PL191122B1

PL191122B1 - Zastosowania przerywacza wiązania CD40:CD154

Info

Publication number: PL191122B1
Application number: PL337810A
Authority: PL
Inventors: Norma S. Kenyon; Camillo Ricordi; David W. Thomas; Linda Burkly
Original assignee: Biogen Idec Inc; Univ Miami
Priority date: 1997-06-20
Filing date: 1998-06-19
Publication date: 2006-03-31
Also published as: PL337810A1

Abstract

1. Zastosowanie przerywacza wiązania CD40:CD154 do wytwarzania leku do hamowania odrzucania przeszczepu tkanki wytwarzającej insulinę przez biorcę przeszczepu będącego naczelnym, przy czym lek jest przeznaczony do podawania biorcy przeszczepu w ilości dostarczającej skuteczną ilość przerywacza wiązania CD40:CD154. 2. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że przerywacz wiązania CD40:CD154 jest: (a) czynnikiem blokującym CD154(CD40L); lub (b) przeciwciałem monoklonalnym; lub (c) przeciwciałem monoklonalnym o charakterystyce wiązania swoistego antygenu jak przeciwciało 5c8 wytwarzane przez ATCC HB 10916. 3. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że tkanką wytwarzającą insulinę jest: (a) tkanka całej trzustki; lub (b) izolowane wysepki trzustkowe; lub (c) populacja komórek obejmująca izolowane komórki β dorosłych wysepek; lub (d) populacja komórek obejmująca izolowane komórki β płodowych wysepek; lub (e) populacja komórek obejmująca hodowane komórki β wysepek; lub (f) populacja komórek obejmująca unieśmiertelnione komórki β wysepek; lub (g) populacja komórek obejmująca komórki gospodarza stabilnie wyrażające gen insuliny; lub (h) populacja komórek obejmująca komórki gospodarza indukowalnie wyrażająca gen insuliny.

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku są zastosowania przerywacza wiązania CD40:CD154. Zgłoszenie stanowi kontynuację w części uprzedniego zgłoszenia tymczasowego USA 60/050,276, zgłoszonego 20 czerwca 1997 i tymczasowego zgłoszenia USA 60/077,256, zgłoszonego 9 marca 1998. Ujawnienia wcześniej zgłoszonych zgłoszeń patentowych są niniejszym włączone przez odniesienie.

Rozwiązania według wynalazku w ogólności dotyczą zahamowania niepożądanej reakcji odpornościowej, w szczególności anty-adaptacyjnej reakcji odpornościowej za pośrednictwem limfocytów T. W szczególności rozwiązania według wynalazku dotyczą zapobiegania, leczenia, stłumienia i odwrócenia reakcji odpornoś ciowej odrzucenia przeszczepionej tkanki albo narzą du u biorcy.

Podstawa wynalazku

Przeszczepienie narządu pomiędzy różniącymi się genetycznie osobnikami niezmiennie prowadzi do immunologicznego odrzucenia narządu z powodu mechanizmów zależnych od limfocytów T, o ile proces odrzucania nie zostanie zakł ócony przez podanie leków hamują cych działanie limfocytów T. Kilka patentów USA ujawnia zastosowanie takich leków immunosupresyjnych w celu hamowania odrzucania przeszczepu, w tym patent USA nr 5,104,858; 5,008,246 i 5,068,323. Inne konwencjonalne środki opisano w Suthanthiran i in., (1994), 331 New. Engl. Med. J. 365-376. Klinicznie stosuje się inhibitory fosfatazy kalcyneuryny i glikokortykosteroidy i te obie grupy leków zapobiegają uwalnianiu za pośrednictwem limfocytów T aktywujących cytokin, w szczególności IL-2. Jednakże, terapia tym rodzajem środków jest nadal niedoskonała. Oba rodzaje leków działają nie wybiórczo na wszystkie limfocyty T przez zaburzanie sygnalizacji przez receptor dla antygenu limfocytu T (TCR, ang. T celi antigen receptor), który jest jedynym pośrednikiem swoistości antygenowej limfocytu T. Oprócz tego, działanie tych leków nie jest trwałe, tak że przerwanie leczenia powoduje zwykle odrzucenie przeszczepu. Tak więc, w celu utrzymania żywego i działającego przeszczepu, biorcy muszą być narażani na następstwa długotrwałej, nieswoistej immunosupresji. Następstwa te obejmują zwiększone ryzyko zakażenia i nowotworzenia, jak również toksyczność, szczególnie wobec wrażliwych narządów takich jak nerki, wątroba i trzustka.

Przeszczepianie komórek wysepek (ICT) może spowodować odwrócenie hiperglikemii i normalizację kontroli metabolicznej glukozy we krwi (Ricordi, Diabetes Rev., 4:356-369, 1996; Scharp i in., Diabetes 39:515-518, 1990; Socci i in., Acta Diabetol. 28:151-157, 1991; Warnock i in., Diabetol. 34:55-58, 1991; Ricordi i in., Transplantation 53:407-414, 1992; Gores i in., Lancet 341:19-21, 1993; Alejandro i in., Diabetes 46;1983-1989, 1997) u osobników dotkniętych cukrzycą (DM). Nawet w przypadku braku oporności na insulinę, podawanie zmniejszonych dawek egzogennej insuliny u osobników po przeszczepie z funkcjonującymi przeszczepami allogenicznymi wysepek (podstawowe wytwarzanie peptydu c >1,0 ng/ml) powoduje doskonałą kontrolę metaboliczną i normalizację hemoglobiny Alc (HbAlc) (Ricordi, Diabetes Rev., 4:356-369, 1996; Scharp i in., Diabetes 39:515-518, 1990; Socci i in., Acta Diabetol. 28:151-157, 1991; Warnock i in., Diabetol. 34:55-58, 1991; Ricordi i in., Transplantation 53:407-414, 1992; Gores i in., Lancet 341:19-21, 1993; Alejandro i in., Diabetes 46; 1983-1989, 1997). Nie obserwowano hipoglikemii, a funkcjonowanie przeszczepów allogenicznych wysepek u biorców z cukrzycą autoagresyjną był o udokumentowane na przestrzeni 6 lat po przeszczepieniu (Alejandro i in., Diabetes 46;1983-1989, 1997). Mimo istotnego zaawansowania, szeroko stosowane przeszczepianie komórek wysepek w celu kontrolowania DM jest ograniczone przez konieczność ciągłej i uogólnionej immunosupresji u biorcy. Ograniczenie to jest nie tylko związane z ryzykiem dotyczącym przewlekłej immunosupresji, ale również z diabeto-gennym wpływem obecnie stosowanych leków immunosupresyjnych.

Ograniczenia obecnie znanych terapii w kontrolowaniu DM pobudziły powszechne zainteresowanie opracowaniem terapii indukowania tolerancji immunologicznej swoistej wobec dawcy, co pozwoliłoby uniknąć długotrwałej immunosupresji biorcy przeszczepu. Obiecujące rezultaty wstępne osiągnięto stosując różne modele przeszczepów allogenicznych u gryzoni. Jednakże, podczas badań przedklinicznych na większych zwierzętach (np. psach, naczelnych innych niż ludzie) wyniki na gryzoniach słabo odpowiadały wynikom ICT na modelach lepiej naśladujących ludzki ICT.

Tak więc, istnieje zapotrzebowanie na ulepszone albo skuteczniejsze leczenie immunosupresyjne albo immunomodulujące biorców przeszczepów, w tym ludzi. W szczególności, istnieje zapotrzebowanie na leczenie, które nie wymaga uogólnionej supresji limfocytów T, tj. leczenie, które nie pozostawi biorcy podatnym na nowotwory i zakażenia oportunistyczne. Jeszcze konkretniej, istnieje zapotrzebowanie na leczenie o mniejszej toksyczności niż współcześnie stosowane leki. Podobnie,

PL 191 122 B1 istnieje zapotrzebowanie na leczenie, które ułatwia trwałą funkcjonalną integrację przeszczepu, tj. integrację, która przetrwa czas trwania kuracji.

Streszczenie wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest zastosowanie przerywacza wiązania CD40:CD154 do wytwarzania leku do (a) hamowania odrzucania przeszczepu tkanki wytwarzającej insulinę przez biorcę przeszczepu będącego naczelnym;

(b) przedłużania przeżycia przeszczepionej tkanki wytwarzającej insulinę u biorcy przeszczepu będącego naczelnym;

(c) odwracania odrzucania przeszczepionej tkanki wytwarzającej insulinę przez biorcę przeszczepu będącego naczelnym;

(d) zachowywania funkcji przeszczepionej tkanki wytwarzającej insulinę u biorcy przeszczepu będącego naczelnym; albo

e) przywracania funkcji zaburzonej, przeszczepionej tkanki wytwarzającej insulinę u biorcy przeszczepu będącego naczelnym;

przy czym lek jest przeznaczony do podawania biorcy przeszczepu w ilości dostarczającej skuteczną ilość przerywacza wiązania CD40:CD154.

Korzystnie przerywaczem wiązania CD40:CD154 stosowanym w zastosowaniach według wynalazku jest:

(a) czynnik blokujący CD154(CD40L); lub (b) przeciwciało monoklonalne; lub (c) przeciwciało monoklonalne o charakterystyce wiązania swoistego antygenu jak przeciwciało 5c8 wytwarzane przez ATCC HB 10916.

Również korzystnie tkanką wytwarzającą insulinę jest:

(a) tkanka całej trzustki; lub (b) izolowane wysepki trzustkowe; lub (c) populacja komórek obejmująca izolowane komórki β dorosłych wysepek; lub (d) populacja komórek obejmująca izolowane komórki β płodowych wysepek; lub (e) populacja komórek obejmująca hodowane komórki β wysepek; lub (f) populacja komórek obejmująca unieśmiertelnione komórki β wysepek; lub (g) populacja komórek obejmująca komórki gospodarza stabilnie wyrażające gen insuliny; lub (h) populacja komórek obejmująca komórki gospodarza indukowalnie wyrażająca gen insuliny.

Ponadto korzystnie w zastosowaniach według wynalazku tkanka wytwarzająca insulinę jest fizycznie oddzielona od tkanek biorcy przez urządzenie immunoizolujące, a korzystniej urządzenie immunoizolujące:

(a) obejmuje półprzepuszczalną barierę tworzącą komorę izolującą, w której zdeponowana jest tkanka wytwarzająca insulinę; albo (b) jest kapsułką; albo (c) jest mikrokapsułką.

Również w korzystnych postaciach wykonania tkanka wytwarzająca insulinę jest allogeniczna albo ksenogeniczna względem biorcy przeszczepu. Korzystnie biorcą przeszczepu jest człowiek, korzystniej biorca przeszczepu jest dotknięty zaburzeniem kontroli metabolicznej metabolizmu glukozy, a najkorzystniej cukrzycą .

Przedmiotem wynalazku jest w szczególności zastosowanie przerywacza wiązania CD40:CD154 do wytwarzania leku do przywracania kontroli metabolicznej metabolizmu glukozy u wymagającego tego naczelnego, przy czym lek jest przeznaczony do podawania naczelnemu, u którego wszczepia się skuteczną ilość tkanki wytwarzającej insulinę, w ilości dostarczającej skuteczną ilość przerywacza wiązania CD40:CD154. Korzystnie przerywaczem wiązania CD40:CD154 jest przeciwciało monoklonalne o charakterystyce wiązania swoistego antygenu jak przeciwciało 5c8 wytwarzane przez ATCC HB 10916.

Korzystniej lek otrzymany zgodnie z zastosowaniem według wynalazku jest przeznaczony do podawania przed przeszczepieniem tkanki. Również korzystnie lek jest przeznaczony do wielokrotnego podawania, przynajmniej dwukrotnie w ciągu dwutygodniowego okresu po wszczepieniu tkanki. Korzystniej, lek jest przeznaczony do wielokrotnego podawania przynajmniej w miesiąc po wszczepieniu tkanki. Najkorzystniej lek jest przeznaczony do wielokrotnego podawania raz w miesiącu, począwszy przynajmniej dwa miesiące po wszczepieniu tkanki.

PL 191 122 B1

W korzystnej postaci wykonania lek otrzymywany zgodnie z zastosowaniem wedł ug wynalazku jest przeznaczony do podawania gdy ssakowi wszczepia się również skuteczną ilość czynnika toleryzującego. Korzystnie czynnikiem toleryzującym jest tkanka szpiku, która jest zgodna pod względem MHC z tkanką wytwarzającą insulinę. Najkorzystniej czynnik toleryzujący jest wybrany z grupy składającej się z:

(a) tkanki szpiku, która jest syngeniczna z tkanką wytwarzającą insulinę;

(b) pełnego szpiku;

(c) populacji komórek krwiotwórczych CD34(+);

(d) populacji komórek krwiotwórczych CD34(+), które są CD40 (-).

Tak więc rozwiązania według wynalazku mają na celu dostarczenie środka immunomodulacyjnego, który osłabia przeciwną adaptacji reakcję limfocytów T, bez konieczności ogólnej immunosupresji limfocytów T. Ponadto umożliwiają one dostarczanie środka immunomodulującego, który ułatwia integrację funkcjonalną tkanki przeszczepu z biorcą, w szczególności przeszczepu pochodzącego z wysepek trzustkowych z organizmem biorcy, w szczególności biorcy będącego człowiekiem. Tak więc dostarczanie środka immunomodulującego, hamuje odrzucanie immunologiczne przeszczepionej tkanki, w szczególnoś ci przeszczepionych wysepek trzustkowych albo innej tkanki wytwarzają cej insulinę . Ś rodek immunomodulujacy znajdujący zastosowanie w rozwiązaniach według wynalazku przerywa dostarczanie sygnału kostymulującego do aktywowanych limfocytów T. Rozwiązania według wynalazku umożliwiają dostarczenie przerywacza wiązania CD40:CD154, takiego jak czynnik blokujący CD154, do zastosowania w terapii, szczególnie do zastosowania w leczeniu w celu złagodzenia albo opóźnienia immunologicznego odrzucenia przeszczepionej tkanki. W bardziej ogólnym aspekcie rozwiązania według wynalazku zwiększają dostępność przeszczepów tkankowych, w szczególności przeszczepów tkanki wytwarzającej insulinę, przez dostarczenie kompozycji terapeutycznej umożliwiającej funkcjonalną integrację tkanki nieautologicznej (allogenicznej albo ksenogenicznej) z organizmem biorcy. Rozwiązania według wynalazku mają na celu zapobieganie, osłabianie albo leczenie cukrzycy (DM).

Niniejszy wynalazek opiera się na ujawnieniu, że zastosowanie przerywacza wiązania CD40:CD154, takiego jak czynnik blokujący CD154, zastosowanego pojedynczo albo w kombinacji z innym czynnikiem terapeutycznym, takim jak ś rodek immunomodulują cy albo toleryzują cy, hamuje, łagodzi, osłabia, opóźnia albo odwraca anty-adaptacyjne odrzucenie przez układ odpornościowy przeszczepionej tkanki wytwarzającej insulinę u biorcy, bez konieczności uogólnionej supresji układu odpornościowego biorcy.

Tak więc, opisane zostały niniejszym sposoby i kompozycje do immunomodulacyjnej terapii dla biorców przeszczepionej tkanki wytwarzającej insulinę. Pierwszy sposób hamuje odrzucanie przeszczepionej tkanki wytwarzającej insulinę u biorcy. Drugi sposób przedłuża przeżycie przeszczepu. Trzeci sposób odwraca odrzucanie przeszczepu. Czwarty sposób zachowuje działanie przeszczepu tkankowego. Piąty sposób przywraca funkcję uszkodzonego przeszczepu. Szósty sposób wywołuje tolerancję immunologiczną wobec tkanki. Wszystkie powyższe sposoby obejmują traktowanie osobnika z przeszczepem, przy użyciu przerywacza wiązania CD40:CD154, przez co rozumie się dowolny czynnik, który przerywa wiązanie ligandu CD40 (tj. CD40L, znanego również jako CD154 albo antygen 5c8, zaś czasem określanego jako gp39) z przeciwnym lub pokrewnym receptorem (tu, CD40). Korzystnie, przerywaczem wiązania jest czynnik blokujący CD154 (CD40L), przez co rozumie się dowolny czynnik, który wiąże się z CD154 i zapobiega albo zakłóca wiązanie z receptorem (np. CD40). Przykładowym czynnikiem blokującym CD154 jest przeciwciało monoklonalne (mAb) szczególnie przeciwciało o charakterystyce wiązania mAb 5c8, opisane w opisie patentowym USA 5,474,771, którego ujawnienia załączono na drodze odniesienia.

Powyższe sposoby można przeprowadzać ze wszystkimi rodzajami przeszczepów tkankowych wytwarzających insulinę, takimi jak całkowita tkanka trzustkowa albo wysepki trzustkowe wyizolowane konwencjonalnymi technikami. Tak więc, rozwiązania według wynalazku są przydatne do zastosowania tam, gdzie biorca przeszczepu (gospodarz) jest ssakiem, korzystnie naczelnym, jeszcze korzystniej człowiekiem. W szczególności, rozwiązania według wynalazku można stosować, kiedy biorca jest dotknięty albo zagrożony zaburzeniem kontroli metabolicznej glukozy, jak w DM. Dawcą przeszczepu może być niesyngeniczny członek tego samego gatunku filogenetycznego co biorca (tj. dawca allogeniczny, przy tkance allogenicznej), albo członek innego filogenetycznego gatunku (tj. dawca ksenogeniczna, przy tkance ksenogenicznej). Jeżeli dawcą jest dawca ksenogeniczny, korzystnie dawca jest zbliżony do biorcy pod względem MHC, o ile to możliwe; przykładowo, orangutan albo szympans będzie korzystnym dawcą tkanki dla człowieka. Rozwiązania według wynalazku można zastosować w celu

PL 191 122 B1 ułatwienia przyjęcia się przeszczepu dowolnego rodzaju tkanki wytwarzającej insulinę, w tym populacji komórek P wyizolowanych z dorosłych albo płodowych wysepek, albo hodowanych komórek β wysepek (otrzymanych z hodowli pierwotnej albo unieśmiertelnionej linii komórkowej). W rzeczywistości, rozwiązania według wynalazku można zastosować do ułatwienia wszczepienia dowolnej komórki wyrażającej insulinę w sposób indukowany albo konstytutywny, takiej jak komórki poddane inżynierii genetycznej albo komórki gospodarza wytworzone standardowymi technikami inżynierii genetycznej. Ewentualnie, tkanka wytwarzająca insulinę może być fizycznie oddzielona od tkanek biorcy urządzeniem izolującym immunologicznie.

W świetle powyższego, jasne jest, że rozwiązania według wynalazku umożliwiają przywracanie kontroli metabolicznej metabolizmu glukozy u wymagającego tego ssaka. Opisany tu sposób obejmuje wszczepienie ssakowi tkanki wytwarzającej insulinę i leczenie ssaka przerywaczem wiązania CD40-CD154, korzystnie czynnikiem blokującym CD154, takim jak przeciwciało monoklonalne o swoistości wiązania mAb 5c8. W przykładowym protokole, który potwierdzono przez badanie odpowiedniego przedklinicznego modelu ludzkiej DM, wszczepienie indukuje się przez podanie mAb przed ICT, a następnie (korzystnie) przynajmniej dwa podania mAb w okresie dwóch tygodni po ICT (tj. po wszczepieniu tkanki wytwarzającej insulinę). Następnie, jeżeli to konieczne, wszczepienie można utrzymać przez podawanie mAb w miesiąc (czyli cztery tygodnie) po ICT. Utrzymywanie można powtarzać jeżeli jest to konieczne.

Ewentualnie, wszczepienie można wzmocnić przez równoczesne podawanie ssakowi czynnika toleryzującego, przez co rozumie się dowolny czynnik, który zachowuje wszczepienie po przerwaniu leczenia immunomodulującego albo immunosupresyjnego. Przykładowe czynniki toleryzujące obejmują tkankę szpiku, albo populację komórek pochodzących ze szpiku, który jest zgodny pod względem MHC z przeszczepem tkankowym (tu, tkanką wytwarzającą insulinę). Korzystnie, szpik albo komórki są syngeniczne z dawcą albo źródłem tkanki wytwarzającej insulinę. Długotrwałe przeżycie czynnika toleryzującego u biorcy przeszczepu powoduje, że biorca jest immunologiczną chimerą, który to stan charakteryzuje się tolerancją immunologiczną. Populacje pochodzących ze szpiku komórek krwiotwórczych CD34(+) (komórek macierzystych) są szczególnie korzystne jako czynniki toleryzujące. Szczególnie korzystne są populacje komórek macierzystych o fenotypie CD40(-).

Niniejszym opisany został również sposób wykrywania zaburzeń kontroli metabolicznej metabolizmu glukozy u ssaka. Sposób ten jest wystarczająco wrażliwy do wykazania subklinicznego (np. ukrytego albo bezobjawowego) zaburzenia metabolizmu glukozy we krwi, przykładowo, gdy ssak zagrożony jest rozwojem DM albo jest zagrożony, albo na wczesnym etapie odrzucania przeszczepionej tkanki wytwarzającej insulinę. Sposób obejmuje ocenę zawartości glukozy w próbce krwi, pobranej od ssaka w przynajmniej godzinę i mniej niż sześć godzin (korzystnie około 2 godzin) po spożyciu pożywienia. Uważa się, że ssak ma zaburzenia metabolizmu glukozy, gdy zawartość glukozy w próbce poposiłkowej (PPD) wynosi 150 mg/dl albo więcej (tj. ponad około 150 mg/dl). Wiarygodność sposobu jest polepszona, gdy dwie takie próbki pobrane w kolejnych dniach wykazują zawartość glukozy 150 mg/dl albo więcej.

Szczegółowy opis rysunków

Powyższe i inne cele, cechy i zalety rozwiązań według wynalazku, jak również sam wynalazek, staną się lepiej zrozumiałe z poniższego opisu korzystnych wykonań, w oparciu o dołączone rysunki, na których:

Figura 1 jest wykresem poziomu glukozy u orangutanów na czczo (FG), które są biorcami czynnika blokującego CD154 w ICT, jako funkcji dni po operacji (POD).

Figura 2 jest wykresem przedstawiającym poziom FG u rezusów przyjmujących czynnik blokujący CD154 w ICT, jako funkcji dni po operacji (POD).

Figura 3 jest wykresem przedstawiającym poziomy FG rezusów pokazane na figurze 2 z poziomami FG człowieka dotkniętego DM i otrzymującego konwencjonalną terapię zastępczą insuliną.

Szczegółowy opis wynalazku

Aktywacja limfocytów T i zależne od niej procesy immunologiczne wymagają sygnałów za pośrednictwem receptora limfocytu T (TCR) oraz równocześnie dostarczanych sygnałów ko-stymulujących. Istotnym sygnałem ko-stymulującym jest sygnał dostarczany przez związanie CD40 na komórce prezentującej antygen, takiej jak limfocyt B, przez CD40L (CD154) na limfocycie T. Ludzki CD40 jest białkiem powierzchniowym 50 kDa, wyrażanym na limfocytach B, jak również makrofagach i aktywowanych komórkach śródbłonka. CD40 należy do klasy receptorów związanych z programowaną śmiercią komórek, w tym Fas/CD95 i receptora czynnika martwicy nowotworu (TNF) alfa. Ludzki CD154 (CD40L) jest glikoproteiną

PL 191 122 B1 powierzchniową typu II o 32 kDa, z homologią do TNF-alfa, który ulega przemijającej ekspresji na aktywowanych limfocytach T. Wykazano, że wiązanie CD40:CD154 jest niezbędne do reakcji przeciwciał zależnej od limfocytów T. W szczególności, wiązanie CD40:CD154 zapewnia sygnały pobudzające zapobiegające apoptozie i/lub pobudzające limfokiny.

Istota wiązania CD40:CD154 w promowaniu zależnej od limfocytów T reakcji biologicznej jest podkreślona przez ujawnienie, że powiązany z chromosomem X zespół nadmiernego wytwarzania IgM (X-HIGM) u ludzi spowodowany jest pozbawieniem funkcjonalnego CD154. Osobnicy chorzy mają normalny albo wysoki poziom IgM, ale nie są w stanie wytwarzać przeciwciał IgG, IgA ani IgE i cierpią na nawracające, czasami ciężkie, zakażenia bakteryjne i zakażenia pasożytnicze, jak również zwiększonej częstości chłoniaki i nowotwory jamy brzusznej. Podobny fenotyp można zaobserwować u zwierząt ze znokautowanym genem kodującym CD154 (zwierzęta nokautowane). Limfocyty B tych zwierząt mogą wytwarzać IgM pod nieobecność wiązania CD40:CD154, jednak są one niezdolne do przełączania izotypów albo do prawidłowego przeżywania po dojrzewaniu powinowactwa. Histologicznie, centra namnażania węzłów chłonnych nie rozwijają się prawidłowo, a limfocyty B pamięci są nieobecne lub słabo rozwinięte. Funkcjonalnie defekty te przyczyniają się do znacznego obniżenia lub braku wtórnej (dojrzałej) reakcji przeciwciał. Defekty odporności komórkowej są również obserwowane, manifestując się zwiększoną częstością występowania zakażeń bakteryjnych i pasożytniczych. Wiele z tych defektów komórkowych moż na odwrócić przez podanie IL-12 albo IFN-gamma. Obserwacje te wspierają pogląd, że normalne wiązanie CD40:CD154 wspomaga rozwój reakcji odpornościowej limfocytów pomocniczych T typu I.

W wielu badaniach przedklinicznych stwierdzono, ż e czynniki zdolne do przerywania wią zania CD40:CD154 są obiecującymi czynnikami immunomodulującymi. W szczególności, badania obejmujące modele przeszczepienia narządów albo tkanek u małych zwierząt wykazały, że przerywacze wiązania CD40:CD154 ułatwiają przeżywanie przeszczepów allogenicznych. W wybranych modelach, wynikiem przejściowego podawania czynników zakłócających kostymulację limfocytów T było wywołanie przyjęcia przeszczepu na czas nieograniczony. Przerwanie wiązania CD40:CD154 w szczególności daje obiecujące wyniki, ponieważ wydaje się, że związanie tych receptorów poprzedza inne sygnały ko-stymulujące chronologicznie i pod względem hierarchii (Ranheim i in., J. Exp. Med. 177:925-935, 1993; Roy i in., Eur. J. Immunol. 25:596-603, 1995; Han i in., J. Immunol. 155:556-567, 1995; Shinde i in., J. Immunol. 157:2764-2768, 1996; Yang i in., Science 273:1862-1862, 1996; Grewal i in., Science 273:1864-1867, 1996; Lederman i in., J. Immunol. 149:3817-3826, 1992). Blokowanie wiązania CD40:CD154 powoduje przedłużenie przeżycia przeszczepów allogenicznych serca (Larsen i in., Transplantation 61:4-9, 1996; Larsen i in., Naturę 381:434-438), skóry (Larsen i in., Nature 381:434-438; 1996; Markees i in., Transplantation 64:329-335, 1997) i wysepek (Parker i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:9560-9564, 1995; Rossini i in., Celi Transplant., 5:49-52) u gryzoni oraz przeszczepów allogenicznych nerki u naczelnych (Kirki in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 194:8789-8794, 1997). Zauważono również opóźnienie początków wystąpienia cukrzycy immunologicznej w nie-otyłych myszach z cukrzycą (NOD, ang. non-obese diabetic) (Balasa i in., J. Immunol. 159:4620-4627, 1997). Ostatnio, opisano, że zakłócanie wiązania CD40:CD154 zapobiega wytwarzaniu cytokin zapalnych (Dechanet i in., J. Immunol. 159;5640-5647, 1997; Kiener i in., J. Immunol. 155:4917-4925, 1995).

Blokowanie CD40:CD154 może zapewnić potencjalnie potężne terapie do zapobiegania defektom przeszczepów alogenicznych albo ksenogenicznych u osobników z zaburzonym mechanizmem metabolizmu glukozy, takim jak cukrzyca typu I. Jednakże, jak zaznaczono wyżej, badania na gryzoniach słabo korelują z wynikami badań albo leczenia na większych zwierzętach, w tym ludziach.

Ujawnione tu badania stwierdzają wpływ korzystnego czynnika blokującego CD154, humanizowanego mAb o swoistości antygenowej mAb 5c8 (Lederman i in., J. Exp. Med. 175:1091-1101, 1992) na przedklinicznym modelu przeszczepu allogenicznego wysepek u większych zwierząt. Szczegółowo, niniejsze modele obejmują monoterapię blokowaniem CD154 u orangutanów (Papio hamadryas) i innych naczelnych, niebędących ludźmi. Otrzymane wyniki sugerują silnie, że monoterapia blokadą CD154 ułatwia długotrwałe wszczepienie tkanki wytwarzającej insulinę u ludzi, szczególnie ludzi dotkniętych DM albo podobnym defektem w homeostazie glukozy.

Poniższe omówienie ilustruje i podaje przykłady różnorodnych kontekstów i okoliczności, w których można stosować rozwiązania według wynalazku, jak również dostarcza badań sprawdzających zasadę działania szczególnych postaci wykonania rozwiązań według wynalazku.

PL 191 122 B1

Biorcy

Rozwiązania według wynalazku można zastosować do leczenia albo w profilaktyce dla dowolnego będącego ssakiem biorcy przeszczepu tkanki wytwarzającej insulinę, albo dowolnego ssaka wymagającego przeszczepu tkanki wytwarzającej insulinę. Biorca (określany również jako biorca przyjmujący albo biorca) jest dotknięty albo zagrożony defektem kontroli metabolicznej metabolizmu glukozy we krwi (homeostazy glukozy).

Przykładowo, biorca może być hiper- albo hipoglikemiczny. Wynalazek nadaje się szczególnie do zastosowania u biorców diabetycznych, szczególnie biorców dotkniętych cukrzycą (DM). Korzystnie, biorcą jest naczelny, korzystniej wyższy naczelny, najkorzystniej człowiek. W innych wykonaniach, może być inny ssak wymagający przeszczepu tkankowego, szczególnie ssak istotny gospodarczo, albo zwierzę towarzyszące albo inne wartościowe zwierzę, jak np. członek zagrożonego gatunku. Tak więc, biorcy obejmują również, choć nie są ograniczeni do owcy, koni, jagniąt, kóz, świń, psów, kotów, królików, świnek morskich, chomików, dżerbili, szczurów i myszy.

Dawca albo tkanka przeszczepiana

Rozwiązania według wynalazku można zastosować z dowolnym rodzajem przeszczepu tkankowego albo procedurą przeszczepiania, szczególnie gdy tkanka dawcy (tkanka przeszczepiana) jest zagrożona uszkodzeniem albo odrzuceniem przez układ odpornościowy w organizmie biorcy. W szczególnoś ci, wynalazek mo ż na stosować w dowolnym kontekś cie, gdy biorca nie jest zgodny z tkanką przeszczepu (zgodność MHC). Tak wię c, oprócz autologicznych albo syngenicznych tkanek donorowych, rozwiązania według wynalazku można stosować z tkanką przeszczepu allogenicznego albo nawet ksenogenicznego. Tkanka przeszczepiana może pochodzić od ochotnika albo innego żywego organizmu, albo od dawcy zmarłego. Korzystnie, dawca jest zgodny histologicznie z biorcą. Tak więc, gdy biorcą jest człowiek, korzystnym dawcą tkanki jest dawca tkanki autologicznej albo allogenicznej. Jednakże tkankę dawcy można pozyskać od gatunku heterologicznego (kiedy to określa się przeszczep jako przeszczep heterologiczny), takiego jak naczelny niebędący człowiekiem (np. szympansy albo orangutany) albo inny względnie zgodny ssak (np. świnia).

W niektórych wykonaniach, tkanka dawcy obejmuje całą trzustkę. W innych wykonaniach tkanka dawcy obejmuje część, fragment albo bioptat trzustki dawcy. Trzustki otrzymuje się od żywego dawcy albo odpowiedniego martwego dawcy. Gdy stosuje się dawcę martwego, korzystnie trzustkę eksponuje się na warunki niedokrwienia w niskiej temperaturze przez nie dłużej niż około 8 godzin. W jeszcze innych wykonaniach tkanka dawcy obejmuje komórki wytwarzają ce insulin ę , szczególnie izolowane albo zawieszone wysepki albo komórki wysepek, w tym komórki pobrane albo wycięte od dawcy płodowego albo dorosłego, komórki utrzymywane w hodowli pierwotnej albo unieśmiertelnionej linii komórkowej. Odpowiednie środki do wyizolowania komórek wysepek dawcy albo zawiesiny komórek wysepek z całych trzustek są znane (Ricordi i in., (1988) 37 Diabetes 413-420; Tzakis i in., (1990), 336 Lancet 402-405; Linetzky i in., (1997) 46 Diabetes 1120-1123). Odpowiednie trzustki otrzymuje się od dawców zasadniczo pozbawionych defektów w homeostazie glukozy we krwi. Inne źródła komórek wytwarzających insulinę obejmują komórki ukierunkowane wysepek płodowych, ewentualnie namnożone w hodowli pierwotnej. Można zastosować dowolny odpowiedni rodzaj komórek, jednakże, obejmujący komórki niosące egzogenny materiał genetyczny kodujący możliwy do wyrażenia gen insuliny. Tak więc, wynalazek obejmuje zastosowanie transfekowanych albo transformowanych komórek gospodarza, które przekonstruowano (albo otrzymano z komórek, które przekonstruowano) w kierunku ekspresji insuliny, konstytutywnej albo indukowalnej (np. pod kontrolą promotora albo wzmacniacza wrażliwego na glukozę). W innych wykonaniach rozwiązania według wynalazku dotyczą stosowania komórek trzustki albo innych rodzajów komórek, pochodzących od ssaka transgenicznego, którego przekonstruowano w taki sposób, że zawiera materiał genetyczny konieczny do wytwarzania insuliny w niektórych albo wszystkich tkankach organizmu.

Tkankę wytwarzającą insulinę (tkankę dawcy) wprowadza się układowe albo miejscowo do organizmu biorcy. Przykładowo, izolowane, zawieszone albo rozproszone komórki wytwarzające insulinę można wstrzykiwać dożylnie, albo wszczepić w pożądane miejsce, takie jak jama szpikowa, wątroba, pod torebkę nerki, domięśniowo albo dootrzewnowe. W niektórych wykonaniach, komórki są kompetentne mitotycznie i tworzą nową tkankę pochodzącą od dawcy. W innych wykonaniach komórki nie są mitotycznie kompetentne, ale pozostają żywe w organizmie biorcy i wytwarzają insulinę. W każdym przypadku, wszczepia się skuteczną ilość komórek albo tkanki wytwarzającej insulinę, przez co rozumie się ilość odpowiednią do złagodzenia (w sposób wykrywalny osłabienia) defektu biorcy pod względem metabolizmu glukozy (np. hipoglikemii albo hiperglikemii). Optymalnie, ilość jest odpowied8

PL 191 122 B1 nia do przywrócenia biorcy zdolności do utrzymania homeostazy glukozy - co oznacza uwolnienie biorcy z zależności od konwencjonalnej terapii zastępczej insuliną (np. wstrzykiwanej albo wziewnej).

W niektórych wykonaniach, tkanka wytwarzają ca insulinę jest fizycznie oddzielona (odizolowana) od otaczającej tkanki biorcy przez urządzenie immunoizolujące. Odpowiednie urządzenia chronią tkankę wytwarzającą insulinę od większości komórek efektorowych odporności komórkowej i humoralnej, w tym, choć nie tylko leukocytów, immunoglobulin i dopełniacza. Tak więc, urządzenia immunoizolujące zwykle zapewniają barierę półprzepuszczalną, taką jak membrana, o wielkości porów odpowiedniej do zapobieżenia dyfuzji cząsteczek większych niż około 50-100 kDa. Bariera otacza izolacyjną komorę, w której zdeponowana jest tkanka wytwarzająca insulinę, i nie posiada żadnych miejsc w których tkanka wytwarzają ca insulinę mogł aby fizycznie kontaktować się z komórkami albo tkankami na zewnątrz bariery. Można zastosować dowolne konwencjonalne urządzenia, otoczki, kapsułki albo mikrokapsułki, w tym jedno- i dwuścienne mikrokapsułki alginianowe (np. jak opisane w patencie USA 5,227,298, załączone tu jako odnośnik). Inne konwencjonalne mikrokapsułki obejmują kapsułki z polilizyny alginianu, chemicznie usieciowanego alginianu, oraz kapsułki wytworzone z innych materiałów zgodnych biologicznie, utworzone w postaci urządzenia immunoizolującego o dowolnym kształcie albo wielkości (patrz, Jaink i in., (1996) 61 Transplantation 4, załączone tu jako odnośnik).

W dalszych wykonaniach, czynnik toleryzują cy jak szpik albo otrzymane z niego komórki również wszczepia się biorcy. Jako czynnik toleryzujący można zastosować dowolny czynnik toleryzujący. Komórki tolaryzujące są zgodne pod względem MHC z tkanką wytwarzającą insulinę, i są korzystnie otrzymywane od dawcy, który dostarczył tkanki wyrażającej insulinę, albo dawcy, który jest z nim syngeniczny. Odpowiednie środki do preparowania szpiku albo populacji komórek są dobrze znane (patrz, np. Sharp i in., (1984), 69 J. Immunol. Meth. 187-195, Fontes i in., (1995) Meth. in Celi Transplant., Ricordi (wyd.) R.G. Landes Co., str. 619-628). Korzystnie, szpik poddaje się obróbce przy użyciu układu Ceprate® SC Stem Celi Concentration System (CellPro, Inc., Bothell, WA; patrz, CellPro Investigator Brochure, wyd. 06.01.97), albo jego odpowiednika, w celu dostarczenia populacji komórek szpiku wzbogaconych o komórki krwiotwórcze CD34(+). Standardowa analiza sortowania komórek aktywowanych fluorescencją (FACS) albo barwienie immunofluorescencyjne wykazuje, że ta populacja komórek CD34(+) jest zasadniczo wolna od komórek CD40(+), jednakże można zaobserwować ledwo widoczne barwienie na CD40. Ponieważ populacja komórek CD34(+) jest dynamiczną populacją komórek macierzystych, uważa się że obecność niskiego poziomu CD40(+) odpowiada częstości z jaką komórka macierzysta rozpoczyna róż nicowanie w linii limfocytów B. W rzeczywistoś ci, wstę pne badania FACS wykazały, że tylko komórki CD40(+) (które zwykle stanowią nie więcej niż około 0,7%) w populacji komórek macierzystych w CD34(+) są również CD19(+). CD19 jest najwcześniejszym znanym obecnie znacznikiem linii limfocytów B. Zatem, w celu zapewnienia zastosowania prawdziwej populacji komórek macierzystych jako czynnika toleryzującego, komórki CD34(+) można dalej zubażać o CD40(+) konwencjonalnymi sposobami selekcji negatywnej (np. selektywną cytolizą, sortowaniem komórek, odpłukiwaniem itp.).

Przykładowe przerywacze wiązania CD40:CD154

Związki terapeutyczne przydatne w rozwiązaniach według wynalazku obejmują dowolny związek, który blokuje oddziaływanie powierzchniowego CD40 (np. na limfocytach B) z CD40L (CD154) wyrażanym na powierzchni aktywowanych limfocytów T. Związki przerywające wiązanie CD40:CD154, takie jak czynniki blokujące CD154, które są szczególnie uwzględniane, obejmują przeciwciała poliklonalne i monoklonalne (mAb), jak również pochodne przeciwciał, takie jak cząsteczki chimeryczne, cząsteczki humanizowane, cząsteczki o zmniejszonej funkcji efektorowej, cząsteczki o podwójnej swoistości i koniugaty przeciwciał. W korzystnym wykonaniu, przeciwciało wykazuje charakterystykę wiązania swoistą antygenowe jak mAb 5c8, jak opisano w opisie patentowym USA nr 5,474,771, którego ujawnienie jest włączone tu przez odniesienie. W bardzo korzystnym obecnie wykonaniu, przeciwciałem jest przeciwciało humanizowane 5c8. Inne znane przeciwciała przeciwko CD154 obejmują przeciwciała ImxM90, ImxM91 i ImxM92 (Immunex), przeciwciało monoklonalne przeciwko CD154 dostępne z Ancell (klon 24-31, nr kat. 353-020, Bayport, MN) i przeciwciało monoklonalne przeciwko CD40L dostępne z Genzyme (Cambridge, MA, nr kat. 80-3703-01). Również dostępne na rynku jest przeciwciało monoklonalne przeciwko CD40L z PharMingen (San Diego, nr kat. 33580D). Wytworzono i scharakteryzowano liczne przeciwciała przeciwko CD40L (patrz, np. WO 96/23071, Bristol-Myers Squ-ibb, załączone tu jako odnośnik).

Rozwiązania według wynalazku mogą być również realizowane w oparciu o czynniki blokujące CD154 innego rodzaju, takie jak kompletne fragmenty Fab, związki F(ab')2, regiony VH, regiony Fv,

PL 191 122 B1 przeciwciała jednołańcuchowe, (patrz, np. WO 96/23071), polipeptydy, fuzyjne konstrukty polipeptydowe, fuzje CD40 (takie jak CD40Ig, Hpllenbaugh i in., J. Immunol. Meth., 188:1-7, 1995, załączone tu jako odnośnik) oraz związki drobnocząsteczkowe, takie jak pół-peptydowe związki drobnocząsteczkowe albo związki nie-peptydowe, zdolne do blokowania albo przerywania wiązania CD40:CD154. Procedury projektowania, badania przesiewowego i optymalizacji związków drobnocząsteczkowych dostarczone są w zgłoszeniu PCT/US96/10664, zgłoszonym 21 czerwca 1996, załączonym tu jako odnośnik.

Różne postaci przeciwciał można wytworzyć z użyciem standardowych technik rekombinacji DNA (Winter i Milstein, Naturę 349:293-99, 1991). Przykładowo, można skonstruować przeciwciała „chimeryczne”, w których domena wiążąca antygen z przeciwciała zwierzęcego jest połączona z ludzką domeną stałą (przeciwciało pochodzące początkowo od ssaka niebędącego człowiekiem, w którym zastosowano technologię rekombinacji DNA w celu zastąpienia całości albo części regionów zawiasowych i stałych ł ańcucha ciężkiego i/lub region stały łań cucha lekkiego, odpowiadają cymi regionami ł ańcucha ciężkiego i łańcucha lekkiego ludzkiej immunoglobuliny) (patrz, Cabilly i in., patent USA nr 4,816,567; Morrison i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-55, 1984). Przeciwciała chimeryczne zmniejszają reakcje odpornościową wywołaną przez przeciwciała zwierzęce zastosowane do leczenia ludzi.

Oprócz tego, można syntetyzować rekombinowane przeciwciała „humanizowane”. Przeciwciała humanizowane są przeciwciałami początkowo pochodzącymi od ssaka niebędącego człowiekiem, w których zastosowano technologię rekombinacji DNA w celu zastą pienia całoś ci albo cz ęści aminokwasów niekoniecznych do wiązania antygenu aminokwasami z odpowiednich regionów łańcucha ciężkiego i lekkiego ludzkiej immunoglobuliny. Oznacza to, że są to chimery obejmujące w większości sekwencje immunoglobuliny ludzkiej, do których wprowadzono regiony odpowiedzialne za swoiste wiązanie antygenu (patrz, np. zgłoszenie PCT nr WO 94/04679). Zwierzęta są immunizowane pożądanym antygenem, odpowiadające przeciwciała są izolowane i część sekwencji regionu zmiennego odpowiedzialna za swoiste wiązanie antygenu usunięta. Regiony wiążące antygen pochodzenia zwierzęcego są następnie klonowane w odpowiednie pozycje genów ludzkich przeciwciał, w których regiony wiążące antygen zostały usunięte. Humanizowane przeciwciała minimalizują zastosowanie sekwencji heterologicznych (pomiędzy gatunkowych) w przeciwciałach do zastosowania w terapiach u ludzi i dają mniejsze prawdopodobieństwo wywołania niepożądanej reakcji odpornościowej. Primatyzowne przeciwciała mogą być również wytwarzane w sposób podobny.

W nastę pnej postaci wykonania stosowane przeciwciał a ludzkie mogą być wytwarzane u zwierząt niebędących ludźmi, takich jak zwierzęta transgeniczne, niosące jeden albo wiele transgenów ludzkich immunoglobulin. Zwierzęta takie można zastosować jako źródło splenocytów do wytwarzania hybrydoma, jak to opisano w opisie patentowym USA nr 5,569,825.

Fragmenty przeciwciał i przeciwciała jednowartościowe można również zastosować w zastosowaniach według wynalazku. Przeciwciało jednowartościowe obejmuje dimer łańcucha ciężkiego i łańcucha lekkiego, połączonych regionem Fc (albo zrębem) drugiego łańcucha ciężkiego. „Region Fab” oznacza te części łańcuchów, które są z grubsza równoważne albo analogiczne z sekwencjami, które obejmują rozgałęzienie Y łańcucha ciężkiego i łańcucha lekkiego w całości, i które razem (jako agregat) wykazują aktywność przeciwciała. Białko Fab obejmuje agregaty jednego łańcucha ciężkiego i jednego lekkiego (zwykle okre ś lane jako Fab'), jak również tetramery, które odpowiadają dwóm segmentom rozgałęzień przeciwciała Y (zwykle określanego jako F(ab')2, niezależnie czy połączony kowalencyjnie czy nie kowalencyjnie, jak długo agregat jest zdolny do wybiórczego reagowania z konkretnym antygenem albo rodziną antygenów.

Oprócz tego, standardowe techniki rekombinacji DNA można zastosować do zmiany powinowactwa wiązania rekombinowanych przeciwciał z ich antygenami, przez zmianę reszt aminokwasowych w sąsiedztwie miejsc wiązania antygenu. Powinowactwo wiązania antygenu humanizowanego przeciwciała można zwiększyć przez mutagenezę opartą na modelowaniu molekularnym (Queen i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:10029-33, 1989; zgłoszenie PCT nr WO 94/04679). Może być pożądane zwiększenie albo zmniejszenie powinowactwa przeciwciał do CD40L, zależnie od docelowej tkanki albo przewidywanego schematu leczenia. Można to zrobić przez wykorzystanie technologii prezentacji na fagu (patrz, Winter i in., Ann. Rev. Immunol., 12:433-455; Schier i in., J. Mol. Biol., 255:28-43, 1996, załączone tu jako odnośnik). Przykładowo, korzystne może być leczenie pacjenta stałym poziomem przeciwciał o zmniejszonym powinowactwie do CD154 w celu pół-profilaktycznym. Podobnie, przeciwciała o zwiększonym powinowactwie do CD4&L mogą być korzystniejsze podczas krótkotrwałego leczenia.

PL 191 122 B1

Drogi podawania

Przerywacze wiązania CD40:CD154, w tym związki blokujące CD154 mogą być podawane każdym sposobem, który jest medycznie dopuszczalny. Zależnie od swoistych okoliczności pożądane może być podawanie miejscowe albo układowe. Korzystnie, związek jest podawany drogą dootrzewnową, taką jak wstrzyknięcia dożylne, dotętnicze, podskórne, domięśniowe, dogałkowe, dokomorowe, dootrzewnowe, dootrebkowe, doczaszkowe, dokanałowe, albo donosowe, wlewy albo inhalacje. Związek może być również podawany gospodarzowi biorcy przez wszczepienie pompy infuzyjnej, albo biokompatybilnego i biodegradowalnego implantu o przedłużonym uwalnianiu, zarówno przed, jak i po wszczepieniu tkanki dawcy. Alternatywnie, konkretne związki, albo ich preparaty mogą być odpowiednie do podawania doustnego albo dojelitowego. Ponadto inne związki mogą być przydatne do podawania miejscowego.

W dalszym wykonaniu, przerywacz wią zania CD40:CD154 dostarczany jest poś rednio biorcy, przez podanie wektora albo innego materiału genetycznego zdolnego do wyrażania przerywacza. Materiał genetyczny jest internalizowany i wyrażany w komórkach albo tkance biorcy, z wytworzeniem przerywacza in situ. Przykładowo, przydatny konstrukt kwasu nukleinowego obejmujący sekwencję kodująca jeden albo więcej łańcuchów immunoglobulin (Ig) mAb 5c8 jak ujawnione w opisie patentowym USA 5,474,771. Inne przydatne konstrukty obejmują sekwencje kodujące chimeryczne albo humanizowane wersje łańcuchów Ig mAb 5c8 albo ich fragmenty wiążące antygen. Jeszcze inne przydatne konstrukty obejmują sekwencje kodujące część albo całość innych mAb swoistych wobec CD154. Konstrukty te dostarcza się układowo, albo miejscowo, np. w miejsce w pobliżu miejsca wszczepienia tkanki wyrażającej insulinę.

Alternatywnie, wektor, albo inny materiał genetyczny kodujący przerywacz jest internalizowany do odpowiedniej populacji izolowanych komórek w celu wytworzenia komórek gospodarza wytwarzających przerywacz. Komórki te wszczepia się albo podaje we wlewie biorcy, miejscowo albo układowo, w celu zapewnienia wytwarzania przerywacza wią zania CD40:CD154 in situ. Odpowiednie komórki gospodarza obejmują komórki hodowlane, takie jak komórki unieśmiertelnione, jak również komórki otrzymane od biorcy (np. komórki krwi obwodowej albo komórki węzła chłonnego, takie jak naturalne komórki niszczące (NK)).

Ogólnie, związki są podawane organizmowi biorcy. Jednakże, związki mogą być również podawane dawcy, albo do tkanki dawcy. Na przykład, związek może być zawarty w płynach perfuzyjnych, albo konserwujących, w których tkanki dawcy są przechowywane, albo transportowane przed ich integracją z gospodarzem biorcą.

Preparaty

Ogólnie, związki zastosowane w rozwiązaniach według wynalazku są zawieszane, rozpuszczane albo dyspergowane w zaróbce albo nośniku dopuszczalnym farmaceutycznie. Powstała kompozycja terapeutyczna nie wpływa ujemnie na homeostazę biorcy, szczególnie na równowagę elektrolitową. Tak, więc przykładowy nośnik obejmuje normalna sól fizjologiczną (0,15 M NaCl, pH 7,0 do 7,4). Inne dopuszczalne nośniki są dobrze znane w stanie techniki i opisane, na przykład w Remington Pharmaceutical Science, Gennaro, ed., Mack Publishing Co., 1990. Dopuszczalne nośniki mogą obejmować biokompatybilne, obojętne albo bioabsorbowalne sole, czynniki buforujące, oligo- albo polisacharydy, polimery, czynniki poprawiające lepkość, konserwanty i tym podobne.

Przerywacz wiązania CD40:CD154, taki jak czynnik blokujący CD154, stosowany w zastosowaniach według wynalazku jest podawany w farmaceutycznie skutecznej albo terapeutycznie skutecznej ilości lub dawce, która jest ilością wystarczającą do wytworzenia wykrywalnego, korzystnie klinicznie dobroczynnego efektu u biorcy. Medycznie dobroczynne wpływy mogą obejmować zapobieganie, opóźnienie albo złagodzenie pogarszania, albo wykrywalną poprawę, stanu klinicznego biorcy. Przykładowo, wskazania stanu przeszczepu allogenicznego nerki albo przeszczepu ksenogenicznego, funkcja nerek i stan zdrowia monitorowano jednym albo więcej rutynowymi testami laboratoryjnymi, mierzącymi stężenia istotnych substancji we krwi i moczu, inne badania moczu, albo współczynniki oczyszczania różnych substancji z krwi do moczu. Podobnie funkcje regulowania poziomu cukru i stan przeszczepu allogenicznego lub ksenogenicznego wytwarzającego insulinę mogą być monitorowane przez rutynowe pomiary stężenia glukozy we krwi i moczu, metabolitów glukozy lub przez pomiar odpowiedzi insulinowej na prowokację glukozą, tj. konwencjonalny test tolerancji glukozy. Tak więc skuteczna ilość związku terapeutycznego, takiego jak czynnik blokujący CD154 jest dowolną ilością, która w mierzalny sposób zmniejsza zależność biorcy od leczenia zastępczego insuliną . Optymalna skuteczna ilość zasadniczo uwalnia biorcę od zależności od egzogennej insuliny. Konkretnie, skuteczną

PL 191 122 B1 ilością jest ilość, która wywołuje częściowe albo zasadniczo całkowite wszczepienie się (przyjęcie i dział anie) tkanki dawcy wytwarzają cej insulinę .

Dawkowanie i częstość leczenia

Ilość i częstość dawkowania każdego związku zastosowanego w rozwiązaniach według wynalazku pozostaje w zakresie wiedzy i osądu praktykujących lekarzy. Ogólne dawki i schemat podawania został ustalony przez badania przedkliniczne i kliniczne, obejmujące intensywne, lecz rutynowe badania określające optymalne parametry dawkowania związku. Nawet po ustaleniu takich rekomendacji, lekarze mogą często zmieniać te dawki dla różnych gospodarzy biorców, w oparciu o różne założenia, takie jak wiek osobnika, stan medyczny, ciężar, płeć i jednoczesne leczenie innymi związkami farmakologicznymi. Określenie skutecznego dawkowania i schematu podawania każdego przerywacza CD40:CD154 stosowanego do hamowania odrzucenia przeszczepu jest rutynowym postępowaniem dla specjalistów farmaceutów i lekarzy. Dawkowanie i częstość dawkowania powinna być odpowiednia do wytworzenia korzystnej klinicznie zmiany w jednym albo wielu wskaźnikach stanu zdrowia biorcy. Przykładowe schematy podawania i dawkowania są przedstawione poniżej w badaniach uzasadniających działanie. Zasadniczo, wynalazek obejmuje podawanie przerywacza wiązania CD40:CD154 (na przykładzie humanizowanego mAb 5c8, hu5c8) w schemacie wywołującym przyjęcie, a następnie, jeżeli to konieczne w schemacie podtrzymującym przyjęcie.

Aby zilustrować rozważania dotyczące dawkowania związku anty-CD40L, poniżej podano przykłady schematów podawania mAb przeciwko CD40L. Wielkości dawek można łatwo dopasować dla różnych typów związków przeciw CD40L. Ogólnie, rozważane są pojedyncze dawki pomiędzy około 0,05 i około 50 mg/kg ciężaru ciała pacjenta, najczęściej dawki w zakresie 1-20 mg/kg. W ostrym trybie leczenia, takim jak przed, albo w czasie transplantacji, albo w odpowiedzi na rozpoczynające się objawy odrzucania przeszczepu, skuteczna dawka przeciwciał waha się od około 1 mg/kg ciężaru ciała do około 20 mg/kg ciężaru ciała podawana codziennie przez okres około 1 do 5 dni, korzystnie w bolusie do podawania dożylnego. Takie samo dawkowanie i schemat dawkowania może być stosowany w fazie nasycania i w schemacie utrzymywania fazy nasycenia, z fazą utrzymywania nasycenia obejmującą podawanie dożylne i domięśniowe przeciwciał w zakresie od około 0,1 mg/kg ciężaru ciała do około 20 mg/kg ciężaru ciała, w którymkolwiek okresie leczenia w odstępach od tygodnia do 3 miesięcy. Przewlekłe leczenie można również prowadzić schematem utrzymywania fazy nasycenia, w którym przeciwciała są podawane droga doż ylną albo domięśniową w zakresie od około 0,1 mg/kg ciężaru ciała do około 20 mg/kg ciężaru ciała z odstępami między dawkowaniu wahającymi się od około tygodnia do około 3 miesięcy. Dodatkowo, na przewlekłe leczenie można wpływać schematem przerywanych dożylnych bolusów, w którym przeciwciała są podawane między około 1,0 mg/kg ciężaru ciała, a około 100 mg/kg ciężaru ciała, z odstępami między skutecznymi terapiami od 1 do 6 miesięcy. Dla wszystkich schematów, za wyjątkiem schematu przerywanych bolusów, podawanie może być również drogą doustną, dopłucną, donosową albo podskórną.

Jeżeli jest to pożądane skuteczność przeciwciał może być zwiększona przez podawanie okresowe, albo w kombinacji z tradycyjnymi czynnikami terapeutycznymi przeciwko odrzuceniu, albo lekami takimi jak, na przykład kortykosteroidy albo leki immunosupresyjne. Alternatywnie, przeciwciała mogą być sprzęgane z tradycyjnym czynnikiem. Korzystnie pozwalają one na podawania tradycyjnego czynnika w ilości mniejszej niż dawkowanie tradycyjne, na przykład, mniej niż około 50% tradycyjnego dawkowania, gdy czynnik jest podawany w monoterapii. Zgodnie z tym można uniknąć występowania wielu efektów ubocznych związanych z takim czynnikiem.

Terapie złożone do leczenia odrzucenia przeszczepu obejmują zastosowanie przeciwciał przeciw CD40L łącznie z czynnikami ukierunkowanymi na limfocyty B, takie jak przeciwciała przeciwko CDI9, CD28, albo CD20 (niesprzęgnięte albo znakowane pierwiastkami promieniotwórczymi), antagoniści IL-14, LJP394 (blokery receptorów, LaJolla Pharmaceuticals), IR-1116 (małe cząstki, Takeda) i idiotypowe przeciwciał a monoklonalne przeciwko Ig. Alternatywnie, kombinacje mog ą obejmować czynniki ukierunkowane na limfocyty T/B, takie jak CTLA4Ig, antagoniści IL-2, antagoniści IL-4, antagoniści IL-6, antagoniści receptorów, przeciwciała monoklonalne przeciwko CD80/CD86, TNF, antagoniści LFA 1/ICAM, antagoniści VLA4/VCAM, brekwinar i koniugaty toksyny IL-2 (np. DAB), prednizon, mAb przeciwko CD3 (OKT3), mykofenolanu mofetilu (MMF), cyklofosfamid i inne leki immunosupresyjne, takie jak blokery sygnałowe kalcyneuryny, obejmujące lecz nieograniczone do takrolimusa (FK506). Kombinacje mogą również obejmować czynniki ukierunkowane na limfocyty T, takie jak antagoniści CD4, antagoniści CD2 i IL-12.

PL 191 122 B1

W celu utrzymywania integracji przeszczepu, albo w okresie nastę pują cym po zahamowaniu ostrego epizodu odrzucania przeszczepu, jeśli jest to potrzebne podawana jest podtrzymująca dawka przeciwciał przeciwko CD40L, sama albo w kombinacji z tradycyjnym czynnikiem przeciwko odrzuceniu przeszczepu. Następnie, można zmniejszyć dawkowanie, albo częstość podawania, albo obydwa. Gdy nie ma objawów odrzucenia przeszczepu leczenie można przerwać z nieprzerwanym monitorowaniem objawów odrzucenia przeszczepu. W innych przypadkach, określanych przez lekarza, można podawać leczenie okresowe, na przykład w odstępach czterotygodniowych albo dłuższych. Biorcy mogą jednakże wymagać przerywanego leczenia w długim okresie czasu w razie nawrotu objawów choroby.

Przedkliniczne układy modelowe do oceny schematów leczenia przerywaczy CD40:CD154

Korzystnym, przykładowym układem modelowym do badania skuteczności związku przerywającego CD40:CD154 (np. związek przeciwko CD40L, takie jak mAb 5c8) jest model przeszczepu allogenicznego wysepek naczelnych (orangutan i/lub rezus) ujawniony w wcześniejszym, pokrewnym zgłoszeniu amerykańskim 60/050,267 (20/06/97) włączonym tu przez odniesienie. Wykazano wielokrotnie, że niniejszy model jest dokładnym testem manipulacji immunologicznej, który jest wyjątkowo wrażliwy na nawet niewielkie zmiany funkcji przeszczepu allogenicznego albo na objawy uboczne wpływające na gojenie ran u biorcy i funkcjonowanie układu odpornościowego. Dodatkowo, są oczywiste podobieństwa do przeszczepu nerki u ludzi. Szczególnie, geny kodujące białka MHC są dobrze zakonserwowane pomiędzy ludźmi a naczelnymi, wykorzystywanymi jako podstawa modeli i odrzucenie u naczelnych unaczynionych narządów jest analogiczne, co widać klinicznie.

Model ICT u orangutanów z cukrzycą wywołaną przez pankreatotomię

Identyfikacja par dawca-biorca. Jednojądrzaste komórki krwi obwodowej (PBMC) od 10 potencjalnych biorców (orangutany, Papio hamadryas, samce i samice, w wieku 1-2 lata, około 4 kg) z hodowli Mannheimer (Homestead, FL) zastosowano jako frakcja reagująca przeciwko PBMC od 11 dawców męskich (w wieku ponad 2 lata, zakupione w Southwest Foundation w Texas) w jednokierunkowej hodowli mieszanej leukocytów (MLC). MLC przeprowadzono standaryzowanym sposobem jak w ludzkiej MLC. W odniesieniu do niskiego tła i wysokiej aktywności właściwej, zastosowanie poż ywki z dodatkiem surowicy ludzkiej dało doskonałe efekty, w porównaniu z pożywką z surowicą orangutanów albo cielęcą płodową. Dawcy mieli odpowiednią wielkość do uzyskania wystarczającej liczby wysepek i szpiku od jednego dawcy dla dwóch biorców. W przeciwieństwie do umiarkowanych reakcji MLC obserwowanych gdy PBMC od zwierząt z Mannheimer zastosowano jako frakcja reagująca i pobudzają ca w MLC, reaktywność MLC pomię dzy tymi zwierzę tami był a doskonał a, przy czym wszyscy potencjalni biorcy wykazali wskaźnik pobudzenia (S.I.) rzędu > 10,0 wobec frakcji pobudzającej (dawcy, tło < 200-300 zliczeń/minutę). Podjęto próbę wybrania dwóch biorców o podobnej reaktywności MLC wobec wybranego dawcy i wybrano pary dawca-biorca o różnych stopniach alloreaktywnosci. S.I. MLC > 10 uznawano za wysoką reaktywność i wybrano jako minimalną dopuszczalną rozbieżność; dla porównania gdy zwierzęta z Mannheimer zastosowano jako biorców i dawców, S.I. MLC wynosił zwykle poniżej 5.

Izolowanie i podawanie wysepek/szpiku. Wysepki oddzielono od trzustek na dzień przed ICT (tj. dnia -1) stosując niewielkie zmiany automatycznej metody izolowania ludzkich wysepek (Ricordi i in., Diabetes 37;413-420, 1988; Selvaggi i in., Transplant. Pros. 29:1967-1968, 1997) stosując Liberase® (0,47 mg/ml), roztwór kolagenazy (z Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN). Czas niedokrwienia w warunkach niskiej temperatury wynosił średnio 0,5±0,1 godziny. Wysepki wzbogacono przez trzywarstwowy, nieciągły gradient Euroficoll (1,108, 1,096 i 1,037) w których trawioną tkankę trzustki umieszczono w warstwie 1,108. Rozdzielacz komórkowy (COBE 299 l, COBE, Lakewood, CO) stosowano do wirowania gradientu (Robertson, Chadwick, Contractor, James, London, Acta Diabetologica 30: 93-98, 1993). Liczbę, objętość i czystość otrzymanych wysepek oznaczono w następujący sposób: preparat końcowy wysepek zawieszono w 250 ml roztworu RPMI 1640, pobrano trzy porcje po 100 μΐ i barwiono ditiazonem (Latif i in., Transplantation 45:827-830, 1980), po czym liczono w celu określenia całkowitego uzysku wysepek, zaś dane przekształcono matematycznie w celu określenia całkowitej liczby wysepek o średniej średnicy wynoszącej 150 pm (równoważnik wysepki; IEQ) (Ricordi i in., Acta Diabetol. Lat. 27:185-195, 1990).

Do badań nad zwiększaniem tolerancji, od dawców trzustek pobrano trzon kręgowy i poddano obróbce w celu uzyskania komórek szpiku (DBMC) zasadniczo w oparciu o rutynowe modyfikacje metod przetwarzania ludzkich trzonów kręgowych. Biorcom podawano szpik dawców w dniach 5 i 11 po ICT. Podano dawkę całkowitą 10⁹ jądrzastych komórek na kg biorcy.

PL 191 122 B1

Unieruchomienie zwierząt.

W celu uś pienia podawano chlorowodorek ketaminy w mię sień łydki (10 mg/kg). Przedł u ż enie sedacji osiągnięto przez podawanie HC1 ketaminy i.m. w dawce 5 mg/kg. Dodatkową ketaminę podawano za każdym razem, gdy zwierzęta reagowały na bodziec uszczypnięcia w palec. Ponieważ w poprzednich badaniach wykazano, ż e ketamina zmniejsza pierwszą fazę reakcji na glukozę (FPIR), dawkę ketaminy utrzymywano na możliwie niskim poziomie we wszystkich testach metabolicznych (Lehmann i in., J. Med. Primatol. 26:312-321, 1997). Całkowita dawka ketaminy dla utrzymania satysfakcjonującej sedacji w okresie 30 minut wynosiła 35±2 mg/kg. Zwierzęta unieruchomiono fizycznie po uśpieniu ketaminą. Miejsca zabiegu operacyjnego i wkłucia do naczynia oczyszczono beta-dyną i alkoholem zmieniaj ą c waciki. Do ż y ł y wprowadzono cewnik i zabezpieczono.

Pankreatektomia i ICT. W dniu ICT (dzień 0) preparat wysepek odwirowano, i zawieszono osad w CMRL 1066, a nastę pnie hodowano przez noc w 22°C. Przed przeszczepieniem, preparat odwirowano i zawieszono osad w 20 ml RPMI 1640 z dodatkiem 2,5% surowicy dawców i 200 IU heparyny. Liczbę IEQ określono bezpośrednio przed przeszczepieniem. Całkowitą pankreatektomię przeprowadzono według ustalonych procedur chirurgicznych. Po zakończeniu pankreatektomii do jednej z odnóg trzewnych żyły wrotnej wprowadzono cewnik 20G i przeprowadzono ICT przez grawitacyjny wlew preparatu wysepek przez 10 minut.

Immunosupresja i opieka pooperacyjna. Jako środek immunosupresyjny wybrano tacrolimus (FK506), jako lek współcześnie stosowany u ludzki po ICT. Podawanie FK506 rozpoczęto w 5 dni po ICT. Orangutanom podawano FK506 w dawce 0,1 mg/kg/dzień i.m. Poziom leku śledzono codziennie i dostrajano dawkę w celu zachowania poziomu okoł o 15 ng/ml. Humanizowane anty-CD154 (pochodzące z mAb 5c8, Lederman i in., J. Exp. Med. 175:1091-1101, 1992) podawano i.v. w dniu -1, 3 i 10 dni w dawce 10 albo 20 mg/kg, i określano poziom 5c8 i anty-5c8 określono przez ELISA.

W pierwszym dniu po operacji (dzień 1 albo POD 1) orangutanom podano pł yny doż ylnie. Następnie zwierzęta karmiono dietą zawierającą 60 g węglowodanów dziennie, z 45 g małpich herbatników (z dodatkiem viokazy) i 15 g owoców. W oparciu o doświadczenie z 2 pierwszymi zwierzętami leczonymi przeciwciałem przeciwko-CD154 orangutany leczono niską dawką podskórnej insuliny (około 0,5 U/kg/dzień), przez okres 14-20 dni po przeszczepieniu w celu zapobieżenia „wyczerpania się” wysepek ułatwiając warunki i powodzenie wszczepienia.

Monitorowanie.

Glukozę we krwi na czczo i po jedzeniu (odpowiednio, FG i PPG) badano na urządzeniu Glucometer Elitę, co najmniej raz w tygodniu, próbkę krwi pobrano w celu uzyskania osocza do badania poziomów FG na analizatorze glukozy Beckmann. Ogólnie, próbkę krwi uzyskano również w celu potwierdzenia nieprawidłowo wysokich wyników. Próbki krwi pobrane od wszystkich zwierząt w badaniu CD154 przed każdą dawką mAb (przed dniem -1 i tuż przed podaniem przeciwciał w dniu 3 i 10) oraz co tydzień. W około 3 miesiące po przeszczepieniu, częstość badania zmniejszono do 1 na dwa tygodnie. Próbki krwi zastosowano do fenotypowania krwi obwodowej w celu określenia podtypów leukocytów i określenia CBC i badań chemicznych poziomów 5c8 i anty-5c8, insuliny i peptydu C insuliny oraz chimeryzmu. Krew pobierano okresowo w celu ponownego przeprowadzenia MLG z dawcą i antygenami postronnymi.

Testy.

Insulinę w osoczu badano metodą z podwójnym przeciwciałem (Linco Research, Inc., St. Charles, MO). Dolny limit wykrywania wynosił 20 pmol/l, zaś średni współczynnik wariancji wewnątrz testu wynosił 6%. Peptyd C badano w osoczu z dolnym limitem wykrywania 6% i współczynnikiem wariancji wewnątrz testu równym 6%. Glukozę w osoczu mierzono stosując analizator (Beckmann Instruments, Palo Alto, CA). Poziom glukozy we włośniczkowej krwi pełnej mierzono stosując Elitę Glucometer (Bayer, Elkhard, IN). Istotność testu na insulinę dla orangutanów wykazano przez równoległe badanie stężenia insuliny w rozcieńczonych surowicach z krzywą standardową insuliny. Glukagon mierzono stosują test z podwójnym przeciwciałem (DPC, Los Angeles, CA). Te dostępne na rynku testy potwierdzono uprzednio kolejnymi rozcienczeniami (Goodner i in., Diabetes 38:925-931, 1989).

Dożylny test tolerancji glukozy (IVGTT). Uprzednio wykazano, że testy aktywności wysepekkomórek in vivo dają dokładne wyniki odzwierciedlające zmiany w masie komórek (3. (McCulloch i in., Diabetes 40:673-679, 1991). Dożylny test tolerancji glukozy przeprowadzono po 16-18-godzinnym głodzeniu nocnym, jak to opisano uprzednio (Lehman i in., J. Med., Primatol. 26:312-321, 1997) Pokrótce, próbki krwi zebrano w -10, -5 i 0 minucie. Następnie podano 0,5 g glukozy/kg ciężaru ciała w postaci 50% roztworze glukozy przez 20 sekund do ż y ł y odpiszczelowej. Z przeciwległ ej tę tnicy

PL 191 122 B1 udowej pobrano 1,5 ml porcje w 1, 3, 5, 7, 10, 15, 20, 25, 30 minut po wstrzyknięciu. Tak więc całkowitą liczbę próbek zebraliśmy w ciągu 40 minut. Próbki pobrano do szklanych probówek zawierających 0,05 ml 15% płynnego EDTA i 0,2 ml trasylolu (500 KIU aprotyniny/ml), umieszczono na lodzie i odwirowano przez 10 minut. Osocze zamrożono w -80°C i badano w kierunku glukozy, insuliny reagującej immunologicznie i glukagonu.

Analiza statystyczna i obliczenia.

Wyniki podano jako średnią ± SEM. Krzywa zanikania glukozy (Kg) obliczona została z IYGTT jako nachylenie loge(ln) glukozy pomiędzy 10 i 30 minutą, po wstrzyknięciu glukozy, pomnożone przez 100. Ostrą reakcję insuliny na glukozę (AIRG) obliczono jako rosnące pole powierzchni pod krzywą insuliny (AUC) pomiędzy 1 i 10 minutą po wstrzyknięciu iv glukozy. Rosnąca reakcja (AUCGlukoza, AUCInsulina) obliczono przez zasadę trapezoidu z odjęciem wartości od I do 30 minut. Dane analizowano oprogramowaniem Statistica dla Windows (wersja 5.0, 1997, Statsoft, Inc., Tulsa, USA).

Wyniki

Terapia blokadą CD154 przedłuża przeżycie i działanie przeszczepów allogenicznych wysepek. Wszystkie orangutany stały się normoglikemiczne bezpośrednio po przeszczepieniu. Jak pokazano poniżej w tabeli 1, ICT wysepek allogenicznych pod nieobecność leku immunosupresyjnego albo blokady 154 prowadziło do odrzucenie po 8 dniach. Konwencjonalna immunosupresja FK506 (sama albo w kombinacji ze szpikiem albo komórkami macierzystymi wybranymi ze szpiku) nie polepszał a przeżycia przeszczepów, przy czym zwierzęta odrzucały w dniach, odpowiednio, 10, 8 i 10. Z uderzającym kontrastem, leczenie 4 spośród 5 orangutanów mAb przeciwko CD154 (5c8) spowodowało wydłużone przeżycie przeszczepów, znacznie ponad zwierzęta kontrolne i leczone FK506. Wyniki tego badania podano w postaci wykresu na fig. 1, gdzie znajduje się wykres glukozy we krwi na czczo (FG) jako funkcja POD. Niniejsze wyniki pokazują, że terapia blokująca CD154 przedłuża przeżycie przeszczepu allogenicznego wysepek na modelu cukrzycy wywołanej pan-kreatektomią u naczelnych niebędących ludźmi. Co istotne, wyniki te pokazują zdolność leczenia anty-CD154 do odwracania ostrego odrzucania.

Terapię blokującą CD154 można zastosować w połączeniu z przeniesieniem komórek szpiku.

Trzy orangutany dostały opóźnioną infuzję pełnego szpiku (n=2) albo komórek macierzystych szpiku (wyselekcjonowanych na kolumnie Ceprate®, Celi Pro, Bothel USA) (n=1) w POD 5 i 11. Tym orangutanom dano terapię indukującą 5c8 (20 mg/kg, dni -1, 3 i 10), a następnie umieszczono na miesięcznej terapii podtrzymującej, począwszy od POD28. Jedno ze zwierząt czuło się doskonale, nie odrzucając przeszczepu przed POD241. Drugie zwierzę odrzuciło przeszczep w POD112, i było leczone i utrzymało przeszczep do POD162. Trzecie zwierzę leczono przeciw odrzutowi w dniu 70 i utrzymało przeszczep do POD124. Wpływ terapii blokowaniem CD154 na działanie przeszczepu i kontrola metabolizmu glukozy. Kolejne IYGTT u zwierzą t kontrolnych wykazał o doskonałą powtarzalność wydzielania insuliny w pierwszej fazie (FPIS). W szczególności jeden test tolerancji glukozy (IPGTT) i immunohistochemię przeprowadzono na zwierzęciu zabitym w dniu 79, wykazującym funkcjonowanie przeszczepu tkankowego w wątrobie, bez resztkowej produkcji insuliny z miejsc poza wątrobą. Inne zwierzęta w badaniu wykazywały funkcjonujące przeszczepy wysepek, utrzymując je od > 125 do > 220 dni. Kolejne IYGTT 4 do 16 tygodni po pankreato-tomii i przeszczepieniu wysepek wykazywały niemal identyczne wartości Kg co wszystkie zwierzęta, przez ponad 8 tygodni po przeszczepieniu. Wartości Kg zmniejszały się po leczeniu orangutanów hu5c8 w momencie odrzucania. Stabilne wartości obserwowano u orangutanów leczonych hu5c8 w celu utrzymania. Ciężar wysepek, jak oceniono przez FPIS, zmniejszył się z każdym epizodem w czasie. W przeciwieństwie, FPIS (16tygodniowy „follow-up”) po przeszczepieniu dla zwierząt na leczeniu podtrzymującym hu5c8 był dobrze zachowany. Badano również dwa zwierzęta kontrolne. W niektórych IVGTT, problemy techniczne zmusiły do podania większej ilości ketaminy niż w poprzednim badaniu, co spowodowało zmniejszenie wartości Kg i FPIR. Jednakże, podczas „follow-up” standardową dawką ketaminy, wskaźniki te powróciły do normy.

Podczas trwania niniejszego badania ujawniono, że można stwierdzić odrzucenie przeszczepu przed podwyższeniem się FG przez oznaczenie 2-godzinnego PPG. Historycznie, odrzucenie wysepek trzustkowych określano jako dwa kolejne FG wyższe niż 250 mg/dl. Jednakże ujawniono, że dwa kolejne 2 godzinne PPG wyższe niż 150 mg/dl zapewniają czuły wskaźnik wczesnego stadium odrzucania przeszczepu. Zastosowanie leczenia przeciwnego odrzutowi, blokerem CD154 albo konwencjonalnym lekiem przeciwko odrzucaniu, można zastosować odpowiednio wcześnie w procesie odrzucania, co umożliwia uratowanie tkanki aktywnej metabolicznie. W celu ratowania przeszczepu przez hu5c8 stosuje się ten sam schemat dawkowania co zastosowany w indukcji przyjęcia przeszczepu.

PL 191 122 B1

Wnioski z badania na orangutanach. Powyższe badanie pokazuje, że hu5c8 ułatwia wszczepianie wysepek, umożliwia długotrwałe przeżycie allogenicznych wysepek oraz nie wywiera niepożądanych efektów na wydzielanie insuliny albo całkowitą wrażliwość na insulinę. Ponadto, badania te po raz pierwszy ustaliły, że odwrócenie epizodu odrzucania przeszczepu można osiągnąć u dużego zwierzęcia przez blokowanie CD154. Opisane tu leczenie może u dużych zwierząt spowodować zachowanie wydzielania insuliny i całkowitą wrażliwość na insulinę na poziomie przed ICT.

T a b e l a 1.

Przedłużenie przeżycia przeszczepów allogenicznych u dużych zwierząt, przy użyciu przeciwciała anty-CD154

Grupa	N	Gatunek	Czas trwania (POD) niezależności od insuliny
Kontrola	1	Orangutan	8
FK506	3	Orangutan	8, 10, 10
Anty-CD154 indukcja + przeciwko odrzuceniu	5	Orangutan	^a8, ^b59,^c229,^d264,^e284
Anty-CD154 indukcja + utrzymywanie	2	Orangutan	^f113,g238
Anty-CD154 indukcja + utrzymywanie	4	^hRezus	¹16, >80, >94, >166

a) zmniejszona dawka 5c8

b) zwierzę 34R: zabite POD79 z częściową funkcją, epizod odrzucenia POD58, który z powodzeniem odwrócono

c) zwierzę 12R: zabite POD302 z częściową funkcją, 6 epizodów odrzucenia, od POD59

d) zwierzę 29R: zabite POD300, w pełni odrzut, epizod odrzucenia

e) zwierzę 14R; zabite POD301 z częściową funkcją, 4 epizody odrzucenia, od POD31

f) zabite POD130, pełny odrzut

g) zabite POD253, częściowa funkcja

h) dyskutowane niżej

i) padło POD16 niezależne od insuliny, z częściową niedrożnością jelit Model ICT po cukrzycy wywołanej pankreatektomią u rezusów.

O ile nie zaznaczono inaczej, wszystkie procedury wygl ą dał y zasadniczo podobnie do opisanych wyżej dla orangutanów.

Procedury ze zwierzętami. Rezusy SPF, w wieku 2-7 lat, otrzymano z COYANCE (Alice, TX) albo Mannheimer Foundation, Inc. (Homestead, FL) albo podobnych dostawców. Po przybyciu, wszystkie małpy badano w celu określenia ich stanu zdrowia, kondycji psychicznej i fizycznej. Wszystkie procedury chirurgiczne przeprowadzono w warunkach aseptycznych. Zwierzęta głodzono 12-18 godzin przed zabiegiem, a następnie wstępnie znieczulano i.m. ketaminą (10 mg/kg) i atropiną (0,04 mg/kg). Po uśpieniu zwierząt założono im rurkę do tchawicy i cewnik i.v. Rurkę do tchawicy zastosowano w celu ochrony dróg oddechowych i ułatwienia dostępu dla leków. Zwierzęta znieczulono mieszaniną izofluranu i tlenu. Normalny roztwór soli podawano we wlewie przez cewnik przez całą procedurę ICT z szybkością 10 ml/kg/godz.

Przeprowadzono cięcie pośrodkowe w celu uzyskania dostępu do narządów jamy brzusznej. U zwierząt dawców i biorców przeprowadzono całkowitą pankreatektomię z zachowaniem dwunastnicy. Wysepki izolowano z trzustek dawców sposobami konwencjonalnymi do przeszczepienia diabetycznym małpom po pankreatektomii. Po skrwawieniu w znieczuleniu od dawców pobrano trzony kręgów przez nacięcie brzucha z użyciem piły Striker. Kości natychmiast poddano obróbce w celu pobrania szpiku. U niektórych biorców komórki szpiku podano przez żyłę głowową stosując zestaw do przetoczeń typu Y z filtrem.

Po przeprowadzeniu pankreatektomii u biorców, nakłuto odnogi dolnej albo górnej żyły trzewnej i przetoczono wysepki stosując grawitacyjne przetoczenie do wątroby. Na zakończenie procedury, zwierzęta umieszczano na samym tlenie i usuwano rurkę tchawiczą gdy zwierzęta odzyskiwały kontrolę nad drogami oddechowymi. Po ICT, biorców umieszczano w klatce ICU i obserwowano dopóki nie odzyskali stabilności klinicznej. Podawano antybiotyk (Baytril, 5 mg/kg/dobę i.m. przez 5 dni). Jako środek przeciwbólowy stosowano w razie potrzeby Bupomorfinę (0,05 mg/kg).

PL 191 122 B1

Małpy głodzono przed zabiegiem, zaś w POD1 podano in Ga-torade p.o. W POD2 podawano im dwa razy dziennie delikatną dietę, obejmującą banan i zmiękczone (wodą) wysokobiałkowe pożywienie dla małp zawierające viokazę (1 banan i 4 biszkopty). Normalną dietę przywrócono w POD3 (6-8 biszkoptów z viokazą, dwa razy dziennie). Każde ze zwierząt żywiono indywidualnie, w celu uniknięcia współzawodnictwa podczas żywienia. Chore małpy żywiono z ręki w celu poprawienia stanu zdrowia. Małpy w stanie terminalnym albo nieuleczalnym zabijano przez szybkie podanie i.v. chlorku potasu przez cewnik.

Monitorowanie.

Próbki krwi do określania glukozy i insuliny, oraz do śledzenia odporności itp. nie przekraczały 1% ciężaru ciała w żadnym momencie albo 7% w okresie miesiąca. Glukozę we krwi na czczo (FG) określano zastosowanie lancetu do nakłucia pięty w celu uzyskania niewielkiej kropli krwi do umieszczenia na pasku glukometru. W pewnych sytuacjach, np. gdy glukoza okazywała się być wysoka (> 200 mg/dl) przeprowadzano nakłucie żyły w celu uzyskania próbki osocza do analizy na urządzeniu Beckman do analizy glukozy. Próbki krwi otrzymano również przed i w odstępach czasu po przeszczepieniu w celu oceny reaktywności dawca-biorca. Badanie dożylnej tolerancji glukozy (IVGTT) przeprowadza się jak to opisano wyżej, przed przeszczepem i w 4-6 tygodni po.

Wyniki

Blokowanie CD154 przedłuża przeżycie i funkcjonowanie przeszczepów allogenicznych u diabetycznych małp rezus, jak również u orangutanów. Jak pokazano w tabeli 1, obecne badanie pokazało, że monoterapia hu5c8 przedłuża przyjęcie przeszczepów allogenicznych wysepek u drugiego gatunku naczelnych, niebędących ludźmi. Badanie to wykorzystywało schemat wywołania przyjęcia po podaniu hu5c8 w dniach -1, 0, 3 i 10. Badano również comiesięczny schemat podtrzymujący przyjęcie, w celu utrzymania poziomów surowiczych hu5c8. Wyniki podane również na figurze 2 pokazują jasno: funkcjonalne przeszczepy allogeniczne wysepek trzustkowych są zachowane bez wystąpienia epizodów odrzucenia. Istotność tego ujawnienia podkreślona jest porównywalnym zestawem danych przedstawionym na figurze 3, który w dodatku do badań nad rezusami pokazuje wykres FG człowieka (oznakowany LAURA) dotkniętego DM i jednocześnie otrzymującego intensywne leczenie zastępcze insuliną. Laura była zdiagnozowana z DM w wieku 14 miesięcy, a w momencie badania była w wieku sześciu lat i otrzymywała wstrzyknięcia insuliny 2-3 razy dziennie.

Ekwiwalenty

Wynalazek można zrealizować w innej konkretnej postaci bez oddalania się od ducha i jego zasadniczej charakterystyki. Powyższe wykonania są uważane za ilustrujące, nie zaś ograniczające ujawniony wynalazek. Zakres wynalazku określony jest więc przez dołączone zastrzeżenia, nie zaś przez powyższy opis, zaś wszystkie zmiany wchodzą w zakres i rozumienie zamienności zawartych tu zastrzeżeń.

Claims

1. Zastosowanie przerywacza wiązania CD40:CD154 do wytwarzania leku do hamowania odrzucania przeszczepu tkanki wytwarzającej insulinę przez biorcę przeszczepu będącego naczelnym, przy czym lek jest przeznaczony do podawania biorcy przeszczepu w ilości dostarczającej skuteczną ilość przerywacza wiązania CD40:CD154.

2. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że przerywacz wiązania CD40:CD154 jest:

(a) czynnikiem blokującym CD154(CD40L); lub (b) przeciwciałem monoklonalnym; lub (c) przeciwciałem monoklonalnym o charakterystyce wiązania swoistego antygenu jak przeciwciało 5c8 wytwarzane przez ATCC HB 10916.

3. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że tkanką wytwarzającą insulinę jest:

(a) tkanka całej trzustki; lub (b) izolowane wysepki trzustkowe; lub (c) populacja komórek obejmująca izolowane komórki β dorosłych wysepek; lub (d) populacja komórek obejmująca izolowane komórki β płodowych wysepek; lub (e) populacja komórek obejmująca hodowane komórki β wysepek; lub (f) populacja komórek obejmująca unieśmiertelnione komórki β wysepek; lub (g) populacja komórek obejmująca komórki gospodarza stabilnie wyrażające gen insuliny; lub

PL 191 122 B1 (h) populacja komórek obejmująca komórki gospodarza indukowalnie wyrażająca gen insuliny.

4. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że tkanka wytwarzająca insulinę jest fizycznie oddzielona od tkanek biorcy przez urządzenie immunoizolujące.

5. Zastosowanie według zastrz. 4, znamienne tym, że urządzenie immunoizolujące:

6. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że tkanka wytwarzająca insulinę jest allogeniczna albo ksenogeniczna względem biorcy przeszczepu.

7. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że biorcą przeszczepu jest człowiek.

8. Zastosowanie według zastrz. 7, znamienne tym, że biorca przeszczepu jest dotknięty zaburzeniem kontroli metabolicznej metabolizmu glukozy.

9. Zastosowanie według zastrz. 8, znamienne tym, że biorca przeszczepu jest dotknięty cukrzycą.

10. Zastosowanie przerywacza wiązania CD40:CD154 do wytwarzania leku do przedłużania przeżycia przeszczepionej tkanki wytwarzającej insulinę u biorcy przeszczepu będącego naczelnym, przy czym lek jest przeznaczony do podawania biorcy przeszczepu w ilości dostarczającej skuteczną ilość przerywacza wiązania CD40:CD154.

11. Zastosowanie według zastrz. 10, znamienne tym, że przerywacz wiązania CD40:CD154 jest:

12. Zastosowanie według zastrz. 10, znamienne tym, że tkanką wytwarzającą insulinę jest:

13. Zastosowanie według zastrz. 10, znamienne tym, że tkanka wytwarzająca insulinę jest fizycznie oddzielona od tkanek biorcy przez urządzenie immunoizolujące.

14. Zastosowanie według zastrz. 13, znamienne tym, że urządzenie immunoizolujące:

15. Zastosowanie według zastrz, 10, znamienne tym, że tkanka wytwarzająca insulinę jest allogeniczna albo ksenogeniczna względem biorcy przeszczepu.

16. Zastosowanie według zastrz. 10, znamienne tym, że biorcą przeszczepu jest człowiek.

17. Zastosowanie według zastrz. 16, znamienne tym, że biorca przeszczepu jest dotknięty zaburzeniem kontroli metabolicznej metabolizmu glukozy.

18. Zastosowanie według zastrz. 17, znamienne tym, że biorca przeszczepu jest dotknięty cukrzycą.

19. Zastosowanie przerywacza wiązania CD40:CD154 do wytwarzania leku do odwracania odrzucania przeszczepionej tkanki wytwarzającej insulinę przez biorcę przeszczepu będącego naczelnym, przy czym lek jest przeznaczony do podawania biorcy przeszczepu w ilości dostarczającej skuteczną ilość przerywacza wiązania CD40:CD154.

20. Zastosowanie według zastrz. 19, znamienne tym, że przerywacz wiązania CD40:CD154 jest:

21. Zastosowanie według zastrz. 19, znamienne tym, że tkanką wytwarzającą insulinę jest:

(a) tkanka całej trzustki; lub

PL 191 122 B1 (b) izolowane wysepki trzustkowe; lub (c) populacja komórek obejmująca izolowane komórki β dorosłych wysepek; lub (d) populacja komórek obejmująca izolowane komórki β płodowych wysepek; lub (e) populacja komórek obejmująca hodowane komórki β wysepek; lub (f) populacja komórek obejmująca unieśmiertelnione komórki β wysepek; lub (g) populacja komórek obejmująca komórki gospodarza stabilnie wyrażające gen insuliny; lub (h) populacja komórek obejmująca komórki gospodarza indukowalnie wyrażająca gen insuliny.

22. Zastosowanie według zastrz. 19, znamienne tym, że tkanka wytwarzająca insulinę jest fizycznie oddzielona od tkanek biorcy przez urządzenie immunoizolujące.

23. Zastosowanie według zastrz. 22, znamienne tym, że urządzenie immunoizolujące:

24. Zastosowanie według zastrz. 19, znamienne tym, że tkanka wytwarzająca insulinę jest allogeniczna albo ksenogeniczna względem biorcy przeszczepu.

25. Zastosowanie według zastrz. 19, znamienne tym, że biorcą przeszczepu jest człowiek.

26. Zastosowanie według zastrz. 25, znamienne tym, że biorca przeszczepu jest dotknięty zaburzeniem kontroli metabolicznej metabolizmu glukozy.

27. Zastosowanie według zastrz. 26, znamienne tym, że biorca przeszczepu jest dotknięty cukrzycą.

28. Zastosowanie przerywacza wiązania CD40:CD154 do wytwarzania leku do zachowywania funkcji przeszczepionej tkanki wytwarzającej insulinę u biorcy przeszczepu będącego naczelnym, przy czym lek jest przeznaczony do podawania biorcy przeszczepu w ilości dostarczającej skuteczną ilość przerywacza wiązania CD40:CD154.

29. Zastosowanie według zastrz. 28, znamienne tym, że przerywacz wiązania CD40:CD154 jest:

30. Zastosowanie według zastrz. 28, znamienne tym, że tkanką wytwarzającą insulinę jest:

31. Zastosowanie według zastrz, 28, znamienne tym, że tkanka wytwarzająca insulinę jest fizycznie oddzielona od tkanek biorcy przez urządzenie immunoizolujące.

32. Zastosowanie według zastrz. 31, znamienne tym, że urządzenie immunoizolujące:

33. Zastosowanie według zastrz. 28, znamienne tym, że tkanka wytwarzająca insulinę jest allogeniczna albo ksenogeniczna względem biorcy przeszczepu.

34. Zastosowanie według zastrz. 28, znamienne tym, że biorcą przeszczepu jest człowiek.

35. Zastosowanie według zastrz. 34, znamienne tym, że biorca przeszczepu jest dotknięty zaburzeniem kontroli metabolicznej metabolizmu glukozy.

36. Zastosowanie według zastrz. 35, znamienne tym, że biorca przeszczepu jest dotknięty cukrzycą.

37. Zastosowanie przerywacza wiązania CD40:CD154 do wytwarzania leku do przywracania funkcji zaburzonej, przeszczepionej tkanki wytwarzającej insulinę u biorcy przeszczepu będącego naczelnym, przy czym lek jest przeznaczony do podawania biorcy przeszczepu w ilości dostarczającej skuteczną ilość przerywacza wiązania CD40:CD154.

PL 191 122 B1

38. Zastosowanie według zastrz. 37, znamienne tym, że przerywacz wiązania CD40:CD154 jest:

39. Zastosowanie według zastrz. 37, znamienne tym, że tkanką wytwarzającą insulinę jest:

40. Zastosowanie według zastrz. 37, znamienne tym, że tkanka wytwarzająca insulinę jest fizycznie oddzielona od tkanek biorcy przez urządzenie immunoizolujące.

41. Zastosowanie według zastrz. 40, znamienne tym, że urządzenie immunoizolujące:

42. Zastosowanie według zastrz. 37, znamienne tym, że tkanka wytwarzająca insulinę jest allogeniczna albo ksenogeniczna względem biorcy przeszczepu.

43. Zastosowanie według zastrz. 37, znamienne tym, że biorcą przeszczepu jest człowiek.

44. Zastosowanie według zastrz. 43, znamienne tym, że biorca przeszczepu jest dotknięty zaburzeniem kontroli metabolicznej metabolizmu glukozy.

45. Zastosowanie według zastrz. 44, znamienne tym, że biorca przeszczepu jest dotknięty cukrzycą.

46. Zastosowanie przerywacza wiązania CD40:CD154 do wytwarzania leku do przywracania kontroli metabolicznej metabolizmu glukozy u wymagającego tego naczelnego, przy czym lek jest przeznaczony do podawania naczelnemu, u którego wszczepia się skuteczną ilość tkanki wytwarzającej insulinę, w ilości dostarczającej skuteczną ilość przerywacza wiązania CD40:CD154.

47. Zastosowanie według zastrz. 46, znamienne tym, że przerywaczem wiązania CD40:CD154 jest przeciwciało monoklonalne o charakterystyce wiązania swoistego antygenu jak przeciwciało 5c8 wytwarzane przez ATCC HB 10916.

48. Zastosowanie według zastrz. 47, znamienne tym, że lek jest przeznaczony do podawania przed przeszczepieniem tkanki.

49. Zastosowanie według zastrz. 47, znamienne tym, że lek jest przeznaczony do wielokrotnego podawania, przynajmniej dwukrotnie w ciągu dwutygodniowego okresu po wszczepieniu tkanki.

50. Zastosowanie według zastrz. 49, znamienne tym, że lek jest przeznaczony do wielokrotnego podawania przynajmniej w miesiąc po wszczepieniu tkanki.

51. Zastosowanie według zastrz. 50, znamienne tym, że lek jest przeznaczony do wielokrotnego podawania raz w miesiącu, począwszy przynajmniej dwa miesiące po wszczepieniu tkanki.

52. Zastosowanie według zastrz. 46, znamienne tym, że lek jest przeznaczony do podawania gdy ssakowi wszczepia się również skuteczną ilość czynnika toleryzującego.

53. Zastosowanie według zastrz. 52, znamienne tym, że czynnikiem toleryzującym jest tkanka szpiku, która jest zgodna pod względem MHC z tkanką wytwarzającą insulinę.

54. Zastosowanie według zastrz. 53, znamienne tym, że czynnikiem toleryzującym jest:

(a) tkanka szpiku, która jest syngeniczna z tkanką wytwarzającą insulinę; albo (b) pełny szpik; albo (c) populacja komórek krwiotwórczych CD34(+); albo (d) populacja komórek krwiotwórczych CD34(+), które są CD40 (-).