ES2237757T3

ES2237757T3 - Metodos para inducir la tolerancia de celulas t a un injerto de tejido u organo.

Info

Publication number: ES2237757T3
Application number: ES95917593T
Authority: ES
Inventors: Randolph J. Noelle; Fiona H. Durie; David C. Parker; Michael C. Appel; Nancy E. Philips; John P. Mordes; Dale L. Grenier; Aldo A. Rossini
Original assignee: Dartmouth College; University of Massachusetts Medical Center
Current assignee: Dartmouth College; University of Massachusetts Medical Center
Priority date: 1994-04-25
Filing date: 1995-04-25
Publication date: 2005-08-01
Anticipated expiration: 2015-04-25
Also published as: LT4309B; LV11785B; AP764A; CN1150760A; EP0757557B1; US20050152897A1; JP2974415B2; HUT76091A; PT757557E; MD970009A; DE69533984T2; FI964272A; IS2118B; FI964272A0; FI118792B; BR9507509A; CZ312596A3; KR100468330B1; AP9600906A0; PL317022A1

Abstract

SE MUESTRAN METODOS PARA INDUCIR LA TOLERANCIA DE LAS CELULAS T A UN INJERTO DE TEJIDO U ORGANO EN EL DESTINATARIO DE UN TRASPLANTE. LOS METODOS IMPLICAN LA ADMINISTRACION AL PACIENTE: 1) UNA CELULA ALOGENICA O XENOGENICA QUE EXPRESE LOS ANTIGENOS DEL DONANTE Y QUE TIENE UN LIGANDO SOBRE LA SUPERFICIE CELULAR QUE INTERACTUA CON UN RECEPTOR SOBRE LA SUPERFICIE DE UNA CELULA T DEL DESTINATARIO Y QUE HACE DE MEDIADOR EN LA FUNCION DEL DETERMINANTE DEL AUXILIAR DEPENDIENTE DE CONTACTO; Y 2) UN ANTAGONISTA DEL RECEPTOR QUE INHIBE LA INTERACCION DEL LIGANDO CON EL RECEPTOR. EN LA VERSION PREFERIDA, LA CELULA ALOGENICA O XENOGENICA ES UNA CELULA B, PREFERIBLEMENTE UNA CELULA B EN REPOSO, Y LA MOLECULA SOBRE LA SUPERFICIE DE LA CELULA T QUE MEDIA EN LA FUNCION DEL DETERMINANTE DEL AUXILIAR DEPENDIENTE DE CONTACTO ES GP39. EL ANTAGONISTA GP39 PREFERIDO ES UN ANTICUERPO ANTI-GP39. LA CELULA ALOGENICA O XENOGENICA Y EL ANTAGONISTA GP39 SON NORMALMENTE ADMINISTRADOS A UN DESTINATARIO DE TRASPLANTE ANTES DE REALIZAR EL TRASPLANTE DEL TEJIDO U ORGANO. LOS METODOS DE LA INVENCION PUEDEN USARSE PARA INDUCIR LA TOLERANCIA DE CELULAS T A TRASPLANTES TALES COMO HIGADO, RIÑON, CORAZON, PULMON, PIEL, MUSCULO, TEJIDO NEURONAL, ESTOMAGO E INTESTINO. TAMBIEN SE MUESTRA UN METODO PARA TRATAR LA DIABETES QUE SUPONE LA ADMINISTRACION A UN SUJETO DE CELULAS ALOGENICAS O XENOGENICAS QUE EXPRESEN LOS ANTIGENOS DEL DONANTE, UN ANTAGONISTA GP39 E ISLETAS PANCREATICAS.

Description

Métodos para inducir la tolerancia de células T a un injerto de tejido u órgano.

Antecedentes de la invención

Para inducir la activación de células T específicas de un antígeno y la expansión clonal, dos señales proporcionadas por las células presentadoras de antígeno (APCs) deben ser suministradas a la superficie de los linfocitos T en reposo (Jenkins, M. y Schwartz, R. (1987) J. Exp. Med. 165, 302-319; Mueller, D.L. y col. (1990) J. Immunol. 144, 3701-3709; Williams, I.R. y Unanue, E.R. (1990) J. Immunol. 145, 85-93). La primera señal, que confiere especificidad a la respuesta inmune, está mediada a través del receptor de células T (TCR) después del reconocimiento de un péptido antigénico foráneo presentado en el contexto del complejo principal de histocompatibilidad (MHC). La segunda señal, denominada coestimulación, induce la proliferación de las células T y las convieten en funcionales (Schwartz, R.H. (1990) Science 248, 1349-1356). La coestimulación no es específica del antígeno ni está restringida por el MHC, y se cree que es proporcionada por una o más moléculas distintas de la superficie celular expresadas por las APCs (Jenkins, M.K. y col. (1988) J. Immunol. 140, 3324-3330; Linsley, P.S. y col. (1991) J. Exp. Med. 173, 721-730; Gimmi, C.D. y col. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 6575-6579; Young, J.W. y col. (1992) J. Clin. Invest. 90, 229-237; Koulova, L. y col. (1991) J. Exp. Med. 173, 759-762; Reiser, H. y col. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 271-275; van-Seventer, G.A. y col. (1990) J. Immunol. 144, 4579-4586; LaSalle, J.M. y col. (1991) J. Immunol. 147, 774-80; Dustin, M.I. y col. (1989) J. Exp. Med. 169, 503; Armitage, R.J. y col. (1992) Nature 357, 80-82; Liu, Y. y col. (1992) J. Exp. Med. 175, 437-445). Una ruta de coestimulación implicada en la activación de células T implica a la molécula CD28 en la superficie de las células T. Esta molécula puede recibir una señal de coestimulación proporcionada por un ligando en las células B o en otras APCs. Los ligandos de CD28 incluyen miembros de la familia B7 de antígenos de activación de linfocitos B, tales como B7-1 y/o B7-2 (Freedman, A.S. y col. (1987) J. Immunol. 137, 3260-3267; Freeman, G.J. y col. (1989) J. Immunol. 143, 2714-2722; Freeman, G.J. y col. (1991) J. Exp. Med. 174, 625-631; Freeman, G.J. y col. (1993) Science 262, 909-911; Azuma, M. y col. (1993) Nature 366, 76-79; Freeman, G.J. y col. (1993) J. Exp. Med. 178, 2185-2192). B7-1 y B7-2 son también ligandos de otra molécula, CTLA4, presente en la superficie de células T activadas, aunque no está claro el papel de CTLA4 en la coestimula-
ción.

El suministro a una células T de una señal específica del antígeno con una señal de coestimulación da lugar a la activación de la célula T, que puede incluir la proliferación de la célula T y la secreción de citoquinas. En contraste, el suministro a una célula T de una señal específica de un antígeno en ausencia de una señal de coestimulación se cree que induce un estado de insensibilidad o anergia en la célula T, induciendo de este modo en la célula T una tolerancia específica del antígeno.

Las interacciones entre las células T y las células B desempeñan una función fundamental en las respuestas inmunes. La inducción de inmunidad humoral hacia antígenos dependientes del timo requiere una "ayuda" proporcionada por las células T cooperadoras (de aquí en adelante Th). Aunque parte de la ayuda proporcionada a los linfocitos B está mediada por moléculas solubles liberadas por las células Th (por ejemplo linfoquinas tales como IL-4 e IL-5), la activación de las células B requiere también una interacción dependiente del contacto entre las células B y las células Th. Hirohata y col., J. Immunol. 140, 3736-3744 (1988); Bartlett y col., J. Immunol. 143, 1745-1754 (1989). Esto indica que la activación de las células B implica una interacción obligatoria entre moléculas de la superficie celular en las células B y las células Th. La(s) molécula(s) en la célula T media(n) por tanto las funciones efectoras cooperadoras de la célula T dependientes del contacto. Una interacción dependiente del contacto entre moléculas que están en las células B y en las células T está apoyada además por la observación de que membranas plasmáticas aisladas de células T activadas pueden proporcionar las funciones cooperadoras necesarias para la activación de las células B. Brian, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 564-568 (1988); Hodgkin y col., J. Immunol. 145, 2025-2034 (1990); Noelle y col., J. Immunol. 146, 1118-1124 (1991).

Se ha identificado una molécula, CD40, en la superficie de linfocitos B inmaduros y maduros que, cuando es entrecruzada por anticuerpos, induce la proliferación de las células B. Valle y col., Eur. J. Immunol. 19, 1463-1467 (1989); Gordon y col., J. Immunol. 140, 1425-1430 (1988); Gruber y col., J. Immunol. 142, 4144-4152 (1989). CD40 ha sido clonada y caracterizada molecularmente. Stamenkovic y col., EMBO J. 8, 1403-1410 (1989). Un ligando de CD40, gp39 (denominado también ligando de CD40 o CD40L) ha sido también clonado y caracterizado molecularmente. Armitage y col., Nature 357, 80-82 (1992); Lederman y col., J. Exp. Med. 175, 1091-1101 (1992); Hollenbaugh y col., EMBO J. 11, 4313-4319 (1992). La proteína gp39 se expresa en células Th CD4^{+} activadas, pero no en reposo. Spriggs y col., J. Exp. Med. 176, 1543-1550 (1992); Lane y col., Eur. J. Immunol. 22, 2573-2578 (1992); Roy y col., J. Immunol. 151, 1-14 (1993). Células transfectadas con el gen de gp39 y que expresan la proteína gp39 en su superficie pueden activar la proliferación de células B y, junto con otras señales estimuladoras, pueden inducir la producción de anticuerpos. Armitage y col., Nature 357, 80-82 (1992); Hollenbaugh y col., EMBO J. 11, 4313-4319
(1992).

WO 95/06481 forma parte del estado de la técnica en virtud del Artículo 54(3) y (4) EPC. Este documento describe en términos generales la coadministración de células y antagonistas de gp39 para la inducción de tolerancia de células T hacia células de la médula ósea para el tratamiento de la enfermedad de injerto contra huésped.

Resumen de la invención

Las moléculas de la superficie celular que median las funciones efectoras cooperadoras dependientes del contacto de las células T, son importantes para la inducción de respuestas inmunes que requieren la ayuda de células T. Por ejemplo, la interacción de gp39 en las células T con CD40 en las células B desempeña una función fundamental en la activación de respuestas de células B a un antígeno. La presente invención está basada, al menos en parte, en el descubrimiento de que moléculas de la superficie celular que median las funciones efectoras cooperadoras dependientes del contacto de las células T, pueden desempeñar también una función crítica en la respuesta de las células T a aloantígenos. En particular, se ha descubierto que, bajo condiciones apropiadas, la interferencia con una interacción de gp39 con un ligando en una célula alogénica que está presentando aloantígenos a la célula T, puede inducir tolerancia en la célula T. Preferiblemente, la célula alogénica que presenta aloantígenos a la célula T requiere una interacción entre un ligando de gp39 en la célula y gp39 en la célula T para poder proporcionar las señales necesarias para la activación de la célula T. La inhibición de la interacción del ligando de gp39 en la célula alogénica con la gp39 que está en la célula T, impide la activación de la célula T y en su lugar induce tolerancia de la célula T específica del aloantígeno. La inducción de tolerancia de las células T a aloantígenos, según se describe en la presente, puede ser utilizada como régimen preparativo para el trasplante de tejidos u órganos.

Por consiguiente, la presente invención proporciona la utilización de (a) una célula alogénica o xenogénica que expresa al menos un antígeno del donante y que tiene un ligando en la superficie de la misma que interacciona con la gp39 que está en las células T del receptor; y

(b) un antagonista de gp39

para la fabricación de una preparación combinada para ser utilizada simultáneamente, separadamente o secuencialmente en la inducción de tolerancia de las células T a un tejido u órgano de un donante en un receptor del tejido u órgano, con la condición de que, cuando la célula alogénica o xenogénica sea una célula alogénica, el tejido u órgano del donante comprenda islotes pancreáticos, hígado, riñón, corazón, pulmón, piel, músculo, tejido neuronal, estómago o intestino. El antagonista inhibe una interacción entre la molécula que está en la célula T y su ligando en la célula alogénica o xenogénica.

En esta realización, el antagonista es una molécula que inhibe la interacción de gp39 en una célula T con un ligando de gp39 en una célula alogénica o xenogénica. Un antagonista particularmente preferido de gp39 es un anticuerpo anti-gp39. En otra realización, el antagonista de gp39 es una forma soluble de un ligando de gp39, por ejemplo CD40 soluble. La célula alogénica o xenogénica que va a ser administrada al receptor es preferiblemente una célula linfoide, por ejemplo una célula B. Alternativamente, la célula alogénica o xenogénica es una célula B pequeña en reposo. La célula alogénica o xenogénica y el antagonista (por ejemplo, un anticuerpo anti-gp39) son administrados típicamente a un sujeto receptor antes del trasplante del tejido o del órgano al sujeto. Por ejemplo, células linfoides (por ejemplo, células B) del donante del tejido o del órgano serán administradas al receptor, junto con el antagonista, antes del trasplante del tejido o del órgano al receptor.

Los métodos de la presente invención pueden ser utilizados, por ejemplo, para inducir tolerancia de las células T a tejidos u órganos trasplantados tales como hígado, riñón, corazón, pulmón, piel, músculo, tejido neuronal, estómago e intestino. En una realización, el tejido trasplantado comprende islotes pancreáticos. Por consiguiente, la invención proporciona la utilización de (a) una célula alogénica o xenogénica que expresa al menos un antígeno del donante y que tiene un ligando en la superficie de la misma que interacciona con la gp39 que está en las células T del receptor;

(b) un antagonista de gp39; y

(c) células de los islotes pancreáticos del donante

para la fabricación de una preparación combinada para ser utilizada simultáneamente, separadamente o secuencialmente en el tratamiento de la diabetes.

Un aspecto adicional de la presente invención proporciona la utilización de (a) una célula alogénica del donante que expresa al menos un antígeno del donante y que tiene un ligando en la superficie de la misma que interacciona con la gp39 que está en las células T del receptor; y

(b) un anticuerpo anti-gp39,

para la fabricación de una preparación combinada para ser utilizada simultáneamente, separadamente o secuencialmente para inducir tolerancia de las células T a un tejido u órgano de un donante en un receptor del tejido u órgano, donde la célula alogénica del donante y el anticuerpo anti-gp39 deben ser administrados al receptor antes del trasplante del tejido o del órgano, donde el tejido u órgano del donante comprende islotes pancreáticos, hígado, riñón, corazón, pulmón, piel, músculo, tejido neuronal, estómago o intestino.

En un aspecto más, la invención proporciona la utilización de un antagonista de gp39 para la fabricación de una preparación para ser utilizada en la inducción de tolerancia de las células T a un tejido u órgano de un donante en un receptor, receptor que será expuesto a células alogénicas o xenogénicas que expresan al menos un antígeno del donante y que tienen un ligando en la superficie de las mismas que interacciona con la gp39 que está en las células T del receptor, con la condición de que, cuando las células alogénicas o xenogénicas sean células alogénicas, el tejido u órgano del donante comprenda islotes pancreáticos, hígado, riñón, corazón, pulmón, piel, músculo, tejido neuronal, estómago o intestino.

La invención proporciona además la utilización de un antagonista de gp39 para la fabricación de un medicamento para ser utilizado en el tratamiento de la diabetes en un sujeto que será expuesto a células de los islotes pancreáticos del donante y a células alogénicas o xenogénicas que expresan al menos un antígeno del donante y que tienen un ligando en la superficie de las mismas que interacciona con la gp39 que está en las células T del receptor.

Breve descripción de las figuras

La Figura 1 es una representación gráfica de la supervivencia de aloinjertos de islotes pancreáticos trasplantados en ratones químicamente diabéticos pretratados con un anticuerpo anti-gp39 solo o pretratados con células esplénicas alogénicas fraccionadas o no fraccionadas solas.

Las Figuras 2A y 2B son representaciones gráficas de la supervivencia de aloinjertos de islotes pancreáticos trasplantados, medida por una disminución de la concentración de la glucosa plasmática, en ratones químicamente diabéticos pretratados con una única dosis de células esplénicas alogénicas fraccionadas junto con el tratamiento con un anticuerpo anti-gp39 (MR1) durante 2 semanas (panel A) o 7 semanas (panel B). Cada curva representa los datos de un ratón individual. Los símbolos en blanco identifican receptores en los que el aloinjerto de islotes falló espontáneamente. Los símbolos en negro indican los ratones cuyos injertos de islotes eran funcionales al final del experimento.

Las Figuras 3A, B y C son perfiles de citometría de flujo que representan la tinción de linfocitos de sangre periférica humana activados durante 6 horas con CD40Ig (panel A), con el mAb 4D9-8 (panel B) o con el mAb 4D9-9 (panel C).

Las Figuras 4A, B y C son perfiles de citometría de flujo que representan la tinción de linfocitos de sangre periférica humana activados durante 6 horas cultivados en presencia de ciclosporina A y teñidos con el mAb 4D9-8 (panel A), con el mAb 4D9-9 (panel B) o con CD40Ig (panel C).

Las Figuras 5A y B son perfiles de citometría de flujo que representan la tinción de linfocitos de sangre periférica humana activados durante 6 horas con CD40Ig en presencia del mAb 4D9-8 no marcado (panel A) o del mAb 4D9-9 no marcado (panel B).

La Figura 6 es una representación gráfica de la inhibición de la proliferación de células B humanas inducida por gp39 e IL-4 solubles cuando las células son cultivadas en presencia de los mAbs 4D9-8, 4D9-9, 24-31, 24-43, 89-76 u 89-79 anti-gp39 humana.

La Figura 7 es una representación gráfica de la inhibición de una respuesta de linfocitos mixtos aloespecíficos cuando las células son cultivadas en presencia de los mAbs 24-31 u 89-79 anti-gp39 humana.

Descripción detallada de la invención

Esta invención presenta métodos para inducir tolerancia in vivo de células T a un trasplante de un tejido o de un órgano de un donante en un receptor del trasplante. Los métodos implican la administración al receptor de 1) una células alogénica o xenogénica que expresa antígenos del donante y que tiene un ligando en la superficie celular que interacciona con un receptor en la superficie de una célula T del receptor que media la función efectora cooperadora dependiente del contacto, y 2) un antagonista del receptor en la superficie de la célula T que inhibe la interacción del ligando y el receptor. Según se utiliza en la presente, el término "receptor" se refiere a un sujeto en el que se va a trasplantar, está siendo trasplantado o ha sido trasplantado un injerto de un tejido o de un órgano. Según se define en la presente, una célula "alogénica" es obtenida de un individuo diferente de la misma especie que el receptor y expresa "aloantígenos" que difieren de los antígenos expresados por las células del receptor. Una célula "xenogénica" es obtenida de una especie diferente de la del receptor y expresa "xenoantígenos" que difieren de los antígenos expresados por las células del receptor. Según se utiliza en la presente, el término "antígenos del donante" se refiere a antígenos expresados por el injerto de tejido o de órgano del donante que va a ser trasplantado al receptor. Los antígenos del donante pueden ser aloantígenos o xenoantígenos, dependiendo del origen del injerto. La célula alogénica o xenogénica administrada al receptor como parte del régimen de tolerización expresa antígenos del donante, esto es, expresa algunos o todos los mismos antígenos presentes en el tejido u órgano del donante que va a ser trasplantado. La célula alogénica o xenogénica es obtenida preferiblemente del donante del injerto de tejido u órgano, pero puede ser obtenida de una o más fuentes que tengan determinantes antigénicos comunes con el donante.

Además de la célula alogénica o xenogénica, un antagonista de una molécula de las células T que media las funciones efectoras cooperadoras dependientes del contacto es administrado al receptor como parte del régimen de tolerización. Según se define en la presente, una molécula o receptor que media las funciones efectoras cooperadoras dependientes del contacto es una que es expresada en una célula Th y que interacciona con un ligando que está en una célula efectora (por ejemplo, una célula B), donde la interacción de la molécula con su ligando es necesaria para la producción de una respuesta de células efectoras (por ejemplo, la activación de células B). Además de estar implicada en las respuestas de las células efectoras, se ha encontrado ahora que tal molécula o receptor está implicada en la respuesta de la célula T al antígeno. Preferiblemente, la molécula de una célula T que media la función efectora cooperadora dependiente del contacto es gp39. Por consiguiente, en las realizaciones preferidas, los métodos de la invención implican la administración al receptor de un trasplante de una célula alogénica o xenogénica y un antagonista de gp39. La activación de las células T del receptor por la célula alogénica o xenogénica implica una interacción entre la gp39 que está en las células T del receptor y un ligando de gp39 que está en la célula alogénica o xenogénica. Inhibiendo esta interacción con un antagonista de gp39, las células T del receptor no son activadas por los antígenos del donante expresados por la célula alogénica o xenogénica, sino que por el contrario se convierten en tolerantes a los antígenos del donante. La inducción de tolerancia a los antígenos del donante en el receptor permite de este modo el trasplante con éxito del tejido u órgano del donante sin rechazo del injerto del donante mediado inmunológicamente.

Varios aspectos de la invención se describen con más detalle en las subsecciones siguientes.

I. Antagonistas de gp39

De acuerdo con los métodos de la invención, un antagonista de gp39 es administrado a un receptor para interferir con la interacción de la gp39 que está en las células T del receptor con un ligando de gp39 que está en una célula alogénica o xenogénica, tal como una célula B, administrada al receptor. Un antagonista de gp39 se define como una molécula que interfiere con esta interacción. El antagonista de gp39 puede ser un anticuerpo dirigido contra gp39 (por ejemplo, un anticuerpo monoclonal contra gp39), un fragmento o un derivado de un anticuerpo dirigido contra gp39 (por ejemplo, fragmentos Fab o F(ab)'2, anticuerpos quiméricos o anticuerpo humanizados), formas solubles de un ligando de gp39 (por ejemplo, CD40 soluble), formas solubles de una proteína de fusión de un ligando de gp39 (por ejemplo, CD40Ig soluble), o agentes farmacéuticos que rompan o interfieran con la interacción gp39-CD40.

A. Anticuerpos

Un mamífero (por ejemplo, un ratón, un hámster o un conejo) puede ser inmunizado con una forma inmunogénica de la proteína gp39 o con un fragmento de la proteína (por ejemplo, un fragmento peptídico) que induzca una respuesta de anticuerpos en el mamífero. Una célula que exprese gp39 en su superficie puede ser también utilizada como inmunógeno. Inmunógenos alternativos incluyen la proteína gp39 purificada o fragmentos de la proteína purificados. La gp39 puede ser purificada a partir de una célula que exprese gp39 mediante técnicas estándar de purificación. Adicionalmente, ADNc de gp39 (Armitage y col., Nature 357, 80-82 (1992); Lederman y col., J. Exp. Med. 175, 1091-1101 (1992); Hollenbaugh y col., EMBO J. 11, 4313-4319 (1992)) puede ser expresado en una célula huésped, por ejemplo en una bacteria o en una línea celular de mamífero, y la proteína gp39 puede ser purificada a partir de los cultivos celulares mediante técnicas estándar. Alternativamente, pueden sintetizarse péptidos de gp39 sobre la base de la secuencia de aminoácidos de gp39 (descrito en Armitage y col., Nature 357, 80-82 (1992); Lederman y col., J. Exp. Med. 175, 1091-1101 (1992); Hollenbaugh y col., EMBO J. 11, 4313-4319 (1992)) utilizando técnicas conocidas (por ejemplo, la síntesis química con F-moc o T-boc). Las técnicas para conferir inmunogenicidad a una proteína incluyen la conjugación a vehículos u otras técnicas bien conocidas en el oficio. Por ejemplo, la proteína puede ser administrada en presencia de un adyuvante. El progreso de la inmunización puede ser monitorizado mediante la detección de los títulos de anticuerpo en plasma o suero. Puede utilizarse un ELISA estándar u otro inmunoensayo con el inmunógeno como antígeno para determinar los niveles de anticuerpo.

Después de la inmunización, puede obtenerse un antisuero y, si se desea, pueden aislarse anticuerpos policlonales del suero. Para producir anticuerpos monoclonales, pueden recogerse células productoras de anticuerpos (linfocitos) de un animal inmunizado y fusionarse con células de mieloma mediante procedimientos estándar de fusión de células somáticas, inmortalizando así estas células y produciendo células hibridomas. Tales técnicas son bien conocidas en el oficio. Por ejemplo, la técnica de hibridomas desarrollada originalmente por Kohler y Milstein (Nature (1975) 256, 495-497) así como otras técnicas tales como la técnica de hibridomas de células B humanas (Kozbar y col., Immunol. Today (1983) 4, 72), la técnica de hibridomas de VEB para producir anticuerpos monoclonales humanos (Cole y col., Monoclonal Antibodies in Cancer Therapy (1985) (Allen R. Bliss, Inc, páginas 77-96) y la selección de bibliotecas de anticuerpos combinatorias (Huse y col., Science (1989) 246, 1275). Los hibridomas pueden ser sometidos a selección inmunoquímicamente por la producción de anticuerpos reactivos específicamente con la proteína o el péptido y aislarse los anticuerpos monoclonales.

El término anticuerpo, según se utiliza en la presente, tiene la intención de incluir fragmentos del mismo que sean reactivos específicamente con una proteína gp39 o con un péptido de la misma o con una proteína de fusión de gp39. Los anticuerpos pueden ser fragmentados utilizando técnicas convencionales y los fragmentos pueden ser sometidos a selección por su utilidad de la misma manera que la descrita anteriormente para los anticuerpos completos. Por ejemplo, pueden generarse fragmentos F(ab')_{2} mediante el tratamiento del anticuerpo con pepsina. El fragmento F(ab')_{2} resultante puede ser tratado para reducir los puentes disulfuro con el fin de producir fragmentos Fab'. El anticuerpo de la presente invención tiene la intención de incluir además moléculas biespecíficas y quiméricas que tengan una porción de anti-gp39.

Cuando anticuerpos producidos en sujetos no humanos son utilizados terapéuticamente en humanos, son reconocidos en varios grados como foráneos, y puede producirse en el paciente una respuesta inmune. Un procedimiento para minimizar o eliminar este problema, que es preferible a una inmunosupresión general, es producir derivados de anticuerpos quiméricos, esto es, moléculas de anticuerpo que combinan una región variable de un animal no humano y una región constante humana. Las moléculas de anticuerpos quiméricos pueden incluir, por ejemplo, el dominio de unión al antígeno procedente de un anticuerpo de un ratón, una rata u otra especie, con regiones constantes humanas. Se han descrito una variedad de métodos para producir anticuerpos quiméricos y pueden ser utilizados para producir anticuerpos quiméricos que contengan la región variable de una inmunoglobulina que reconozca gp39. Ver, por ejemplo, Morrison y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 6851 (1985); Takeda y col., Nature 314, 452 (1985); Cabilly y col., Patente de EE.UU. Nº 4.816.567; Boss y col., Patente de EE.UU. Nº 4.816.397; Tanaguchi y col., Publicación de Patente Europea EP171496; Publicación de Patente Europea 0173494; Patente del Reino Unido GB 2177096B. Se espera que tales anticuerpos quiméricos sean menos inmunogénicos en un sujeto humano que el anticuerpo no quimérico correspondiente.

Para fines terapéuticos humanos, los anticuerpos monoclonales o quiméricos reactivos específicamente con una proteína gp39 o con un péptido de la misma pueden ser humanizados posteriormente mediante la producción de quimeras de la región variable humana, en las cuales partes de las regiones variables, especialmente las regiones de entramado conservadas del dominio de unión al antígeno, son de origen humano y solamente las regiones hipervariables son de origen no humano. Tales moléculas de inmunoglobulina alteradas pueden ser producidas mediante cualquiera de varias técnicas conocidas en el oficio (por ejemplo, Teng y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 7308-7312 (1983); Kozbor y col., Immunology Today 4, 7279 (1983); Olsson y col., Meth. Enzymol. 92, 3-16 (1982)), y son producidas preferiblemente de acuerdo con las descripciones de la Publicación de PCT WO92/06193 o EP0239400. Los anticuerpos humanizados pueden ser producidos comercialmente por, por ejemplo, Scotgen Limited 2 Holly Road, Twickenham, Middlesex, Gran Bretaña.

Otro método para generar anticuerpos específicos, o fragmentos de anticuerpo, reactivos contra una proteína o péptido de gp39 es la selección de bibliotecas de expresión que codifican genes de inmunoglobulina, o porciones de los mismos, expresados en bacterias con una proteína o péptido de gp39. Por ejemplo, fragmentos Fab completos, regiones VH y regiones FV pueden ser expresados en bacterias utilizando bibliotecas de expresión de fagos. Ver, por ejemplo, Ward y col., Nature 341, 544-546 (1989); Huse y col., Science 246, 1275-1281 (1989) y McCafferty y col., Nature 348, 552-554 (1990). La selección de tales bibliotecas con, por ejemplo, un péptido de gp39 puede identificar fragmentos de inmunoglobulina reactivos con gp39. Alternativamente, el ratón SCID-hu (disponible en Genpharm) puede ser utilizado para producir anticuerpos o fragmentos de los mismos.

Metodologías para producir anticuerpos monoclonales dirigidos contra gp39, incluyendo gp39 humana y gp39 de ratón, y anticuerpos monoclonales adecuados para ser utilizados en los métodos de la invención, están descritos con más detalle en el Ejemplo 2.

Los anticuerpos monoclonales anti-gp39 humana de la invención son los preferidos para ser utilizados en la inducción de tolerancia de células T específica del antígeno. Los anticuerpos preferidos incluyen los anticuerpos monoclonales 3E4, 2H5, 2H8, 4D9-8, 4D9-9, 24-31, 24-43, 89-76 y 89-79, descritos en el Ejemplo 2. Anticuerpos particularmente preferidos son los anticuerpos monoclonales 89-76 y 24-31. Los hibridomas 89-76 y 24-31, productores de los anticuerpos 89-76 y 24-31, respectivamente, fueron depositados bajo las disposiciones del Tratado de Budapest en la American Type Culture Collection, Parklawn Drive, Rockville, Md., el 2 de Septiembre de 1994. Al hibridoma 89-76 se le asignó el Número de Acceso de la ATCC HB11713 y al hibridoma 24-31 se le asignó el Número de Acceso de la ATCC HB11712. Los anticuerpos 24-31 y 89-76 son del isotipo IgG1.

En otra realización, el mAb anti-gp39 humana para ser utilizado en los métodos de la invención se une a un epítopo reconocido por un anticuerpo monoclonal seleccionado del grupo que consta de 3E4, 2H5, 2H8, 4D9-8, 4D9-9, 24-31, 24-43, 89-76 y 89-79. Más preferiblemente, el mAb anti-gp39 humana se une a un epítopo reconocido por el anticuerpo monoclonal 24-31 o por el anticuerpo monoclonal 89-76. La capacidad de un mAb para unirse a un epítopo reconocido por cualquiera de los anticuerpos anteriormente mencionados puede ser determinada mediante ensayos estándar de competición cruzada. Por ejemplo, un anticuerpo que se una al mismo epítopo reconocido por el mAb 24-31 competirá con 24-31 marcado para unirse a células T activadas, mientras que un anticuerpo que se una a un epítopo diferente del reconocido por el mAb 24-31 no competirá con 24-31 marcado para unirse a células T activadas.

B. Ligandos Solubles de gp39

Otros antagonistas de gp39 que pueden ser administrados para inducir tolerancia de células T incluyen las formas solubles de un ligando de gp39. Un ligando soluble monovalente de gp39, tal como CD40 soluble, puede unirse a gp39, inhibiendo de este modo la interacción de gp39 con CD40 que está en las células B. El término "soluble" indica que el ligando no está asociado permanentemente a una membrana celular. Un ligando de gp39 soluble puede ser preparado mediante síntesis química o, preferiblemente, mediante técnicas de ADN recombinante, por ejemplo expresando solamente el dominio extracelular (estando ausentes los dominios transmembranal y citoplásmico) del ligando. Un ligando de gp39 soluble preferido es CD40 soluble. Alternativamente, un ligando soluble de gp39 puede estar en forma de una proteína de fusión. Tal proteína de fusión comprende al menos una porción del ligando de gp39 unida a una segunda molécula. Por ejemplo, CD40 puede ser expresado como una proteína de fusión con inmunoglobulina (esto es, una proteína de fusión CD40Ig). En una realización, se produce una proteína de fusión que contiene residuos de aminoácidos de una porción del dominio extracelular de CD40 unidos a residuos de aminoácidos de una secuencia correspondiente a las regiones bisagra, CH2 y CH3 de la cadena pesada de una inmunoglobulina, por ejemplo C\gamma1, para formar una proteína de fusión CD40Ig (ver, por ejemplo, Linsley y col. (1991) J. Exp. Med. 1783, 721-730; Capon y col. (1989) Nature 337, 525-531; y Capon U.S. 5.116.964). La proteína de fusión puede ser producida mediante síntesis química o, preferiblemente, mediante técnicas de ADN recombinante basadas en el ADNc de CD40 (Stamenkovic y col., EMBO J., 8, 1403-1410 (1989)).

II. Células para la Inducción de Tolerancia Específica de un Antígeno

La presente invención está basada, al menos en parte, en el descubrimiento de que la presentación de aloantígenos a células T por células alogénicas en presencia de un antagonista de gp39 tiene como resultado la tolerancia a los aloantígenos por las células T. Las células que son capaces de inducir tolerancia por este mecanismo incluyen aquéllas que presentan el antígeno y activan a las células T por interacción con gp39 (esto es, es necesaria una interacción entre la gp39 que está en las células T y un ligando de gp39 que está en la célula presentadora de antígeno para proporcionar las señales apropiadas a la célula T para la activación de la célula T). La inhibición de la interacción del ligando que está en la célula alogénica o xenogénica con la gp39 de las células T del receptor impide la activación de las células T por alo o xenoantígenos y, por el contrario, induce tolerancia a los antígenos por parte de la célula T. Una interferencia con la activación de la célula T a través de gp39 puede impedir la inducción de moléculas coestimuladoras en la célula alogénica o xenogénica (por ejemplo, moléculas de la familia B7 en una célula B), de tal manera que la célula proporciona solamente una señal antigénica a la célula T en ausencia de una señal coestimuladora, induciendo así la tolerancia.

Por consiguiente, en los métodos de la invención, una célula alogénica o xenogénica es administrada a un sujeto receptor. La célula alogénica o xenogénica es capaz de presentar un antígeno a las células T del receptor y es, por ejemplo, un linfocito B, una célula presentadora de antígeno "profesional" (por ejemplo un monocito, una célula dendrítica, una célula de Langerhan) u otra célula que presente antígenos a las células inmunes (por ejemplo, un queratinocito, una célula endotelial, un astrocito, un fibroblasto, un oligodendrocito). Además, es preferible que la célula alogénica o xenogénica tenga una capacidad reducida para estimular una señal coestimuladora en las células T del receptor. Por ejemplo, la célula alogénica o xenogénica puede carecer de la expresión de, o expresar solamente niveles bajos de, moléculas coestimuladoras tales como la familia B7 de proteínas (por ejemplo, B7-1 o B7-2). La expresión de moléculas coestimuladoras en células alogénicas o xenogénicas potenciales para ser utilizadas en el método de la invención puede ser determinada mediante técnicas estándar, por ejemplo mediante citometría de flujo utilizando anticuerpos dirigidos contra las moléculas coestimuladoras.

Las células alogénicas o xenogénicas preferidas para inducir tolerancia de células T son células linfoides, por ejemplo linfocitos de sangre periférica o células esplénicas. Las células linfoides preferidas para inducir tolerancia de células T son las células B. Las células B pueden ser purificadas a partir de una población mixta de células (por ejemplo, otros tipos celulares en sangre periférica o bazo) mediante técnicas estándar de separación celular. Por ejemplo, las células adherentes pueden ser eliminadas cultivando las células esplénicas en placas de plástico y recuperando la población de células no adherentes. Las células T pueden ser eliminadas de una población mixta de células mediante tratamiento con un anticuerpo anti-células T (por ejemplo, anti-Thy1.1 y/o anti-Thy1.2) y complemento. En una realización, se utilizan como células presentadoras de antígeno células linfoides en reposo, preferiblemente células B en reposo. Las células linfoides en reposo, tales como células B en reposo, pueden ser aisladas por técnicas conocidas en el oficio, por ejemplo basadas en su pequeño tamaño y su baja densidad. Las células linfoides en reposo pueden ser aisladas por ejemplo mediante elutriación centrífuga en contracorriente según se describe en el Ejemplo 1. Utilizando elutriación centrífuga en contracorriente puede obtenerse una población de células linfoides pequeñas en reposo en la que se han eliminado las células que pueden activar respuestas de células T, recogiendo fracción(es) a 14-19 ml/minuto, preferiblemente 19 ml/minuto (a 3.200 rpm). Alternativamente, pueden aislarse linfocitos pequeños en reposo (por ejemplo, células B) mediante centrifugación en gradiente de densidad discontinuo, por ejemplo utilizando un gradiente de Ficoll o Percoll, y puede obtenerse una capa que contiene linfocitos en reposo, pequeños, después de la centrifugación. Las células B en reposo pequeñas pueden ser distinguidas también de las células B activadas mediante el análisis de la expresión de moléculas coestimuladoras, tales como B7-1 y/o B7-2, en la superficie de las células B activadas mediante técnicas estándar (por ejemplo, inmunofluorescencia).

Las células alogénicas o xenogénicas administradas al receptor funcionan, al menos en parte, presentando antígenos del donante a las células T del receptor. De este modo, las células expresan antígenos que son expresados también por el tejido u órgano del donante. Típicamente, esto puede ser realizado utilizando células alogénicas o xenogénicas obtenidas del donante del injerto de tejido u órgano. Por ejemplo, pueden aislarse células linfoides periféricas, células B o células esplénicas del donante del tejido u órgano y utilizarse en los métodos de la invención. Alternativamente, pueden obtenerse células alogénicas o xenogénicas de una fuente distinta del donante del tejido u órgano siempre que las células tengan determinantes antigénicos en común con el donante del tejido u órgano. Por ejemplo, pueden utilizarse células alogénicas o xenogénicas que expresen (en su mayoría o todas) los mismos antígenos del complejo principal de histocompatibilidad que el tejido u órgano del donante. Por tanto, pueden utilizarse células alogénicas o xenogénicas de una fuente que tenga el mismo haplotipo del MHC que el donante del tejido u órgano (por ejemplo, un pariente cercano del donante del injerto).

III. Administración de Células y de Antagonistas de gp39

La tolerancia de células T a un injerto de órgano o tejido puede ser inducida de acuerdo con la invención mediante la administración al receptor del trasplante de un antagonista de gp39 junto con una célula alogénica o xenogénica que exprese antígenos del donante e interaccione con las células T del receptor a través de gp39. En una realización preferida, la célula alogénica o xenogénica y el antagonista de gp39 son administrados al receptor simultáneamente o contemporáneamente. Alternativamente, el antagonista de gp39 puede ser administrado antes de la administración de las células alogénicas o xenogénicas, por ejemplo cuando el antagonista es un anticuerpo con una semivida larga. En una realización preferida, el antagonista y las células alogénicas o xenogénicas son administrados al receptor antes del trasplante del órgano o tejido al receptor (esto es, el receptor es pretratado con el antagonista y las células). Por ejemplo, la administración de las células alogénicas o xenogénicas y el antagonista puede ser realizada varios días antes (por ejemplo de cinco a ocho días antes) del trasplante del tejido u órgano.

Se ha encontrado que la administración de una única dosis de células alogénicas (en combinación con el antagonista) es suficiente para la inducción de tolerancia de las células T a un tejido u órgano del donante (ver el Ejemplo 1). El número de células administradas puede variar dependiendo del tipo de célula utilizado, del tipo de injerto de tejido u órgano, del peso del receptor, de la condición general del receptor y de otras variables conocidas por el técnico experto. El número apropiado de células para ser utilizado en el método de la invención puede ser determinado por una persona con experiencia habitual en la técnica mediante métodos convencionales (por ejemplo, según se describe en el Ejemplo 1). Las células son administradas en una forma y por una vía que sean adecuadas para la inducción de tolerancia de células T en el receptor. Las células pueden ser administradas en una solución fisiológicamente aceptable, tal como una solución salina tamponada o un vehículo similar. Las células son administradas preferiblemente por vía intravenosa.

Un antagonista de la invención es administrado a un sujeto en una forma biológicamente compatible adecuada para la administración farmacéutica in vivo con el fin de inducir tolerancia de células T. Por "forma biológicamente compatible adecuada para la administración in vivo", se indica una forma del antagonista que va a ser administrado en la que cualquier efecto tóxico es superado por los efectos terapéuticos del compuesto. El término sujeto tiene la intención de incluir organismos vivos en los que pueda producirse una respuesta inmune, por ejemplo mamíferos. Ejemplos de sujetos incluyen humanos, perros, gatos, ratones, ratas y especies transgénicas de los mismos. Un antagonista de gp39 puede ser administrado en cualquier forma farmacológica, opcionalmente con un vehículo farmacéuticamente aceptable. La administración de una cantidad terapéuticamente activa del antagonista se define como una cantidad eficaz, a las dosificaciones y durante los periodos de tiempo necesarios para conseguir el resultado deseado (por ejemplo, tolerancia de células T). Por ejemplo, una cantidad terapéuticamente activa de un antagonista de gp39 puede variar de acuerdo con factores tales como el estado de enfermedad, la edad, el sexo y el peso del individuo, y con la capacidad del antagonista para inducir una respuesta deseada en el individuo. Los regímenes de dosificación pueden ser ajustados para que proporcionen la respuesta terapéutica óptima. Por ejemplo, pueden administrarse diariamente varias dosis divididas, o la dosis puede ser reducida proporcionalmente según esté indicado por las exigencias de la situación terapéutica. Según se describe en el Ejemplo 1 para el tratamiento con un anticuerpo anti-gp39, un régimen de tratamiento eficaz puede incluir el inicio de la administración del anticuerpo antes del trasplante del tejido u órgano (por ejemplo, de cinco a ocho días antes del trasplante), seguido por una nueva administración del anticuerpo (por ejemplo, en días alternos) durante varias semanas (por ejemplo, de dos a siete semanas) después del trasplante.

El compuesto activo (por ejemplo, un antagonista tal como un anticuerpo) puede ser administrado de una manera conveniente tal como mediante inyección (subcutánea, intravenosa, etc.), administración oral, inhalación, aplicación transdérmica o administración rectal. Dependiendo de la vía de administración, el compuesto activo puede estar revestido con un material para proteger al compuesto de la acción de enzimas, ácidos y otras condiciones naturales que puedan inactivar al compuesto. Una vía de administración preferida es mediante inyección intravenosa.

Para administrar un antagonista de gp39 mediante administración distinta de parenteral, puede ser necesario revestir el antagonista, o coadministrar el antagonista, con un material para impedir su inactivación. Por ejemplo, un antagonista puede ser administrado a un individuo en un vehículo o diluyente apropiado, coadministrado con inhibidores enzimáticos o en un vehículo apropiado tal como liposomas. Los diluyentes farmacéuticamente aceptables incluyen solución salina y soluciones tampón acuosas. Los inhibidores enzimáticos incluyen el inhibidor de la tripsina pancreática, diisopropilfluorofosfato (DEP) y trasilol. Los liposomas incluyen emulsiones agua-en aceite-en agua así como liposomas convencionales (Strejan y col. (1984) J. Neuroimmunol. 7, 27).

El compuesto activo puede ser también administrado parenteralmente o intraperitonealmente. Pueden prepararse también dispersiones en glicerol, polietilén glicoles líquidos y mezclas de los mismos y en aceites. Bajo las condiciones habituales de almacenamiento y utilización, estas preparaciones pueden tener un conservante para impedir el crecimiento de microorganismos.

Las composiciones farmacéuticas adecuadas para uso inyectable incluyen soluciones acuosas estériles (si son solubles en agua) o dispersiones y polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones o dispersiones inyectables estériles. En todos los casos, la composición debe ser estéril y debe ser fluida hasta el punto de que exista una fácil administración con jeringa. Debe ser estable bajo las condiciones de fabricación y almacenamiento y debe estar conservada frente a la acción contaminante de microorganismos tales como bacterias y hongos. El vehículo puede ser un solvente o un medio de dispersión conteniendo, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilén glicol y polietilén glicol líquido, y similares), y mezclas adecuadas de los mismos. La fluidez apropiada puede ser mantenida, por ejemplo, mediante la utilización de un revestimiento tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de una dispersión y mediante la utilización de surfactantes. La prevención de la acción de microorganismos puede ser conseguida por diferentes agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido ascórbico, timerosal y similares. En muchos casos, será preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, polialcoholes tales como manitol, sorbitol, cloruro de sodio, en la composición. La absorción prolongada de las composiciones inyectables puede provocarse incluyendo en la composición un agente que retrase la absorción, por ejemplo monoestearato de aluminio y gelatina.

Pueden prepararse soluciones inyectables estériles incorporando el compuesto activo (por ejemplo, un antagonista de gp39) en la cantidad requerida en un solvente apropiado con un ingrediente o con una combinación de los ingredientes enumerados anteriormente, según se requiera, seguido por esterilización por filtración. Generalmente, las dispersiones son preparadas incorporando el compuesto activo a un vehículo estéril que contenga un medio de dispersión básico y los demás ingredientes requeridos de los enumerados anteriormente. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los métodos preferidos de preparación son secado al vacío y liofilización, que producen un polvo del ingrediente activo (por ejemplo, un antagonista) más cualquier ingrediente adicional deseado a partir de una solución del mismo esterilizada por filtración previamente.

Cuando el compuesto activo está protegido adecuadamente, según se describió anteriormente, la proteína puede ser administrada oralmente, por ejemplo con un diluyente inerte o con un vehículo comestible asimilable. Según se utiliza en la presente, "vehículo farmacéuticamente aceptable" incluye cualquiera y todos los solventes, medios de dispersión, revestimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y retardantes de la absorción, y similares. La utilización de tales medios y agentes para sustancias farmacéuticamente activas es bien conocida en la técnica. Excepto en la medida en que cualquier medio o agente convencional sea incompatible con el compuesto activo, se contempla la utilización de los mismos en las composiciones terapéuticas. Pueden incorporarse también a las composiciones compuestos activos suplementarios.

Es especialmente ventajoso formular composiciones parenterales en forma de unidad de dosificación para facilitar la administración y la uniformidad de la dosificación. Una forma de unidad de dosificación, según se utiliza en la presente, se refiere a unidades físicamente discretas adecuadas como dosis unitarias para el sujeto mamífero que va a ser tratado; conteniendo cada unidad una cantidad predeterminada de compuesto activo calculada para que produzca el efecto terapéutico deseado en asociación con el vehículo farmacéutico requerido. Las especificaciones de las formas de unidad de dosificación de la invención están dictadas por, y dependen directamente de, (a) las características exclusivas del compuesto activo y el efecto terapéutico particular a conseguir, y (b) las limitaciones inherentes a la técnica de formular tal compuesto activo para el tratamiento de la sensibilidad en individuos.

Posteriormente a, o simultáneamente con, el régimen de tolerización descrito en la presente, un tejido u órgano de un donante es trasplantado a un receptor del trasplante mediante técnicas convencionales.

IV. Usos de los Métodos de la Invención

Los métodos de la invención son aplicables a una amplia variedad de situaciones de trasplante de tejidos y órganos. Los métodos pueden ser utilizados para inducir tolerancia de células T en el receptor de un injerto de un tejido o de un órgano tal como islotes pancreáticos, hígado, riñón, corazón, pulmón, piel, músculo, tejido neuronal, estómago e intestino. Por tanto, los métodos de la invención pueden ser aplicados en el tratamiento de enfermedades o condiciones que incluyan el trasplante de un tejido u órgano (por ejemplo, el trasplante de hígado para tratar hipercolesterolemia, el trasplante de células musculares para tratar la distrofia muscular, el trasplante de tejido neuronal para tratar la Enfermedad de Huntington o la Enfermedad de Parkinson, etc.). En una realización preferida, el tejido trasplantado comprende islotes pancreáticos. Por consiguiente, la invención incluye un método para tratar la diabetes mediante el trasplante de células de los islotes pancreáticos. El método comprende la administración a un sujeto con necesidad de tratamiento de: 1) células alogénicas o xenogénicas que expresen antígenos del donante, 2) un antagonista de una molécula expresada en las células T del receptor que medie la función efectora cooperadora dependiente del contacto, tal como un antagonista de gp39 (por ejemplo, un anticuerpo anti-gp39) y 3) células de los islotes pancreáticos del donante. Preferiblemente, las células alogénicas o xenogénicas y el antagonista son administrados al receptor antes de la administración de los islotes pancreáticos.

La invención está ilustrada adicionalmente por los ejemplos siguientes que no deben ser considerados como limitantes. El contenido de todas las referencia, patentes y solicitudes de patente publicadas citadas a lo largo de toda esta solicitud se incorporan de este modo por referencia.

Ejemplo 1 Inducción de Tolerancia a Aloinjertos de Islotes Pancreáticos Mediante el Tratamiento del Receptor con Células Alogénicas y Anti-gp39

Los estudios de alotrasplantes contemporáneos dependen de la inmunosupresión generalizada que anula de manera no específica las funciones inmunoefectoras. Sin embargo, los agentes farmacéuticos inmunosupresores pueden producir efectos colaterales significativos. Además, el alotrasplante de islotes de Langerhans para el tratamiento de la diabetes ha demostrado ser refractario a este procedimiento (ver, por ejemplo, Robertson, R.P. (1992) N. Engl. J. Med. 327, 1861). Terapias con anticuerpos dirigidos contra las células T pueden permitir el aloinjerto con éxito de islotes en roedores, pero este método tiene como resultado generalmente también una inmunosupresión generalizada (Carpenter, C.B. (1990) N. Engl. J. Med. 322, 1224; Roark, J.H. y col. (1992) Transplantation 54, 1098; Kahan, B.D. (1992) Curr. Opin. Immunol. 4, 553). En este ejemplo, se indujo tolerancia a los aloinjertos de islotes en un receptor del trasplante mediante manipulación de la presentación del aloantígeno a las células T con el fin de impedir su activación. La supervivencia de los aloinjertos de islotes en ratones C57BL/6 (H-2^{b}) químicamente diabéticos fue examinada utilizando la metodología siguiente:

Inducción de la Diabetes

Ratones C57BL/6J (H-2^{b}) macho se convirtieron en diabéticos por la administración intravenosa de estreptozotocina (140 mg/kg). La diabetes permanente fue confirmada por la demostración de una concentración de glucosa en plasma \geq400 mg/dl en tres ocasiones a lo largo de un periodo de una semana.

Fraccionamiento de Células Esplénicas Alogénicas

Las células alogénicas del donante para el pretratamiento de los receptores del injerto fueron obtenidas de animales híbridos (C57 x BALB/c)(H-2^{b/d})F_{1} para impedir la enfermedad de injerto contra huésped. Para aislar las células linfocíticas pequeñas, suspensiones de células de bazo de ratones (C57 x BALB/c)F_{1} hembra de 8 semanas de edad fueron mermadas de eritrocitos y posteriormente fraccionadas por tamaño mediante elutriación según está descrito en Tony, H.P. y col. (1985) J. Exp. Med. 161, 223 y Gosselin, E.J. y col. (1988) J. Immunol. 140, 1408. Brevemente, los linfocitos pequeños son aislados mediante elutriación centrífuga en contracorriente utilizando, por ejemplo, una centrífuga modelo J-6B (Beckman Instruments, Palo Alto, CA). Aproximadamente 1-5 x 10^{8} células en 8 ml de medio de cultivo o de solución salina equilibrada con un 1,5% de suero bovino fetal son tratadas con desoxirribonucleasa, cargadas en la cámara de elutriación con una velocidad de flujo contracorriente inicial de 13,5 ml/minuto y centrifugadas a 4EC a una velocidad constante de 3.200 rpm. Una fracción de células pequeñas con muy pocas células grandes contaminantes es eluida típicamente a 14-19 ml/minuto, aunque la velocidad de flujo exacta puede depender del medio en el que las células están suspendidas. En los experimentos descritos en la presente, la fracción de células pequeñas fue recogida a 19 ml/minuto (a 3.200 rpm). Esta fracción estaba mermada completamente de la función de las células accesorias resistentes a radiación (3000 rads) cuando se analizó con líneas de células T específicas para IgG y H2^{d} (CDC35) de conejo o alorreactivas con H2^{b} (D10.G4). Las células pequeñas y las células no fraccionadas fueron lavadas dos veces en medio sin suero antes de la inyección en la vena de la cola de los receptores del aloinjerto. Se utilizaron aproximadamente 40-100 x 10^{6} células esplénicas no fraccionadas de (C57 x BALB/c)F_{1}(H-2^{b/d}) o 40-100 x 10^{6} células esplénicas pequeñas elutriadas de (C57 x BALB/c)F_{1}(H-2^{b/d}).

Pretratamiento de los Receptores del Injerto

Los receptores del injerto fueron pretratados con células esplénicas alogénicas de (C57 x BALB/c)F_{1}(H-2^{b/d}) no fraccionadas, con células esplénicas de diámetro pequeño de la "Fracción 19" elutriadas en las que se había eliminado la actividad APC (aisladas según se describió anteriormente), con un anticuerpo monoclonal anti-gp39 (MR1, ver el Ejemplo 2, Experimento 3), o con una combinación de células alogénicas y anticuerpo anti-gp39. Las células de la Fracción 19 fueron ensayadas en dos rangos de dosis diferentes, una dosis baja de 40-44 x 10^{6} células o una dosis alta de 77-88 x 10^{6} células. Los animales control no recibieron ni células alogénicas ni tratamiento con anticuerpos. Las células alogénicas fueron administradas a los receptores del injerto mediante inyección en la vena de la cola de cinco a ocho días antes del trasplante del aloinjerto de islotes. El tratamiento con el anticuerpo MR1 fue a una dosis de 250 \mug/ratón dos veces a la semana comenzando 7 días antes del trasplante de los islotes y continuando durante 2-7 semanas o hasta el fallo del injerto. La primera inyección de anticuerpo se administró típicamente el mismo día que la primera inyección de células esplénicas alogénicas.

Trasplante de un Aloinjerto de Islotes

Islotes de BALB/c (H-2^{d}) alogénicos fueron aislados mediante un método modificado de digestión con colagenasa (Gottlieb , P.A. y col. (1990) Diabetes 39, 643). Islotes a una dosis de 30 islotes/g de peso corporal fueron implantados en la cápsula subrenal de los ratones receptores C57BL/6J (H-2^{b}) inmediatamente después del aislamiento. La supervivencia del injerto fue definida como el mantenimiento de una concentración de glucosa en plasma \leq200 mg/dl.

Resultados

En una primera serie de experimentos, los receptores de aloinjertos de islotes fueron pretratados con células esplénicas alogénicas solas o con anticuerpo anti-gp39 solo. Según se muestra en la Figura 1, en ausencia del pretratamiento con células esplénicas, todos los aloinjertos de islotes fueron rechazados dentro de los 13 días siguientes al trasplante (9\pm2 d; rango 5-13 d; N=23). Se observó también una mala supervivencia de los islotes en los animales tratados únicamente con células esplénicas no fraccionadas que contenían actividad APC normal (6\pm3 d; rango 4-12 d; N=7) o con dosis bajas (40-44 x 10^{6} células) de células esplénicas de la Fracción 19 en las que se habían eliminado las APC (7\pm3 d; rango 3-14 d; N=16). En contraste, la inyección de una dosis mayor de esplenocitos pequeños de la Fracción 19 mermados en APC (75-88 x 10^{6} células) prolongó la supervivencia del aloinjerto (19\pm10 d; rango 7-40 d; N=16). Este efecto sobre la duración de la supervivencia del injerto era estadísticamente significativo (F_{3,58}=17,3, p<0,001, cuando se comparó con los grupos no tratados con nada, tratados con transfusiones de bazo completo o con la dosis más baja de células esplénicas de la Fracción 19) pero no era permanente. La prolongada pero finita supervivencia de los islotes alogénicos en receptores diabéticos de células pequeñas de la Fracción 19 en la que se habían eliminado las APC, sugería que estas células solas no pueden mantener la supervivencia del aloinjerto. Un grupo adicional de receptores del injerto fue tratado con 77-88 x 10^{6} células de la Fracción 20. Esta fracción estaba también compuesta en su mayoría por linfocitos pequeños, pero difiere de la población de la Fracción 19 en que contiene una función APC medible. Los receptores de estas células (N=6) rechazaron todos sus injertos rápidamente (media=8,5 d; rango 6-12). Otro grupo de receptores del injerto fue tratado únicamente con un anticuerpo monoclonal anti-gp39, MR1. La Figura 1 ilustra que esos aloinjertos de islotes fracasaron en 15 días en 7/11 ratones tratados únicamente con el mAb anti-gp39. Los cuatro ratones restantes tenían injertos funcionales a la finalización del experimento el día 48. Los resultados demuestran que la administración al receptor del anticuerpo anti-gp39 MR1 solo puede prolongar la supervivencia de los aloinjertos de islotes (media 20=19 d; rango 9-indefinido; N=5). El grado de prolongación era estadísticamente similar al conseguido utilizando una dosis más elevada de células esplénicas de la Fracción 19 solas y significativamente mayor que el alcanzado en los otros tres grupos (p<0,05).

La serie de experimentos descrita anteriormente indicaba que dosis elevadas de células esplénicas de la Fracción 19 en las que se habían eliminado las APC o el tratamiento con el mAb anti-gp39 solo podían incrementar la supervivencia de los aloinjertos de islotes pancreáticos en comparación con el no tratamiento. Sin embargo, ninguno de los tratamientos solo era eficaz para inducir tolerancia de larga duración a los aloinjertos de islotes en los receptores. En la serie siguiente de experimentos, el tratamiento con células esplénicas alogénicas fue combinado con el tratamiento del receptor con anti-gp39. Se encontró que la administración combinada de células esplénicas alogénicas y anti-gp39 era más eficaz que la de cada reactivo solo. Los resultados están mostrados en la Figura 2, en la que cada curva representa datos de un ratón individual. Los símbolos en blanco identifican receptores en los que el aloinjerto de islotes falló espontáneamente. Los símbolos rellenos indican ratones cuyos injertos de islotes eran funcionales al final del experimento. La Figura 2 (panel B) muestra que se consiguió una supervivencia indefinida del injerto en todos los animales tratados durante 7 semanas con el mAb anti-gp39 y una única inyección de células esplénicas de la Fracción 19 de las que se habían eliminado las APC (N=6). La alteración de este protocolo mediante la reducción de la duración del tratamiento con anti-gp39 debilitó, pero no suprimió, el efecto favorable sobre la supervivencia del injerto. Se consiguió una supervivencia indefinida del injerto en 6/8 receptores cuando el mAb anti-gp39 fue administrado solamente durante 2 semanas en combinación con las células esplénicas de la Fracción 19 (Figura 2, panel A). Se observó también una supervivencia indefinida del injerto en los receptores tratados con anti-gp39 durante 2 ó 7 semanas en combinación con una inyección de células esplénicas alogénicas no fraccionadas.

Con el fin de confirmar la función del injerto de islotes y la ausencia de secreción de insulina por los islotes nativos residuales no destruidos por el tratamiento con estreptozotocina, se extrajeron los riñones que llevaban implantes subrenales. En todos los casos, la nefrectomía unilateral tuvo como resultado la recurrencia de la hiperglucemia (>300 mg/dl) en 3 días.

Los aloinjertos de islotes y el páncreas nativo fueron estudiados histológicamente en todos los animales, cuando fracasó el injerto o al final del experimento. Las secciones histológicas de los aloinjertos de islotes en los riñones de los receptores de linfocitos pequeños alogénicos fraccionados y un tratamiento continuo con el mAb MR1 (7 semanas), presentaban abundantes islotes intactos visibles por debajo de la cápsula renal que carecían de infiltración de mononucleares y contenían células positivas para insulina y glucagón bien granuladas. En contraste, las secciones histológicas de los aloinjertos de islotes en los riñones de los receptores tratados con el mAb anti-gp39 solo, mostraban una inflamación intensa con células mononucleares características y la destrucción concomitante de las células de los islotes. En los páncreas de todos los huéspedes, la morfología de los islotes era uniformemente consistente con la diabetes por estreptozotocina.

Ejemplo 2 Producción y Caracterización de Anticuerpos Anti-gp39

Experimento 1

Anticuerpos dirigidos contra la gp39 humana

Para la inducción de tolerancia de células T específica de un antígeno en un sujeto humano, es preferible administrar un anticuerpo dirigido contra la gp39 humana. Se utilizó la metodología siguiente para producir anticuerpos monoclonales anti-gp39 humana en ratón. Ratones BALB/c fueron inmunizados con una proteína de fusión de gp39 soluble, gp39-CD8, en Adyuvante Completo de Freund (ACF). Los ratones fueron desafiados posteriormente 6 semanas más tarde con gp39-CD8 soluble en Adyuvante Incompleto de Freund (AIF). La gp39-CD8 soluble fue administrada en forma soluble 4 semanas después de la inmunización secundaria. Los ratones fueron posteriormente reforzados con linfocitos de sangre periférica humana activados 2 semanas más tarde, seguido por un refuerzo final con gp39-CD8 soluble después de 2 semanas adicionales. Los esplenocitos fueron fusionados con la pareja de fusión NS-1 el día 4 después de la última inmunización, según los protocolos estándar.

Los clones que producían anticuerpos anti-gp39 humana fueron seleccionados sobre la base de un proceso de selección múltiple. Los clones fueron seleccionados inicialmente mediante un ensayo de unión a placas utilizando gp39-CD8. Los clones positivos fueron seleccionados posteriormente frente a una proteína de fusión de CD8 control, CD72-CD8. Los clones que resultaron positivos en el ensayo de unión a placas con CD8-CD72 fueron eliminados. Los clones restantes fueron sometidos a selección posteriormente sobre linfocitos de sangre periférica (PBL) humana en reposo y activados durante 6 horas mediante análisis de citometría de flujo. Los hibridomas que teñían PBL activados, pero no en reposo, fueron considerados positivos. Finalmente, los clones restantes fueron analizados para determinar su capacidad para bloquear la unión de CD40Ig a la gp39 unida a las placas.

Aproximadamente 300 clones fueron sometidos a selección inicialmente frente a gp39-CD8 y CD72-CD8 en los ensayos de unión a placas. De esos clones, se encontró que 30 detectaban gp39 unida a las placas y no CD8. Estos clones fueron posteriormente sometidos a selección por la detección de gp39 en PBL humanos activados. Aproximadamente 15 clones detectaron una molécula en PBL activados, pero no en células en reposo. La especificidad fue confirmada posteriormente determinando la capacidad de los clones para bloquear la detección por CD40Ig de la gp39 unida a las placas. Tres de diez clones analizados bloqueaban la unión de CD40Ig en este ensayo. Estos clones fueron 3E4, 2H5 y 2H8. Tales clones son preferidos para ser utilizados en los métodos descritos en la presente. Los clones que resultaron positivos sobre PBL activados, pero no sobre PBL en reposo, fueron también sometidos a selección por su reactividad con un clon de células T de rata activadas, POMC8. El clon 2H8 expresaba reactividad cruzada con esta línea de células T de rata.

Experimento 2

Anticuerpos dirigidos contra la gp39 humana

Se utilizó un procedimiento de inmunización similar al descrito en el Experimento 1 para producir anticuerpos adicionales dirigidos contra la gp39 humana. Un ratón BALB/c fue inmunizado con gp39-CD8 soluble en ACF, seguido por el desafío 4 semanas más tarde con linfocitos de sangre periférica humana activados durante 6 horas. El ratón fue reforzado posteriormente con gp39-CD8 soluble, 4 días antes de la fusión de los esplenocitos con la pareja de fusión NS-1 mediante protocolos estándar. La selección de los clones de hibridomas se llevó a cabo mediante la tinción citométrica de flujo de PBLs humanos activados durante 6 horas. Se seleccionaron los clones que teñían PBLs humanos activados pero no en reposo. Seis clones, 4D9-8, 4D9-9, 24-31, 24-43, 89-76 y 89-79, fueron seleccionados para análisis posterior.

La especificidad de los anticuerpos seleccionados fue confirmada mediante varios ensayos. En primer lugar, el análisis de citometría de flujo demostró que los seis mAbs teñían células T de sangre periférica activadas, pero no en reposo (ver las Figuras 3B y 3C para un ejemplo representativo, las cuales representan la tinción de células T activadas con 4D9-8 y 4D9-9, respectivamente). La expresión de la molécula reconocida por cada uno de los seis anticuerpos es detectable dentro de las 4 horas siguientes a la activación, es máxima entre 6-8 horas después de la activación y es indetectable hacia las 24 horas después de la activación. Los seis mAbs reconocían todos una molécula expresada en PBLs CD3^{+} activados, predominantemente del fenotipo CD4^{+}, pero una porción de células T CD8^{+} expresaba también la molécula. La expresión de la molécula reconocida por los seis mAbs es inhibida por la presencia de ciclosporina A en el medio de cultivo, igual que lo es la expresión de gp39 (ver las Figuras 4A y 4B para un ejemplo representativo, las cuales representan la tinción de células T tratadas con ciclosporina con 4D9-8 y 4D9-9, respectivamente). La cinética y la distribución de la expresión de la molécula reconocida por estos mAbs son idénticas a las de gp39, según se detectó por la proteína de fusión CD40Ig humana. Además, los seis mAbs bloqueaban todos la tinción de gp39 por CD40Ig (ver las Figuras 5A y 5B para un ejemplo representativo, las cuales representan la inhibición de la tinción de gp39 por CD40Ig en presencia de 4D9-8 y 4D9-9, respectivamente). En un ensayo de ELISA, los seis mAbs reconocían todos gp39-CD8, una forma de fusión soluble de la molécula de gp39. Además, los seis mAbs inmunoprecipitaban todos una molécula de 36 kD aproximadamente de PBLs humanos activados marcados con ^{35}S-metionina. La molécula inmunoprecipitada es idéntica a la precipitada por la proteína de fusión humana CD40Ig.

La actividad funcional de los seis mAbs seleccionados (4D9-8, 4D9-9, 24-32, 24-43, 89-76 y 89-79) fue analizada según sigue. En primer lugar, se midió la capacidad de los mAbs para inhibir la proliferación de células B humanas purificadas cultivadas con IL-4 y gp39 soluble. Células B humanas purificadas fueron cultivadas con gp39 e IL-4 en presencia o ausencia de los anticuerpos monoclonales purificados o de CD40Ig a dosis entre 0 y 12,5 \mug/ml. La proliferación de las células B fue determinada después de 3 días en cultivo por incorporación de timidina. Los resultados (mostrados en la Figura 6) demuestran que los seis mAbs pueden todos inhibir la proliferación de células B inducida por gp39 e IL-4. Los mAbs 89-76 y 24-31 fueron los más eficaces para inhibir la proliferación inducida de células B.

A continuación, se examinó la capacidad de los mAbs para inhibir la diferenciación de células B, medida por la producción de Ig inducida por células T activadas con anti-CD3 e IL-2. Se prepararon células B humanas IgD^{+} purificadas mediante selección positiva con FACS y posteriormente se cultivaron con células T humanas activadas con anti-CD3 (tratadas con mitomicina C) e IL-2 durante 6 días en presencia o ausencia de anticuerpos monoclonales anti-gp39 purificados a dosis entre 0 y 10 \mug/ml. La producción de IgM, IgG e IgA fue determinada mediante ELISA el día 6. Los resultados (mostrados a continuación en la Tabla 1) demuestran que los seis anticuerpos pueden inhibir todos la diferenciación de células B dependiente de células T, según se midió por la producción de IgM, IgG e IgA.

TABLA 1

1

2

Con el fin de examinar el efecto de los mAbs anti-gp39 sobre las respuestas de las células T, los mAbs fueron incluidos en reacciones mixtas de linfocitos (MLR) estándar. Se cultivaron 300.000 linfocitos de sangre periférica humana (respondedores = R) con 100.000 linfocitos de sangre periférica alogénicos irradiados (estimuladores = S) en presencia o ausencia de los mAbs anti-gp39 (10 \mug/ml). A los cultivos se les aplicó un pulso de ^{3}H-timidina el día 4, 5 ó 6 y se recogieron 18 horas después. Los seis mAbs anti-gp39 humana inhibían todos las respuestas aloespecíficas medidas por MLR (ver la Figura 7 para un ejemplo representativo, la cual representa la inhibición de las respuestas aloespecíficas cuando R y S son incubados en presencia de 24-31 ó 89-76; se utilizaron como controles positivos una proteína de fusión CTLA4-inmunoglobulina y un mAb anti-CD28).

Con el fin de determinar si los seis mAb reconocían epítopos distintos en la molécula de gp39 humana, se llevaron a cabo experimentos de bloqueo cruzado. PBLs humanos activados fueron bloqueados primeramente con cada uno de los seis mAbs (25 \mug/ml de anticuerpo no conjugado). Las células fueron lavadas y teñidas posteriormente con 10 \mug/ml de anticuerpo conjugado a biotina, seguido por la reacción con avidina conjugada a fitoeritrina (PE-Av). La tinción de las células con PE-Av fue analizada mediante FACS. Los resultados se muestran a continuación en la Tabla 2.

TABLA 2

3

\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
  \begin{minipage}[t]{150mm} La intensidad de la tinción y el
porcentaje de células positivas están representados por el símbolo +
(++++ = IM >200; +++ = IM >125; ++ = IM >50; + = IM >25;
- = no hay tinción por encima del fondo). ND= no
determinado.\end{minipage} \cr}

Todos los anticuerpos bloqueaban la unión de CD40Ig a PBLs humanos activados. Sin embargo, los datos mostrados en la Tabla 2 demuestran claramente el fracaso de algunos anticuerpos para bloquear la unión de otros anticuerpos a PBLs humanos activados, sugiriendo que reconocen epítopos distintos en las moléculas de gp39 humana.

Los hibridomas 89-76 y 24-31, que producen los anticuerpos 89-76 y 24-31, respectivamente, fueron depositados bajo las disposiciones del Tratado de Budapest en la American Type Culture Collection, Parklawn Drive, Rockville, Md., el 2 de Septiembre de 1994. Al hibridoma 89-76 se le asignó el Número de Acceso de la ATCC HB11713 y al hibridoma 24-31 se le asignó el Número de Acceso de la ATCC HB11712.

Experimento 3

Anticuerpos dirigidos contra gp39 de ratón

En una realización de la invención, el antagonista de gp39 es un anticuerpo monoclonal anti-gp39 de ratón, MR1. Se utilizó el método siguiente para producir el anticuerpo monoclonal MR1, y puede ser utilizado para generar otros anticuerpos dirigidos hacia gp39.

Se inmunizaron hámsteres intraperitonealmente con 5 x 10^{6} células T_{h}1 activadas (d1.6) a intervalos semanales durante seis semanas. Cuando el título sérico contra T_{h}1 murinas fue mayor de 1:10.000 aproximadamente, se llevaron a cabo fusiones celulares con polietilén glicol utilizando esplenocitos de hámster inmune y NS-1. Los sobrenadantes de los pocillos que contenían hibridomas en crecimiento fueron sometidos a selección mediante citometría de flujo sobre T_{h}1 en reposo y activadas. Un hibridoma particular, que producía un mAb que reconocía selectivamente T_{h} activadas, fue analizado posteriormente y subclonado para derivar MR1. MR1 fue producido en líquido ascítico y purificado mediante HPLC de intercambio iónico. Un hibridoma MR1 ha sido depositado en la American Type Culture Collection y le fue asignado el Número de Acceso HB11048.

Equivalentes

Las personas expertas en la técnica reconocerán, o serán capaces de determinar empleando no más de una experimentación rutinaria, muchos equivalentes de las realizaciones específicas de la invención descritas en la presente. Tales equivalentes están destinados a ser abarcados por las reivindicaciones siguientes. El contenido de todas las referencias y solicitudes de patente publicadas citadas a lo largo de toda esta solicitud se incorporan de este modo por referencia.

Claims

1. Utilización de (a) una célula alogénica o xenogénica que expresa al menos un antígeno de un donante y que tiene un ligando en la superficie de la misma que interacciona con la gp39 de las células T del receptor; y

(b) un antagonista de gp39

para la fabricación de una preparación combinada para ser utilizada simultáneamente, separadamente o secuencialmente en la inducción de tolerancia de las células T a un tejido u órgano de un donante en un receptor del tejido u órgano, con la condición de que, cuando la célula alogénica o xenogénica sea una célula alogénica, el tejido u órgano del donante comprenda islotes pancreáticos, hígado, riñón, corazón, pulmón, piel, músculo, tejido neuronal, estómago o intestino.

2. Utilización de (a) una célula alogénica o xenogénica que expresa al menos un antígeno de un donante y que tiene un ligando en la superficie de la misma que interacciona con la gp39 de las células T del receptor;

(b) un antagonista de gp39; y

(c) células de los islotes pancreáticos del donante para la fabricación de una preparación combinada para uso simultáneo, separado o secuencial en el tratamiento de la diabetes.

3. Utilización de acuerdo con la reivindicación 1 o con la reivindicación 2, en la que el antagonista es un anticuerpo anti-gp39.

4. Utilización de (a) una célula alogénica de un donante que expresa al menos un antígeno del donante y que tiene un ligando en la superficie de la misma que interacciona con la gp39 de las células T del receptor; y

(b) un anticuerpo anti-gp39,

para la fabricación de una preparación combinada para uso simultáneo, separado o secuencial en la inducción de tolerancia de células T a un tejido u órgano del donante en un receptor del tejido u órgano, donde la célula alogénica del donante y al anticuerpo anti-gp39 serán administrados al receptor antes del trasplante del tejido u órgano, donde el tejido u órgano del donante comprende islotes pancreáticos, hígado, riñón, corazón, pulmón, piel, músculo, tejido neuronal, estómago o intestino.

5. Utilización de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que la célula alogénica o xenogénica es una célula linfoide.

6. Utilización de acuerdo con la reivindicación 5, en la que la célula linfoide es una célula B.

7. Utilización de acuerdo con la reivindicación 6, en la que la célula B es una célula B en reposo.

8. Utilización de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 5 a 7, en la que la célula alogénica o xenogénica y el antagonista serán administrados al receptor antes del trasplante del tejido u órgano.

9. Utilización de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 4 a 8, en la que el tejido u órgano comprende islotes pancreáticos.

10. Utilización de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 4 a 8, en la que el tejido u órgano es seleccionado del grupo que consta de hígado, riñón, corazón, pulmón, piel, músculo, tejido neuronal, estómago e intestino.

11. Utilización de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 3 a 10, en la que el anticuerpo anti-gp39 es un anticuerpo monoclonal.

12. Utilización de acuerdo con la reivindicación 11, en la que el anticuerpo monoclonal es obtenible de la línea celular de hibridomas MR1 depositada como ATCC HB11048.

13. Utilización de acuerdo con la reivindicación 11, en la que el anticuerpo monoclonal es un anticuerpo monoclonal quimérico.

14. Utilización de acuerdo con la reivindicación 11, en la que el anticuerpo monoclonal es un anticuerpo monoclonal humanizado.

15. Utilización de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 3 a 14, en la que el anticuerpo anti-gp39 es un anticuerpo anti-gp39 humana.

\newpage

16. Utilización de acuerdo con la reivindicación 1 o con la reivindicación 2, en la que el antagonista de gp39 es una forma soluble de un ligando de gp39.

17. Utilización de acuerdo con la reivindicación 16, en la que la forma soluble de un ligando de gp39 es una proteína de fusión de CD40.

18. Utilización de un antagonista de gp39 para la fabricación de una preparación para ser utilizada en la inducción de tolerancia de las células T a un tejido u órgano de un donante en un receptor, receptor que va a ser expuesto a células alogénicas o xenogénicas que expresan al menos un antígeno del donante y que tienen un ligando en la superficie de las mismas que interacciona con la gp39 de las células T del receptor, con la condición de que, cuando las células alogénicas o xenogénicas sean células alogénicas, el tejido u órgano del donante comprenda islotes pancreáticos, hígado, riñón, corazón, pulmón, piel, músculo, tejido neuronal, estómago o intestino.

19. Utilización de acuerdo con la reivindicación 18, en la que las células alogénicas o xenogénicas que expresan al menos un antígeno del donante comprenden células linfoides o células presentadoras de antígeno.

20. Utilización de acuerdo con la reivindicación 19, en la que dicha célula linfoide es un linfocito B.

21. Utilización de acuerdo con la reivindicación 19, en la que dicha célula presentadora de antígeno es seleccionada de monocitos, células dendríticas, células de Langerhan, queratinocitos, células endoteliales, astrocitos, fibroblastos y oligodendrocitos.

22. Utilización de acuerdo con la reivindicación 19, en la que la célula presentadora de antígeno es una célula B.

23. Utilización de acuerdo con la reivindicación 18, en la que el tejido u órgano del donante comprende hígado, riñón, corazón, pulmón, piel, músculo, tejido neuronal, estómago o intestino.

24. Utilización de un antagonista de gp39 para la fabricación de un medicamento para ser utilizado en el tratamiento de la diabetes en un sujeto que va a ser expuesto a células de los islotes pancreáticos del donante y a células alogénicas o xenogénicas que expresan al menos un antígeno del donante y que tienen un ligando en la superficie de las mismas que interacciona con la gp39 de las células T del receptor.

25. Utilización de acuerdo con la reivindicación 24, en la que las células alogénicas o xenogénicas que expresan al menos un antígeno del donante incluyen células linfoides tales como linfocitos B; células dendríticas, monocitos y células de Langerhan.

26. Utilización de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 18 a 25, en la que el antagonista de gp39 es un anticuerpo anti-gp39 o una proteína de fusión de CD40 soluble.

27. Utilización de acuerdo con la reivindicación 26, en la que el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal anti-gp39.

28. Utilización de acuerdo con la reivindicación 27, en la que el anticuerpo monoclonal es un anticuerpo quimérico o un anticuerpo monoclonal humanizado.