előnyösen használhatók az antigénspecifikus T-sejt-tolerancia előidézésére. Az előnyösen alkalmazható antitestek a 2. példában ismertetett 3E4,

2H5, 2H8, 4D9-8, 4D9-9, 24-31, 24-43, 89-76 és 89-79 monoklonális antitestek. Különösen előnyős antitestek a 89-76 és a 24-31 monoklonális antitestek.

A 89-76 és 24-31 hibridómákat, melyek a 89-76, illetve 24-31 antitesteket termelik, a Budapesti Egyezménynek megfelelően deponáltuk az American Type «

Culture Collection (Parklawn Drive, Rockville, MD,:

USA) törzsgyűjteményben. A 89-76 hibridóma az· i

ATCC HB11713, a 24-31 hibridóma pedig az ATCC HB11712 nyilvántartási számot kapta. A 24-31 és t

89-76 antitestek IgGl izotípusúak.

A találmány szerinti módszer egy másik foganatosí- | tási módjának megfelelően az alkalmazott anti-humángp39 monoklonális antitest olyan epitóphoz kötődik, | melyet felismernek az alábbi csoportba tartozó an- s ;

titestek: 3E4, 2H5, 2H8, 4D9-8, 4D9-9, 24-31, ^!

24-43, 89-76 ás 89-79. Még előnyösebben, az antihumán-gp39 monoklonális antitest ahhoz az epitóphoz kötődik, melyet a 24-31 vagy a 89-76 monoklonális antitest ismer fel. Valamely monoklonális antitestnek az a képessége, hogy olyan epitóphoz kötődik, amilyet a korábban említett antitestek felismernek, meghatározható a szokásos keresztkompetíciós kimutatási technikával. Abban az esetben például, ha az antitest kötődik ahhoz az epitóphoz, amelyet a 24-31 monoklonális antitest felismer, akkor vetélkedni fog a jelzett 24-31 molekulával az aktivált T-sejtekhez való kötődésben. Ha az adott antitest más epitóphoz kötődik, mint amit a 24-31 monoklonális antitest felismer, akkor nem fog versengeni a jelzett 24-31 molekulával az aktivált T- + sejtekhez való kötődésben.

B. Oldható gp39 ligandumok

Másfajta, a T-sejt-tolerancia kialakítása érdekében a szervezetbe juttatható gp39 antagonisták közé tartoznak a gp39 ligandum oldható formái. Az egyértékű old- ] ható gp39 ligandum, amilyen például az oldható CD40, j képes hozzákötődni a gp39 molekulához, meggátolva ezáltal a gp39 és a B-sejten lévő CD40 kölcsönhatását. g

Az „oldható” kifejezés arra utal, hogy a ligandum nincs jállandó jelleggel a sejtmembránhoz kapcsolódva. Az r oldható gp39 ligandum elkészíthető kémiai szintézis5

HU 221 752 Bl sel, vagy - előnyösen - rekombináns DNS-technika felhasználásával, például csak a ligandum extracelluláris részletének expressziójával (a transzmembrán- és a citoplazmarészletek nélkül). Előnyös oldható gp39 ligandum az oldható CD40. Az oldható gp39 ligandum 5 fúziós fehéije formájában is lehet. Az ilyen fúziós fehérje a gp39 ligandumnak legalább egy részletét tartalmazza, egy másik molekulához kapcsolva. A CD40 például immunglobulinnal kapcsolt fúziós fehéreként is expresszálható (CD40Ig fúziós fehéije). A jelen talál- 10 mány szerinti módszer egyik foganatosítási módja szerint az előállított fúziós fehéije a CD40 extracelluláris részletének megfelelő aminosavmaradékokat tartalmazza, egy immunglobulin nehéz lánc (például Cgl) tengely, CH2 és CH3 szakaszának megfelelő ami- 15 nosavszekvenciához kapcsolva, létrehozva így a CD40Ig fúziós fehérjét [Lindsey et al. (1991) J. Exp. Med. 173, 721-730; Capon et al. (1989) Natúré 337, 525-531; Capon US 5116964], A fúziós fehéije előállítása kémiai szintézissel, vagy - előnyösen - rekombi- 20 náns DNS-technika alkalmazásával történhet, a CD40 cDNS alapján [Stamenkovic et al. (1989) EMBO J. 8,1403-1410].

II. Az antigénspecifikus tolerancia előidézésére szolgáló sejtek 25

A jelen találmány - legalábbis részben - azon a felismerésen alapszik, hogy az allogén sejtek által hordozott alloantigének kapcsolatba kerülése a T-sejtekkel gp39 antagonista jelenlétében a T-sejtek alloantigének iránti toleranciáját váltja ki. Azok a sejtek, amelyek ké- 30 pesek a tolerancia előidézésére ezzel a mechanizmussal, nem mások, mint amelyek antigént prezentálnak és a gp39 molekulával kölcsönhatásba lépve aktiválják a T-sejteket (azaz a T-sejten lévő gp39 molekula és az antigént prezentáló sejten lévő gp39 ligandum kölcsönha- 35 tása kell ahhoz, hogy a T-sejt aktiválódásához szükséges jelzés eljusson a T-sejthez). Az allogén vagy xenogén sejten lévő ligandum és a recipiens T-sejteken lévő gp39 molekulák kölcsönhatásának gátlása megakadályozza a T-sejt alloantigén vagy xenoantigén általi akti- 40 válódását, sőt a T-sejt antigének iránti toleranciáját eredményezi. A T-sejt gp39 molekula útján történő aktiválódásának megzavarása megakadályozhatja az allogén vagy xenogén sejteken lévő kostímulációs molekulák (például a B-sejten lévő B7 családba tartozó 45 molekulák) indukcióját, és így a sejt csupán antigén jelet továbbít a T-sejthez, ami a kostímulációs jel hiányában toleranciát idéz elő.

Fentieknek megfelelően, a találmány szerinti módszer kivitelezése során allogén vagy xenogén sejtet jut- 50 tatunk a recipiens szervezetbe. Az allogén vagy xenogén sejt képes antigént prezentálni a recipiens T-sejtek számára, és például B-limfocita, amely „hivatásos” antigénprezentáló sejt (például monocita, dendrocita, Langerhans sejt) vagy más, olyan sejt lehet, amely an- 55 tigént prezentál az immunsejtek számára (keratinocita, endotél sejt, asztrocita, fibroblaszt, oligodendrocita). Előnyös továbbá, ha az allogén vagy xenogén sejt csak csökkent mértékben képes kostímulációs jelet kiváltani a recipiens T-sejtekben. Lehetséges például, hogy az 60 allogén vagy xenogén sejt kismértékben vagy egyáltalán nem képes expresszábii az olyan kostímulációs molekulákat, mint a B7 családba tartozó fehéijék (például

B7-1 és B7-2). A jelen találmány szerinti módszer kivitelezése során alkalmazható allogén vagy xenogén sejtek kostímulációs molekulákat expresszáló képessége szokásos technikákkal, igy például citofluorimetriával, kostímulációs molekulák elleni antitestek felhasználásával meghatározható.

A T-sejt-tolerancia előidézésére használt allogén vagy xenogén sejtek előnyösen limfoid sejtek, például perifériás vérből származó limfociták vagy lépsejtek.

A T-sejt-tolerancia előidézésére használt limfoid sejtek előnyösen B-sejtek. A B-sejtek kevert sejtpopulációból (például más sejttípusok a perifériás vérben vagy a lépben) szokásos sejtszeparációs módszerek alkalmazásával tisztán kinyerhetők. Az adhéziós sejtek eltávolíthatók például oly módon, hogy a lépsejteket műanyagból készült edényben tenyésztjük, és a nem adhéziós sejtpopulációt kinyeijük. A T-sejtek kevert sejtpopulációból antí-T-sejt antitest (például anti-Thyl.l és/vagy antí-Thyl.2) és komplement alkalmazásával távolíthatók el. A jelen találmány szerinti módszer egy előnyös foganatodtási módja szerint nyugvó limfoid sejteket, előnyösen nyugvó B-sejteket alkalmazunk antigénprezentáló sejtekként. A nyugvó Umfbid sejtek, amilyenek például a B-sejtek, a szakmában ismert technikákkal izolálhatok, például kis méretük és sűrűségük alapján. A nyugvó limfoid sejtek izolálhatok például az 1. példában ismertetett ellenáramú centrifugális ülepítéssel. Az ellenáramú centrifugális ülepítés alkalmazásával T-sejtválaszt aktiválni képes sejtekben szegény, kisméretű, nyugvó limfoid sejtpopuláció kapható a 14-19 ml/perc |.

közötti, előnyösen pedig a 19 ml/perces frakció(k) ,, összegyűjtésével (3200 percenkénti foidulatszám mellett). Másféleképpen a kisméretű, nyugvó limfociták p (például B-sejtek) szakaszos sűrűséggradiens-centrifugálással izolálhatok, például Ficoll- vagy Percoll-gradiens alkalmazásával, midőn egy, a kisméretű, nyugvó limfocitákat tartalmazó réteget kapunk a centrifugálás után. A kisméretű, nyugvó B-sejtek megkülönböztethetők az aktivált B-sejtektől oly módon, hogy a felszínükön kostímulációs molekulákat (például B7-1 és/vagy B7-2) expresszáló aktíváit B-sejteket szokásos technikák (például immunfluoreszcencia) alkalmazásával kimutatjuk

A recipiens szervezetbe juttatott allogén vagy xenogén sejtek funkciója - legalább részben - az, hogy a recipiens T-sejtek számára donor antigént jelentenek. +

Ezért ezek a sejtek olyan antigéneket expresszálnak, amelyeket a donor szövet vagy szerv is expresszál. Ez f jellemző módon úgy biztositható, hogy az allogén vagy xenogén sejtek a szövet- vagy szervdonorból származnak. A szövet- vagy szervdonorból például perifériás limfoid sejtek, B-sejtek vagy lépsejtek izolálhatok, me- í lyek felhasználhatók a jelen találmány szerinti módszer F alkalmazása során. Az allogén vagy xenogén sejtek £ más forrásból is származhatnak, mint a szövet- vagy fszervdonor, feltéve, hogy a sejtek antigéndeterminánsai ri megegyeznek a szövet- vagy szervdonoréval. Felhasz6

HU 221 752 Bl nálhatók például az olyan allogén vagy xenogén sejtek, amelyek - zömmel vagy teljesen - expiesszálják a szövet- vagy szervdonoréval megegyező nagyobb hisztokompatibilitási komplex antigénjeit. Ilyen módon alkalmazhatók azok az allogén vagy xenogén sejtek, ame- 5 lyek a szövet- vagy szervdonor MHC haplotípusának megfelelő forrásból származnak (például a donor közeli rokonától).

III. Sejtek és gp39 antagonisták bejuttatása a recipiensbe 10

A szövet- vagy szervtranszplantátum iránti T-sejttolerancia előidézhető a jelen találmány szerinti módszer alkalmazásával, oly módon, hogy a recipiens szervezetbe gp39 antagonistát juttatunk allogén vagy xenogén sejtekkel együtt, melyek donor antigéneket exp- 15 resszálnak, és kölcsönhatásba lépnek a recipiens Tsejtekkel a gp39 útján. A találmány szerinti módszer előnyös foganatositási módja szerint az allogén vagy xenogén sejteket, valamint a gp39 antagonistát szimultán vagy egyidejűleg juttatjuk a recipiens szervezetbe. 20 Másféleképp, a gp39 antagonista az allogén vagy xenogén sejtek beadása előtt is bejuttatható a recipiensbe, például abban az esetben, ha az antagonista hosszú felezési idejű antitest. A találmány szerinti módszer előnyös foganatositási módja szerint az antagonistát és az 25 allogén vagy xenogén sejteket a szövet vagy szerv átültetését megelőzően juttatjuk a recipiens szervezetbe, azaz a recipienst az antagonistával és a sejtekkel előkezeljük. Az allogén vagy xenogén sejtek, valamint az antagonista bejuttatása történhet például több nappal (pél- 30 dául 5-8 nappal) a szövet vagy szerv átültetése előtt.

A donor szövet vagy szerv iránti T-sejt-tolerancia előidézéséhez elegendőnek bizonyult az allogén sejtek (antagonistával kombinált) egyetlen dózisban történő beadása (lásd 1. példa). A bejuttatott sejtek mennyisége 35 az alkalmazott sejttípustól, a szövet- vagy szervtranszplantátum típusától, a recipiens testtömegétől és általános állapotától, valamint egyéb, a szakmában jártasak számára nyilvánvaló faktoroktól függően változó lehet.

A találmány szerinti módszer kivitelezéséhez megfe- 40 lelő sejtmennyiség meghatározható átlagos szakértelem és hagyományos módszerek segítségével (például az 1. példában leírtak szerint). A sejtek bejuttatása a recipiensbe olyan alakban és úton történik, amely megfelelő a T-sejt-tolerancia előidézésére. A sejtek bejuttatha- 45 tők fiziológiailag elfogadható oldatban, például pufferolt sóoldatban, vagy más, hasonló módon. A sejteket előnyösen intravénásán juttatjuk a recipiensbe.

A találmány szerinti antagonistát in vivő gyógyszeradagolásra alkalmas, biológiailag kompatibilis alakban 50 juttatjuk be a recipiens alanyba a T-sejt-tolerancia előidézése érdekében. Az „in vivő adagolásra alkalmas, biológiailag kompatibilis” kifejezésen a bejuttatandó antagonista olyan alakját értjük, amelynél a lehetséges toxikus mellékhatásokat felülmúlják a vegyület terápiás hatásai. Az alany kifejezés szándékaink szerint olyan élőlényekre vonatkozik, melyekben immunválasz váltható ki (például emlősök). Ilyen alanyok például az ember, a kutya, a macska, az egér, a patkány és ezek transzgenikus változatai. A gp39 antagonista bejuttatása bármely farmakológiai alakban történheti adott esetben farmakológiailag elfogadható hordozó alkalmazásával. Az antagonista terápiásán aktív mennyiségének bejuttatása oly módon definiálható, hogy ez a mennyiség az adott dózisokban és időintervallumban szükséges és elégséges a kivánt eredmény (például Tsejt-tolerancia) eléréséhez. Egy gp39 antagonista terápiásán aktív mennyisége például az egyed egészségi állapotától, életkorától, nemétől és testtömegétől, valamint az antagonistának a kívánt hatás előidézésére való képességétől függően változó lehet Az adagolási stratégiát az optimális terápiás válasz elérésének megfelelően állíthatjuk be. A kezelés történhet például több, elosztott napi dózisban vagy akár arányosan csökkenthető is a terápiás helyzet követelményeinek megfelelően. Az 1. példában leírtak szerint a gp39 antagonistával végzett kezelés során a hatásos adagolási stratégia része az antitest bejuttatásának inicializálása a szövetvagy szervátültetést megelőzően (például 5-8 nappal a transzplantáció előtt), majd az antitest újbóli bejuttatása (például minden második napon) több héten át (2-7 héten át) a transzplantáció után.

Az aktív vegyülettel (például antagonista, amilyen egy antitest) történő kezelés bármely alkalmas módon elvégezhető, így például injekcióval (szubkután, intravénás stb.), szájon át, inhalációval, transzdermálisan vagy rektálisan bejuttatva a hatóanyagot. Az adagolás» módjától függően az aktív vegyületet bevonhatjuk valamely anyaggal, amely megvédi a vegyületet az enzimatikus hatásra, savas vagy más, természetes körűimé- * nyék között bekövetkező inaktíválédástól. Az adagolás* előnyösen intravénás injekcióval történik.

Amennyiben a gp39 antagonista bejuttatása nem parenterális úton történik, úgy szükséges lehet az antagonista bevonatolása vagy együtt adása valamely, az inaktiválódást kivédeni képes anyaggal. Az antagonista bejuttatható az egyedbe például megfelelő vivőanyag vagy hígítószer alkalmazásával, együtt adható enziminhibitorokkal, vagy olyan, alkalmas hordozóban, mint például liposzómában. A farmakológiailag elfogadható hígítószerek közé tartozik a konyhasóoldat, valamint a vizes pufferoldatok. Enziminhibitorok például a hasnyálmirigy termelte tripszin inhibitora, a diizopropil-fluorofoszfát (DEP) és a trazilol. A liposzómák lehetnek víz/olaj/víz emulziók éppúgy, mint hagyományos liposzómák [Strejan et al. (1984) J. Neuroimmunol. 7,27J.

Az aktív vegyület parenterálisan vagy intraperitoneálisan is bejuttatható. Készíthetők diszperziók is, glicerin, folyékony polietilénglikolok vagy ezek elegyeinek, valamint olajoknak a felhasználásával. A tárolás és az alkalmazás szokásos körülményei között ezek a készítmények a mikroorganizmusok elszaporodásának megakadályozására konzerválószert is tartalmazhatnak.

Az injektálásra alkalmas gyógyszerkészítmények lehetnek steril vizes oldatok (ha a hatóanyag vizoldható), avagy diszperziók és steril porok a steril injektálható oldatok vagy diszperziók közvetlen felhasználás előtti elkészítéséhez. A készítménynek valamennyi esetben sterilnek és kellőképp folyékonynak kell lennie. Stabilnak

HU 221 752 BI kell lennie a gyártás és a tárolás körülményei között, valamint meg kell akadályozni a baktériumok és gombák okozta mikrobiális fertőződését. A vivőanyag lehet oldószer vagy diszperziós közeg, amely például vizet, etanolt, poliolt (például glicerint, polipropilénglikolt, folyékony polietilénglikolokat és hasonlókat), valamint ezek alkalmas keverékeit tartalmazza. A megfelelő folyékonyság biztosítható például bevonatok (például lecitin) alkalmazásával, diszperziók esetében a szükséges részecskeméret fenntartásával és felületaktív anyagok használatával. A mikroorganizmusok elszaporodása megakadályozható különféle antibakteriális és antifungális szerekkel, például parabennel, klór-butanollal, fenollal, aszkoibinsawal, timerozállal, és hasonlókkal. Sok esetben előnyös lehet izotóniás szerek, például cukrok, polialkoholok (mannit, szorbit), konyhasó alkalmazása a készítményben. Az injektálható készítmény felszívódása elnyújtható, ha a készítménybe a felszívódást lassító szereket, például aluminium-monosztearátot és zselatint keverünk.

A steril injektálható oldat elkészítéséhez az aktív vegyület (például gp39 antagonista) szükséges mennyiségét alkalmas oldószerben feloldjuk, a fentiekben számba vett ingrediensek közül eggyel vagy többel elegyítjük, majd sterilre szűrjük. A diszperziókat általában úgy készítjük, hogy az aktív vegyületet hozzáadjuk a diszperziós alapközeget, valamint a szükséges egyéb ingredienseket tartalmazó steril hordozóhoz. Steril injektálható oldatok elkészítésére szolgáló steril porok esetében az előállítás legelőnyösebb módja a vákuumszárítás és a fagyasztva szárítás, mely az előzetesen elkészített és sterilre szűrt oldatból a hatóanyagon (például antagonista) túlmenően bármely más kívánt ingredienst is tartalmazó port eredményez.

Ha az aktív vegyületet a korábban leírtak szerint megfelelőképpen megvédjük, akkor a fehéije szájon át is bejuttatható, például inért higitószeirel vagy ehető, emészthető hordozóval. Jelen értelemben a „farmakológiailag elfogadható hordozó” bármely és valamennyi oldószerre, diszperziós közegre, bevonatra, antibakteriális és antifungális szerre, izotóniás és felszívódást lassító anyagra, és hasonlókra egyaránt vonatkozik. Az ilyen közegek és szerek alkalmazása farmakológiailag aktív hatóanyagok esetében közismert a szakmában jártasak előtt. Az aktív vegyülettel esetlegesen inkompatibilis hagyományos közegek és szerek alkalmazása a készítményben megfontolandó. A készítmény más aktív vegyületekkel is kiegészíthető.

Különösen előnyős a parenterális készítmények dózisegységként való kiszerelése, mivel ez megkönnyíti a bejuttatást, és egységesíti az adagolást. A dózisegység kifejezés jelen értelemben diszkrét fizikai egységeket jelent, melyek egységnyi adagot tartalmaznak emlős alanyok kezelésére. Minden egység az aktív vegyület meghatározott mennyiségét tartalmazza, melyet a kívánt terápiás hatás eléréséhez szükséges értékre számítottunk ki, a szükséges gyógyászati vivőanyag figyelembevételével. A találmány szerinti egységdózis jellemzői szigorúan meghatározottak, és egyértelműen függnek (a) az aktív vegyület egyedi tulajdonságaitól és az elérni kívánt terápiás hatástól, valamint (b) a kezelésre szolgáló vegyületből való gyógyszerkészítéssel járó megkötöttségektől.

A tolerancia előidézésére irányuló, fentiekben ismertetett kezelést követően vagy azzal egyidejűleg, a donor szövetet vagy szervet hagyományos technikák alkalmazásával átültetjük a redpiensbe.

IV. A találmány szerinti módszerek alkalmazása

A jelen találmány szerinti módszerek széles körben felhasználhatók szövet- és szervátültetések során. Ezek a módszerek alkalmasak arecipiens szervezetben Tsejt-tolerancia előidézésére olyan szövet- vagy szervtranszplantátumok iránt, mint például a hasnyálmirigyszigetek, a máj, a vese, a szív, a tüdő, a bőr, az izom, az idegszövet, a gyomor és a bél. Ilyen módon a találmány szerinti módszerek felhasználhatók mindazon betegségek vagy állapotok kezelése során, melyek végső soron a transzplantációt szükségessé teszik (például májátültetés hiperkoleszterinémia kezelésére, izomsejt-átültetés izomsorvadás kezelésére, idegszövet-átültetés, Huntington-betegség vagy Parkinson-kór kezelésére stb.). A találmány szerinti módszer előnyös foganatosítási módja szerint az átültetendő szövet hasnyálmirigysziget. Ennek megfelelően a találmány a cukorbetegség kezelésére szolgáló módszert biztosit, a hasnyálmirigyszigetsejtek átültetése révén. A módszer kivitelezése során a kezelendő alany szervezetébe juttatunk: 1) allogén vagy xenogén sejteket, melyek donor antigéneket expresszálnak, 2) a recipiens T-sejtjén expresszálódó, a kontaktustól függő segítő-végrehajtó funkciót közvetítő molekula antagonistát (például anti-gp39 antitestet),» valamint 3) donor hasnyálmirigy-szigetsejteket.

A következő példák a találmány jobb megértését szolgálják, semmiképpen sem korlátozva annak tárgy» körét.

1. példa

Hasnyálmirigysziget-transzplantátum iránti tolerancia előidézése a recipiens allogén sejtekkel és anti39 antitesttel történő kezelésével

Napjaink allotranszplantációs technikája a generalizált immunszuppresszióra támaszkodik, amely nemspecifikusan megszünteti az immun végrehajtó funkciókat. Mindazonáltal, az immunszuppresszív hatóanyagoknak számottevő mellékhatásuk lehet. Ráadásul a cukorbetegségnek Langerhans-sziget allotranszplantációval történő kezelése nem bizonyult járható útnak ezzel a módszerrel [Robertson, R P. (1992) N. Engl. J. Med. 327,1861]. A T-sejtek elleni antitesttel végzett terápia lehetővé teszi a szigetsejtek sikeres allotranszplantációját rágcsálókban, de ez a módszer rendszerint ugyancsak generalizált immunszuppresszióhoz vezet [Carpenter, C. B. (1990) N. Engl. J. Med. 322, 1224; Roark, J. H. et al. (1992) Transplantation 54, 1098; Kahan, B. D. (1992) Curr. Opin. Immunoi. 4, 553]. Az e példában ismertetett kísérletben a recipiens szervezetnek az átültetett sziget allotranszplantátumok iránti toleranciáját oly módon idéztük elő, hogy manipuláltuk az alloantigén prezentálását a T-sejt számára, megakadályozva így annak aktiválódását. A kémiai módszerrel di8

HU 221 752 Bl abetikussá tett C57BL/6(H-2^b) egérbe ültetett szigetallograft túlélésének vizsgálatát a következők szerint végeztük:

Cukorbetegség indukálása

Hím C57BL/6J(H-2^b) egereket streptozotocin 5 (140 mg/kg) intravénás adásával diabetikussá tettünk.

Az állandósult cukorbetegség tényét a vérplazma glükózkoncentrációjának egy hét alatt három alkalommal elvégzett mérésével igazoltuk (£400 mg/dl).

Allogén lépsejt frakcionálása 10

A recipiens egyedek előkezeléséhez szükséges allogén donorsejteket (C57x BALB/c) (H—2^b/d)F₁ hibrid állatokból nyertük, hogy a befogadó szervezettel szembeni reakciót elkerüljük. A kisméretű limfotikus sejtek izolálásához 8 hetes (C57xBALB/c)F_{ nőstény 15 egerek lépsejtszuszpenziójából kivontuk az eritrocitákat, majd ülepítéssel méret szerinti frakcionálást végeztünk [Tony, Η. P. et al. (1985) J. Exp. Med. 161, 223; Gosselin, E. J. et al. (1988) J. Immunoi. 140, 1408]. Röviden, a kisméretű limfocitákat ellenáramú centrifugális 20 ülepitéssel, például J-6B típusú centrifugán (Beckman Instruments, Palo Alto, CA, USA) izoláltuk. Körülbelül 1-5x10* sejtet 8 ml tápközegben vagy 1,5% magzati borjúszérumot tartalmazó kiegyenlített sóoldatban dezoxiribonukleáz enzimmel kezeltünk, majd az elegyet 25 ülepítőkamrába töltöttük, és 13,5 ml/perc kezdeti ellenáramú átfolyási sebességről indulva 4 °C-on pörgettük állandó, 3200 percenkénti fordulatszámot biztosítva.

A kisméretűsejt-frakció, nagyon kevés nagysejtszennyezéssel, jellemzően 14-19 ml/perc tartományban 30 eluálódik, bár a pontos átfolyási sebesség attól a közegtől is függ, amelyben a sejteket szuszpendáltuk. Az itt leírt kísérlet során a kisméretűsejt-frakciót 19 ml/perc értéknél (3200 fordulat/perc) kaptuk. Ez a frakció teljesen mentes volt a sugárzás rezisztens (3000 rád) járulékos 35 sejtfunkciótól a nyúl IgG és H2^d(CDC35) specifikus Tsejtvonal, valamint a H2b(D10-G4)-gyel alloreaktív Tsejtvonal alkalmazásával végzett meghatározások tanúsága szerint. A kisméretű sejteket, illetve a frakcionálatlan sejteket kétszer mostuk szérummentes közeggel a 40 recipiens farokvénájába való injektálás előtt. A kezeléshez körülbelül 40-100χ 10« (C57xBALB/c)F,(H-2M) frakcionálatlan lépsejtet, illetve 40-100x10« (C57xBALB/c)F₁(H-2^b/d) ülepített kisméretű lépsejtet használtunk fel. 45

A recipiensek előkezelése

A recipienseket előkezeltük külön-külön frakcionálatlan (C57xBALB/c)F,(H-2^b/íl) allogén lépsejtekkel; ülepített, „19-es ffakciójú”, kis átmérőjű lépsejtekkel, melyekből kivontuk az APC-aktivitást; anti-gp39 an- 50 titesttel (MRI molekula, a 2. példa 3. kísérletében); vagy allogén sejtek és anti-gp39 antitest kombinációjával. A 19-es frakció sejtjeit két különböző dózistartományban is kipróbáltuk, 40-44x10« alsó koncentráció, illetve 77-88 χ 10« felső koncentráció alkalmazásé- 55 val. A kontrollállatok sem allogén sejteket, sem antitestkezelést nem kaptak. Az allogén sejteket 5-8 nappal az allotranszplantációt megelőzően juttattuk a recipiensbe, a farokvénába injektálva. Az MRI antitestkezelés 250 mg/egér dózisban, hetenként kétszer tör- 60 tént, a transzplantáció előtt hét nappal kezdve, majd további 2-7 héten át, illetve a kilökődésig folytatva. Az első antitestinjekciót általában ugyanaznap adtuk, mint az allogén lépsejtek első injekcióját.

Hasnyálmirigy-allotranszplantáció

Allogén BALB/c(H-2^d) hasnyálmirigy-szigetsejteket izoláltunk a módosított kollagenáz emésztéses módszerrel [Gottlieb, P. A. et al. (1990) Diabetes 39, 643].

Közvetlenül izolálás után a szigetsejteket 30 sziget/g testtömeg dózisban a recipiens C57Bl/6J(H-2^b) egerek szubrenális kapszulájába ültettük be. A transzplantátum túlélését a plazma glükózkoncentrációjának 200 mg/dl alatti értéken tartásával definiáltuk.

Eredmények

Az első kísérletsorozatban a szigetallograft recipienseket allogén lépsejtekkel, illetve anti-gp39 antitesttel külön-külön előkezeltük. Amint az az 1. ábrán látható, a lépsejtes előkezelés hiányában valamennyi szigetallograft kilökődött a transzplantációt követő 13 napon belül (9±2 nap; tartomány 5-13 nap; N=23).

Gyenge volt a szigetek túlélése azokban az állatokban is, melyeket csak normál APC-aktivitással rendelkező frakcionálatlan lépsejtekkel (6±3 nap; tartomány 4-12 nap; N=7) vagy kis dózisban (40-44x10« sejt)

19-es frakciójú APC-mentes lépsejtekkel kezeltünk l (7+3 nap; tartomány 3-14 nap; N=16). Ezzel ellentét- j ben, a magasabb dózisban adott kisméretű splenociták j (75-88 χ 10« sejt) meghosszabbították az allograft túlélé- j sét (19±10 nap; tartomány 7-40 nap, N=16). A graft | túlélésének hosszára gyakorolt hatás statisztikailag szignifikánsnak tekinthető (F_3i5g=17,3 p<0,001, ha a keze-*’ letlen, a teljes léppel kezelt, avagy a kisdózisú 19-es frakciójú lépsejtekkel kezelt csoport adataihoz hasonlítjuk), de nem volt állandó. Az allogén szigetek meghosszabbított, ám véges túlélése az APC-mentes, 19-es frakciójú, kisméretű sejtekkel kezelt diabetikus recipiensekben azt mutatta, hogy ezek a sejtek önmagukban * nem képesek fenntartani az allograft túlélését.

A recipiensek egy másik csoportját a 20-as frakció sejtjeivel kezeltük 77-88 χ 10« dózisban. Ez a frakció zömmel szintén kisméretű limfocitákat tartalmazott, de eltért a 19-es frakciótól abban a tekintetben, hogy mérhető APC-aktivitást tartalmazott. Az ezzel kezelt recipienseknél csaknem azonnali kilökődés volt tapasztalható (átlag 8,5 nap; tartomány 6-12; N=6). A recipiensek másik csoportját egyedül az MRI anti-gp39 antitesttel kezeltük. Az 1. ábrán látható, hogy a szigetallograftok 15 napon belül kilökődtek a csak anti-gp39 monoklonális antitesttel kezelt 11 egér közül 7 esetében. A mara- t dék 4 egérben a transzplantátum működőképes volt a kísérlet befejeztekor, a 48. napon is. Ezek az eredmények azt mutatják, hogy ha egyedül az MRI anti-gp39 antitestet juttatunk a recipiensbe, az képes meghosszabbítani a szigetallograft túlélését. A meghosszabbítás mértéke statisztikailag hasonló a magasabb dózisú 19-es frakciójú lépsejtekkel önmagukban végzett kezelésnél elért- L hez, és szignifikánsan felülmúlja a másik három csőportnál kapott eredményt (p<0,05). ΙΑ fentiekben ismertetett kísérletsorozat azt jelzi, jhogy a nagy dózisban adagolt 19-es frakciójú, APC9

HU 221 752 Bl mentes lépsejtekkel, csakúgy mint az anti-gp39 monoklonális antitesttel önmagában végzett kezelés fokozza az allotranszplantátum túlélőképességét, a kezeletlen kontrolihoz viszonyítva. Egyik fajta kezelés sem bizonyult azonban kellően hatékonynak a recipiensnek a szigetallograft iránti tartós toleranciája előidézését illetően. A következő kísérletsorozatban az allogén lépsejtekkel való kezelést kombináltuk a recipiens antigp39 kezelésével. Az allogén lépsejtes és az antigp39 kezelés kombinálása hatásosabbnak bizonyult, mint bármelyikük önmagában. Az eredmények a 2. ábrán láthatók, ahol mindegyik görbe egy-egy egér adatait mutatja. A világos jelek azokhoz a recipiensekhez tartoznak, amelyeknél a szigetallograft spontán kilökődését tapasztaltuk. A sötét jelek azoknak az egereknek az adatait ábrázolják, melyekben a transzplantátum működőképes volt a kísérlet befejeztekor is. A 2. ábra tanúsága szerint (B) meghatározatlan grafttúlélés érhető el azoknál az állatoknál, amelyeket 7 héten át antigp39 monoklonális antitesttel kezeltünk, és emellett egyetlen injekcióban kapták a 19-es frakció APCmentes lépsejtjeit (N=6). Ennek a kísérleti beállításnak az a módosítása, hogy ha az anti-gp39 kezelés időtartamát csökkentettük, az gyengítette, de nem szüntette meg a grafl túlélésére gyakorolt kedvező hatást. Meghatározatlan grafltúlélést tapasztaltunk nyolcból hat recipiensnél, midőn az anti-gp39 monoklonális antitestkezelést csak két héten át végeztük a 19-es frakciójú lépsejtekkel együtt (2 A. ábra). A meghatározatlan idejű grafttúlélés abban az esetben is megfigyelhető volt, amikor a recipienseket 2 vagy 7 héten át kezeltük, egyetlen, frakcionálatlan allogén lépsejteket tartalmazó injekcióval kombinálva.

Annak érdekében, hogy a szigettranszplantátum működőképességét igazoljuk, és a streptozotocinkezeléssel el nem pusztított, visszamaradó természetes szigetek inzulinkiválasztásának lehetőségét kizárjuk, a szubrenális implantátumokat tartalmazó veséket eltávolítottuk. Az unilaterális neftektómia minden esetben a hiperglikémia (>300 mg/dl) kiújulását eredményezte 3 napon belül.

A szigettranszplantátumokat és a természetes hasnyálmirigyeket hisztológiai vizsgálatnak vetettük alá minden állatban, a kilökődéskor, illetve a kísérlet befejeztével. A frakcionált, allogén kisméretű limficitákkal, valamint folyamatosan (7 héten át) MR1 monoklonális antitesttel kezelt recipiensek veséjében lévő transzplantátum hisztológiai metszetén a renális kapszula alatt bőven láthatók olyan ép szigetek, melyek mentesek a mononukleáris beszűrődéstől, és inzulinszemcséket, valamint glükagon pozitív sejteket tartalmaznak. Ezzel szemben a csupán anti-gp39 monoklonális antitesttel kezelt recipiensek veséjében lévő szigettranszplantátumok hisztológiai metszetén jellegzetesen kiterjedt mononukleáris sejtgyulladás, és az ezzel járó szigetsejtpusztulás volt megfigyelhető. Valamennyi alany esetében a hasnyálmirigyben lévő szigetsejtek morfológiája egyöntetűen megfelelt a streptozocinnal kiváltott cukorbetegség esetén tapasztalhatónak.

2. példa

Az anti-gp39 antitestek előállítása és jellemzése

1. kísérlet - Humán gp39 elleni antitestek

Annak érdekében, hogy antigénspecifikus T-sejttoleranciát idézzünk elő emberi szervezetben, előnyösen humán gp39 elleni antitestet alkalmazunk. Az antihumán-gp39 egér monoklonális antitestek előállítása az alábbiak szerint történt Balb/c egereket gp39-CD8, oldható gp39 fúziós fehérjével immunizáltunk, komplett Freund-adjuváns (CFA) alkalmazásával. Hat héttel később az egereket oldható gp39-CD8 fehérjével provokáltuk, ezúttal inkomplett Freund-adjuvánsban (IFA) beadva. Négy héttel a másodlagos immunizálás után az oldható gp39-CD8 fehéije vízoldható formáját juttattuk az egerekbe, az immunválasz erősítésére. Ezután két héttel az egerek immunitását humán perifériás vérből származó, aktivált limfocitákkal fokoztuk, majd az utolsó megerősítés újabb két hét után oldható gp39-CD8 fehérjével történt. A végső immunizálás után 4 nappal a splenocitákat az NS-1 fúziós partnerrel fuzionáltattuk a szokásos eljárás szerint.

Az anti-humán-gp39 antitesteket termelő kiónokat többszörös szkrinelés alapján választottuk ki. A kiónok szkrínelését először a gp39-CD8 kötődésének vizsgálatával végeztük. A pozitív kiónokat ezután CD8 fúziós fehéqekontrollal, CD72-CD8 fehérjével szkrineltük. Az ebben a vizsgálatban pozitív eredményt adó klánokat elvetettük. A maradék klóitokat ezt követően nyugvó, illetve hat órán át aktivált, humán perifériás vérből származó limfocitákon (PBL) szkrineltük, citofluorimetriás analízissel. Az aktivált limfocitákkal reakciót adó, de a nyugvó limfocitákkal nem reagáló hibridómák esetében tekintettük az eredményt pozitívnak. Legvégül, a maradék kiónoknál azt vizsgáltuk meg, hogy képesek-e blokkolni a CD401g kötődését a lemezen rögzített gp39 molekulához.

2. kísérlet - Humán gp39 elleni antitestek

Az 1. kísérletben ismertetetthez hasonló immunizálási eljárással további, humán gp39 elleni antitesteket állítottunk elő. Egyetlen Balb/c egeret oldható gp39-CD8 és CFA alkalmazásával immunizáltunk, majd az immunválaszt humán perifériás vérből származó, hat órán át aktivált limfocitákkal provokáltuk négy hét múlva. Az egér immunreakcióját ezután oldható gp39-CD8 fúziós fehérjével megerősítettük, majd négy nap múlva a splenocitákat NS-1 fúziós partnerrel fúzionáltattuk, a szokásos eljárás szerint. A hibridómaklónok szkrínelését hat órán át aktivált PBL felhasználásával, citofluorimetriás analízissel végeztük. Az aktivált limfocitákkal reakciót adó, de a nyugvó limfocitákkal nem reagáló kiónokat kiválasztottuk. A következő hat kiónt választottuk ki a további vizsgálatokhoz: 4D9-8, 4D9-9,24-31,24-43,89-76 és 89-79.

A kiválasztott antitestek specifitását több vizsgálattal igazoltuk. Először citofluorimetriás analízissel mutattuk ki, hogy mind a hat monoklonális antitest reakcióba lép az aktivált perifériás T-sejtekkel, de nem reagál a nyugvókkal (jellemző példa látható a 3A. és 3C. ábrán, melyek az aktivált T-sejtek reakcióját mutatják a 4D9-8, illetve 4D9-9 antitestekkel). Az összes felsorolt antitest ál10

HU 221 752 Bl tál felismert molekula expressziója kimutatható 4 órás aktiválás után, maximális az aktiválás utáni 6-8 óra között, és kimutathatatlan az aktiválás után 24 órával. Mind a hat monoklonális antitest felismer egy molekulát, melyet az aktivált CD3+PBL, főleg a CD4+ fenotípusú termel, 5 de a CD8⁺ T-sejtek egy része is expresszálja a szóban forgó molekulát. A hat monoklonális antitest által felismert molekula expressziója gátolt, amennyiben ciklosporin-A van jelen a tápközegben, éppúgy, mint a gp39 expressziója (jellemző példa látható a 4A. és 4B. ábrán, me- 10 lyek a ciklosporinnal kezelt T-sejtek reakcióját mutatják 4D9-8, illetve 4D9-9 antitestekkel). Az ezen antitestek által felismert molekula expressziójának kinetikája és megoszlása azonos a gp39 molekuláéval, amint az a humán CD401g fúziós fehérjével kimutatható. Ezen tűimé- 15 nőén mind a hat monoklonális antitest blokkolja a gp39 és a CD40Ig reakcióját (jellemző példa látható az 5A. és 5B. ábrán, melyek a gp39 és a CD40Ig reakciójának gátlását mutatják 4D9-8, illetve 4D9-9 jelenlétében). ELISA-módszerrel végzett vizsgálat alapján mind 20 a hat monoklonális antitest felismeri a gp39-CD8 fehérjét, mely a gp39 molekula oldható, fúziós alakja. Ezenkívül mind a hat monoklonális antitest immunprecipitál egy körülbelül 36 kilodalton méretű molekulát a ³⁵S-metioninnal jelzett humán perifériás vérből származó limfo- 25 citákból. Az immunprecipitált molekula azonos azzal, melyet a humán CD40Ig fúziós fehérje precipitál.

A hat kiválasztott monoklonális antitest (4D9-8, 4D9-9, 24-31, 24-43, 89-76 és 89-79) funkcionális aktivitásának vizsgálata a következők szerint történt Először meghatároztuk az antitesteknek azt a képességét, hogy gátolják az IL-4 és oldható gp39 jelenlétében tenyésztett, tisztított humán B-sejtek proliferációját A tisztított humán B-sejteket gp39 és IL-4 fehérjét tartalmazó közegben tenyésztettük, a tisztított monoklonális antitestek, vagy CD40Ig jelenlétében, illetve távollétében (alkalmazott dózisok: 0-12,5 mg/ml). A B-sejtek proliferációját a timidin beépülésének mérésével határoztuk meg a tenyészetben 3 nap múlva. Az eredmények (6. ábra) szerint mind a hat monoklonális antitest képes gátolni a B-sejtek gp39 és IL-4 indukálta proliferációját Az indukált B-sejt-proliferáció gátlásában leghatásosabbnak a 89-76 és a 24-31 antitestek bizonyultak.

Ezután az anti-CD3 molekulával aktivált T-sejtekkel és IL-2 fehérjével indukált Ig-termelés mérésével azt vizsgáltuk, hogy az antitestek képesek-e gátolni a B-sejtek differenciálódását. A tisztított IgD+ humán Bsejteket FACS alkalmazásával végzett pozitív szelekcióval állítottuk elő. Az így kapott B-sejteket antiCD3 molekulával aktivált (mitomycin C-vel kezelt) humán T-sejteket és IL-2 fehérjét tartalmazó közegben tenyésztettük, tisztított anti-gp39 monoklonális antitestek jelenlétében, illetve távollétében (alkalmazott dózisok: 0-10 mg/ml). A tenyésztés hatodik napján az IgM-, IgG- és IgA-képződést ELISA-módszerrel meghatároztuk. Az eredmények (1. táblázat) szerint mind a hat antitest képes gátolni az IgM, IgG és IgA termelődésével mért T-sejt-függő B-sejt-differenciálódást.

1. táblázat

Monoklonális antitest	Dózis mg/ml	Immunglobulin-termelés
IgM	IgG	IgA
-	-	17500	6710	4471
4D9-8	0,1	4813	2130	2819
	1,0	4394	2558	1519
	10,0	1081	389	396
4D9-9	0,1	3594	919	1731
	1,0	2659	1233	1606
	10,0	374	448	266
24-31	0,1	3863	981	344
	1,0	1287	314	165
	10,0	1120	596	23
24-43	0,1	6227	4132	432
	1,0	3193	2130	192
	10,0	7021	1232	1081
89-76	0,1	3783	1069	344
	1,0	2180	352	171
	10,0	818	551	19
89-79	0,1	9763	1924	3021
	1,0	2314	460	156
	10,0	183	135	434

la

SS

HU 221 752 BI

Annak érdekében, hogy megvizsgáljuk az antigp39 monoklonális antitesteknek a T-sejt-válaszokra gyakorolt hatását, a monoklonális antitestekkel elvégeztük a szabványos kevert limfocita reakciót (MLR). Humán perifériás vérből származó 300 000 limfocitát (vá- 5 laszobjektumok=R) együtt tenyésztettünk besugárzott allogén perifériás vérből származó 100 000 limfocitával (stimuláló objektumok=S) az anti-gp39 monoklonális antitestek jelenlétében (10 mg/ml), illetve távollétében. A tenyészetekhez impulzusszerűen ³H-timidint adtunk a 4., 5. és 6. napon, majd 18 órával később a sejteket kinyertük. Mind a hat anti-humán-gp39 monoklonális antitest gátolta az MLR módszerrel mért allospecifikus válaszreakciót (jellemző példa látható a

7. ábrán, amely az allospecifikus válaszreakció gátlását 15 mutatja, midőn az R és S inkubálása 24-31, illetve

89-76 jelenlétében történt; pozitív kontrollként

CTLA4-immunglobulin fúziós fehérjét és antiCD28 monoklonális antitestet használtunk).

Annak kiderítésére, hogy vajon a hat monoklonális antitest különböző epitópokat ismer-e fel a humán gp39 molekulán, keresztblokkolási kísérleteket hajtottunk végre. Először aktivált humán PBL blokkolását végeztük el a hat monoklonális antitest mindegyikével (25 mg/ml konjugálatlan antitest). A sejteket mostuk, majd előbb antitest-biotin konjugátummal (10 mg/ml), azután pedig fítoeritrin-avidin konjugátummal (PE-Αν) reagáltattuk őket. A reakciót FACS alkalmazásával értékeltük. Az eredményeket a 2. táblázat tartalmazza.

2. táblázat

Blokkoló antitest	Reaktáns antitest
4D9 8	4D9-9	24-31	24-43	89-76	89-79
-	+++	+ + +	+ + + +	+ + + +	+ + + +	+ + + +
4D9-8	ND	-	+ + + +	+ + + +	+ + +	+ + +
4D9-9	+ + +	ND	+ + +	+ + + +	+ + +	+ + +
24-31	+	+	ND	+ + +	+ +	+ +
24-43	+	+	+ + +	ND	+ +	+
89-76	+	+	+++	+ + +	ND	+ + +
89-79	+	+ +	+++	+ + +	+ + +	ND

A reakció (elszíneződés) intenzitása és a pozitív sejtek százalékos arányát jelzi a + szimbólum (+ + + + =MI>200; + + + =MI>125; + + =MI>50; + =MI>25; -=a háttérhez képest elszíneződés nem látható). ND=nem vizsgáltuk.

Valamennyi antitest blokkolta a CD40Ig kötődését az aktivált humán PBL sejtekhez. A 2. táblázatban lévő adatok azonban világosan mutatják, hogy némely antitest nem volt képes blokkolni más antitestek kötődését az aktivált humán PBL sejtekhez, ami annak a jele, hogy különböző epitópokat ismernek fel a humán gp39 molekulán.

A 89-76 és 24-31 hibridómákat, melyek a 89-76, illetve 24-31 antitesteket termelik, a Budapesti Egyezménynek megfelelően deponáltuk az American Type Culture Collection (Parklawn Drive, Rockville, MD, USA) törzsgyűjteményben 1994. szeptember 2-án. A 89-76 hibridóma az ATCC HB11713, a 24-31 hibridóma pedig az ATCC HB11712 nyilvántartási számot kapta.

3. kísérlet - Egérgp39 elleni antitestek

A találmány szerinti módszer egyik foganatosítási módjának megfelelően a gp39 antagonistaként MR1 anti-egér-gp39 monoklonális antitestet használunk. Az MR1 monoklonális antitest előállítását a következő eljárással végeztük, mely alkalmas további gp39 elleni antitestek előállítására is.

Hörcsögöket immunizáltunk intraperitoneálisan, 5x10® aktivált T_bl sejt (dl .6) felhasználásával, hetenkénti kezeléssel, összesen hat héten át Amikor az egér T_hl elleni szérumtiter meghaladta a kb. 1:10 000 értéket polietilénglikolt alkalmazva sejtfúziót hajtottunk végre immunizált hörcsög splenociták és NS-1 felhasználásával. A szaporodó hibridómákat tartalmazó mikrotiterlemezlyukakból vett felülúszót nyugvó, illetve aktivált T_hl sejteken szkríneltük citofluorimetriás módszerrel. Egyetlen hibridómát, mely az aktivált T_h sejtet szelektíven felismerő monoklonális antitestet termelt, további kipróbálásnak vetettünk alá, és szubklónoztunk az MR1 elkészítése céljából. Az aszcitesz sejtekben előállított MR1 tisztítása ioncserés HPLC-módszerrel történt. Az MR1 hibridómát deponáltuk az American Type Culture Collection törzsgyűjteményben, ahol az ATCC HB11048 nyilvántartási számot kapta.

Claims (41)

1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK

   1. Kompozíció, amely donor szövet vagy szerv iránti T-sejt-toleranciának a szövetet vagy szervet befogadó szervezetben történő előidézésére szolgál, azzal jel12

   HU 221 752 Bl lemezve, hogy a következő anyagok kombinációját tartalmazza:

   a) allogén vagy xenogén sejtet, mely legalább egy hasnyálmirigy-, máj-, vese-, szív-, tüdő-, bőr-, izom-, ideg-, gyomor- vagy béleredetű donor antigént expresszál, és amely egy, a recipiens szervezet kontaktusfüggő segítő-végrehajtó fúnkciót közvetítő T-sejtjeinek felszínén lévő receptorral kölcsönhatásba lépő ligandummal rendelkezik a sejt felszínén; valamint

   b) a recipiens T-sejt felszínén lévő receptor antagonistáját, amely gátolja a ligandum és a receptor kölcsönhatását.
2. 2. Az 1. igénypont szerinti kompozíció, azzal jellemezve, hogy a kontaktusfiiggő segítő-végrehajtó fúnkciót közvetítő T-sejt felszínál lévő receptor gp39.
3. 3. A 2. igénypont szerinti kompozíció, azzal jellemezve, hogy az antagonista anti-gp39 antitest
4. 4. A 3. igénypont szerinti kompozíció, azzal jellemezve, hogy az anti-gp39 antitest monoklonális antitest.
5. 5. A 3. igénypont szerinti kompozíció, azzal jellemezve, hogy az anti-gp39 antitest anti-humán-gp39 antitest.
6. 6. A 4. igénypont szerinti kompozíció, azzal jellemezve, hogy a monoklonális antitest MR1 antitest (deponálási szám: HB 11048).
7. 7. A 4. igénypont szerinti kompozíció, azzal jellemezve, hogy a monoklonális antitest kiméra monoklonális antitest vagy egy humanizált monoklonális antitest
8. 8. Az 1. igénypont szerinti kompozíció, azzal jellemezve, hogy az allogén vagy xenogén sejt limfoid sejt.
9. 9. A 8. igénypont szerinti kompozíció, azzal jellemezve, hogy a limfoid sejt B-sejt.
10. 10. A 9. igénypont szerinti kompozíció, αζζα/ jellemezve, hogy a B-sejt nyugvó B-sejt.
11. 11. Az 1. igénypont szerinti kompozíció, azzal jellemezve, hogy az átültetésre kerülő szövet vagy szerv hasnyálmirigysziget.
12. 12. Kompozíció, amely donor szövet vagy szerv iránti T-sejt-toleranciának a szövetet vagy szervet befogadó szervezetben történő előidézésére szolgál, azzal jellemezve, hogy a következő anyagok kombinációját tartalmazza:

    a) allogén vagy xenogén sejtet, mely legalább egy hasnyálmirigy-, máj-, vese-, szív-, tüdő-, bőr-, izom-, ideg-, gyomor- vagy béleredetű donor antigént expresszál, és

    b) egy gp39 antagonistát.
13. 13. A12. igénypont szerinti kompozíció, azzaljellemezve, hogy a gp39 antagonista anti-gp39 antitest.
14. 14. A 13. igénypont szerinti kompozíció, azzaljellemezve, hogy az anti-gp39 antitest monoklonális antitest.
15. 15. A 13. A igénypont szerinti kompozíció, azzal jellemezve, hogy az anti-gp39 antitest anti-humángp39 antitest.
16. 16. A 14. igénypont szerinti kompozíció, azzal jellemezve, hogy a monoklonális antitest MR1 antitest (deponálási szám: HB 11048).
17. 17. A 14. igénypont szerinti kompozíció, azzal jellemezve, hogy a monoklonális antitest kiméra monoklonális antitest vagy egy humanizált monoklonális antitest.
18. 18. A 12. igénypont szerinti kompozíció, ózza/ jellemezve, hogy a gp39 antagonista oldható formájú gp39 ligandum.
19. 19. A18. igénypont szerinti kompozíció, azzal jellemezve, hogy az oldható formájú gp39 ligandum CD40 fúziós fehérje.
20. 20. A12. igénypont szerinti kompozíció, azzal jellemezve, hogy az allogén vagy xenogén sejt limfoid sejt.
21. 21. A 20. igénypont szerinti kompozíció, azzal jellemezve, hogy a limfoid sejt B-sejt.
22. 22. A 21. igénypont szerinti kompozíció, azzal jellemezve, hogy a B-sejt nyugvó B-sejt.
23. 23. Az 14. igénypont szerinti kompozíció, azzal jellemezve, hogy az átültetésre kerülő szövet vagy szerv hasnyálmirigysziget.
24. 24. Kompozíció cukorbetegség kezelésére, azzal jellemezve, hogy a következő anyagok kombinációját tartalmazza:

    a) allogén vagy xenogén sejtet, mely legalább egy donor antigént expresszál;

    b) egy gp39 antagonistát; valamint

    c) a donor hasnyálmirigy-szigetsejteket.
25. 25. A 24. igénypont szerinti kompozíció, azzal jellemezve, hogy az anti-gp39 antitest monoklonális antitest.
26. 26. A 24. igénypont szerinti kompozíció, azzal jellemezve, hogy az anti-gp39 antitest anti-humán-gp39 antitest.
27. 27. A 25. igénypont szerinti kompozíció, azzaljelle* mezve, hogy a monoklonális antitest MR1 antitest.
28. 28. A 25. igénypont szerinti kompozíció, azzaljelle>mezve, hogy a monoklonális antitest kiméra monoklonális antitest vagy egy humanizált monoklonális antitest.
29. 29. A 24. igénypont szerinti kompozíció, azzal jellemezve, hogy a gp39 antagonista oldható formájú gp39 ligandum.
30. 30. A 29. igénypont szerinti kompozíció, azzal jellemezve, hogy az oldható formájú gp39 ligandum CD40 fúziós fehéije.
31. 31. A 24. igénypont szerinti kompozíció, azzal jellemezve, hogy az allogén vagy xenogén sejt limfoid sejt.
32. 32. A 31. igénypont szerinti kompozíció, azzaljellemezve, hogy a limfoid sejt B-sejt.
33. 33. A 32. igénypont szerinti kompozíció, azzal jellemezve, hogy a B-sejt nyugvó B-sejt.
34. 34. Kompozíció, donor szövet vagy szerv iránti Tsejt-tolerancia előidézésére a szövetet vagy szervet befogadó szervezetben, azzal jellemezve, hogy a következő anyagok kombinációját tartalmazza:

    a) hasnyálmirigy-, máj-, vese-, szív-, tüdő-, bőr-, izom-, ideg-, gyomor- vagy béleredetű donor allogén sejtet; valamint

    b) egy anti-gp39 antitestet.
35. 35. A 34. igénypont szerinti kompozíció, azzal jellemezve, hogy az anti-gp39 antitest monoklonális antitest.
36. 36. A 34. igénypont szerinti kompozíció, azzaljellemezve, hogy az anti-gp39 antitest anti-humán-gp39 antitest.

    t j:

    I13

    HU 221 752 Bl
37. 37. A 34. igénypont szerinti kompozíció, azzal jellemezve, hogy a monoklonális antitest MR1 antitest (deponálási szám: HB 11048).
38. 38. A 35. igénypont szerinti kompozíció, azzal jellemezve, hogy a monoklonális antitest kiméra monokloná- 5 lis antitest vagy egy humanizált monoklonális antitest.
39. 39. A 34. igénypont szerinti kompozíció, azzal jellemezve, hogy a donor allogén sejt limfoid sejt.
40. 40. A 39. igénypont szerinti kompozíció, azzal jellemezve, hogy a limfoid sejt B-sejt.
41. 41. A 40. igénypont szerinti kompozíció, azzal jellemezve, hogy a B-sejt nyugvó B-sejt.