EA002550B1 - Лечение посредством блокады cd154 при трансплантации ткани панкреатических островков - Google Patents

Abstract

Способы и композиции для ингибирования отторжения инсулин-продуцирующей ткани организмом реципиента трансплантата, а также способы и композиции для пролонгирования выживания или функции трансплантата; для реверсирования отторжения трансплантата или восстановления функции поврежденного трансплантата и для индуцирования иммунологической толерантности по отношению к трансплантированной инсулин-продуцирующей ткани. Настоящие способы и композиции подходят для лечения или профилактики дефектов метаболического контроля гомеостаза глюкозы крови, включая дефекты, проявляющиеся сахарным диабетом (СД).

Description

Родственные заявки

Настоящая заявка является частично продолжающей в отношении более ранней заявки и.8.Ртоущюпа1 8.Ν. 60/050267, поданной 20 июня 1997 г., и заявки и.8.Ртоущюпа1 8.Ν. 60/077265, поданной 9 марта 1998 г. Идеи этих обеих более ранних временных патентных заявок включены в настоящий документ в качестве ссылок.

Область изобретения

Настоящее изобретение относится к подавлению нежелательных иммунных ответов, в частности, противоадаптивных иммунных ответов, опосредованных Т-лимфоцитами. Настоящее изобретение относится, в частности, к предупреждению, лечению, подавлению или обратному развитию отторжения пересаженной ткани или органа организмом-хозяином в результате работы иммунной системы.

Предпосылки к созданию изобретения

Пересадка органов с участием генетически не идентичных индивидуумов неизбежно приводит к иммунологическому отторжению органа посредством механизмов, зависящих от Тклеток, если только этот процесс отторжения не прекращается путем введения лекарственных средств, подавляющих функцию Т-клеток. Несколько патентов США раскрывают применение таких иммунодепрессантов для ингибирования отторжения трансплантата, включая №№ 5104858, 5008246 и 5068323. Другие обычно применяющиеся агенты описаны в 8и111ап11пгап е1 а1. (1994), 331 Ν™ Епд. Меб. 1. 365-376. В клинике применяют ингибиторы кальциневринфосфатазы и глюкокортикостероиды, которые оба предотвращают опосредованное Т-клетками высвобождение активирующих цитокинов, в частности, 1Ь-2. Однако лечение обычными лекарственными средствами этих типов остается далеким от совершенства. Оба этих типа действуют посредством препятствования прохождению сигнала через механизм антигенных рецепторов Т-клеток (ТКР), единственного медиатора Т-клеточной антигенной специфичности, и действуют на все Т-клетки без какой бы то ни было избирательности. Помимо этого, эффект этих лекарств непродолжителен, и прекращение лечения обычно приводит к отторжению трансплантата. Таким образом, для поддержания жизнеспособной функциональной интеграции трансплантата реципиенты вынуждены страдать от последствий долгосрочной и неспецифичной иммуносупрессии. Эти последствия включают повышенный риск инфекции и появления злокачественных новообразований, а также токсичность, особенно в отношении чувствительных органов или тканей, таких как почки, печень и поджелудочная железа.

Трансплантация островковых клеток (ТОК) может привести к обратному развитию гипергликемии и нормализации метаболического контроля глюкозы крови (Шсотбц Э|аЬе1е5

Веу1еи8 4:356-369, 1996; 8сйатр е1 а1., Э1аЬе1е8 39:515-518, 1990; 8осс1 е1 а1., Ас1а Э1аЬе1о1 28:151-157, 1991; Уагпоск е1 а1., Э|аЬе1о1оща 34:55-58, 1991; К1сотб1 е1 а1., Тгап8р1ап1а1юп 53:407-414, 1992; Оогек е1 а1., Ьапсе! 341:19-21, 1993; А1е)апбго е1 а1., Э1аЬе1е8 46:1983-1989, 1997) у лиц, страдающих сахарным диабетом (СД). Даже в отсутствии независимости от инсулина введение небольших доз экзогенного инсулина реципиентам, у которых успешно функционировал трансплантат островковой ткани (базальная выработка С-белка >1,0 нг/мл), обеспечивал отличный метаболический контроль и нормализацию гемоглобина А1с (НЬА1с) (К1сотб1, Э1аЬе1е8 Кеу1еик 4:356-369, 1996;

8сйатр е1 а1., Э1аЬе1е8 39:515-518, 1990; 8осс1 е1 а1., Ас1а Э1аЬе1о1 28:151-157, 1991; Уагпоск е1 а1., Э|аЬе1о1оща 34:55-58, 1991; В1согб1 е1 а1., Тгапкр1ап1а1юп 53:407-414, 1992; Оогек е1 а1., Ьапсе! 341:19-21, 1993; А1с|апбго е1 а1., Э1аЬе1е8

46:1983-1989, 1997). Гипогликемия не наблюдалась и функционирование островковых трансплантатов у реципиентов с аутоиммунным диабетом в течение свыше 6 лет после пересадки в настоящее время является подтвержденным документами фактом (А1е)апбго е1 а1., Э1аЬе1е8 46:1983-1989, 1997). Несмотря на эти значительные успехи, широкое применение трансплантации островковых клеток для контроля СД ограничивается тем, что реципиенту требуется осуществление постоянной генерализованной иммуносупрессии. Это ограничение связано не только с риском, связанным с постоянной иммуносупрессии, но также и с диабетогенным эффектом иммунодепрессантов, применяющихся в настоящее время.

Эти ограничения современных методов лечения, связанных с подавлением СД стимулировали большой интерес к усовершенствованию лечения, направленного на индукцию специфичной для донора иммунологической толерантности, которые позволили бы избежать необходимости в долгосрочной иммуносупрессии пересаженных тканей у реципиентов. Многообещающие первоначальные результаты были получены некоторыми исследователями, которые работали с модельными системами аллотрансплантации на грызунах. Однако при доклинических испытаниях на больших животных (например, на собаках и приматах, не являющихся человеком), было установлено, что результаты, полученные в опытах на грызунах, трудно использовать для предсказания результатов ТОК на экспериментальных животных, наиболее близких к ТОК у человека.

Соответственно, существует потребность в разработке улучшенного или более эффективного иммуносупрессивного или иммуномодулирующего лечения трансплантатов реципиентов, включая человека. В частности, существует потребность в разработке лечения, которое не требует тотальной Т-клеточной иммуно3 супрессии, т.е. лечения, которое не делает реципиента подверженным риску злокачественных новообразований или условно-патогенных инфекций. Более конкретно, существует потребность в разработке лечения с меньшей токсичностью по сравнению с современными терапевтическими агентами. Подобно этому, существует потребность в разработке лечения, которое способствовало бы продолжительной функциональной интеграции трансплантата, т.е. интеграции, которая сохраняется после окончания курса лечения.

Краткое описание существа изобретения

Целью настоящего изобретения является создание иммуномодулирующего агента, который смягчает противоадаптивный Т-клеточный ответ без необходимости тотальной Тклеточной иммуносупрессии. Другой целью настоящего изобретения является создание иммуномодулирующего агента, который способствует функциональной интеграции тканевого трансплантата, в частности, трансплантата панкреатической островковой ткани, в организм реципиента, в частности, человека. Другой целью настоящего изобретения является создание иммуномодулирующего агента, который ингибирует иммунологическое отторжение трансплантированной ткани, в частности трансплантированных панкреатических островков или иной инсулин-продуцирующей ткани. Еще одной целью настоящего изобретения является создание иммуномодулирующего агента, который прерывает прохождение костимулирующего сигнала активированным Т-клеткам. Конкретной целью является создание прерывателя связывания ί.Ό40:ί.Ό154. такого как агент, блокирующий ί.Ό154. для применения в терапии, в частности, для смягчения, задерживания или реверсирования иммунологического отторжения трансплантированной ткани. Более общей целью настоящего изобретения является улучшение доступности тканевых трансплантатов, в частности, инсулин-продуцирующих тканевых трансплантатов, путем создания иммуномодулирующих композиций, которые обеспечивают функциональную интеграцию неаутологичной ткани (например, аллогенной или ксеногенной ткани) в организм реципиента. Еще одной главной целью является предотвращение, смягчение, ослабление или лечение сахарного диабета (СД).

Настоящее изобретение базируется на открытии того факта, что применение прерывателя связывания СЭ40:СЭ154. такого как агент, блокирующий СЭ154. как в отдельности, так и в комбинации с другим терапевтическим агентом, таким как иммуномодулирующий агент или агент, усиливающий толерантность, ослабляет, подавляет, предотвращает, задерживает или реверсирует противоадаптивное иммунологическое отторжение трансплантированной инсулин-продуцирующей ткани в организме реципиента, без необходимости тотального подавления иммунной системы реципиента.

Соответственно, настоящее изобретение относится к способам и композициям для иммуномодулирующего лечения реципиентов трансплантированной инсулин-продуцирующей ткани. Первый способ ингибирует отторжение трансплантата инсулин-продуцирующей ткани организмом реципиента. Второй способ пролонгирует выживание тканевого трансплантата. Третий способ реверсирует отторжение тканевого трансплантата. Четвертый способ сохраняет функцию тканевого трансплантата. Пятый способ восстанавливает функцию поврежденного трансплантата. Шестой способ индуцирует иммунологическую толерантность к тканевому трансплантату. Все перечисленные способы включают лечение реципиента трансплантата прерывателем связывания ί.Ό40:ί.Ό154. под которым подразумевается любой агент, который прерывает связывание лиганда ί.Ό40 (т.е.

ί.Ό40Ε также известный как СО 154 или антиген 5с8, или иногда упоминаемый как др39) с его родственными рецепторами или противорецепторами (здесь СЭ40). Предпочтительно прерывателем связывания является агент, блокирующий СЭ154 (СО40Б). под которым подразумевается любой агент, который связывается с ί.Ό154 и предотвращает или препятствует его связыванию с противорецепторами (например, ί.Ό40). Примером агента, блокирующего ί.Ό154. является моноклональное антитело (МАЬ). в частности, антитело, обладающее антиген-специфичными связывающими характеристиками 5с8 МАЬ, описанное в патенте США 5474771. идеи которого включены в настоящий документ в качестве ссылки.

Описанные выше способы можно применять для всех типов трансплантатов инсулинпродуцирующей ткани, таких как интактная панкреатическая ткань или панкреатические островки, выделенные с помощью обычных методик. Таким образом, настоящее изобретение пригодно для применения, когда реципиентом трансплантата (реципиентом-хозяином) является млекопитающее, предпочтительно примат, наиболее предпочтительно человек. В частности, настоящее изобретение пригодно для применения, когда реципиент трансплантата страдает или входит в группу повышенного риска нарушения метаболического контроля метаболизма глюкозы, такого как СД. Донор трансплантата может быть несингенным членом того же филогенетического вида, что и реципиент трансплантата (т.е. аллогенным донором, у которого производится забор ткани для аллотрансплантации). или членом отличающегося филогенетического вида (т.е. ксеногенным донором, у которого производится забор ткани для ксенотрансплантации). Если в качестве источника ткани для трансплантации используется ксеногенный донор, предпочтительно донор должен быть относительно совместимым по МНС с реципиентом-хозяином, например гамадрил или шимпанзе будут предпочтительными в качестве донора ткани для трансплантации в случае пересадки ее человеку. Настоящее изобретение может быть использовано для ускорения приживления других типов инсулинпродуцирующей ткани, включая клеточные популяции изолированных островковых β-клетоквзрослого организма или плода или культивированные островковые β-клетки (полученные как из первичной клеточной культуры, так и иммортализованной клеточной линии). В самом деле, настоящее изобретение может использоваться для ускорения приживления любой клетки, экспрессирующей ген инсулина как при стимуляции, так и постоянно, такой как сконструированная клетка, клетка-хозяин, полученные с помощью обычных методик генной инженерии. Необязательно, инсулин-продуцирующая ткань может быть физически отделена от тканей реципиента с помощью иммуноизолирующего устройства.

С учетом вышеизложенного ясно, что настоящее изобретение создает способ восстановления метаболического контроля метаболизма глюкозы у млекопитающего, которое в этом нуждается. Этот способ включает имплантирование инсулин-продуцирующей ткани млекопитающему и лечение млекопитающего прерывателем связывания СО40:СО154, предпочтительно агентом, блокирующим СО154. В предпочтительных вариантах осуществления настоящего изобретения агентом, блокирующим СО 154, является моноклональное антитело МАЬ 5с8. В протоколе, который может служить примером, подтвержденном доклиническими испытаниями на больших подходящих для этих целей экспериментальных животных, на которых моделировался СД человека, приживление индуцировалось введением МАЬ до проведения ТОК, после чего (предпочтительно), по меньшей мере, дважды вводились МАЬ в течение двухнедельного периода после ТОК (т.е. после имплантации инсулин-продуцирующей ткани). После этого, по желанию, приживление поддерживается введением МАЬ в течение одного месяца (определяется как четыре недели) после ТОК. Эту поддержку можно повторять по мере необходимости или как только это представляется разумным.

Необязательно приживление можно усиливать путем одновременного лечения млекопитающего агентом, повышающим толерантность, под которым подразумевается любой агент, который сохраняет приживление после прекращения иммуномодулирующего или иммуносупрессивного лечения. Примером агента, повышающего толерантность может служить ткань костного мозга или популяция клеток, полученная из костного мозга, которые совмес тимы по системе МНС с тканевым трансплантатом (здесь с инсулин-продуцирующей тканью). Предпочтительно костный мозг или клетки являются сингенными по отношению к донору или источнику инсулин-продуцирующей ткани. Долгосрочное выживание агента, повышающего толерантность, в организме реципиента трансплантата, соответственно, делает реципиента иммунологически химерическим, т.е. приводит в состояние, проявляющееся донор-специфичной иммунологической толерантностью. Особенно предпочтительными агентами, повышающими толерантность, являются популяции полученных из костного мозга гемопоэтических клеток СО34(+) (стволовые клетки). Особенно предпочтительными являются популяции стволовых клеток, имеющие фенотип клеточной поверхности СО40(-).

В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу обнаружения нарушения метаболического контроля метаболизма глюкозы у млекопитающего. Этот способ достаточно чувствителен, чтобы обнаруживать субклиническое (например, скрытое или бессимптомное) нарушение метаболизма глюкозы крови, например, когда млекопитающее входит в группу повышенного риска развития СД или повышенного риска или уже находящегося на ранних стадиях отторжения прижившейся инсулинпродуцирующей ткани. Этот способ включает оценку содержания глюкозы в образце, включающем кровь, взятую у млекопитающего, по меньшей мере, через 1 ч и менее чем через 6 ч (предпочтительно около 2 ч) после того, как млекопитающее животное потребляло пищу. Считается, что у млекопитающего нарушен метаболизм глюкозы, если содержание глюкозы в образце, полученном после приема пищи (ППП), составляет 150 мг/дл или выше (т.е. превышает приблизительно 150 мг/дл). Надежность этого способа повышается, если оценивают два таких образца, отобранных в течение двух последующих дней, и в обоих обнаруживают содержание глюкозы 150 мг/дл или выше.

Краткое описание чертежей

Перечисленные выше и другие цели, признаки и преимущества настоящего изобретения, а также само изобретение можно более полно представить, благодаря следующему описанию предпочтительных вариантов его осуществления, при чтении и одновременном изучении сопровождающих чертежей, на которых фиг. 1 представляет из себя линейный график, на котором отмечены уровни глюкозы крови натощак (ГН) у гамадрилов-реципиентов, получающих лечение агентом, блокирующим СО154, после ТОК, в зависимости от дня после операции (ДПО);

фиг. 2 - линейный график, на котором отмечены уровни ГН у макак резус, реципиентов, получающих лечение агентом, блокирующим

ί.Ό154. после ТОК, в зависимости от дня после операции (ДПО);

фиг 3 - линейный график, на котором сравниваются уровни ГН у макак резус, представленные на фиг. 2. и уровни ГН у человека, страдающего СД и получающего обычное заместительное лечение инсулином.

Подробное описание изобретения

Активация Т-клеток и зависящие от нее иммунологические процессы требуют как наличия опосредованных Т-клеточными рецепторами(ТКР) сигналов, так и наличия одновременно доставляемых костимулирующих сигналов. Важный костимулирующий сигнал доставляется путем лигирования СЭ40 на антиген-презентирующую клетку, такую как В-клетка, посредством СО40Ь (ΟΌ154) на Т-клетке. СЭ40 человека представляет из себя белок клеточной поверхности весом 50 кДа, который экспрессируется зрелыми В-клетками, а также макрофагами и активированными эндотелиальными клетками. ί.Ό40 принадлежит к классу рецепторов, участвующих в запрограммированной смерти клетки, который включает также рецепторы Ра§/СО95 и фактора некроза опухолей (ΤΝΡ) альфа. СО 154 (СО40Ь) представляет из себя гликопротеин мембраны типа II весом 32 кДа, обладающий гомологичностью в отношении ΤΝΡ альфа, который временно экспрессируется главным образом активированными Т-клетками. Было установлено, что связывание ί.Ό40:ί.Ό154 требуется для всех ответов с выработкой антител, зависящих от Т-клеток. В частности, связывание СЭ40:СЭ154 создает антиапоптотические и/или лимфокиновые стимулирующие сигналы.

Важность связывания СЭ40:СЭ154 в возникновении зависящих от Т-клеток биологических ответов была оценена более полно, когда было установлено, что связанный с Х гипер-1дМ синдром (Х-НЮМ) у человека представляет из себя фенотип, возникающий в результате генетического отсутствия функционального СЭ154. Страдающие этим синдромом лица имеют нормальные или высокие уровни 1дМ. но не могут вырабатывать антитела 1дС. 1дА или 1дЕ и страдают от рецидивирующих, иногда тяжелых, бактериальных и паразитарных инфекций, а также среди них наблюдается повышенная частота возникновения лимфом и абдоминальных раков. Сходный фенотип наблюдается и у животных, не являющихся человеком, нуллизиготных по гену, кодирующему СО 154 (нокаутные животные). В-клетки нуллизиготных по СЭ154 животных могут вырабатывать 1дМ в отсутствии связывания ί.Ό40:ί.Ό154. но не способны переносить изотипическое разнообразие или нормально выживать после созревания аффинности. Гистологически герминальные центры лимфатических узлов не могут развиваться должным образом, и В-клетки памяти отсутствуют или развиваются слабо. Функционально эти дефекты вносят свой вклад в серьезное ос лабление или отсутствие вторичного (зрелого) антительного ответа. Наблюдаются также дефекты клеточного иммунитета, что проявляется повышенной частотой возникновения бактериальных и паразитарных инфекций. Многие из этих клеточно-опосредованных дефектов могут быть реверсированы посредством введения 1Ь12 или ΙΡΝ-гамма. Эти наблюдения подтверждают точку зрения о том, что нормальное связывание СЭ40:СЭ154 ускоряет развитие иммунных ответов I типа с участием Т-хелперов.

В ряде доклинических испытаний было установлено, что агенты, способные прерывать связывание ί.Ό40:ί.Ό154 являются многообещающими иммуномодулирующими агентами. В частности, исследования на малых животных, которым пересаживали орган или ткань, показали, что прерыватели связывания СЭ40:СЭ154 способствуют выживанию аллогенных трансплантатов. На выборочных моделях временное введение агентов, препятствующих Т-клеточной костимуляции, приводило к индукции неограниченного восприятия трансплантата. Прерывание связывания СЭ40:СЭ154. в частности, дало многообещающие результаты, поскольку, как представляется, образование этой пары противорецепторов предшествует другим костимулирующим сигналам по хронологии и важности (Капйет е! а1.. I. Ехр. Меб. 177:925-935. 1993; Коу е! а1.. Еиг. I. 1ттипо1. 25:596-603. 1995; Нап е! а1.. I. 1ттипо1. 155:556-567. 1995; 8Ыпбе е! а1.. I. 1ттипо1. 157:2764-2768. 1996; Уапд е! а1.. 8οίепсе 273:1862-1864. 1996; Сге\\а1 е! а1.. 8е1епее 273:1864-1867. 1996; Ьебегтап е! а1.. I. 1ттипо1. 149:3817-3826. 1992). Блокада связывания

СЭ40:СЭ154 вызывала пролонгирование выживания сердечных (Ьагкеп е! а1.. Тгаи8р1ап1а!юп 61:4-9. 1996; Ьагаеп е! а1.. №Щ.1ге 381:434-438. 1996). кожных (Ьагаеп е! а1.. 381:434-438. 1996; Магкеек е! а1.. Τ^аи8р1аиίаί^оп 64:329-335. 1997) и островковых трансплантатов (Рагкег е! а1.. Ргос. N311. Асаб. 8с1. И8А 92:9560-9564. 1995; Кокыш е! а1.. Се11 Тгап8р1ап!. 5:49-52).

У грызунов и алогенных почек у приматов (Кик е! а1.. Ргос. №И. Асаб. 8ск И8А 194:87898794. 1997). Была показана также задержка развития аутоиммунного диабета у страдающих диабетом без ожирения (ДБО) мышей (Ва1ака е! а1.. I. 1ттипо1. 159:4620-4627. 1997). И, наконец, сообщалось о том, что препятствие связыванию СЭ40:СЭ154 предотвращает выработку цитокинов воспаления (Оесйапе! е! а1.. I. 1ттипо1. 159:5640-5647. 1997; К1епег е! а1.. I. 1ттипо1. 155:4917-4925. 1995).

Таким образом, блокада СЭ40:СЭ154 может потенциально обеспечивать лекарственные средства для предотвращения неудачной трансплантации островковых аллотрансплантатов и ксенотрансплантатов у индивидуумов, имеющих дефектный метаболизм глюкозы, такой как диабет I типа. Однако, как отмечалось выше, исследования на грызунах плохо коррелируют с результатами испытаний или лечения на больших животных, включая человека.

В настоящем документе описаны исследования, в которых оценивались эффекты предпочтительного агента, блокирующего СБ 154, гуманизированного МАВ, обладающего антиген-специфичными связывающими свойствами МАЬ 5с8 (Ьебегтап е! а1., 1, Ехр. Меб. 175:10911101, 1992), с использованием преклинических моделей аллотрансплантации на больших животных. Конкретно, эти модели включали монотерапию с помощью блокады СБ 154 гамадрилов (Рарю Натабгуак) и других приматов, не являющихся человеком. Результаты, полученные в этих исследованиях, настоятельно наводят на мысль о том, что монотерапия с помощью блокады СБ 154 будет способствовать долгосрочному приживлению инсулин-продуцирующей ткани у человека, особенно, у человека, страдающего СД или сходным дефектом гомеостаза глюкозы.

Следующие данные иллюстрируют и представляют примеры различных контекстов и обстоятельств, при которых может осуществляться на практике настоящее изобретение, а также доказательных исследований, включающих конкретные варианты осуществления настоящего изобретения.

Реципиенты-хозяева

Настоящее изобретение может применяться для лечения или профилактики любого млекопитающего-реципиента трансплантата инсулин-продуцирующей ткани или любого млекопитающего, которому требуется трансплантация инсулин-продуцирующей ткани. Реципиентыхозяева (также упоминаются как реципиенты или хозяева), соответственно, страдают или находятся в группе повышенного риска дефекта метаболического контроля метаболизма глюкозы крови (гомеостаза глюкозы). Например, у реципиента может быть гипер- или гипогликемия. Настоящее изобретение особенно удобно для применения у реципиентов, страдающих диабетом, особенно, у реципиентов, страдающих сахарным диабетом (СД). Предпочтительно, этот реципиент является приматом, более предпочтительно высшим приматом, наиболее предпочтительно человеком. В других вариантах осуществления настоящего изобретения реципиент может быть другим млекопитающим, нуждающимся в трансплантации ткани, особенно, млекопитающим, имеющим коммерческую ценность, или домашним животным или другим ценным животным, таким как животное, принадлежащее к виду, находящемуся под угрозой исчезновения.

Таким образом, примеры реципиентахозяина включают, но не ограничиваются, овец, лошадей, крупный рогатый скот, коз, свиней, собак, кошек, кроликов, морских свинок, хомячков, песчанок, крыс и мышей.

Донор ткани для трансплантации

Настоящее изобретение может быть осуществлено с помощью любого типа трансплантата инсулин-продуцирующей ткани или процедуры трансплантации, особенно, процедур, при которых донорская (трансплантируемая) ткань подвергается или имеет риск неудачи или отторжения иммунной системой реципиентахозяина. В частности, настоящее изобретение может быть применено в любом контексте, когда донорская ткань не является гистосовместимой (совместимой по системе МНС) с реципиентом-хозяином. Таким образом, помимо аутологичной или сингенной донорской ткани, настоящее изобретение может осуществляться при применении аллогенной или даже ксеногенной донорской ткани. Донорскую ткань можно получать обычными способами, от добровольца или другого живого донора, или от трупа. Предпочтительно, донор является насколько это возможно гистосовместимым с реципиентомхозяином. Таким образом, когда реципиентомхозяином является человек, предпочтительна аутологичная или аллогенная донорская ткань. Однако донорская ткань может быть получена от гетерологичного вида (в этом случае это называется гетеротрансплантатом), такого как примат, не являющийся человеком (например, шимпанзе или гамадрил), или другое относительно совместимое млекопитающее (например, свинья).

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения донорская ткань включает интактную поджелудочную железу. В других вариантах осуществления настоящего изобретения донорская ткань включает часть, долю или биоптат донорской поджелудочной железы. Донорская поджелудочная железа может быть получена от живого донора или извлечена из подходящего трупа. Если используется материал от донора-трупа, поджелудочную железу предпочтительно выдерживают в условиях холода и ишемии в течение не более приблизительно 8 ч. В еще одних вариантах осуществления настоящего изобретения донорская ткань включает инсулин-продуцируюшие клетки, особенно, выделенные или суспендированные островки или островковые клетки, включая клетки, изъятые или вырезанные из донора-плода или взрослого донора, клетки, живущие в первичной культуре, или клетки иммортализованной клеточной линии. Подходящие методики получения донорских островков или суспензий островковых клеток из целой поджелудочной железы хорошо известны (см., например, К1еогб1 е! а1. (1988), 37 Б1аЬе!е§ 413-420; ТхакЕ е! а1. (1990), 336 Ьапее! 402-405; ЬшеНку е! а1. 1997, 46 Б1аЬе!е§ 11201123). Подходящие поджелудочные железы получают от доноров, практически не имеющих дефектов гомеостаза глюкозы крови. Другие источники инсулин-продуцирующих клеток включают плодные островковые клетки11 предшественники, необязательно, подрощенные в первичной культуре. Однако может использоваться любой подходящий клеточный тип, включая клетки, несущие экзогенный генетический материал, кодирующий способный экспрессироваться ген инсулина. Таким образом, настоящее изобретение охватывает применение трансфецированных или трансформированных клеток-хозяев (или получены из клетокпредшественников, сконструированных так, чтобы они экспрессировали инсулин, как постоянно, так и в результате стимуляции, например, под контролем чувствительного к глюкозе промотора или усилителя). В других вариантах осуществления настоящее изобретение охватывает применение панкреатических или других типов донорских клеток, полученных от трансгенного млекопитающего, которое конструировалось с целью включения генетического материала, необходимого для выработки инсулина в некоторых или во всех тканях его организма.

Инсулин-продуцирующая ткань (донорская ткань) вводится системно или локально в организм реципиента-хозяина. Например, выделенные суспендированные или диспергированные инсулин-продуцирующие клетки могут вводиться в кровеносный сосуд или имплантироваться в желаемый участок, такой как костномозговая полость, печень, внутрь почечной капсулы, внутримышечно или интраперитонеально. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения эти клетки являются митотически компетентными и производят новую ткань донорского происхождения. В других вариантах осуществления настоящего изобретения эти клетки не являются митотически компетентными, но остаются жизнеспособными в организме донора и вырабатывают или экспрессируют инсулин. В любом случае, имплантируется эффективное количество инсулин-продуцирующих клеток или ткани, под которым подразумевается количество, достаточное для ослабления (заметного смягчения) дефекта метаболизма глюкозы (например, гипогликемии или гипергликемии) у реципиента. Оптимально, это количество является достаточным для восстановления способности организма реципиента поддерживать гомеостаз глюкозы - т.е. достаточным для того, чтобы освободить реципиента от зависимости от обычной (например, путем инъекций или ингаляций) инсулиновой заместительной терапии.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения инсулин-продуцирующая ткань физически отделяется (изолируется) от окружающих тканей реципиента с помощью иммуноизолирующего устройства. Подходящие устройства защищают инсулин-продуцирующую ткань от большинства эффекторов клеточного и гуморального иммунитета, включая (но не ограничиваясь) лейкоциты, иммуноглобулин и комплемент. Таким образом, иммуноизоли рующее устройство обычно создает полупроницаемый барьер, такой как мембрана, имеющая поры такого размера, который достаточен для предотвращения диффузии через поры молекул размером более приблизительно 50-100 кДа. Этот барьер представляет из себя изолирующую камеру, в которой располагается инсулинпродуцирующая ткань и которая не имеет участков, в которых инсулин-продуцирующая ткань может физически контактировать с клетками или тканями, находящимися снаружи от барьера. Можно использовать любое обычное устройство, оболочку, капсулу или микрокапсулу, включая альгинатные микрокапсулы с одинарной или двойной оболочкой (например, такие, которые описаны в патенте США № 5227298, идеи которого включены в настоящий документ в качестве ссылки). Другие обычные микрокапсулы включают альгинатные полилизиновые микрокапсулы, микрокапсулы из химически поперечно-сшитого альгината и капсулы, изготовленные из других биосовместимых полимеров, сформованных в виде структурно обособленного иммуноизолирующего устройства любой нужной формы или размера (см., например, 1ашк е! а1. (1996), 61 Тгап8р1ап1а1юи 4, идеи которого включены в настоящий документ в качестве ссылки).

В других вариантах осуществления настоящего изобретения агент, повышающий толерантность, такой как костный мозг или полученные из него клетки, также имплантируется в организм реципиента-хозяина. Любая толерогенная ткань или тип клеток может использоваться в качестве агента, повышающего толерантность, включая клетки стромы поджелудочной железы, а также клетки костного мозга. Толерогенные клетки являются совместимыми по системе МНС с инсулин-продуцирующей тканью и предпочтительно, выделяются от донора, от которого отбирали инсулинпродуцирующую ткань или от сингенного с ним донора. Подходящие средства для получения костного мозга или его клеточных популяций хорошо известны (см, например. 81атр е! а1. (1984), 69 1. 1ттиио1. Ме111. 187-195, РоШек е! а1. (1995), в МеШобк ίη Се11 Тгаи8р1аи1а1юи, Κίοοτάί, еб., К. О. Ьаибек Со., риЬ., стр. 619-628). Предпочтительно, костный мозг следует обрабатывать с помощью системы Серга!е® 8С 81ет Се11 Соиеейтабои 8уЧет (Се11Рго, 1ис., Во!1е11, \¥А; см. Се11Рго 1пус51фаЮг Втосйиге, теу. 06.01.97) или эквивалентной ей системы, для того, чтобы получить костномозговую клеточную популяцию, обогащенную гемопоэтическими клетками СЭ34(+). Стандартная сортировка флюорисцентноактивированных клеток (РАС8) или иммунофлюоресцентное окрашивание обнаруживают, что эта популяция клеток СЭ34(+) практически не содержит клеток СЭ40(+), хотя может наблюдаться некоторое слабое окрашивание СЭ40(+). Поскольку популяция клеток

СЭ34(+) является динамической популяцией стволовых клеток, полагают, что присутствие малого количества клеток ί.Ό40(+) соответствует частоте, с которой стволовые клетки претерпевают дифференцировку по В-клеточной линии. На самом деле, предварительные исследования с использованием РАС8 установили, что только клетки СЭ40(+) (которые обычно представляют приблизительно не более 0,7% от общего количества) в популяции стволовых клеток ί.Ό34(+) также являются СЭ19(+). СО 19 в настоящее время являются самыми ранними известными маркерами В-клеточной линии. Соответственно, для того, чтобы гарантировать использование популяции истинных стволовых клеток в качестве агента, повышающего толерантность, клетки ί.Ό34(+) могут быть дополнительно очищены от клеток ί.Ό40(+) с помощью известных средств негативной селекции (например, селективного цитолиза, сортировки клеток, пэннинга и т.п.).

Примеры прерывателей связывания СБ40:СП154

Терапевтические соединения, пригодные для осуществления на практике настоящего изобретения, включают любое соединение, которое блокирует взаимодействие ί.Ό40 клеточной поверхности (например, на В-клетках) с экспрессируемым СО40Ь (СЭ154), например, на поверхности активированных Т-клеток. Соединения, прерывающие связывание ί.Ό40:ί.Ό154, такие как агенты, блокирующие СО 154, которые конкретно рассматриваются, включают поликлональные антитела и моноклональные антитела (МАЬ), а также производные антител, такие как химерические молекулы, гуманизированные молекулы, молекулы с редуцированными эффекторными функциями, биспецифичные молекулы и конъюгаты антител. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения антитело имеет антигенспецифичные характеристики связывания МАЬ 5с8, как описано в патенте США № 5474771, описание которого включено в настоящий документ в качестве ссылки. В наиболее предпочтительном в настоящее время варианте осуществления настоящего изобретения этим антителом является гуманизированное 5с8. Другие известные антитела против СО 154 включают антитела 1тхМ90, 1тхМ91 и 1тхМ92 (полученные от компании Iттυηеx), анти-СО40Ь МАЬ, которые можно приобрести в компании Апсе11 (клон 24-31, № в каталоге 353-020, Ваурой, ΜΝ) и анти-СП40Ь МАЬ, которые можно приобрести в компании Сеихуте (СатЬтгбде, МА, № в каталоге 80-3703-01). Имеются в продаже также анти-СО40Ь МАЬ от компании РЬатМгидеи (8ап Огедо, № в каталоге 33580Ό). Также были получены и охарактеризованы многие другие антиСО40Ь антитела (см., например, XVО 96/23071, Впйо1 Муегз 8цшЬЬ, описание которого включено в настоящий документ в качестве ссылки).

Настоящее изобретение включает также применение агентов, блокирующих СЭ154. других типов, таких как полные фрагменты РаЬ, соединения Р(аЬ)₂, участки ν_Η, участки Ρ_ν, одноцепочечные антитела (см., например, νθ 96/23071), полипептиды, слитые конструкции полипептидов, слитые конструкции СЭ40 (такие как СО401д, как описано у Но11еиЬаидЬ е! а1., 1. 1ттипо1. Ме111. 188:1-7, 1995, включенном в настоящий документ в качестве ссылки), а также малые молекулы, такие как малые полупептидные соединения или непептидные соединения, которые способны блокировать или прерывать связывание СЭ40:СЭ154. Процедуры проектирования, скрининга и оптимизации малых молекул представлены в патентной заявке РСТ/ϋδ 96/10664, зарегистрированной 21 июня 1996 г., описание которой включено в настоящий документ в качестве ссылки.

Можно получать также различные формы антител с помощью стандартных методик рекомбинантной ДНК (\νίη^Γ апб МгЫеги, №Ш.1ге 349:293-99, 1991). Например, могут быть созданы химерные антитела, в которых антигенсвязывающий домен из антитела животного присоединен к константному домену человека (антитело, полученное первоначально от млекопитающего, не являющегося человеком, в котором применялась методика рекомбинантной ДНК для замены всех или части шарнирного и константного участков тяжелой цепи и/или константного участка легкой цепи на соответствующие участки легкой или тяжелой цепи человеческого иммуноглобулина) (см., например, СаЬШу е! а1., патент США № 4 816 567; Могпзоп е! а1., Ргос. Асаб. 8сг. 81:6851-55, 1984). Химерные антитела снижают иммуногенные ответы, которые вызываются антителами животных, когда последние применяются для лечения или профилактики человека.

Помимо этого, могут быть синтезированы рекомбинантные гуманизированные антитела. Гуманизированные антитела представляют из себя антитела, первоначально полученные от млекопитающего, не являющегося человеком, в которых применялась методика рекомбинантной ДНК для замены некоторых или всех аминокислот, которые не требуются для связывания антигена, на аминокислоты из соответствующих участков легкой или тяжелой цепи иммуноглобулина человека. Другими словами, они являются химерами, включающими, главным образом, последовательности человеческого иммуноглобулина, в которые вставлены участки, ответственные за специфичное связывание с антигеном (см., например, РСТ патентную заявку νθ 94/04679). Животных иммунизируют нужным антигеном, выделяют соответствующие антитела и часть последовательностей вариабельного участка, ответственную за специфичное связывание с антигеном, удаляют. Затем клонируют полученные от животного антиген15 связывающие участки в подходящую позицию генов антител человека, из которых были изъяты антиген-связывающие участки. Гуманизированные антитела минимизируют применение гетерологичных (межвидовых) последовательностей в антителах, предназначенных для лечения человека, и с меньшей вероятностью вызывают нежелательные иммунные ответы. Сходным образом можно получать приматизированные антитела.

Другой вариант осуществления настоящего изобретения включает применение человеческих антител, которые могут быть получены от животных, не являющихся человеком, таких как трансгенные животные, несущие один или более трансгенов иммуноглобулинов человека. Таких животных можно использовать как источник спленоцитов для получения гибридов, как описано в патенте США № 5569825.

В практическом осуществлении настоящего изобретения можно использовать также фрагменты антител и унивалентные антитела. Унивалентные антитела включают димер тяжелой и легкой цепей, связанный с участком Ре (или стволом) второй тяжелой цепи. Участок РаЬ относится к тем частям цепей, которые приблизительно эквивалентны или аналогичны последовательностям, которые включают участки Υ -ветвей тяжелой цепи, и легкой цепи целиком, и которые, как было показано, вместе (в агрегатах) демонстрируют активность антител. Белок РаЬ включает агрегаты одной тяжелой и одной легкой цепи (широко известные как РаЬ'), а также тетрамеры, которые соответствуют сегментам антитела Υ, состоящим из двух ветвей, (широко известные как Р(аЬ)₂), каждые из которых ковалентно или нековалентно агрегированы, так, что эти агрегаты способны селективно реагировать с определенным антигеном или семейством антигенов.

Помимо этого, можно использовать обычные методики рекомбинантной ДНК для изменения аффинного связывания рекомбинантных антител с их антигенами, путем изменения аминокислотных остатков поблизости от антигенсвязывающих участков. Антиген-связывающая аффинность гуманизированного антитела может быть повышена путем мутагенеза на основе молекулярного моделирования (Ос.|ссп е! а1., Ргос. Ыаб. Асаб. 8с1. 86:10029-33, 1989; РСТ патентная заявка ХУО 94/04679). Может быть желательным повысить или понизить аффинность антител к СБ40Б. в зависимости от типа ткани, на которую они нацелены или от конкретной применяемой схемы лечения. Это можно осуществить путем применения методики дисплея фагов (см., например. \Уш1ег е! а1., Апп. Рсу. 1ттипо1. 12:433-455; и 8сЫег е! а1., 1. Мо1. Βΐο1. 255:28-43, 1996, включенную в настоящий документ в качестве ссылки). Например, может быть выгодным в полупрофилактических целях лечить пациента с помощью постоянных уровней антител с пониженной аффинностью к

СО40Ь. Подобно этому, антитела с повышенной аффинностью к СО40Ь могут иметь преимущества при кратковременном лечении.

Пути введения

Прерыватели связывания С040:С0154, включая агенты, блокирующие СО 154, которые используются в настоящем изобретении, можно вводить, любым приемлемым с медицинской точки зрения путем. В зависимости от конкретных обстоятельств может быть желательным местное или системное введение. Предпочтительно, этот агент вводят парентеральным путем, таким как внутривенная, внутриартериальная, подкожная, внутримышечная, интраорбитальная, интравентрикулярная, интраперитонеальная, подкапсульная, интракраниальная, интраспинальная или интраназальная инъекция, инфузия или ингаляция. Этот агент также можно вводить путем имплантации инфузионного насоса помпы или биосовместимого или биоразрушаемого имплантата с замедленным высвобождением активного агента, в организм реципиента-хозяина, или до или после имплантации донорской ткани. Альтернативно, определенные соединения настоящего изобретения или содержащие их композиции могут подходить для перорального или энтерального введения. Некоторые другие соединения настоящего изобретения могут подходить для местного введения.

В других вариантах осуществления настоящего изобретения прерыватель связывания СО40:СО154 вводят реципиенту не напрямую, а в виде вектора или другого экспрессируемого генетического материала, кодирующего прерыватель. Генетический материал интернализуется и экспрессируется в клетках или ткани реципиента, вырабатывая, таким образом, прерыватель ίη кйи. Например, подходящая конструкция нуклеиновой кислоты должна включать последовательность, кодирующую одну или более цепей иммуноглобулина (1д) МАЬ 5с8, как описано в патенте США № 5474771. Другие подходящие конструкции должны включать последовательности, кодирующие химерные или гуманизированные версии цепей МАЬ 5с8 1д или их антиген-связывающие фрагменты. Другие подходящие конструкции должны включать последовательности, кодирующие часть или все другие специфичные в отношении СО154 МАЬ. Такая конструкция доставляется системно или местно, например, в участок поблизости от места имплантации инсулин-экспрессирующей ткани.

Альтернативно, вектор или другой генетический материал, кодирующий прерыватель, интернализуется в подходящую популяцию изолированных клеток для получения клетокхозяев, продуцирующих прерыватель. Эти клетки-хозяева затем имплантируются или переливаются реципиенту, или местно, или системно, для обеспечения выработки прерывателя связывания ί'Ό40:ί.Ό154 ίη зйи. Подходящие клеткихозяева включают культивируемые клетки, такие как иммортализованные клетки, а также клетки, полученные у реципиента (например, клетки периферической крови или лимфатических узлов, такие как естественные киллеры (ЕК)).

Обычно соединения настоящего изобретения вводятся реципиенту-хозяину. Однако эти соединения могут также вводиться донору или в донорскую ткань. Например, соединение настоящего изобретения можно включать в жидкость для перфузии или консервации, в которой хранится или транспортируется донорская ткань до ее интеграции в организм реципиентахозяина.

Композиция

Обычно соединение (соединения), применяющиеся в практическом осуществлении настоящего изобретения, суспендируют, растворяют или диспергируют в фармацевтически приемлемом носителе или наполнителе. Получающаяся терапевтическая композиция не оказывает неблагоприятного воздействия на гомеостаз реципиента, в частности, на электролитный баланс. Так, пример носителя включает нормальный физиологический раствор (0,15М №1С1. рН от 7,0 до 7,4). Другие приемлемые носители хорошо известны специалистам и описаны, например, в Кетшдоп'з Рйаттасеибса1 8е1епсез, Оеппато, еб. Маск РиЬйзЫпд Со., 1990. Приемлемые носители могут включать биосовместимые, инертные или биопоглощаемые соли, буферные агенты, олиго- или полисахариды, полимеры, агенты, улучшающие вязкость, консерванты и т. п.

Любой прерыватель связывания СЭ40:СО154, такой как агент, блокирующий СО154, который используется в практическом осуществлении настоящего изобретения, помещают в композицию таким образом, чтобы обеспечивалась доставка фармацевтически эффективного или терапевтически эффективного количества или дозы, что представляет из себя количество, достаточное для оказания выраженного предпочтительно благоприятного в медицинском отношении воздействия на реципиента. Благоприятные в медицинском отношении эффекты должны включать предотвращение, задержку или ослабление ухудшения или выраженное улучшение состояния здоровья реципиента. В качестве примера, почечную функцию и здоровье аллотрансплантата или ксенотрансплантата почки можно контролировать с помощью обычного определения концентраций азота мочевины или креатинина крови, или объема и содержания растворенных веществ в моче, или скорости клиренса определенных растворенных веществ из крови в мочу. Подобно этому, сахарорегулирующую функцию и здоровье инсулинпродуцирующего аллотрансплантата или ксе нотрансплантата можно контролировать с помощью обычного определения концентраций глюкозы в моче или крови, метаболитов глюкозы или инсулина, или с помощью измерения инсулинового ответа на нагрузку глюкозой, например, с помощью обычного теста на толерантность к глюкозе. Таким образом, эффективным количеством терапевтического соединения настоящего изобретения, такого как агент, блокирующий СО 154, является такое количество, которое заметно снижает зависимость реципиента от инсулиновой заместительной терапии. Оптимальным эффективным количеством является такое количество, которое практически освобождает реципиента от зависимости от экзогенного инсулина. Более конкретно, эффективным количеством является такое количество, которое индуцирует частичное или практически полное приживление (восприятие организмом и функционирование) донорской инсулинпродуцирующей ткани.

Дозировки и частота введения

Количество и частота дозирования любого конкретного соединения, предназначенного для применения в практике настоящего изобретения, находится в компетенции специалистов в области трансплантологии, таких как хирургитрансплантологи. Среднюю дозировку и схему введения устанавливают в ходе доклинических и клинических испытаний, которые включают в себя обширные, но рутинные исследования, направленные на определение эффективных, например, оптимальных параметров введения для конкретного соединения. Даже после получения таких рекомендаций практикующий врач сможет варьировать дозировками для различных пациентов, основываясь на различных соображениях, таких как возраст пациента, состояние его здоровья, вес, пол и одновременное лечение другими лекарственными средствами. Определение эффективной дозы и схемы введения для каждого прерывателя связывания СО40:СО154, который применяется для подавления отторжения трансплантата, является обычным вопросом для специалиста в области фармацевтики и медицины. Дозировки и продолжительность курса лечения должны быть достаточными для получения клинически благоприятного изменения одного или более показателей состояния здоровья реципиента. Примеры продолжительности курса лечения и схем дозирования представлены далее в результатах предварительных исследований, включенных в настоящий документ. Практически, настоящее изобретение включает введение прерывателя связывания СО40:СО154 (примером могут служить гуманизированные антитела МАЬ 5с8, Йи5с8) по схеме, обеспечивающей восприятие трансплантата, после чего, если это покажется необходимым, по схеме, обеспечивающей поддержание жизнеспособности трансплантата.

Для иллюстрации соображений по поводу дозирования анти-СЭ40 соединения далее приводятся примеры стратегии введения для антиСЭ40 МЛЬ. Дозировки можно затем легко рассчитать для других типов анти-СЭ40 соединений. В общем, предполагаются однократные дозы величиной приблизительно от 0,05 до 50 мг/кг веса тела пациента, наиболее часто в пределах 1-20 мг/кг. Для лечения острого состояния, такого как перед трансплантацией или во время трансплантации или в ответ на любое свидетельство начала отторжения трансплантата, эффективная доза антител находится в пределах приблизительно от 1 до 20 мг/кг веса тела, назначаемая ежедневно в течение периода времени приблизительно от 1 до 5 дней предпочтительно болюсным внутривенным введением. Те же дозировки и схему лечения можно использовать во время загрузочной фазы при схеме загрузки-поддержания; причем во время фазы поддержания осуществляют внутривенное или внутримышечное введение антител в количестве приблизительно от 0,1 до 20 мг/кг веса тела в течение периода лечения с интервалами от недели до 3 месяцев. Постоянное лечение также может осуществляться по схеме поддержания, при которой антитела вводятся внутривенным или внутримышечным путем в количестве приблизительно от 0,1 до 20 мг/кг веса тела с интервалами между введением доз в пределах приблизительно от 1 недели до 3 месяцев. Помимо этого, постоянное лечение можно усиливать прерывистой схемой болюсного внутривенного введения, при котором антитела вводятся в количестве приблизительно от 1,0 до 100 мг/кг веса тела с интервалами между последовательными видами лечения от 1 до 6 месяцев. Для всех видов лечения, кроме прерывистой болюсной схемы, введение может быть также пероральным, пульмонарным, назальным или подкожным.

Если это желательно, эффективность антител можно повысить путем введения, серийно или в сочетании, обычных терапевтических агентов или лекарственных средств против отторжения, таких как, например, кортикостероиды или иммунодепрессанты. Альтернативно, антитела можно конъюгировать с обычно применяющимся для этой цели агентом. Это позволяет вводить обычный агент в меньшем количестве по сравнению с обычной дозировкой, например, приблизительно менее 50% от стандартной дозы, если агент вводится в качестве монотерапии. Соответственно, можно избежать многих побочных эффектов, связанных с эти агентом.

Комбинированные лекарственные средства по настоящему изобретению для лечения отторжения трансплантата включают применение анти-СЭ40 антител вместе с агентами, направленными на В-клетки, такими как анти-СЭ19, анти-СЭ28 или анти-СЭ20 антитело (неконъюгированное или радиоактивно помеченное), антагонисты 1Ь-14, ЫР394 (блокатор рецепторов Ьа1о11а РйагшасеиБсак), ΙΚ-1116 (малая молекула Такеба) и анти-1д идиотипические моноклональные антитела. Альтернативно, эти комбинации могут включать агенты, нацеленные на Т-клетки и В-клетки, такие как СТЬА41д, антагонисты 1Ь-2, антагонисты 1Ь-4, антагонисты 1Ь6, антагонисты рецепторов, анти-СЭЗО/СЭЗб моноклональные антитела, ΤΝΡ, антагонисты ЬЕА1/1САМ, антагонисты УЪА4/УСАМ, бреквинар и конъюгаты 1Ь-2 и токсина (например, ЭЛВ). преднизон, анти-СЭ3 МаЬ (ОКТ3), микофенолята мофетил (ММЕ), циклофосфамид и другие иммунодепрессанты, такие как блокаторы кальциневринового сигнала, включая, но не ограничиваясь, такролимус (ЕК506). Комбинации могут также включать агенты, нацеленные на Т-клетки, такие как антагонисты СЭ4, антагонисты СЭ2 и 1Ь-12.

Для поддержания интеграции трансплантата или в период после подавления острой фазы отторжения трансплантата, вводят поддерживающую дозу анти-СЭ40 антител, отдельно или в комбинации с обычным агентом против отторжения, если необходимо. Следовательно, дозировку или частоту введения или и то, и другое можно сократить. Если признаков отторжения трансплантата не наблюдается, лечение можно прекратить при условии тщательного наблюдения за признаками отторжения трансплантата. В других случаях, по решению практикующего врача, можно осуществлять лечение время от времени, например, с интервалами в четыре недели или более. Реципиентам, однако, может потребоваться прерывистое лечение на долгосрочной основе в случае любого возобновления симптомов болезни.

Доклинические модельные системы для оценки схем лечения прерывателем связывания СБ40:СП154

Предпочтительно примерами модельных систем для тестирования эффективности соединения, прерывающего связывание ί.Ό40:ί.Ό154 (например, анти-СП40Ь соединения или агента, блокирующего СЭ154, такого как МАЬ, обладающего специфичностью МаЬ 5с8), являются модели островковых аллотрансплантатов на приматах (гамадрилах и/или макаках-резус), описанные ранее в родственной заявке и.8.Ргоу18Юиа1 8.Ν. 60/050267 (06/20/97), идеи которой включены в настоящий документ в качестве ссылки. Было установлено, что такие модели на приматах являются оптимальным тестом иммунного воздействия: они исключительно чувствительны даже к малейшим изменениям функции аллотрансплантата или к побочным эффектам в отношении заживления ран и функции иммунной системы у реципиента. Помимо этого, эти модели обладают очевидным биологическим сходством с трансплантацией почки у человека. Конкретно, гены, которые кодируют белки МНС, хорошо консервируются между человеком и приматами, которые используются в качестве основы для моделей, и отторжение васкуляризованных органов у приматов точно имитирует картину, которую наблюдают в клинических условиях.

Модель ТОК на гамадрилах при диабете, вызванной удалением поджелудочной железы Идентификация пар донор-реципиент. Мононуклеарные клетки периферической крови (МКПК) от 10 потенциальных реципиентов (гамадрилы, Рарю йашабтуаз, самцы и самки, возраст 1-2 года, вес около 4,0 кг) из питомника Маппйеппег (Ношез!еаб, РЬ) использовали в качестве респондеров против МКПК от 11 самцов-доноров (возраст более 2 лет, приобретены у компании 8ои1йетез1 Роиибабои в Техасе) в одним способом смешанной культуре лейкоцитов (СКЛ). СКЛ гамадрилов была изготовлена с помощью стандартной методики для СКЛ человека. С учетом низкой фоновой и высокой специфичной реактивности, применение среды, содержащей сыворотку крови человека, дало превосходные результаты по сравнению со средой, содержащей сыворотку крови гамадрила или плода коровы. Доноры имели размеры, достаточные для получения островков и костного мозга от 1 донора, чтобы их хватило для трансплантации 2 реципиентам. В противоположность умеренным ответам СКЛ, которые наблюдались при использовании МКПК от животных в Маиийе1шег в качестве СКЛреспондеров и стимуляторов, реактивность СКЛ между этими животными была отличной, с индексами стимуляции (И.С.) при действии стимуляторов для всех потенциальных реципиентов >10,0 (доноры, фоны <200-300 импульсов в минуту). Была предпринята попытка выбрать двух реципиентов со сходной СКЛ-реактивностью в отношении определенного донора, и были выбраны пары донор-реципиент с различающимися степенями аллореактивности. И.С. для СКЛ >10 считался очень реактивным и был выбран в качестве показателя минимальной приемлемой несовместимости; в качестве сравнения, когда животные из Мапийетет использовались в качестве доноров и реципиентов, И.С. для СКЛ был обычно меньше 5.

Получение и введение островков и костного мозга. Островки выделяли из поджелудочной железы за один день до ТОК (т.е. на 1 день исследования) с помощью минимальной модификации автоматизированного метода для выделения островков человека (К1сотб1 е! а1., И|аЬе1е5 37, 413-420, 1988; 8е1уадд1 е! а1., Ттаизр1аи1. Ргос. 29: 1967-1968, 1997) с использованием либеразы ЫЬетазе® (раствор коллагеназы 0,47 мг/мл, полученной от компании ВоейпидетМаппйепп. 1иб1апаро115, ΙΝ). Время холодной ишемии для поджелудочных желез в среднем составляло 0,5±0,1 ч. Островки обогащали в трехслойном прерывистом градиенте ЕитойсоП (1,108, 1,096, 1,037), в котором ферментативно переваренная панкреатическая ткань помещалась на дне, в слое 1,108. Для центрифугирования градиентов использовали клеточный сепаратор (СОВЕ 299 1, СОВЕ, Ьакеуооб, СО) (ВоЬейзои, Сйабукк, Сои1тас1от, 1ашез, Ьоибои. Ас!а О1аЬе1о1од1са 30:93-98, 1993). Количество, объем и чистоту полученных островков определяли следующим образом: конечный островковый препарат суспендировали в 250 мл раствора КРМ1 1640, три образца по 100 мкл окрашивали дитизоном (Ьай! е! а1., Ттаизр1аи!а!юи 45: 827830, 1988) и подсчитывали для оценки общего выхода островков, а данные математически преобразовывали для определения общего количества островков со средним диаметром 150 пм (островковый эквивалент, ОЭ) (В1сотб1 е! а1., Ас!а Б1аЬе1о1. Ьа!. 27:185-195, 1990).

Для исследований по повышению толерантности, от донора поджелудочной железы брали тело позвонка для получения клеток костного мозга донора (ККМД), обычно, с помощью стандартных модификаций методов для обработки тел позвонков человека. Для реципиентов костного мозга донора производили инфузии на 5 и 11 день после ТОК. В целом реципиент получал дозу 10⁹ нуклеаров на кг веса тела.

Обездвиживание животных. Для химического обездвиживания инъецировали в ягодичную мышцу кетамина гидрохлорид (10 мг/кг веса тела). Пролонгирование седации достигалось внутримышечным введением кетамина НС1 в дозе 5 мг/кг. Дополнительно кетамин вводили, если животное реагировало на стимулирования уколом в большой палец стопы. Поскольку предыдущие исследования показали, что кетамин сокращает продолжительность первой фазы инсулинового ответа (ПФИО) на глюкозу, дозу кетамина поддерживали на самом низком возможном уровне во всех метаболических тестах (Ьейшапи е! а1., 1. Меб. Рт1ша!о1. 26:312-321, 1997). Общая доза кетамина для поддержания удовлетворительной седации в течение 30минутного периода времени составляла 35±2 мг/кг. Животных при седации кетамином обездвиживали и физически. Участки оперативного доступа и пункции сосудов обрабатывали попеременно бетадином и спиртом. В вены помещали постоянные катетеры и тщательно их закрепляли.

Удаление поджелудочной железы и ТОК. В день ТОК (день исследования 0) препарат островков центрифугировали и осадок ресуспендировали в обогащенной СМКБ 1066, после чего культивировали в течение ночи при 22°С. Перед трансплантацией препарат центрифугировали и осадок ресуспендировали в 20 мл раствора КРМ1 1640, содержавшем 2,5% донорской сыворотки крови и 200 МЕ гепарина. Количество ОЭ определяли непосредственно перед трансплантацией. Полное удаление поджелу дочной железы выполняли в соответствии с принятой хирургической техникой. По окончании полного удаления поджелудочной железы в одну из мезентериальных венозных ветвей портальной вены помещали сосудистый катетер 20С и осуществляли ТОК посредством гравитационной инфузии островкового препарата в течение 10-минутного периода времени.

Иммуносупрессия и послеоперационное лечение. В качестве иммунодепрессанта выбрали РК506 (такролимус), поскольку это лекарственное средство в настоящее время применяется при ТОК у человека. Введение РК506 начинали за 5 дней до ТОК. Реципиентам-гамадрилам вводили дозу 0,1 мг/кг веса тела в день, внутримышечно. Уровни лекарственного средства определяли ежедневно и дозу подбирали таким образом, чтобы поддерживающие уровни составляли приблизительно 15 нг/мл. Гуманизированные анти-СИ 154 (полученные из МаЬ 5с8, Ьебеттап е1 а1., 1. Ехр. Меб. 175:1091-1101, 1992) вводили внутривенно в дни исследования -1, 3 и 10 в дозе от 10 до 20 мг/кг и сывороточные уровни 5с8 и анти-5с8 определяли посредством иммуноферментного твердофазного анализа.

На первый день после операции (день исследования 1 или ДПО 1) гамадрилы получали жидкости внутривенно. Затем животных начинали кормить, и их диета содержала 60 г углеводов в день в 45 г бисквитов для обезьян (с добавлением виоказы) и 15 г фруктов. С учетом опыта с первыми двумя животными, которых лечили анти-СИ154, всех других гамадрилов лечили малыми подкожными дозами инсулина (приблизительно 0,5 ЕД/кг веса тела в день) в течение периода времени 14-20 дней после трансплантации островков, с целью предотвращения истощения островков, что оптимизирует условия, необходимые для успешного приживления.

Мониторинг. Определяли глюкозу крови натощак и после приема пищи (ГН и ГППП, соответственно) с помощью отбора крови из пятки и исследования ее на глюкометре О1исоте1ег Е111е и, по меньшей мере, один раз в неделю брали образец крови для получения плазмы для тестирования уровней ГН с помощью анализатора глюкозы Весктап. Обычно получали также образец крови для подтверждения необычно высоких показателей. Образцы крови брали у всех животных в исследовании анти-СИ 154 перед получением ими каждой дозы МаЬ (перед днем -1 и непосредственно перед введением антител на день 3 и 10) и далее еженедельно. Спустя приблизительно 3 месяца после трансплантации, анализы брали реже, раз в две недели. Образцы крови использовали для фенотипирования периферической крови с целью оценки подгрупп лейкоцитов и определения общего количества форменных элементов и биохимических показателей, уровней 5с8 и анти-5с8, инсулина и С-пептида, а также химеризма. Кровь брали периодически для повторного тестирования реактивности СКЛ на антигены донора и антигены 3 партии.

Анализы. Инсулин плазмы был подвергнут анализу способом двойного антитела (Ьшсо Ке5еагс11. 1пс., 81. Сйабек, МО). Низший предел определения составлял 20 пмоль/л, а средний коэффициент вариации по время анализа составлял 6%. С-пептид анализировали в плазме крови, при низшем пределе определения 6% и коэффициенте вариации во время анализа 6%. Глюкозу плазмы определяли с помощью анализатора глюкозы (Весктап 1п81гитеп18, Ра1о А11о, СА). Общие уровни глюкозы в кровеносных капиллярах определяли с помощью глюкометра Е1йе (Вауег, Е1кйагб, ΙΝ). Надежность анализа на инсулин для гамадрилов была продемонстрирована параллелизмом концентраций инсулина в разведениях сыворотки крови со стандартной инсулиновой кривой. Глюкагон определяли с помощью двойного анализа с антителами (ИРС, Ьок Апде1е§, СА). Эти коммерческие наборы ранее были выверены путем серийных разведений (Оообпет е1 а1., И1аЬе1е§ 38:925-931, 1989).

Внутривенный тест на толерантность к глюкозе (ВВТТГ). Ранее было показано, что тесты на функцию островковых клеток ш у|уо точно отражают изменения массы р-клеток (МсСи11осй е1 а1., И1аЬе1е§ 40: 673-679, 1991). Внутривенные тесты на толерантность к глюкозе выполняли после 16-18-часового ночного воздержания от пищи, как ранее было описано (Ьейтаип е1 а1., 1. Меб. Рпта1о1. 26:312-321, 1997). Вкратце, образцы крови брали на -10, -5 и 0 мин. Затем в подкожную вену инъецировали 0,5 г глюкозы на кг веса тела в виде 50% раствора глюкозы, в течение 20 с. Образцы объемом 1,5 мл отбирали из контралатеральной бедренной артерии на 1, 3, 5, 7, 10, 15, 20, 25, 30 мин после инъекции. Таким образом, в течение периода времени 40 мин отбирали 12 образцов крови. Образцы помещали в стеклянные пробирки, содержавшие 0,05 мл 15% жидкой ЭДТА и 0,2 мл трасилола (500 К.ЕД. апротинина/мл крови), помещали пробирки на лед и центрифугировали в течение 10 мин. Плазму затем замораживали при -80°С и позднее анализировали на содержание глюкозы, иммунореактивный инсулин и глюкагон.

Статистический анализ и расчеты. Результаты представлены в виде средних величин ± СО среднего. Константу исчезновения глюкозы (Кг) рассчитывали по результатам ВВТТГ как наклон падения 1од_е (1п) глюкозы плазмы между 10 и 30 мин после инъекции глюкозы, умноженного на 100. Острый инсулиновый ответ на глюкозу (ОИОГ) рассчитывали как прирост площади под инсулиновой кривой (ППК) между 1-10 мин после в/в инъекции глюкозы. Ответы прироста (ППКглюкозы, ППКинсулина) рассчи25 тывали по правилу трапеции с вычитанием исходных величин от 1 до 30 мин. Данные анализировали с помощью компьютерной программы \νίηάο\ν5 δίαίΜΚδ (версия 5,0, 1997, δΙαΙκοΓί. 1пс., Ти18а, ОК, ИЗА).

Результаты

Терапия с помощью блокады СР154 пролонгирует выживание и функцию островковых аллотрансплантатов. Все гамадрилы имели нормальный уровень глюкозы в крови немедленно после трансплантации. Как показано ниже в табл. 1, ТОК аллогенных островков в отсутствии иммуносупрессивной или блокирующей СО154 терапии, приводила к отторжению на 8 день. Стандартная иммуносупрессия с помощью РК506 (отдельно или в комбинации с цельным костным мозгом или со стволовыми клетками костного мозга) не могла улучшить выживание островков, и у животных происходило отторжение на 10, 8 и 10 день соответственно. С этими результатами разительно контрастировало то, что лечение 4 из 5 гамадрилов с помощью антиСО 154 (5с8) Май приводило к пролонгированию выживания островковых аллотрансплантатов, значительно превосходившему их выживание у контрольных животных, которых лечили с помощью РК506. Результаты этого исследования также представлены далее в виде линейного графика на фиг. 1, которая изображает график зависимости глюкозы крови натощак (ГН) от ДПО. Представленные результаты впервые демонстрируют, что терапия с помощью блокады СО154 пролонгирует выживание островковых аллотрансплантатов у приматов, не являющихся человеком, на которых моделировался диабет, индуцированный удалением поджелудочной железы. Важно, что эти результаты также демонстрируют способность терапии с помощью анти-СО 154 реверсировать острое отторжение.

Терапию с помощью блокады СО154 можно применять в комбинации с клетками костного мозга. Три гамадрила получали отсроченные инфузии цельного костного мозга (п=2) или стволовых клеток костного мозга (отобранных на колонке Серга1е®, Се11Рго, Во1йе11, νΑ) (п=1) на ДПО 5 и 11. Эти гамадрилы получали индукционную терапию 5с8 (20 мг/кг, дни -1, 3 и 10), а затем их переводили на ежемесячную поддерживающую терапию, начиная с ДПО 28. Одно животное показало отличные результаты, не имея признаков отторжения до ДПО 241. У второго животного отторжение началось на ДПО 112, его лечили по поводу отторжения и поддерживали вплоть до ДПО 162. Третье животное лечили по поводу отторжения на 70 день и поддерживали вплоть до ДПО 124.

Влияние терапии с помощью блокады

СР154 на функцию трансплантата, включая контроль метаболизма глюкозы. Повторные

ВВТТГ у контрольных животных показали отличную воспроизводимость первой фазы секреции инсулина (ПФСИ). В частности, один тест на толерантность к глюкозе (ВВТТГ) и иммуногистохимическое исследование, выполненное у животного после эвтаназии на 79 день, обнаружили функционирующую трансплантированную ткань в печени, без остаточной выработки инсулина в участках вне печени. У других животных в этом исследовании были обнаружены функционирующие островковые аллотрансплантаты, при выживании трансплантатов в течение периода времени от >125 и >220 дней. Повторные ВВТТГ через 4-16 недель после удаления поджелудочной железы и трансплантации островков показали почти идентичные величины Кг у всех животных, вплоть до 8 недель после операции. Величины Кг затем действительно понизились у гамадрилов, которых лечили с помощью йи5с8 во время отторжения. Стабильные величины наблюдались у гамадрилов, которых лечили поддерживающими дозами йи5с8. Масса островков, как было установлено с помощью ПФСИ, сокращалась с течением времени с каждым эпизодом отторжения. Напротив, ПФСИ (наблюдение 16 недель) после трансплантации островков у животных, получавших терапию с помощью йи5с8, хорошо сохранялась. Изучались также двое контрольных животных. В некоторых ВВТТГ технические проблемы потребовали введения большего количества кетамина по сравнению с предыдущим исследованием, что привело к снижению величины Кг и ПФСИ. Однако при последующем наблюдении со стандартной дозой кетамина, эти показатели вернулись к норме.

В ходе настоящих исследований было установлено, что отторжение трансплантата можно обнаружить до подъема ГН путем оценки 2часовой ГППП. Исторически, отторжение островкового трансплантата как два последовательных результата ГН, превышающих 250 мг/дл. Однако в настоящее время установлено, что два последовательных результата 2-часовой ГППП, превышающих 150 мг/дл, обеспечивают чувствительный показатель ранних стадий отторжения трансплантата. Использование терапии против отторжения, как с помощью блокатора СО 154, так и с помощью обычного агента против отторжения, таким образом, может применяться достаточно рано в процессе отторжения, так, чтобы успеть спасти метаболически жизнеспособную ткань трансплантата. Для спасения отторгающихся трансплантатов с помощью йи5с8 повторяли ту же схему дозирования, которую использовали для индуцирования приема трансплантата организмом.

Выводы, сделанные из исследований на гамадрилах. Описанные выше исследования показывают, что йи5с8 ускоряет приживление островкового трансплантата, обеспечивает долгосрочное выживание аллогенных островков и не оказывает неблагоприятного воздействия как на секрецию инсулина, так и на чувствительность к инсулину в целом. Помимо этого, эти исследования впервые установили, что приживление может поддерживаться и что реверсирование эпизодов отторжения островков у больших животных возможно с помощью терапии блокадой ΟΌ154. Таким образом, описанные в настоящем документе способы лечения могут привести к сохранению секреции инсулина и общей чувствительности к инсулину у больших животных на уровне до проведения ТОК.

Таблица 1

Пролонгирование выживания аллотрансплантата у приматов, не являющихся человеком, с помощью анти-СО 154

Группа	N	Вид	Длительность (в ДПО) независимости от инсулина
Контроль	1	гамадрил	8
ЕК506	3	гамадрил	8,10,10
анти-СО 154 индукция + анти-отторжение	5	гамадрил	а8, ь59, с229, ά264, е284
анти-СО 154 индукция + поддержание	2	гамадрил	1113, д238
анти-СО 154 индукция + поддержание	4	презус	‘16, >80, >94, >166

a) получал уменьшенную дозу 5с8

b) животное 34В; умерщвлено на ДПО 79 с частичной функцией, перенесло эпизод отторжения на

ДПО 58, который был успешно реверсирован

с) животное 12В; умерщвлено на ДПО 302 с частичной функцией, перенесло шесть успешно пролеченных эпизодов отторжения, начавшихся на ДПО 59 ф животное 29В; умерщвлено на ДПО 300, полное отторжение, перенесло один эпизод отторжения

е) животное 14В; умерщвлено на ДПО 301 с частичной функцией, перенесло четыре успешно пролеченных эпизода отторжения, начавшихся на ДПО 31

I) умерщвлено на ДПО 130, полное отторжение

д) умерщвлено на ДПО 253 с частичной функцией

II) обсуждается ниже

ί) погибло в инсулиннезависимом состоянии на ДПО 16 вследствие частичной кишечной непроходимости

Модель ТОК в связи с диабетом, индуцированным удалением поджелудочной железы, на макаках-резус

Если не указывается иное, все процедуры были такими же, как описано выше для исследований на гамадрилах.

Процедуры на животных. Макак-резус 8РЕ, возраст 2-7 лет, можно свободно приобрести у компании СОУАЫСЕ (Айсе, ТХ), или Маппйсппсг Еоипйайоп, 1пс. (Нотейеаф ЕЬ), или у подобных поставщиков. После поступления всех обезьян обследовали с целью определения общего состояния здоровья, физического состояния и психического статуса. Все хирургические процедуры выполнялись в асептических условиях. Животных лишали пищи в течение 12-18 ч и вводили в/м кетамин (10 мг/кг) и атропин (0,04 мг/кг) в качестве премидинации. После седации животных им быстро устанавливали эндотрахеальную трубку и в/в катетер. Эндотрахеальную трубку использовали для защиты дыхательных путей и обеспечения легкого доступа для неотложного введения лекарственных средств. Основной наркоз заключался в комбинации изофлюрана и кислорода. Через катетер на протяжении всей процедуры ТОК производилась инфузия физиологического раствора для инъекций со скоростью 10 мл/кг в час.

Производили срединный разрез для обеспечения доступа к органам брюшной полости. И донорам, и реципиентам производили тотальное удаление поджелудочной железы с сохранением двенадцатиперстной кишки. Островки выделяли из донорской поджелудочной железы обычными способами для последующей трансплантации обезьянам с удаленной поджелудочной железой и развившимся в связи с этим диабетом. После обескровливания донора под наркозом удаляли тела позвонков через брюшной разрез с помощью устройства 81пкет 8а\\\ Кости немедленно подвергали обработке для извлечения костного мозга. Некоторым реципиентам клетки костного мозга инфузировали через головную вену с помощью устройства для переливания крови у-типа, снабженного фильтром.

После удаления поджелудочной железы у животных-реципиентов катетеризировали венозную ветвь нижней или верхней брыжеечной вены и инфузировали островки посредством гравитационного дренажа в печень. После этого хирургические разрезы ушивали согласно стандартной хирургической технике. В конце процедуры животному давали только кислород и удаляли эндотрахеальную трубку после того, как животное выходило из наркоза в достаточной степени, чтобы контролировать дыхательные пути. После ТОК реципиентов помещали в клетки интенсивной терапии и наблюдали за ними до стабилизации состояния. После операции животным вводили антибиотики (Вау1тф (5 мг/кг в/м, каждые 24 ч в течение 5 дней). При необходимости в качестве анальгетика использовали бупоморфин (0,05 мг/кг в/м).

После операции обезьянам не давали пищи и перорально давали гаторад на ДПО 1. На ДПО 2 их начинали кормить дважды в день мягкой диетой, состоящей из бананов и умягченного (водой) высокобелкового сухого корма для обезьян, содержавшего виоказу (1 банан плюс 4 бисквита). На нормальную диету переходили на ДПО 3 (6-8 бисквитов плюс фрукты,с виоказой, дважды в день). Каждое животное кормили отдельно, чтобы избежать конкуренции за пищу. Вольных обезьян кормили с рук для улучшения их здоровья и питания. Животных в критическом состоянии следует лечить изолированно до тех пор, пока они не поправятся. Обезьяны, состояние которых признано терминальным или неизлечимым, умерщвлялись путем быстрого в/в введения хлорида калия через в/в катетер.

Мониторинг. Отбор образцов крови для мониторинга глюкозы и инсулина, иммунного мониторинга и т.п. не превышал 1% веса тела за один раз или 7% веса тела за один месяц. Уровни в крови глюкозы натощак (ГН) определяли с помощью укола пятки для получения маленькой капли крови, которую помещали на полоску глюкометра. В некоторых ситуациях, например, когда содержание глюкозы оказывалось высоким (>200 мг/дл), производили пункцию вены и получали образец плазмы для анализа на анализаторе глюкозы Весктап. Отбирали также образцы крови до и с интервалами после трансплантации для оценки антидонорской иммунореактивности реципиента. Внутривенный тест на толерантность к глюкозе (ВВТТГ) выполняли как описано выше, до трансплантации и с 4-6недельными интервалами после трансплантации.

Результаты

Терапия с помощью блокады СЛ154 пролонгирует выживание и функцию островковых аллотрансплантатов у макак-резус, страдающих диабетом, так же, как и у гамадрилов. Как показано выше в табл. 1, настоящее исследование показало, что монотерапия с помощью 1ш5с8 пролонгирует выживание островковых аллотрансплантатов у второго вида приматов, не являющихся человеком. В этом исследовании применялась схема, индуцирующая принятие трансплантата, которая заключалась в введении 1ш5с8 на день исследования -1, 0, 3 и 10. Также далее следовала ежемесячная схема принятияподдержания, с целью поддержания сывороточных уровней 1ш5с8. Результаты, представленные также на фиг. 2, поразительны: функционирующие островковые аллотрансплантаты сохранялись без признаков отторжения. Важность этого открытия подчеркивается сравнительными данными, представленными на фиг. 3, которые, помимо экспериментальных данных для макакрезус, показывают график ГН для человека (обозначено ЛАУРА), страдающего СД и в на стоящее время получающего интенсивную заместительную терапию инсулином. ЛАУРЕ был поставлен диагноз СД в возрасте четырнадцати месяцев, и на момент проведения настоящего исследования ей было шесть лет и она получала инъекции инсулина два-три раза в день, ежедневно.

Эквиваленты

Настоящее изобретение можно практически осуществлять в других специфических формах, без отступления от его идеи или главных характеристик. Представленные выше варианты осуществления, раскрытого в настоящем документе изобретения, таким образом, со всех точек зрения являются иллюстративными, а не ограничивающими. Объем настоящего изобретения, таким образом, указан в прилагаемой формуле изобретения, а не в представленном выше описании, и все изменения, которые подпадают под значение и рамки эквивалентности формулы изобретения, охватываются настоящим изобретением.

Claims (29)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Способ ингибирования отторжения трансплантата инсулин-продуцирующей ткани организмом реципиента-примата, включающий в себя этап введения эффективного количества прерывателя связывания СЛ40:СЛ154 реципиенту трансплантата, причем указанный прерыватель связывания СЛ40:СЛ154 представляет собой антитело, которое специфически связывается с СЛ154. с его антигенсвязывающим фрагментом или с его производной.
2. 2. Способ пролонгирования выживания трансплантированной инсулин-продуцирующей ткани в организме реципиента-примата, включающий в себя этап введения эффективного количества прерывателя связывания

   СЛ40:СЛ154 реципиенту трансплантата, причем указанный прерыватель связывания

   СЛ40:СЛ154 представляет собой антитело, которое специфически связывается с СЛ154, с его антигенсвязывающим фрагментом или с его производной.
3. 3. Способ реверсирования отторжения трансплантированной инсулин-продуцирующей ткани организмом реципиента-примата, включающий в себя этап введения эффективного количества прерывателя связывания

   СЛ40:СЛ154 реципиенту трансплантата, причем указанный прерыватель связывания

   СЛ40:СЛ154 представляет собой антитело, которое специфически связывается с СЛ154, с его антигенсвязывающим фрагментом или с его производной.
4. 4. Способ сохранения функции трансплантированной инсулин-продуцирующей ткани в организме реципиента-примата, включающий в себя этап введения эффективного количества прерывателя связывания СЛ40:СЛ154 реципи енту трансплантата, причем указанный прерыватель связывания СЭ40:СЭ154 представляет собой антитело, которое специфически связывается с СЭ154. с его антигенсвязывающим фрагментом или с его производной.
5. 5. Способ восстановления функции повре- жденной трансплантированной инсулинпродуцирующей ткани в организме реципиентапримата, включающий в себя этап введения эффективного количества прерывателя связывания ί.Ό40:ί.Ό154 реципиенту трансплантата, причем указанный прерыватель связывания

   ί.Ό40:ί.Ό154 представляет собой антитело, которое специфически связывается с СЭ154. с его антигенсвязывающим фрагментом или с его производной.
6. 6. Способ по любому из пп.1-5, отличающийся тем, что указанным антителом является моноклональное антитело.
7. 7. Способ по п.6, отличающийся тем, что моноклональное антитело имеет антигенспецифичные связывающие свойства антитела 5с8, продуцируемого штаммом АТСС № НВ 10916.
8. 8. Способ по пп. 1, 2, 3, 4 или 5, отличающийся тем, что инсулин-продуцирующей тканью является цельная ткань поджелудочной железы или изолированные панкреатические островки.
9. 9. Способ по пп. 1, 2, 3, 4 или 5, отличающийся тем, что инсулин-продуцирующей тканью является клеточная популяция, включающая в себя изолированные островковые βклетки взрослого организма, изолированные островковые β-клетки плода, культивируемые островковые β-клетки или иммортализованные островковые β-клетки.
10. 10. Способ по пп. 1, 2, 3, 4 или 5, отличающийся тем, что инсулин-продуцирующей тканью является клеточная популяция, включающая в себя клетки-хозяева, постоянно или после стимуляции экспрессирующие ген инсулина.
11. 11. Способ по пп.1, 2, 3, 4 или 5, отличающийся тем, что инсулин-продуцирующая ткань физически отделена от тканей реципиента с помощью иммуноизолирующего устройства.
12. 12. Способ по п. 11, отличающийся тем, что иммуноизолирующее устройство включает в себя полупроницаемый барьер, определяемый как изоляционная камера, в которой располагается инсулин-продуцирующая ткань.
13. 13. Способ по п. 12, отличающийся тем, что иммуноизолирующим устройством является капсула или микрокапсула.
14. 14. Способ по пп.1, 2, 3, 4 или 5, отличающийся тем, что инсулин-продуцирующая ткань является аллогенной по отношению к реципиенту трансплантата.
15. 15. Способ по пп.1, 2, 3, 4 или 5, отличающийся тем, что инсулин-продуцирующая ткань является ксеногенной по отношению к реципиенту трансплантата.
16. 16. Способ по пп.1, 2, 3, 4 или 5, отличающийся тем, что реципиентом трансплантата является человек.
17. 17. Способ по п.16, отличающийся тем, что реципиент трансплантата страдает нарушением метаболического контроля обмена глюкозы.
18. 18. Способ по п.17, отличающийся тем, что реципиент трансплантата страдает сахарным диабетом.
19. 19. Способ восстановления метаболического контроля обмена глюкозы у примата, нуждающегося в таком восстановлении, включающий в себя следующие этапы:

    a) имплантирование эффективного количества инсулин-продуцирующей ткани указанному примату и

    b) введение эффективного количества прерывателя связывания СЭ40:СЭ154 указанному примату, причем указанный прерыватель связывания ί.Ό40:ί.Ό154 представляет собой антитело, которое специфически связывается с СО 154, с его антигенсвязывающим фрагментом или с его производной.
20. 20. Способ по п.19, отличающийся тем, что антителом является моноклональное антитело, имеющее антиген-специфичные связывающие свойства антитела 5с8, продуцируемого штаммом АТСС № НВ 10916.
21. 21. Способ по п.20, отличающийся тем, что моноклональное антитело вводят до имплантирования ткани.
22. 22. Способ по п. 21, включающий в себя дополнительный этап повторного введения моноклонального антитела, по меньшей мере, дважды в течение двухнедельного периода времени после имплантирования ткани.
23. 23. Способ по п.22, включающий в себя еще один дополнительный этап повторного введения моноклонального антитела, по меньшей мере, через один месяц после имплантирования ткани.
24. 24. Способ по п.23, включающий в себя еще один дополнительный этап повторного введения моноклонального антитела на месячной основе, начиная, по меньшей мере, через два месяца после имплантирования ткани.
25. 25. Способ по п. 19, включающий в себя следующий дополнительный этап:

    c) имплантирование примату эффективного количества агента, повышающего толерантность.
26. 26. Способ по п.25, отличающийся тем, что агентом, повышающим толерантность, является ткань костного мозга, совместимая по системе МНС с инсулин-продуцирующей тканью.
27. 27. Способ по п.25, отличающийся тем, что агентом, повышающим толерантность, является ткань костного мозга, сингенная по отношению к инсулин-продуцирующей ткани.

    30. Способ по п.29, отличающийся тем, что гемопоэтическими клетками СБ34(+) являются клетки СБ40(-).
28. 28. Способ по п.26 или 27, отличающийся тем, что тканью костного мозга является цельный костный мозг.
29. 29. Способ по п.26 или 27, отличающийся тем, что тканью костного мозга является популяция гемопоэтических клеток СБ34(+).