KR100337078B1 - 항-gp39항체및이것의사용방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 단백질 gp39 (또한 CD40 리간드로 언급된)를 결합시키는 항체에 관한 것이다. 바람직하게, 상기 항체는 IgG1 이성체의 단클론성 항체이고, 사람 GP39를 결합시킨다. 바람직한 구체예에서, 본 발명의 항체는, 하이브리도마 24-31 (ATCC Accession Number _)에 의해 생성되는 단클론성 항체 24-31에 의해 인식되는 에피토프를 결합시키거나, 또는 하이브리도마 89-76 (ATCC Accession Number _)에 의해 생성되는 단클론성 항체 89-76에 의해 인식되는 에피토프를 결합시킨다. 본 발명은, 또한 본 발명의 항체로 이루어진 약제학적 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 항체는 B 세포 증식 및 분화, T 세포 반응을 저해하는데 유용하고, 1 세포 내성을 유도하는데 유용하다. 항-gp39 항체 또는 이것의 일부를 코오드화 하는 핵산 분자 및 상기 핵산 분자를 혼입하는 발현벡터 및 숙주 세포가 또한 본 발명에 의해 포함된다.
Description
[발명의 배경]
항원-특이적 T 세포 활성화 및 클론 확장(clonal expansion)을 유도하기 위해서는, 항원 제공 세포(APC)에 의해 제공되는 2개의 신호가 휴지 T 림프구의 표면으로 전달되어야 한다 [참고문헌 : Jenkins, M. and Schwartz, R. (1987) J. Exp. Med. 165, 302-319 ; Mueller, D.L., et al, (1990) J. Immunol, 144, 3701-3709 ; Williams, 1.R. and Unanue, E.R, (1990) J. Immunol. 145, 85-93]. 면역 반응에 특이성을 부여하는 첫 번째 신호는, 주요 조직전합성 복합체(MHC)와 관련하여 제공되는 외래 항원성 펩티드의 인식 후에 T 세포 수용체(TCR)를 통해 매개된다. 동시자극(co-stimulation)으로 일컬어지는 두 번째 신호는 T 세포가 증식되고 기능성이 되도록 유도한다. [Schwartz, R. H. (1990) Science 248, 1349-1356]. 동시자극은 항원-특이적이지도 않고, MHC 제한적이지도 않으며, APC에 의해 발현되는 하나 이상의 별개의 세포 표면 분자에 의해 제공되는 것으로 여겨진다 [참고문헌 : Jenkins, M.K., et al. (1988) J. Immunol. 140, 3324-3330 ; Linsley, P.S., et al. (1991) J,.Exp. Med. 173, 721-730 ; Gimmi, C.D., et at., (1991) Proc. Natl, Acad. Sci, USA, 88, 6575-6579 ; Young, J.W., et al. (1992) J. Clin. lnvest. 90, 229-237 ; Koulova, L., et al (1991) J. Exp. Med, 173, 721-762 ; Reiser, H., et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89, 271-275 ; van-Seventer, G.A., et al. (1990) J. Immunol 144, 4579-4586 ; Lasalle, J.M., et al., (1991) J. Immunol. 147, 774-80 ; Dustin, M.1., et al., (1989) J. Exp, Med. 169, 503 ; Armitage, R.J., et al. (1992) Nature 357, 80-82 ; Liu, Y., et al. (1992) J. Exp. Med. 175, 437-445]. T 세포 활성화에 관여하는 하나의 동시자극 경로는 T 세포의 표면 상에 있는 분자 CD28을 포함한다. 이러한 분자는 B 세포 또는 그외의 APC 상의 리간드에 의해 전달되는 동시 자극 신호를 수신할 수 있다. CD28에 대한 리간드는 B7-1 및/또는 B7-2와 같은 B 림프구 활성화 항원의 B7 부류의 멤버를 포함한다 [참고문헌 : Freedman. A.S. et al. (1987) J. Immunol. 137, 3260-3267 ; Freeman, G.J. et al. (1989) J. Immunol. 143, 2714-2722 : Freeman, G.J. et al. (1991) J. Exp. Med. 174, 625-631 ; Freeman, G.J. et al, (1993) Science 262, 909-911 ; Azuma, M. et al. (1993) Nature 366, 76-79 ; Freeman, G.J. et al. (1993) J. Exp, Med 178, 2185-2192]. 또한, B7-1 및 B7-2는 활성화된 T 세포의 표면에 존재하는 또 다른 분자, 즉, CTLA4에 대한 리간드이지만, 동시자극에서의 CTLA4의 역할은 불분명하다.
동시자극 신호와 함께 항원-특이적 신호가 T 세포에 전달되면, T 세포 증식 및 사이토킨 분비 둘 모두를 포함할 수 있는 T 세포 활성화가 유도 된다. 대조적으로, 동시자극 신호 없이 항원-특이적 신호가 T 세포에 전달되면, T 세포의 불응답 또는 아네르기 상태가 유도되어, 1 세포의 항원-특이적 내성을 유도하는 것으로 여겨진다.
T 세포와 B 세포의 상호작용은 면역 반응에서 중추 역할을 한다. 흉선-의존성 항원에 대한 체액 면역의 유도는 T 헬퍼(이후 Th로 표기) 세포에 의해 제공되는 "헬프(help)"를 필요로 한다. B 림프구에 제공되는 일부 헬프는 Th 세포에 의해 방출되는 가용성 분자(예를 들어 IL-4 및 IL-5와 같은 림 포카인)에 의해 매개되는 반면에, B 세포의 활성화는 또한 B 세포와 Th 세포 사이의 접촉 의존성 상호작용을 필요로 한다 [참고문헌 : Hirohata et al., J. Immunol., 140:3736-3744 (1988) ; Bartlett et al., J. Immunol., 143:1745-1754 (1989)], 이는 B 세포 활성화가 B 세포 및 Th 세포 상의 세포 표면 분자들 사이의 필수적 상호작용을 수반함을 나타내준다. 따라서, T 세포 상의 분자(들)는 T 세포의 접촉 의존성 헬퍼 이펙터 기능을 매개한다. B 세포와 T 세포 상의 분자들 사이의 접촉 의존성 상호작용은 활성화된-T 세포의 단리된 원형질막이 B 세포 활성화에 필요한 헬퍼 기능을 제공할 수 있다는 관찰에 의해 추가로 지지된다 [Brian, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:564-568 (1998); Hodgkin at al., J. Immunol., 145:2025-2034 (1990);Noelle et al., J. Immunol,, 146:1118-1124 (1991)].
항체에 의해 가교되는 경우에 B 세포 증식을 유도시키는 분자 CD40은 미숙 및 성숙 B 림프구의 표면 상에서 확인되었다. [Valle et al., Eur, J. Immunol., 19:1463-1467 (1989); Cordon at al., J. Immunol., 140:1425-1430(1988); Gruber et al., J. Immunol., 142:4144-4152 (1989)]. CD40은 분자적으로 클로닝되고 특징화되었다. [Stamenkovic et al., EMBO J., 8:1403-1410(1959)], CD40의 리간드인 gp39(또한 CD40 리간드 또는 CD40L로 명명됨)가 또한 클로닝되고 특징화되었다. [Armitage et al., Nature, 357:80-82(1992); Lederman et al., J. Exp. Med.,175:1091-1101 (1992); Hollenbaugh et al., EMBO J., 11:4313-4319 (1992)], gp39 단백질은 활성화되었지만 휴지 상태는 아닌 CD4+Th 세포 상에서 발현된다.[Spriggs et al., J. Exp. Med., 176:1543-l550 (1992); Lane et al., Eur. J. Immunol., 22:2573-2578(1992); Roy et al., J. Immunol., 151:1-14 (1993)]. gp39 유전자로 트랜스펙션되어, 표면 상에서 gp39 단백질을 발현시키는 세포는 B 세포 증식을 일으킬 수 있으며, 그 밖의 자극 신호와 함께 항체 생성을 유도할 수 있다. [Armitage : et al., Nature, 357:80-82 (1992); Hollenbaugh et al., EMBO J.,11:4313-43l9 (1992)].
[발명의 개요]
T 세포의 접촉 의존성 헬퍼 이펙터 기능을 매개하는 세포 표면 분자 가 T 세포 헬프를 필요로 하는 면역 반응을 유도하는 데에 있어서 중요하다. 예를 들어, T 세포 상의 gp39와 B 세포 상의 CD40의 상호작용은 항원에 대한 B 세포 반응을 활성화시키는 데에 중추적인 역할을 한다. 본 발명은, 최소한 부덕적으로, 접촉 의존성 헬퍼 이펙터 기능을 매개하는 세포 표면 분자가 또한 항원에 대한 T 세포의 반응에서 중요한 역할을 한다는 발견을 기초로 한다. 특히, 적당한 조건하에서 T 세포 상의 gp39와 T 세포에 항원을 제공하는 세포 상의 리간드 사이의 상호작용을 간섭하는 것이 항원-특이적 T 세포 내성을 유도할 수 있는 것으로 발견되었다. 따라서, 1 세포에 항원을 제공하는 세포는, T 세포의 활성화에 필요한 신호를 제공할 수 있게 해주는 이 세포 상의 gp39 리간드(예를 들어, CD40)와 T 세포 상의 gp39 사이의 상호작용을 필요로 한다. gp39 리간드와 gp39 사이의 상호작용의 억제는 T 세포 활성화를 방해하고 항원-특이적 T 세포 내성을 유도한다.
본 발명의 방법은 항원-특이적 T 세포 내성의 유도에 관한 것이다. 이 방법은 T 세포를, 1) T 세포에 항원을 제공하고 접촉-의존성 헬퍼 이펙터 기능을 매개하는 T 세포의 표면 상의 수용체와 상호작용하는 리간드를 표면에 갖는 세포, 및 2) 접촉-의존성 헬퍼 이펙터 기능을 매개하는 T 세포의 표면 상의 수용체의 길항물질과 접촉시키는 것을 포함한다. 길항물질은 수용체와 이의 리간드와의 상호작용을 억제시킨다. T 세포는 생체외에서 항원을 제공하는 세포 및 길항물질과 접촉하거나, 대안적으로, 세포 및 길항물질은 피검체에게 투여되어 생체내에서 T 세포 내성을 유도할 수 있다.
바람직한 구체예에서, 접촉-의존성 헬퍼 이펙터 기능을 매개하는 T 세포의 표면 상의 수용체는 gp39이다. 이 구체예에서, 길항물질은 gp39와 T 세포에 항원을 제공하는 세포 상의 이의 리간드의 상호작용을 억제하는 분자이다. 특히 바람직한 gp39 길항물질은 항-gP39 항체이다. 대안적으로, gp39 길항물질은 gp39 리간드의 가용성 형태, 예를 들어 가용성 CD40이다. T 세포에 항원을 제공하는 세포는 바람직하게는 B 세포이다. 상기 B 세포 는 작은 휴지 B 세포일 수 있다. 가용성 항원에 대한 T 세포 내성을 유도 하기 위해, B 세포는 T 세포와 접촉하기 전에 (예를 들어, 피검체에 투여되기 전에) 항원과 접촉할 수 있다. 또 다른 구체예에서, 동종항원에 대한 T 세포 내성을 유도하기 위해, 1 세포에 항원을 제공하는 데에 사용되는 세포는 동종 세포이다. 동종 세포는, 예를 들어 동종 B 세포, 동종 골수, 동종 비장 세포, 또는 말초 혈액 중의 동종 세포일 수 있다.
본 발명의 방법은 예를 들어, 가용성 항원에 대한 T 세포 내성을 유도하거나, 골수 이식체 또는 다른 기관 이식체에 대한 T 세포 내성을 유도하거나, 골수 이식에서 이식편-대-숙주 질환을 억제하기 위해 사용될 수 있다. 골수 이식의 경우, 이식된 골수 세포는 자체적으로 본 발명의 방법에서 사용되는 T 세포에 항원을 제공하는 세포로서의 역할을 한다. 따라서, 본 발명의 한 구체예에서, 골수 이식체의 수용은 피검체에게 gp39 길항물질(예를 들어, 항-gp39 항체)와 함께 동종 골수를 투여함으로써 촉진된다.
본 발명은 또한, B 세포 증식, B 세포 분화 및 T 세포 반응을 억제할 수 있는 항-사람 gp39 단클론성 항체, 및 이러한 항체를 포함하는 약제 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 항-사람 gp39 단클론성 항체는 면역 반응을 일반적으로 조절하는 데에 사용하기에 바람직하고, 특히 항원-특이적 T 세포 내성을 유도하는 데에 사용하기에 바람직하다. 바람직한 항체로는 실시예 6에 기술되어 있는 단클론성 항체 3E4, 2H5, 2H8, 4D9-8, 4D9-9, 24-31, 24-43, 89-76 및 89-79가 있다. 특히 바람직한 항체는 단클론성 항체 89-76 및 24-31이다. 89-76 및 24-31 항체를 각각 생성시키는 89-76 및 24-31 하이브리도마는 부다페스트 조약의 규정하에, 1994년 9월 2일에, 메릴랜드, 록빌, 파크론 드라이브에 소재하는 아메리칸 타입 컬춰 콜렉션(American Type Culture Collection) (ATCC)에 기탁되었다. 89-76 하이브리도마는 ATCC 수탁 번호 HBl1713이고, 24-31 하이브리도마는 ATCC 수탁번호 HBl1712이다. 24-31 및 89-76 항체는 lgG1 아이소타입이다.
따라서, 한 구체예에서, 본 발명은 lgG1 아이소타입의 항-사람 gp39
단클론성 항체(mAb)를 제공한다, 본 발명의 항-사람 gp39 mAb는 표준 시험관내 분석에서의 B 세포 증식, 예를 들어 인터로이킨-4 및 가용성 gp39에 의한 B 세포의 처리에 의해 유도되는 B 세포 증식을 억제시킬 수 있다. 바람직하게는, 항-사람 gp39 항체는 약 0.01 내지 5.0㎍/㎖, 더욱 바람직하게는 약 0.1 내지 2.5㎍/㎖, 더욱더 바람직하게는 약 0.1 내지 1.25㎍/㎖ 의IC50(즉, 증식을 50% 까지 억제하는 데에 필요한 농도)으로 B 세포 증식을 억제한다. 또한, 본 발명의 항-사람 gp39 mAb는 표준 시험관내 검정에서의 IgG, IgM 및/또는 IgA의 B 세포 생성, 예를 들어 활성화된 T 세포(예를 들어, 항-CD3 항체에 의한 처리에 의해 활성화된 T 세포)를 사용하여 B 세포를 배양함으로써 유도되는 Ig 생성을 억제시킬 수 있다. 바람직하게는, 항-사람 gp39 항체는 약 0.01 내지 1.0㎍/㎖ 더욱 바람직하게는 약 0.01 내지 0.1㎍/㎖의 IC50으로 IgG, IgM 및/또는 IgA의 B 세포 생성을 억제한다.
바람직한 구체예에서, 본 발명의 항-사람 gp39 mAb는 3E4, 2H5, 2H8, 4D9-8, 4D9-9, 24-31, 24-43, 89-76 및 89-79로 구성된 군으로부터 선택된 단클론성 항체에 의해 인식되는 에피토프와 결합한다. 더욱 바람직하게는, 항-사람 gp39 mAb는 단클론성 항체 24-31 또는 단클론성 항체 89-76에 의해 인식되는 에피토프와 결합한다. 상기 언급된 항체들 중 어느 하나에 의해 인식되는 에피토프에 결합할 수 있는 mAb의 능력은 표준 교차-경쟁 분석에 의해 측정될 수 있다. 예를 들어, mAb 24-31에 의해 인식되는 동일한 에피토프에 결합하는 항체는 활성화된 T 세포에 대한표지된 24-31의 결합에 대해 경쟁할 것이며, 반면에, mAb 24-31에 의해 인식되는 에피토프와 상이한 에피토프와 결합하는 항체는 활성화된 T 세포에 대한 표지된 24-31의 결합에 대해 경쟁하지 않을 것이다.
본 발명은 또한, 본 발명의 항-사람 gp39 항체의 약제 조성물을 제공한다 이들 조성물은 항-사람 gp39 mAb(예를 들어, 바람직하게는 24-31 또는 89-76) 및 약제학적으로 허용될 수 있는 담체를 포함하는 것이 통상적이다.
본 발명은 또 다른 양태는 항-사람 gp39 mAb를 코드화하는 핵산(예를 들어, 항-사람 gp39 mAb의 면역글로불린 중쇄 또는 경쇄, 또는 이들의 일부를 코드화하는 DNA)에 관한 것이다. 이러한 핵산은 항-사람 gp39 mAb를 생성시키는 세포(예를 들어, 하이브리도마)로부터 표준 기술에 의해 단리될 수 있다. 예를 들어, 24-31 또는 89-76 mAb를 코드화하는 핵산은 CDNA 라이브러리 스크리닝, PCR 증폭 또는 그외의 표준 기술에 의해, 각각 24-31 또는 89-76 하이브리도마로부터 단리될 수 있다. 항-사람 gp39 mAb 사슬을 코드화하는 핵산은 표준 재조합 DNA 기술에 의해 조작되어, 재조합 항-사람 gp39 mAb, 예를 들어, 키메라 또는 인간화된 항-사람 gp39 mAb를 생성킬 수 있다.
더욱이, 항-사람 gp39 mAb를 코드화하는 핵산은 발현 벡터 내로 통합되고 숙주 세포 내로 도입되어, 항-사람 gp39 항체의 재조합 형태의 발현 및 생성을 용이하게 할 수 있다.
제1도는 생체내 항-gp39 처리에 의해 유도되는 단백질 항원에 대한 T 세포내성을 설명하는 그래프이다. T 세포 반응은 항-gp39 항체의 존재 또는 부재하에서 항원 펄스된 B 세포에 대해 미리 생체내 투여시킨 항원에 의한 항원투여시에 생체외에서 측정되었다.
제2도는 생체내 항-gp39 처리에 의해 유도된 동종 B 세포에 대한 T 세포 내성을 설명하는 그래프이다. T 세포 반응은 항-gp39 항체의 존재 또는 부재하에서 미리 생체내 투여시킨 동종 B 세포에 의한 항원투여시에 생체외에서 측정되었다.
제3A도는 수용 동물을 항-gp39 항체로 처리하였을 때, 동종 B 세포에 의해 유도된 일차 동종 CTL 반응의 억제를 설명하는 그래프이다. 표시된 군은 처리되지 않은 마우스(■), 항-gp39 처리된 마우스(△) 및 프라이밍 되지 않은 Balb/c 마우스로부터의 비장 세포(● ; 네거티브 대조 이펙터 세포로서 사용됨)이다.
제3B도 및 제3C도는 수용 동물을 항-gp39 항체로 처리하였을 때, LPS 처리된 B 세포 블라스트(blast)에 의해 유도된 일차 동종 CTL 반응의 억제를 설명하는 그래프이다. 패널 B 및 C는 2가지 독립적 실험을 나타낸다. 표시된 군은 처리하지 않은 생체내 LPS 블라스트(▲), 항-gp39 처리된 생체내 LPS 블라스트(●), 처리하지 않은 생체내 휴지 B 세포(○) 및 항-gp39 처리된 생체내 휴지 B 세포(□)이다.
제4A도는 수용 동물을 항-gp39 항체로 처리하였을 때, 동종 B 세포에 의해 유도된 이차 동종 CTL 반응의 억제를 설명하는 그래프이다. 도시된 이펙터 군은 : Hlg 처리된 수용자(●), 나이브(naive) Balb/c(▲) 및 항-gp39 처리된 수용자(■)이다. 상응하는 유전적동계(syngeneic) 반응(Balb/c 세포로 자극된 Balb/c 세포)은 안이 비어있는 기호로 나타내었다.
제4B도는 항-gp39 처리에 의한 동종 CTL 반응의 억제의 특이성을 설명하는 그래프이다. 이 그래프에는 나이브 Balb/c 세포(○) 또는 H-2b반수체형 B 세포와 항-gp39의 투여에 의해 H-2b에 대해 내성화된 세포(■)에의한 H-2k표적에 대한 CTL 반응이 나타난다.
제5도는 항-gp39 항체로 처리하거나 처리하지 않으면서 숙주로 골수를 전달한 후에 다양한 시점에서의 골수 이식을 받은 숙주 내의 비장 세포의 수를 나타내는 막대 그래프이다.
제6A도는 생체내 항-gp39로 처리되거나 처리되지 않은 골수 이식을 받은 마우스로부터 분리한 후에 생체외에서 비장 B 세포에 의해 생성된 IgA의 농도를 나타내는 그래프이다. 비장 B 세포를 분리하고, 골수 이식한 지 7일 또는 14일 후에 항체 생성을 측정하였다.
제6B도는 생체내 항-gp39로 처리되거나 처리되지 않은 골수 이식을 받은 마우스로부터 분리한 후에 생체외에서 비장 B 세포에 의해 생성된 IgGl의 농도를 나타내는 그래프이다. 비장 B 세포를 분리하고, 골수 이식한 지 7일 내지 14일 후에 항체 생성을 측정하였다.
제7A도는 골수 전달 후에 다양한 시점에서의 생체내 항-gp39로 처리되거나 처리되지 않은 골수 이식을 받은 마우스의 혈청 IgE 농도를 나타내는 그래프이다.
제7B도는 골수 전달 후에 다양한 시점에서의 생체내 항-gp39로 처리되거나 처리되지 않은 골수 이식을 받은 마우스의 혈청 항-DNA 항체 농도를 나타내는 그래프이다.
제8A도 및 제8B도는 다양한 이펙터 대 표적세포 비(E:T 비)에서의 생체내 항-gp39 처리되거나 처리되지 않은 골수 이식을 받은 마우스로부터의 세포독성 T 세포의 생체외 세포용해 활성을 나타내는 그래프이다. 패널 A 및 B는 2가지 독립된 실험을 나타낸다.
제9A도, 제9B도 및 제9C도는 CD40Ig(패널 A), mAb 4D9-8(패널 B) 또는 mAb 4D9-9(패널 C)를 사용한 6시간 활성화된 사람 말초 혈액 림프구의 염색을 나타내는 유동 혈구계산 프로파일이다.
제10A도, 제10B도 및 제10C도는 염색된 시클로포린 A의 존재하에서 배양된 6 시간 활성화된 사람 말초 혈액 림프구의 mAb 4D9-8(패널 A), mAb 4D9-9(패널 B) 또는 CD40Ig(패널 C)을 사용한 염색을 나타내는 유동혈구계산 프로파일이다.
제11A도 및 제11B도는 표지되지 않은 mAb 4D9-8(패널 A) 또는 표지되지 않은 mAb 4D9-9(패널 B)의 존재하에서의 CD40Ig를 사용한 6시간 활성화된 사람 말초 혈액 림프구의 염색을 나타내는 유동 혈구계산 프로파일이다.
제12도는 세포를 항-사람 gp39 mAb인 4D9-8, 4D9-9, 24-31, 24-43, 89-76 또는 89-79의 존재하에서 배양하였을 때, 가용성 gp39 및 IL-4에 의해 유도되는 사람 B 세포 증식의 억제를 나타내는 그래프이다.
제13도는 세포를 항-사람 gp39 mAb인 24-31 또는 89-79의 존재하에서 배양하였을 때, 동종 특이적 혼합 림프구 반응의 억제를 나타내는 그래프이다.
본 발명은 항원 특이적 T 세포 내성을 유도하는 방법을 특징으로 한다. 이 방법은 T 세포를 1) T 세포에 항원을 제공하고 접촉 의존성 헬퍼 이펙터 기능을 매개하는 T 세포의 표면 상의 수용체와 상호작용하는 리간드를표면 상에 갖는 세포, 및 2) 수용체와 리간드의 상호작용을 억제하는 T 세포 상의 수용체의 길항물질과 접촉시키는 것을 포함한다. 본 원에 규정된 바와 같이, 접촉 의존성 헬퍼 이펙터 기능을 매개하는 분자 또는 수용체는 Th 세포 상에 발현되고 이펙터 세포 (예를 들어, B 세포) 상의 리간드와 상호작용하는 물질이며, 수용체와 이것의 리간드의 상호작용은 이펙터 세포 반응(예를 들어, B 세포 활성화)의 발생에 필수적이다. 이펙터 세포 반응에 관여하는 것 이외에, 이러한 분자가 항원에 대한 T 세포의 반응에 관여하는 것으로 밝혀졌다.
접촉 의존성 헬퍼 이펙터 기능을 매개하는 T 세포 상의 바람직한 분자는 gp39이다. 따라서, 바람직한 구체예에서, 본 발명의 방법은 T 세포를 항원을 제공하는 세포 및 gp39 길항물질과 접촉시키는 것을 포함한다. 따라서, 항원을 제공하는 데에 사용되는 세포는 T 세포의 표면 상의 gp39와 상호작용하여 T 세포를 활성화 시키는(즉, T 세포에 T 세포 활성화를 위해 필수적인 신호를 전달하는) 세포이다. 예를 들어, 세포는 CD40을 발현시키고 T 세포에 항원을 제공하는 B 세포일 수 있다. 항원을 제공하는 세포 상의 gp39 리간드와 T 세포 상의 gp39 사이의 상호작용을 억제함으로써, 1 세포는 제공된 항원에 의해 활성화되는 것이 아니라, 오히려 항원에 대해 내성을 띠게 된다.
본 발명의 방법은 생체내에서 항원에 대한 T 세포 내성을 유도하는 데에 사용될 수 있다. 예를 들어, T 세포에 항원을 제공하는 세포는 접촉 의존성 헥퍼 이펙터 기능을 매개하는 T 세포 상에서 발현되는 수용체의 길항물질(예를 들어, gp39 길항물질)과 함께 피검체에 투여될 수 있다. 또한, 본 발명의 방법은 T 세포를 접촉 의존성 헬퍼 이펙터 기능을 매개하는 T 세포 상에서 발현되는 수용체의 길항물질(예를 들어 gp39 길항물질)과 함께 T 세포에 항원을 제공하는 세포와 생체외에서 접촉시킴으로써 생체외에서 T 세포가 한원에 대해 내성을 갖도록 하는데 사용될 수 있다. 생체외에서 내성을 갖게 된 T 세포는 피검체에 투여될 수 있다. 본 발명의 방법은 피검체의 T 세포가 특정 항원에 대해, 또는 동종 골수와 같은 이식 세포(예를 들어, 골수 이식의 경우)에 대해 내성을 갖도록 하는 데에 사용될 수 있다. 또한, 본 발명의 방법은 골수 이식에서 이식편 대 숙주 질환을 억제하는 데에 유용하다.
본 발명의 다양한 양태는 하기에서 더욱 상세히 설명된다.
1. gp39 길항물질
본 발명의 방법에 따라, gp39 길항물질은 T 세포와 접촉하여 (예를 들어, 피검체에 투여되어), B 세포와 같은 항원 제공 세포 상의 gp39 리간드와 T 세포 상의 gp39의 상호작용을 간섭한다. gp39 길항물질은 이러한 상호작용을 간섭하는 분자로서 규정된다. gp39 길항물질은 gp39에 대한 항체(예를 들어, gp39에 대한 단클론성 항체), gp39에 대한 항체의 단편 또는 유도체(예를 들어, Fab 또는 F(ab)'2 단편, 키메라 항체 또는 인간화된 항체), gp39 리간드의 가용성 형태(예를 들어, 가용성 CD40), gp39 리간드의 융합 단백질의 가용성 형태(예를 들어, 가용성 CD40Ig) 또는gp39-CD40 상호작용을 방해거나 간섭하는 약제일 수 있다.
A. 항체
포유동물(예를 들어, 마우스, 햄스터 또는 토끼)은 포유 동물의 항체반응을 유도하는 면역원 형태의 gp39 단백질 또는 단백질 단편(예를 들어, 펩티드 단편)으로 면역될 수 있다. 표면 상에서 gp39를 발현시키는 세포가 또한 면역원으로서 사용될 수 있다. 또 다른 면역원으로는 정제된 gp39 단백질 또는 단백질 단편이 있다. gp39는 표준 정제 기술에 의해 gp39-발현 세포로부터 정제될 수 있으며 ; gp39 CDNA [Armitage et al., Nature, 357:80-82 (1992); Lederman et al., J. Exp, Med., 175:1091-1101 (1992); Hollenbaugh at al., EMBO J., 11:4313-4319 (1992)]는 숙주 세포, 예를 들어 박테리아 또는 포유동물 세포주에서 발현될 수 있고 gp39 단백질은 표준 기술에 의해 세포 배양액으로부터 정제될 수 있다. gp39 펩티드는 공지된 기술(예를 들어, F-moc 또는 T-boc 화학적 합성)을 사용하여, gp39의 아미노산 서열(문헌[Armitage et al,, Nature, 357:80-82 (1992); Lederman et al., J. Exp. Med., 175:1091-1101 (1992); Hollenbaugh et al., EMBO J., 11:4313-4319 (1992)]에 기재되어 있음)을 기초로 하여 합성될 수 있다. 단백질에 면역원성을 부여하는 기술로는 담체와의 콘쥬게이션 또는 당분야에 널리 공지된 다른 기술이 있다. 예를 들어, 단백질은 보조제의 존재하에서 투여될 수 있다. 면멱화의 진행은 혈장 또는 혈청에서의 항체 역가를 검출 함으로써 모니터될 수 있다. 항원으로서의 면역원에 대해 표준 ELISA 또는 다른 면역검정을 사용하여 항체의 농도를 평가할 수 있다.
면역화 후에, 항혈청이 수득될 수 있고, 소망에 따라, 다클른성 항체 가 혈청으로부터 단리될 수 있다. 단클론성 항체를 생성시키기 위해, 항체 생성 세포(림프구)를 면역화된 동물로부터 채취하고, 표준 체세포 융합 공정에 의해 골수종 세포와 융합시킴으로써, 이들 세포를 불멸화시켜서 하이브리도마 세포를 수득할 수 있다. 이러한 기술은 당분야에 널리 공지되어 있다.
예를 들어, 콜러(Kohler) 및 밀스테인(Milstein)에 의해 최초로 개발된 하이브리도마 기술[Nature (1975) 256:495-497] 뿐만 아니라 사람 B-세포 하이브리도마 기술[Kozbar et al., Immunol. Today (1983) 4:72), 사람 단클론성 항체를 생성하기 위한 EBV-하이브리도마 기술[Cole et al. Monocloanl Antibodies in Cancer Therapy (1985) (Allen R. Bliss, Inc., pages 77-96)], 및 조합 항체 라이브러리의 스크리닝[Huse et al., Science (1989) 246:1275]과 같은 다른 기술. 하이브리도마 세포는 단백질 또는 펩티드와 특이적으로 반응하는 항체의 생성을 위해 면역화학적으로 스크리닝될 수 있고, 단클론성 항체가 단리될 수 있다.
본원에 사용되는 용어 "항체(antibody)"는 gp39 단백질 또는 이것의 펩티드 또는 gp39 융합 단백질과 특이적으로 반응하는 항체의 단편을 포함 하도륵 기도된다. 항체는 통상적인 기술을 사용하여 단편화될 수 있으며, 단편은 전항체(whole antibody)에 대해 상기 기술된 것과 통일한 방식으로 유용성에 대해 스크리닝될 수 있다. 예를 들어, F(ab')2단편은 항체를 펩신 으로 처리함으로써 생성될 수 있다. 생성된 F(ab')2단편은 이황화물 브릿지 를 감소시키도록 처리되어 Fab' 단편을 생성시킬 수 있다. 또한, 본 발명의 항체는 한-gp39 부분을 갖는 이중특이적(bispecific) 및 키메라 분자를 포함하도록 의도된다.
사람 이외의 피검체에서 생성된 항체가 치료를 목적으로 사람에게 사용될 때, 이들은 외래 인자로서 다양한 정도로 인식되어, 환자 체내에서 면역 반응이 발생될 수 있다. 일반적 면역억제에 바람직한, 상기 문제점을 최소화시키거나 해소하기 위한 하나의 방법은 키메라 항체 유도체, 즉 사람 이외의 동물의 가변 영역 및 사람 불변 영역이 결합된 항체 분자를 생성시키는 것이다. 키메라 항체 분자는, 예를 들어, 마우스, 랫트 또는 그외의 종의 항체로부터의 항원 결합 도메인을 사람 불변 영역과 함께 포함할 수 있다. 키메라 항체를 제조하는 다양한 방법이 공지되어 있으며, 이들 방법은 gp39를 인식하는 면역글로불린 가변 영역을 함유하는 키메라 항체를 제조하기위해 사용될 수 있다 [참고 문헌 : Morrison et al., Proc. Natl. Acad, Sci. U.S.A, 81:6851 (1985) ; Takeda et al., Nature 314:452 (1985), Cabilly et al., U.S. Patent No. 4,816,567 ; Boss et at., U.S. Patent No, 4,816,397 ; Tanaguchi et al., European Patent Publication EP 171496; European Patent Publication 0173494, United Kingdom Patent GB 2177096B]. 이러한 키메라 항체가 상응하는 비-키메라(non-chimeric) 항체보다 인체 내에서 덜 면역원성일 것으로 기대된다.
사람을 치료하기 위해, gp39 단백질 또는 펩티드와 특이적으로 반응하는 단클론성 또는 키메라 항체는 사람 가변 영역 키메라를 생성시킴으로 써 추가로 인간화될 수 있는데, 이 키메라에서, 가변 영역의 일부, 특히 항원 -결합 도메인의 보존 프레임워크 영역은 사람으로부터 유래하고, 고가변성 영역만이 사람 이외의 기원을 지닌다. 이러한 변형된 면역글로불린 분자는 당분야에 공지된 수가지 방법 중 어느 하나에 의해 생성될 수 있으며[참조 : Teng et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 80:7308-7312 (1983); Kozbor et al., Immunology Today, 4:7279 (1983); OIsson et at., Meth, Enzymol., 92:3-16 (1982)], PCT공보 WO92/06193호 또는 EP 0239400호의 교시에 따라 제조하는것이 바람직하다. 인간화된 항체는 예를 들어 스코트겐 리미티드[Scotgen Limited, 2 Holly Road, Twickenham, Middlesex, Great Britain]로부터 상업적으로 구입할 수 있다.
gp39 단백질 또는 펩티드에 대해 반응성인 특이적 항체 또는 항체 단편을 생성시키는 또 다른 방법은, gp39 단백질 또는 펩티드를 지닌 박테리아에서 발현되는 면역 글로불린 유전자 또는 이것의 일부를 코드화하는 발현 라이브러리를 스크리닝하는 것이다. 예를 들어, 완전한 Fab 단편, VH 영역 및 FV 영역을 파지 발현 라이브러리를 사용하여 박테리아에서 발현될 수 있다 [참고 문헌 : Ward et al., Nature, 341:544-546: (1989); Huse et al., Science, 246: 1275-1281 (1989); and McCafferty et al., Nature, 348:552-554 (1990)]. 이러한 라이브러리를 예를 들어 gp39 펩티드로 스크리닝하면, gp39와 반응하는 면역글로불린 단편을 확인할 수 있다. 다른 방법으로, SCID-hu 마우스[젠파암(Genpharm)으로부터 구입할 수 있음]가 항체 또는 이것의 단편을 생성시키기 위해 사용될 수 있다.
사람 gp39 및 마우스 gp39를 포함하는 gp39에 대한 단클론성 항체, 및 본 발명의 방법에 사용하기에 적합한 단클론성 항체를 생성시키는 방법은 실시예 6에 더욱 상세히 기술되어 있다. 특히 본 발명의 바람직한 항-사람 gp39 항체는, 각각 하이브리도마 24-31 및 89-76에 의해 생성되는 mAb 24-31 및 89-76이다. 89-76 및 24-31 항체를 각각 생성시키는 89-76 및 24-31 하이브리도마는 부다페스트 조약의 규정하에, 1994년 9월 2일에, 메릴랜드, 록스빌, 파크론 드라이브에 소재하는 아메리칸 타입 컬춰 콜렉션에 기탁되었다. 89-76 하이브리도마는 ATCC 수탁 번호 HBl1713이고, 24-31 하이브리도마는 ATCC 수탁번호 HB11712이다.
키메라 및 인간화된 항체와 같은 재조합 항-gp39 항체는 표준 재조합 DNA 기술에 따라 항-gp39 항체를 코드화하는 핵산(예를 들어, DNA)을 조작함으로써 생성될 수 있다. 따라서, 본 발명의 또 다른 양태는 gp39, 특히 사람 gp39와 반응하는 면역 글로불린 경쇄 또는 중쇄, 또는 이들의 일부를 코드화하는 단리된 핵산 분자에 관한 것이다. 면역글로불린 코드화 핵산은 결합된 경쇄 또는 중쇄 불변 영역(또는 이것의 일부)과 함께 또는 이 영역없이 면역글로불린 경쇄 또는 중쇄 가변 영역을 코드화할 수 있다. 이러한 핵산은 표준 기술에 의해 항-사람 gp39 mAb를 생성시키는 세포 (예를 들어, 하이브리도마)로부터 단리될 수 있다. 예를 들어, 24-31 또는 89-76 mAb를 코드화하는 핵산은 cDNA 라이브러리 스크리닝, PCR 증폭 또는 그밖의 표준 기술에 의해 각각 24-31 또는 89-76 하이브리도마로부터 단리될 수 있다. 또한, 단리 및 가능한 추가의 조작 후, 항-사람 gp39 mAb를 코드화하는 핵산은 발현 벡터 내로 삽입되고 숙주 세포 내로 도입되어 항-사람 gp39 항체의 재조합 형태의 생성 및 발현을 용이하게 해준다.
B. gp39에 대한 가용성 리간드
T 세포 내성을 유도하기 위해 사용될 수 있는 다른 gp39 길항물질은 gp39 리간드의 가용성 형태이다. 가용성 CD40과 같은 gp39의 1가 가용성 리간드는 gp39와 결합하여, B 세포 상의 CD40과 gp39의 상호작용을 억제시킬 수 있다. 용어 "가용성"은 리간드가 세포막과 영구적으로 결합되지 않음을 가리킨다. 가용성 gp39 리간드는 화학적 합성에 의해 제조되거나, 바람직하게는, 재조합 DNA 기술에 의해, 예를 들어 리간드의 세포외 도메인(트랜스멤브레인 및 세포질 도메인 없이)만을 발현시킴으로써 제조될 수 있다. 바람직한 가용성 gp39 리간드는 가용성 CD40이다. 대안적으로, 가용성 gp39 리간드는 융합 단백질의 형태일 수 있다. 이러한 융합 단백질은 gp39 리간드의 일부 또는 전부가 2차 분자에 결합된 형태로 되어있다. 예를 들어, CD40은 면역 글로불린과의 융합 단백질(즉, CD40lg 융합 단백질)로서 발현될 수 있다. 하나의 구체예에서, CD40 분자의 세포외 도메인 부분의 아미노산 잔기가 면역글로불린 중쇄의 힌지 CH2 및 CH3 영역에 상응하는 서열의 아미노산 잔기 예를 들어 Cγ1에 결합되어 CD40lg 융합 단백질을 생성시키는 융합 단백질이 생성된다 [참고 문헌 : Linsley et al. (1991) J. Exp Med. 1783:721-730; Capon et al;. (1989) Nature 337, 525-531; and Capon U.S. 5,116,964]. 융합 단백질은 화학적 합성에 의해 생성되거나, 바람직하게는 CD40의 cDNA를 기초로 하여 재조합 DNA 기술[Stamenkovic et al., EMBO J., 8:1403-1410 (1989)]에 의해 생성될 수 있다.
II. 항원 특이적 내성을 유도시키기 위한 세포
본 발명은 항원을 제공할 뿐만 아니라 gp39와도 상호작용하는 세포에 의해 항원을 T 세포에 제공하되 항원을 gp39 길항물질의 존재하에서 T세포에 제공하는경우에 항원 특이적 T 세포 내성이 유발된다는 발견을 최소한 부분적으로 기초로 한다. 이러한 메카니즘에 의해 T 세포 내성을 유도할 수 있는 세포로는 T 세포에 항원을 제공하며 T 세포 활성화를 위해 필요한 신호를 T 세포에 전달하기 위해 상기 세포 상의 gp39 리간드와 T 세포상의 gp39의 상호작용을 필요로 하는 세포가 있다. 이러한 상호작용의 억제는 제공된 항원에 의한 T 세포 활성화를 방지하고, 또한 T 세포의 항원 특이적 내성을 유도한다. gp39를 통한 T 세포의 활성화를 간섭하는 것은 항원 제공 세포 상의 동시자극 분자(예를 들어, B 세포와 같은 항원 제공 세포 상의 B7 패밀리 분자)의 유도를 방지하여, 항원 제공 세포가 동시자극 신호 없이 항원성 신호만을 전달하게 됨으로써, 내성을 유도할 수 있다.
따라서, 본 발명의 방법에서는, 항원을 제공하는 세포가 수용 피검체에게 투여된다 "항원을 제공하는 세포" 및 "항원 제공 세포"는 본원에서 상호교환적으로 사용되고, 수용자의 T 세포에 항원을 제공할 수 있는 세포로서, B 림프구, "프로페셔널(professional)" 항원 제공 세포(예를 들어, 단핵 세포, 수상 세포, 랑게르한스 세포) 및 면역 세포에 항원을 제공하는 그밖의 세포(예를 들어, 각질세포, 내피 세포, 성상세포, 섬유아세포, 희돌기교세포 (oligodendrocyte))를 포함하는 것으로 의도된다. 또한, 항원 제공 세포가 수용자 T 세포내에서 동시자극 신호를 자극시킬 수 있는 능력이 감소된 것이 바람직하다. 예를 들어, 항원 제공 세포는 B7 패밀리 단백질(예를 들어, B7-1 및 B7-2)과 같은 동시자극 분자의 발현이 결핍되거나, 이들 분자를 단지 낮은 정도로 발현시킬 수 있다. 본 발명의 방법에서 사용하려는 잠재적 항원 제공 세포 상의 공동자극 분자의 발현은 표준 기술, 예를 들어 동시자극분자에 대한 항체를 사용하는 유량 세포계산법에 의해 평가될 수 있다.
T 세포 내성을 유도하기 위한 바람직한 항원 제공 세포는 림프 세포, 예를 들어 말초혈 림프구 또는 비장 세포이다. T 세포 내성을 유도하기 위한 바람직한 림프 세포는 B 세포이다. B 세포는 표준 세포 분리 기술에 의해 혼합 세포군(예를 들어, 말초혈 또는 비장의 다른 세포 유형)으로부터 정제될 수 있다. 예를 들어, 부착 세포는 플라스틱 접시 상에서 비장 세포를 배양하고, 비부착 세포군을 회수함으로써 제거될 수 있다. T 세포는 항-T 세포·항체(예를 들어, 항-Thy1.1 및/또는 항-Thy1.2) 및 보체로 처리함으로써 혼합 세포군으로부터 제거될 수 있다. 하나의 구체예에서는, 휴지 림프 세포, 바람직하게는 휴지 B 세포가 항원 제공 세포로서 사용된다. 휴지 B 세포와 같은 휴지 림프 세포는, 예를 들어 이들의 작은 크기 및 밀도를 기초로하여 당분야에 공지된 기술에 의해 단리될 수 있다. 휴지 림프 세포는 예를 들어 문헌[Tony, H-P. and Parker, D.C. (1985) J. Exp. Med. 161:223-241]에 기술되어 있는 바와 같이 역류 원심 경사법에 의해 단리될 수 있다. 역류 원심 경사법을 사용하는 경우, T 세포 반응을 활성화시킬 수 있는 세포가 없는 작은 휴지 림프 세포군은 14 내지 19 m1/분, 바람직하게는 19 m1/분(3,200 rpm)으로 분획을 수집함으로써 수득될 수 있다. 대안적으로, 작은 휴지 림프구(예를 들어, B 세포)는, 예를 들어 피콜(Ficoll) 또는 퍼콜(Percoll) 구배를 사용하여, 불연속 밀도 구배 원심분리에 의해 단리될 수 있고, 원심 분리 후에 작은 휴지 림프구를 함유하는 층이 얻어질 수 있다. 또한, 작은 휴지 B 세포는, 표준 기술(예를 들어, 면역형광법)에 의해 활성화된 B 세포의 표면 상에서의 B7-1 및/또는 B7-2와 같은 동시자극 분자의 발현을 검정함으로써, 활성화된 B 세포와 구별될 수 있다.
B 세포와 같은 항원 제공 세포는, T 세포와 접촉하기 전에(예를 들어, 피검체에 투여되기 전에) 항원(예를 들어, 가용성 단백질)과 접촉할 수 있으며, 세포는 gp39 길항물질의 존재하에서 T 세포에 항원을 제공하여 항원에 대한 특이적 T 세포 내성을 유도하기 위해 사용될 수 있다 (실시예 1 참조). 대안적으로, 동종항원에 대한 내성은 항원 제공 세포로서 동종 세포를 사용함으로써 유도될 수 있다 (실시예 2 및 3 참조). 동종 세포는 T 세포에 동종 단백질의 항원성 단편을 제공한다. 하나의 구체예에서, 동종 세포는 동종 B 세포와 같은 동종 림프 세포이다. 대안적으로, 피검체는 말초 혈 내의 세포(예를 들어, 말초혈 림프구), 비장 세포 또는 글수 세포로 내성화될 수 있다. 골수 이식의 경우, 공여자 골수 세포는 자체적으로 T 세포와 접촉되는(예를 들어, 피검체에 투여되는 경우) 항원 제공 세포로서 기능한다. 따라서, 동종 골수는 gp39 길항물질과 함께 투여되어 수용자에게서 골수에 대한 내성을 유도하고, 이식편 대 숙주 질환을 방지할 수 있다 (실시예 4 및 5 참조)
III. 세포 및 gp39 길항물질의 투여
항원 특이적 T 세포 내성은, gp39 길항물질을 T 세포에 항원을 제공하고 T 세포 상의 gp39와 상호작용하는 리간드를 발현시키는 세포와 함께 피검체에 투여함으로써 본 발명에 따라 유도될 수 있다. 바람직한 구체예에서, 항원 제공 세포 및 gp39 길항물질은 동시에 투여된다. 대안적으로, gp39 길항물질은, 예를 들어 길항물질이 반감기가 긴 항체인 경우, 세포를 투여하기 전에 투여될 수 있다. 투여하려는 세포가 이식편-대-숙주 질환의 억제가 바람직한 골수 세포인 경우, 골수 중의공여자 T 세포는 공여자 골수를 생체외에서 숙주로부터의 B세포 및 gp39 길항물질과 인큐베이팅시킴으로써 수용 숙주에 전달하기 전에 내성화될 수 있다. gp39 처리는 필요에 따라 골수 전달 동안 및 후에 생체내에서 계속될 수 있다. 골수 또는 그밖의 기관 이식체를 수용하게 될 피검체의 경우, 이식체에 대한 동종 내성은 기관 또는 골수 세포의 전달 전에 동종 내성을 유도하는 방법으로 처리함으로써 피검체에게서 유도될 수 있다. 이러한 예비 처리 방법은, gp39 길항물질과 함께 공여자로부터 대상 세포를 투여하는 것을 수반할 수 있다. 공여자로부터의 세포는, 예를 들어 B 세포, 전체 말초혈 또는 이들의 일부 단편(예를 들어, 말초혈 림프구 또는 작은 휴지 림프구 또는 B 세포)일 수 있다.
1회 용량의 항원 제공 세포를 투여하는 것은(길항물질과 함께) T 세포 내성을 유도시키기에 충분한 것으로 밝혀졌다 (실시예 참조), 투여되는 항원 제공 세포의 수는 사용된 세포의 유형, 조직 또는 기관 이식편의 유형, 수용자의 체중, 수용자의 일반적 상태 및 당업자에게 공지되어 있는 그밖의 변수에 따라 달라질 수 있다. 본 발명의 방법에 사용하기 위한 세포의 적합한 수는 통상적인 방법(예를 들어, 실시예에 기술된 검정의 사용)에 의해 당업자에 의해 결정될 수 있다. 세포는 수용자에게서 내성을 유도시키기에 적합한 경로 및 형태로 투여된다. 세포는 완층 식염수 또는 유사한 비히클과 같은 생리학적으로 허용될 수 있는 용액에 함유된 형태로 투여될 수 있다. 세포는 정맥내 투여되는 것이 바람직하다.
본 발명의 길항물질은 T 세포 내성을 유도시키기 위해 생체내 약제투여에 적합한 생물학적으로 양립할 수 있는 형태로 피검체에게 투여된다. "생체내 투여에적합한 생물학적으로 양립할 수 있는 형태"는 단백질의 치료적 효과가 임의의 독성 효과를 능가하도록 투여되는 길항물질의 형태를 의미한다. "피검체"는 면역 반응이 유도될 수 있는 살아있는 생물, 예를 들어 포유동물을 포함하도록 의도된다. 피검체의 예로는 사람, 개, 고양이, 마우스, 랫트 및 이들의 형질전환 종이 있다. gp39 길항물질은 임의의 약물학적 형태, 임의적으로 약제학적으로 허용될 수 있는 담체에 함유된 형태로 투여될 수 있다. 치료적 활성량의 길항물질의 투여는 원하는 결과를 달성하는 데에 필요한 용량 및 기간에 걸쳐 유효한 양으로서 규정된다. 예를 들어, gp39의 길항물질의 치료적 활성량은 질환의 상태, 연령, 성별 및 체중과 같 은 인자, 및 체내에서 원하는 반응을 유도시킬 수 있는 길항물질의 능력에 따라 달라질 수 있다. 투여 양생법은 최적 치료학적 반응을 제공하도록 조정될 수 있다. 예를 들어, 수회의 분할된 용량이 매일 투여될 수 있거나, 치료 상황에 필요한 요건에 따라 용량이 비례적으로 감소될 수 있다.
활성 화합물(예를 들어, 길항물질)은 주사(피하주사, 정맥 주사 등), 경구 투여, 흡입, 경피 도포 또는 직장 투여와 같은 편리한 방식으로 투여될 수 있다. 투여 경로에 따라, 활성 화합물은 효소, 산 및 화합물을 블활성화 시킬 수 있는 다른 천연 조건의 작용으로부터 화합물을 보호하기 위한 물질로 코팅될 수 있다. 바람직한 투여 경로는 정맥내 주사에 의한 것이다.
비경구적 투여 이외의 방법으로 gp39의 길항물질을 투여하기 위해, 길항물질을 불활성화를 방지하기 위한 물질로 코팅하거나, 길항물질을 이러한 물질과 동시 투여하는 것이 필요할 수 있다, 예를 들어, 길항물질은 적당한 담체 또는 희석제에함유된 형태로 개체에 투여되거나, 효소 억제제와 동시 투여되거나, 리포솜과 같은 적당한 담체에 함유된 형태로 투여될 수 있다. 약제학적으로 허용될 수 있는 희석제로는 식염수 및 완충 수용액이 있다. 효소 억제제는 췌장 트립신 억제제, 디이소프로필 플루오로포스페이트 (DEP) 및 트라질올(trasylol)을 포함한다. 리포솜은 물속 수중유중수 (water-in-oil-in-water) 에멀션 및 통상적인 리포솜을 포함한다 [참조 : Strejan et al,, (1984) J. Neuroimmunol 7:27].
또한, 활성 화합물은 비경구적으로 또는 복강내로 투여될 수 있다. 분산액은 글리세롤, 액체 폴리에틸렌 글리콜 및 이들의 혼합물, 및 오일 중에서 제조될 수 있다. 저장 및 사용의 일반적 조건하에서, 이들 제제는 미생물의 증식을 방지하기 위해 방부제를 함유할 수 있다.
주사용으로 적합한 약제 조성물은 살균 수용액(수용성인 경우) 또는 분산액, 및 살균 주사용 용액 또는 분산액의 즉시 준비를 위한 살균 분말을 포함한다. 모든 경우에, 조성물은 무균 상태이어야 하고, 주사가 용이할 정도로 유동성이어야 한다. 이것은 제조 및 저장의 조건하에서 안정해야 하고, 박테리아 및 진균과 같은 미생물의 오염 작용에 대해 보호되어 한다. 담체는, 예를 들어 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 플리에틸렌 글리콜 등), 및 이들의 적합한 혼합물을 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 예를 들어, 레시틴과 같은 코팅의 사용에 의해, 분산액의 경우에는 요구되는 입자 크기의 유지에 의해, 그리고 계면활성제의 사용에 의해 적합한 유동성이 유지될 수 있다. 미생물 작용의 방지는 다양한 항박테리아제 및 항진균제, 예를 들어 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 아소르브산, 티메로잘 등에 의해 달성될 수 있다. 많은 경우에, 조성물 중에 등장제, 예를 들어 당류, 만니톨 및 소르비톨과 같은 폴리알코올, 및 염화 나트륨을 포함시키는 것이 바람직할 것이다. 주사용 조성물의 지속성 흡수는 흡수를 지연시키는 제제, 예를 들어 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴을 조성물 중에 포함시킴으로써 유발될 수 있다.
살균 주사 용액은 필요에 따라 상기 나열된 성분들 중 하나 또는 이들의 조합물과 함께 적당한 용매 중에 활성 화합물(예를 들어, gp39의 길항 물질)을 필요한 양으로 흡입시킨 후, 여과 살균시킴으로써 제조될 수 있다. 일반적으로, 분산액은 염기성 분산 매질 및 상기 나열된 성분으로부터의 필요한 다른 성분을 함유하는 살균 비히클 내로 활성 화합물을 혼입시킴으로써 제조된다. 살균 주사 용액의 제조를 위한 살균 분말의 경우, 바람직한 제조 방법은 진공 건조 및 동결 건조이며, 이는 이미 살균 여과된 용액으로부터 활성 성분(예를 들어, 길항물질)과 임의의 추가의 바람직한 성분의 분말을 생성시킨다.
활성 화합물이 상기 기술된 바와 같이 적합하게 보호되는 경우, 단백질은 예를 들어 불활성 희석제 또는 흡수성 식용 담체와 함께 경구적으로 투여될 수 있다, 본원에서 사용되는 "약제학적으로 허용될 수 있는 담체"는 임의의 모든 용매, 분산 매질, 코팅, 항박테리아제, 항진균제, 등장제 및 흡수 지연제 등을 포함한다. 약제학적 활성 성분에 대해 이러한 매질과 제제를 사용하는 것은 당분야에 널리 공지되어 있다. 임의의 통상적 매질 또는 제제가 활성 화합물과 양립할 수 없는 경우를 제외하고는, 치료 조성물에 이들을 사용하는 것이 고려된다, 보충적 활성 화합물이또한 조성물에 혼입될 수 있다.
투여의 용이성 및 용량의 균일성을 위해, 단위 제형으로 비경구용 조성물을 제형화하는 것이 특히 유리하다. 본원에 사용되는 바와 같은 단위 제형은 치료하려는 포유동물 피검체에 대한 단위 용량으로서 적합한 물리적으로 불연속적인 단위를 의미하며; 각각의 단위는 필요한 약제학적 담체와 함께 바람직한 치료 효과를 발생시키도록 계산된 소정량의 활성 화합물을 함유한다. 본 발명의 단위 제형에 대한 상세한 사항은 (a) 활성 화합물의 독특한 특징 및 달성하려는 특정 치료 효과 및 (b) 개체의 민감성의 치료를 위한 이러한 화합물을 합성하는 데에 있어서의 당 분야에 존재하는 고유 제한으로 규정되고, 이들에 직접적으로 의존적이다.
생체내에서의 T 세포의 내성화 이외에, 본 발명은 예를 들어, gp39 길항물질의 존재하에서 항원 제공 세포와 접촉시킴으로써 T 세포를 생체외에서 내성화시키는 것을 포함한다. 예를 들어, T 세포는 피검체로부터 수득되어 항원 제공 세포 및 길항물질과의 배양에 의해 생체외에서 내성화된 후, 피검체에게 재투여될 수 있다.
IV. 본 발명의 방법의 용도
본 발명의 방법은 다양한 항원에 대해 T 세포 내성을 유도하는 데에 적용될 수 있다. 예를 들어, T 세포 내성은 실시예 1에 기술된 바와 같이 가용성 항원(예를 들어, 가용성 단백질)에 대해 유도될 수 있다. T 세포는 비정상적 면역 반응과 관련된 자가면역 질환 또는 질병에 관여하는 항원에 대해 내성화될 수 있다. 예를 들어, 하나의 구체예에서, 항원은 자가항원이다. 또 다른 구체예에서, 항원은 알레르겐이다. 대안적으로, T 세포는 외래 세포 상에서 발현되는 항원에 대해 내성화될수 있다 (실시예 2 내지 5에 기술된 바와 같음). 따라서, 또 다른 구체예에서, 항원은 동종항원 또는 이종 항원이다. 동종 항원 및 이종 항원에 대한 T 세포 내성의 유도는 예를 들어, 조직 또는 기관 이식편 또는 골수 이식체와 같은 공여자 이식편의 수용자에 대한 거부반응을 억제하기 위해 특히 이식에 사용된다. 또한, 골수 이식편 내의 공여자 T 세포를 내성화시키는 것은 이식편 대 숙주 질환을 억제하는 데에 유용하다 (실시예 5 참조).
본 발명은 비제한적인 하기 실시예에 의해 추가로 예시된다. 본원에서 인용된 모든 문헌, 특허 및 발표된 특허출원이 본원에 참고문헌으로 인용되었다.
실시예 1
: 항원 특이적 내성의 유도
방법
마우스를 KLH 펄스된 비장 B 림프구로 5일 동안 면역화시켰다. 일차 면역차 동안, 동물을 항-gp39 항체 MR1으로 처리하거나 처리하지 않았다, 초기 면역화시킨지 5일 후에, 마우스에게 완전 프로인트(Freund) 애쥬번트(CFA) 중의 KLH로 국소(사료 패드) 시험투여하였다. 마우스를 5일 후에 희생시키고, 유출 림프절을 절제하여, KLH에 대한 T 세포 증식 반응을 시험관내에서 계속 검정하였다.
결과
항원으로 펄스된 활성화된 B 림프구로 면역화되고, 계속해서 동일한 항원으로 시험투여된 동물은 면역 항원에 대한 상당한 면역 반응을 개시하였다. 항원 특이적 T 림프구의 증식에 의해 측정된 반응을 제 1 도에 도시하였다. 일차 면역화 동안 동물을 항-gp39 항체로 동물을 처리하는 것은 시험관내에서 항원 시험투여시에 항원 특이적 T 림프구의 무반응을 초래하였다. 항-gp39 항체로 처리된 동물로부터의 림프절로부터 수득된 T 림프구는, 처리되지 않은 동물의 림프절로부터 수득된 T 림프구와 비교하여 감소된 증식 능력을 나타내었다.
실시예 2
: 동종 세포에 대한 T 세포 내성의 유도
방법
Balb/c (H-2d) 마우스를 DBA/2 (H-2b) 마우스로부터의 동종 비장 B 세포로 면역화시켰다. 면역화 후 5일 동안 동물을 항-gp39 항체인 MR1로 처리하거나, 처리하지 않았다. 6일째에, 동물들을 희생시키고, 비장을 절제하였다. 항-gp39 항체 처리 또는 비처리 동물로부터의 비장 세포를 계속해서 자극 없이 또는 방사선 조사된 DBA/2 비장 세포로 시험관내에서 배양시켰다. 배양을 시작한지 3일 후에, 이러한 이차 동종 자극에 대한 증식 반응을 측정하였다.
결과
동종 비장 B 세포로 면역화된 동물로부터의 T 림프구는 시험관내에서 동일한 세포로 5일 후에 시험투여하는 경우, 강한 증식 반응을 개시하였다 (제 2 도). 그러나, 동종 비장 B 세포로 면역화되고, 항-gp39 항체로 처리된 마우스로부터의 T 림프구는, 계속해서 시험관내에서 시험투여하는 경우, 감소된 증식 능력을 나타내었다. 항-gp39 항체 처리된 마우스는 대조 비처리 마우스와 비교하여 시험투여에 대한 반응성이 약 50% 감소하였다.
실시예 3
: 항-gp 39 처리는 동종 B 세포에 대한 CTL 반응의 발생을 방해한다.
본 실시예에서는, 세포독성 T 세포(CTL)의 생성에서의 gp39의 역할을 조사하였다. CTL의 발생에서의 gp39의 생체내 기능을 분석하기 위해, 동종 B 세포에 의한 면역화에 의한 동종특이적 CTL의 생성에 대한 항-gp39 처리의 영향을 검사하였다. 일차 및 이차 CTL 반응 둘 모두의 항-gp39 처리의 영향을 결정하였다.
일차 CTL 반응
항-gp39가 생체내에서 항원성 B 세포가 동종특이적 CTL 반응을 유도하는 것을 억제할 수 있는지를 시험하기 위해, 동종 B 세포 (T-기갈된 비장 세포)를 항-gp39와 함께 또는 항-gp39 없이 수용자 마우스에 투여하였다. Balb/c 마우스[암컷, 6 내지 8주령(Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME)]를 항-Thy1.2(ATCC 클론 HO13.4로부터 제조된 복수) 및 토끼 보충 처리에 의해 T 세포가 기갈된 C57BL/6[암컷, 6 내지 8주령(Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME)] 비장 세포(30-50 × 106)로 면역화시켰다 그런 다음, 이들 수용자 마우스를 항-gp39로 5 일 동안 처리(0, 2 및 4일째에 250 mg/수용자) 하거나, 처리하지 않았다. 5일째에, 비장을 절제하고, CTL 반응을 4시간의 크롬 방출 검정을 사용하여 측정하였다. 프라이밍되지 않은 Balb/c 마우스로부터의 비장 세포를 네거티브 대조 이펙터 세포로서 사용하였다. 사용된 표적 세포는 E 암컷 K1(H-2b, C57BL/6 균주로부터 유래된 T 세포 림프종) 및 P815(H-2d, DBA/2J 균주로부터 유래된 비만 세포종)이다.51Cr-표지된 표적 세포를 세척하고, 100:1, 20:1 및 4:1의 이펙터:표적(E:T) 비로 이펙터 세포를 갖는 96-웰 플레이트 중에 웰당 1 × 104세포로 플레이팅하였다. 플레이트를 간단히 원심분리시킨 후, 4 시간 동안 5% CO2중에서 37℃로 큐베이션시켰다. 플레이트를 다시 한번 원심분리시키고, 감마 카운팅[매릴랜드 게티스버그에 소재하는 LKB 클리니감마, 월레이스, 인코포레이티드(LKB Clinigamma, Wallace Inc.)]을 위해 각각의 웰로부터 무세포 상층액 100 ml를 수집하였다. 특이적 용해율(%)을 (a-b)/c로 규정하였으며, 여기에서 a는 이펙터 세포와 함께 인큐베이션된 표적 세포에 의해 방출된 cpm이고, b는 배지만으로 인큐베이션시킨 표적 세포에 의해 방출된 cpm (자발적 방출)이고, c는 표적 세포로부터의 동결-해동 방출성 cpm (전체 cpm의 약 80%가 혼입됨)이다. P815 표적은 시험된 세포 샘플에 의해서는 용해되지 않았다. E 암컷 K1 표적에 대한 결과를 제 3A도에 예시하였으며, 여기에서 도시된 군은 비처리 마우스(■), 항-gp39 처리 마우스(△) 및 프라이밍되지 않은 Balb/c 마우스로부터의 비장 세포(●: 네거티브 대조군 이펙터 세포로서 사용됨)이다. 이러한 결과는 항-gp39 및 동종 세포를 수용한 마우스가 동종 B세포에 반응하여 생체내에서 일차 CTL 반응을 발생시키지 않음을 증명한다. 이와 대조적으로, 항-gp39의 부재하에, 동종 B 세포는 동종항원에 대해 수용자 동물을 감작시키고, 실질적인 CTL 반응을 유도하였다.
항-gp39가 비활성화된 비장 B 세포의 면역관용원성 효과를 증폭할 수 있는지만을 측정하기 위해, LPS 활성화된 B 세포를 사용하여, 항-gp39의 존재 또는 부재하에 CTL을 프라이밍시켰다. C57BL/6 마우스로부터의 B 세포를 상기 기술된 바와같이 제조하고, 리포다당류[LPS; 50 mg/ml; 미주리 세인트루이스에 소재하는 시그마 디아그노스틱스(Sigma Diagnostics)]의 존재 또는 부재하에 2일 동안 배양시켰다. 그런 다음, 세포를 모으고, 충분히 세척하고, Bal/c 수용자 마우스에 복강내 주입하였다 (30-50 × 106). 상기 기술한 바와 같이, 수용자 마우스를 0, 2 및 4일째에 항-gp39로 처리하거나, 처리하지 않았다. 5일째에, 비장을 절제하고 CTL 반응을 상기 기술한 바와 같이 결정하였다. 2가지 별도의 실험의 결과를 제 3B도(상부 및 하부 패널)에 도시하였다. 표시된 군은 처리되지 않은 생체내 LPS 아세포(＞), 항-gp39 처리된 생체내 LPS 아세포(●), 처리되지 않은 생체내 휴지 B 세포(○) 및 항-gp39 처리된 생체내 휴지 B 세포(□)이다. 결과는, 완전하지는 않지만, 항-gp39 처리가 동종 LPS 아세포에 대한 일차 CTL 반응도 감소시킴을 나타낸다.
이차 CTL 반응
CTL 형성에 대한 항-gp39 및 동종 B 세포 투여의 영향을 시험하기 위해, 처리된 마우스 및 비처리 마우스로부터의 비장 세포를 시험관내에서 자극하고, CTL 반응의 범위를 조사하였다. 상기 기술된 바와 같이, Balb/c 마우스를 C57BL/6-유래된 B 세포로 생체내에서 프라이밍시켰다. 항-gp39 및 대조군 햄스터 Ig (HIg)-처리된 동물로부터의 비장 세포를 절제하고, 5 x 106세포/ml를 5 × 106자극자/ml로 비장 B 세포(항-Thy1.2 + 보충 처리에 의해 준비)의 다양한 미토마이신 C 처리된(2.5 mg/ml, 37 ℃, 미주리 세인트 루이스에 소재하는 시그마 디아그노스틱스) 균주와 함께 5일 동안 배양시켰다 ("반응자"). 자극자 군은 각각 이차 동종 반응 및 일차 동계 반응을 나타내는 C57BL/6(H-2b) 및 Balb/c(H-2d)였다. 자극자 및 반응자 세포를 새로 준비한 감작 RPMI-1640 배지[매릴랜드 워커스빌에 소재하는 바이오 휘태커 (Bio Whittaker)], 1 × 105M 2-메르캅토에탄올[캘리포니아 허클레스에 소재하는 바이오-래드 라보라토리즈(Bio-Rad Laboratories)], 2 mM L-글루타민]미주리 세이트루이스에 소재하는 시그마 디아그노스틱스], 500 U/ml 페니실린 및 500 U/ml 스트렙토마이신[미주리 세이트루이스에 소재하는 시그마 디아그노스틱스] 중에서 배양시켰다. 5일 후, 반응자 세포를 모으고, 사멸된 세포를 밀도 구배상에서의 원심분리에 의해 제거하였다. 생성된 생세포를 상기 기술된 바와 같이 CTL 검정에서 이펙터로서 사용하였다. 표적은 E 암컷 K1(H-2b, C57BL/6 균주로부터 유래된 T 세포 림프종) 및 P815 (H-2b, DBA/2J 균주로부터 유래된 비만 세포종)를 포함한다. 결과를 제 4A도에 도시하였다. 도시된 동종 자극 이펙터 군은 Hlg 처리 수용자(●), 나이브 Balb/c (＞) 및 항-gp39 처리 수용자(■)이다. 상응하는 동계 반응(Balb/c 세포로 자극된 Balb/c 세포)은 개방 기호로 나타내었다. 예상되는 바와 같이, 항-gp39 처리의 부재하에서의 동종 T-기갈 비장 세포 (H-2b)에 의한 마우스의 생체내 면역화는 시험관내에서 강한 이차 CTL 반응을 유발시켰다. 강화된 이차 항 -H-2bCTL 반응은, 마우스가 생체내에서 항-gp39를 수용하는 경우에는 관찰되지 않았다.
항-gp39 처리에 의한 CTL 반응의 억제의 특이성을 결정하기 위해, 상기 기술된 바와 같은 비장 세포 배양액을 CTL 검정에서, 자극자로서 B10BR (H-2K) 비장 B 세포를 사용하고, 표적으로서 SL8 (H-2k, AKR 균주로부터 유래된 자발적 T 세포 림프종)을 사용하여, 항-H-2k동종 반응(제 3 부분 동종 반응)에 대해 분석하였다. 결과를 제 4B도에 도시하였다. 도시된 군은 나이브 Balb/c(○) 및 항-gp39 처리 수용자(■)이다. 결과는 H-2b비장 세포 및 항-gp39의 투여가 방관자 동종항원 (H-2k)에 대한 시험관내 CTL 반응을 변경시키지 않기 때문에, 항-gp39 처리에 의한 항-H2b특이적 CTL 반응의 억제가 동종특이적임을 증명한다.
종합하면, 이들 데이터는 항-gp39이 동종특이적 CTL 반응(일차 및 이차 둘 모두)의 발생을 방해함을 보여준다. 항-gp39의 존재하에, 시험관내 이차 배양물에서 일부 항-H-2bCTL 활성이 나타날 수 있기 때문에, 관련 동종 항원에 대해 특이적인 CTL 전구체가 여전히 존재한다. 결과적으로, 항-gp39 처리가 CTL 프라이밍을 블로킹시키거나 프라이밍된 동종특이적 CTL의 빈도수를 감소시킴으로써, 이차 시험관내 반응을 감소시킬 수 있다. 휴지 B 세포의 사용은 LPS 아세포에 의해 유도되는 동종 CTL 반응이 또한 항-gp39에 의해 손상되었기 때문에, 이러한 무반응을 증명하기 위해 필수적인 것은 아니다.
실시예 4: 수용자가 gp39에 대한 항체로 처리된 경우, 동종 뮤린 골수의 이식은 안정한 키메라를 유도한다.
통상적 화학요법에 의해 치료될 수 없는 많은 혈액학적 질환의 치료는 동종 골수 이식과 관련되어 있다. 이러한 적극적 치료는 동종 골수의 관류와 커플링된 화학요법의 골수를 제거할 수 있는 고용량의 투여가 클론원성 종양 세포의 소거를 가능하게 하는 것과 관련되어 있다.
흉선 T 세포를 제거하는 흉선 방사선 조사가 항-CD4 mAb를 포함하는 T 세포에 대한 단클론성 항체(mAb)를 사용하였을 때, 안정한 키메라의 발생을 증가시킴은 이미 밝혀져 있다. 이러한 항체 방법은 T 세포 제거 및 그에 따른 공여자 특이적 내성을 유도하며, 이는 공여자 피부 이식편에 대한내성에 의해 제시될 수 있었다. 300 rad WBI, 생체내 항-T 세포 mAb 치료 및 이종 골수의 투여 후에 영구적 동종이식의 달성에 실패하는 것은 흉선 내의 영향받지 않은 T 세포로 인한 것일 수 있다. 항-CD4 및 항-CD8 mAb의 사용은 말초혈 및 비장 T 세포의 효과적인 감소를 유도할 수 있으나, 흉선 T 세포는 간단하게 mAb로 피복되지만, 제거되지는 않는다. 따라서, 흉선 방사선 조사는 마우스를 대상으로 수행된다.
방법
이식편 대 숙주 질환이 유도되는 것을 피하기 위해, 환자 체내로의 F1의 동종 골수 이식(BMT)을 위한 뮤린 모델을 사용하였다. 본 발명자들은 H-2d/b의 전체 MHC 일배체형을 생성시키는 (C57BL/6 x Balb/c)F1인 F1 균주 CB6를 사용하였다. 골수를 절제하고, 항-gp39 항체, MR1의 존재 또는 부재하에, 방사선 조사된 BALB/c모체내에 정맥내 주입하였다. 키메리즘 (chimerism)의 최고 레벨을 결정하고, 각각의 방사선 조사 제벨을 사용하여 항-gp39 항체 처리된 동물과 비처리 동물을 비교하기 위해, 전신 방사선 조사(WBI) 레벨을 변동시켰다. H-2d(BALB/C) 마우스내에 존재하는 H-2bMHC 일배체형의 말초혈 림프구의 유동 혈구계산 분석에 의해 키메리즘을 결정하였다. 이러한 마우스의 결합이 적합하고, 키메라가 500 및 600 rad WBI의 레벨로 수득될 수 있음은 이전에 밝혀졌다.
결과
키메리즘을 유동 혈구계산법에 의한 C57BL/6 유래된 세포(H-2b)의 확인에 의해 검출하였다. 키메리즘은 본 연구의 출발로부터 항-gp39 항체로 처리되었을 경우에만, 14일 내에 400, 500 및 600 전신 방사선 조사된 마우스에서 발생하는 것으로 밝혀졌다 항체 처리되지 않은 마우스는 600 전신방사선 조사된 경우를 제외하고, 방사선 조사의 모든 레벨에서 세포를 거부 하였으며, 이에 의해 이들에게 400 rad에서 항체 처리된 군과 같은 정도로 골수를 제공하였다 (표 1). 항-gp39 항체 치료법으로 400, 500 및 600 rad 에서 치료한 지 6주 후의 키메리즘의 레벨은 각각 70.7 + 5.74, 94.1 및 84.4 + 8.56인 것으로 밝혀졌지만, 처리되지 않은 것은 600 rad에서 85.7 +8.56 키메라성으로 밝혀졌다 (표 2). 이러한 점에서 세포의 표현형화는-T세포, B 세포 및 대식세포가 모두 키메라화되었고, 처리된 경우 400 rad에 대한 동일한 정도가 600 rad 비처리 군과 비교됨을 시사하는 것이다 (표 2). 또한,항-gp39 항체 처리가 말초내의 림프구 세포의 전체 백분율 개체군을 현저하게 변화시키지 않는 것으로 나타났다. 항-gp39 항체에 의한 동물의 처리를 마쳤을 때, 동물은 이식 8주 후까지 안정하게 키메라성인 것으로 밝혀졌다.
[표 1]
키메리즘을 발생시키는 전신 방사선 조사의 레벨. 괄호안의 수는 각각의 레벨에서 시험된 동물의 전체 수를 나타낸다.
[표 2]
H-2Kb±표준 오차에 대해 포지티브인 B 세포, T 세포 및 대식세포(Mac.)의 백분율.
실시예 5: 항-gp39에 의한 수용자의 처리와 결합된 동종 골수 이식은 급성 및 만성 이식편 대 숙주 질환을 억제한다.
하기 방법을 본 실시예에 사용하였다 :
마우스 : DBA/2 (H-2d), C57BL/6 (H-2d) 및 B6D2F1, ((C57BL/6 (H-2d) x DBA/2)F1, 하이브리드) 마우스를 NCI 실험실[매릴랜드, 베테스다(Bethesda, Maryland)에 소재함]로부터 입수하여, 다아트마우쓰 메디칼 스쿨(Dartmouth Medical School)에 있는 애니멀 패실리티(Animal facility)에서 바이러스가 없는 환경에서 유지시켰다. 이 연구에 사용된 마우스는 모두 암컷이고, 6 내지 8주령 이었다.
만성 GVHD의 유도 : 만성 GVHD를 모체 (DBA/2) 비장 세포를 방사선 조사되지 않은 (C57BL/6 x DBA/2)F1, 하이브리드 수용 동물 체내에 정맥내 주입함으로써 유도시켰다(참조 : Fast, L.D. (1990) J. Immunol/. 144:4177). 모체 마우스를 마취시키고, 비장의 제거를 위한 방법 도중에 목 탈구에 의해 치사시켰다. 분리한 비장 세포를 세척하고, F1수용 동물 체내로의 정맥내 주입을 위해 RPMI 1640 매질[매릴랜드 월더스빌에 소재하는 휘태커 (Whittaker)] 중에 재현탁시켰다.
급성 GVHD의 유도 : 급성 GVHD를 방사선 조사되지 않은 (C57BL/6 x DBA/2)F1하이브리드 수용 동물 체내에 모체 C57BL/6 비장 세포를 정맥내 주입함으로써 유도시켰다. 세포들을 만성 GVHD 유도에 대해서와 같이 이식을 위해 준비하였다.
항체 : 항-gp39 : MRI을 증래에 기술된 바와 같이, 복수 내에서 생성시키고, 이온 교환 HPLC에 의해 정제하였다 [참조 : Foy, T. M. et al. (1993) J. Exp,Med. 178:1567-1575 ; Noelle, R.J. et al. (1992) Proc. Natl. Acad, Sci. USA 89:6550], 다클론성 항-이소타입 항체 : 모든 항-IgGl및 IgA 항체 및 표준 대조군을 알라바마, 버밍엄에 소재하는 서던 바이오테크놀로지 어소시에이츠, 인코포레이티드(Southern Biotechnology Associates, Inc.)로부터 입수하였다. 항-IgE 항체 : IgE 특이적 ELIZA에 사용된 모든 항-IgE 항체 (BIE3 및 바이오틴 AM95) 및 표준 물질(A3B1)을 티. 월드슈미트, 아이에이 박사(Dr. T. Waldschmidt, IA)로부터 기증받았다. 항-MHC 일배체형 항체 : H-2KbFITC 컨쥬게이션된 항체 및 H-2Dd바이오틴 컨쥬게이션된 항체를 캘리포니아, 샌디에고에 소재하는 파르밍엔(PharMingen)으로부터 입수하였다.
세포주 : 사용된 세포주는 아메리칸 타입 컬춰 컬렉션으로부터 입수한 P8l5 (H-2d) 및 LB27.4(H-2b×d)를 포함하였다. 세포주 c1.18.5(H-2b)는 윌리엄 알. 그린 박사(Dr. William R. Green)로부터 기증받았다.
시험관내에서의 다클론성 Ig 생성 : 대조군 및 cGVHD 마우스로부터의 비장을 절제하고, 단일 세포 현탁액을 준비하였다. 세포를 트리스-완충 염화암모늄으로 처리하여, 적혈구를 제거하고, 전체 백혈구 세포 수를 육안헤모사이토미터 계수에 의해 결정하였다. 세포를 5% CO2하에, 37℃에서 3일 동안 완전 (c)RPMI-1640 배지(10% 태아 혈청(Hyclone, Logan UT), 25 mM HEPES, 2 mM L-글루타민, 5000 U/ml 페니실린 및 5000 mg/ml 스트렙토마이신으로 보충됨) 1 ml 중에서 인큐베이션시켰다 (5× 106). 배양액 상층액을 세포를 펠릿화시켜 모으고, Ig를 이소타입 특이적 ELISA 검정에 의해 정량화하였다.
이소타입 특이적 및 항원 특이적 ELISA : IgG1및 IgA를 검출하기 위한 ELISA : PBS 중의 염소 항-마우스 IgGl또는 IgA(10㎍/㎖ ; 알라바마, 버밍엄에 소재하는 서던 바이오테크놀로지 어소시에이츠, 인코포레이티드)를 37℃에서 1시간 동안, 그 다음 4℃에서 밤새동안 96-웰 폴리비닐 마이크로 역가 플레이트의 웰 상에 흡수시켰다. 플레이트를 세척하고, 37 ℃에서 1시간 동안 1% FCS를 함유하는 PBS로 블록킹시켰다. 적정판을 다시 세척하고, 상층액 및 표준 대조군(IgG1및 IgA, 알라바마, 버밍엄에 소재하는 서던 바이오테크놀로지 어소시에이츠, 인코포레이티드)의 적당한 희석액을 37℃에서 2시간 동안 첨가하였다. 그 후에, 플레이트를 3회 세척하고, 알칼리성 포스파타아제 컨쥬게이션된 염소 항-마우스 IgGl또는 IgA (1/500 희석액) (알라바마, 버밍엄에 소재하는 서던 바이오테크놀로지 어소시에이츠, 인 코포레이티드)를 37℃에서 2시간 동안 첨가하였다. 플레이트를 충분히 세척하고, 포스파타아제 기질(1 mg/ml ; 미주리 세이트루이스에 소재하는 시그마 디아그노스틱스)을 첨가하였을 때, 적당한 색 변화가 나타났다. 410 nm의 흡수도에서 ELISA 판독기[다이나테크 라보라토리즈, 인코포레이티드 (Dynatech Laboratories, Inc.)]에 의해 판독값을 측정하였다. Ig의 농도를 적당한 이소타입 표준 곡선과의 비교에 의해 측정하고, 평균 + 표준오차(n=3) 로서 표시하였다.
IgE를 검출하기 위한 ELISA : 96-웰 폴리비닐 마이크로 역가 플레이트의 웰을 4℃에서 밤새동안 항-마우스 IgE 포획 항체[B1E3 (2 mg/ml)]로 피복시킨 후, 37℃에서 1시간 동안 1% FCS를 함유하는 PBS로 블륵킹시켰다. 플레이트를 다시 세척하고, 상층액 및 표준 대조군[A3B1(IgE)]의 적당한 희석액을 37℃에서 2시간 동안 첨가하였다. 적정판을 충분히 세척하고, EM95-바이오틴(5 mg/ml)을 각각의 웰에 첨가하고, 37℃에서 2시간 동안 인큐베이션시켰다. 그 후에, 추가로 2시간 동안 스트렙타바딘에 컨쥬게이션된 알칼리성 포스파타아제를 첨가(1/500 희석액)한 후, 포스파타아제 기질(1 mg/ml ; 미주리 세인트루이스에 소재하는 시그마 디아그노스틱스)의 첨가 전에 충분히 세척하여, 적당한 색 변화를 유발시켰다. 410 nm의 흡수도에서 ELISA판독기(다이나테크 라보라토리즈, 인코포레이티드)에 의해 판독값을 측정하였다. Ig의 농도를 표준 극선과의 비교에 의해 측정하고, 평균 + 표준오차 (n=3)로 표시하였다.
항-DNA Ab를 검출하기 위한 ELISA : 송아지 흉선 DNA(미주리 세이트루이스에 소재하는 시그마)(5㎍/㎖)를 0.1 M 탄산나트륨/중탄산나트륨을 함유하는 커플링 완충액(pH 9.8) 중에 용해시켰다. 이것을 10분 동안 비등시킨 후, 3분 동안 얼음 상에서 인큐베이션시켰다. 그 후에, DNA의 CD 260을 측정하고, 필요한 (5㎍/㎖) DNA가 얻어지도록 농도를 조절하였다. 그 후에, 100㎕를 96-웰 폴리비닐 마이크로 역가 플레이트의 웰에 첨가하고, 4℃에서 밤새동안 인큐베이션시켰다. 그 후에, 플레이트를 3회 세척하고, 37℃에서 1시간 동안 1% FCS 및 0.02% 나트륨 아지드를 함유하는 PBS로 블록킹시켰다. 플레이트를 다시 세척하고, 혈청 샘플의 연속 희석액을첨가하고 (100 ml) 37℃에서 2시간 동안 인큐베이션시켰다. 검출 항체, 염소 항 마우스 IgGl알칼리성 포스파타아제를 각각의 웰에 첨가하고, 37℃에서 2시간 동안 다시 한번 인큐베이션시켰다. 플레이트를 충분히 세척하고, 포스파타아 제 기질(1 mg/ml; 미주리 세인트루이스에 소재하는 시그마 디아그노스틱스)을 첨가하여, 적당한 색 변화를 유발시켰다. 410 nm의 흡수도에서 ELISA판독기(다이나테크 라보라토리즈, 인코포레이티드)에 의해 판독값을 측정하였다. 항체 역가를 포지티브 혈청 샘플과 비교하고, 결과를 임의적 단위로 표시하였다.
공여자 유래된 세포를 검출하기 위한 유동 혈구계산 분석. 항-gp39 로 처리되거나 처리되지 않은 cGVHD 마우스인 정상 BDF1으로부터 비장을 절제하여, 단일 세포 현탁액을 준비하였다. 세포를 피콜-하이파크 (Ficoll-Hypaque)(4:1) 상에 적층시킨 후에, 실온에서 20분 동안 2000 rpm으로 원심분리시켰다. 생성된 림프구 층을 분리하고, 5% FCS를 함유한 BSS로 한번 세척하였다. 튜브 1개당 1 × 106개 세포를 최종 부피 50㎕에서 염색을 위해 사용하였다. 래트 혈청 50㎕를 각각의 튜브에 첨가하여 항체의 비특이적 결합을 방지하였다. 세포를 (a) 대조군 항체: 래트 Ig FITC(1:100 최종 희석) 및 PE-스트렙타비딘(1:500 최종 희석) 및 (b) FITC H-2Kb및 바이오틴 H-2Db(둘 모두 1:100 최종 희석)로 염색시켰다 세포를 얼음 상에서 20분 동안 인큐베이션시킨 후, 2회 세척하여, 비결합 항체를 모두 제거하였다. 최종적으로, PE-스트렙타비딘(1:500 최종 희석)을 적당한 튜브에 첨가하여, 얼음 상에서 추가로 20분 동안 바이오틴 컨쥬게이션된 항체를 검출하였다. 세포를 2회 세척하여, 벡톤 디킨슨(Becton Dickinson) FACScan에서의 분석을 위해 준비하였다. 전면 및 측면 스캣터를 통해 포지티브 게이팅시킨 후에, 관련된 MHC 일배체형에 대해 포지티브인 세포(%)의 측정을 위해, 샘플 1개당 10,000개 사건을 수집하였다.
CTL 검정을 평가하기 위한 크롬 방출 검정.51Cr-표지된 표적 세포를 세척하고, 100:1, 20:1 및 4:1의 E:T 비에서 이펙터 세포로 96 웰 플레이트 중에 웰당 1 × 104으로 플레이팅하였다. 사용된 표적 세포에는 P815(H-2d), LB27.4(H-2b×d) 및 c118.5(H-2b)가 포함된다. 플레이트를 간단하게 원심분리시킨 후, 4시간 동안 5% CO2하에 37℃에서 인큐베이션시켰다. 플레이트를 다시 한번 원심분리시키고, 감마 카운터에 의한 계수를 위해 각각의 웰로부터 세포 비함유 상층액의 분취액을 수집하였다. 특이적 용해(%)를 (a-b)/c로 규정하였으며, 여기에서 a는 이펙터 세포와 함께 인큐베이션시킨 표적 세포에 의해 방출된 cpm이고, b는 배지만으로 인큐베이션시킨 표적 세포에 의해 방출된 cpm(자발적 방출)이고, c는 표적 동결-해동 방출 가능한 cpm(혼입된 전체 cpm의 약 80%)이다.
시험관내에서의 급성 GVHD 비장 세포의 이차 자극. 급성 GVHD 비장을 항-gp39 처리된 동물, HIg 처리된 동물 또는 비처리 동물로부터 절제하였다. 비장으로부터 적혈구를 기갈시킨 후, 세포 웰당 1 × 104로 분취시켰다. 방사선 조사된 자극자 세포(P815)를 적당한 웰에 첨가하였다. 상기에서 언급한 바와 같이, 7일 후에,적당한 표적에 대하여 CTL 검정을 수행하 였다.
결과
마우스에서의 GVHD는 거비증을 유발시킨다. 마우스에서, cGVHD의 결과 중 하나는 비장의 증대이다. 공여자 세포의 존재에 대한 반응일지라도, 비장을 침윤시키고 증대시키는 것은 주로 숙주 자신의 세포이다 [참조 : Rolink, A.G. et aI. (1983) J. Exp. Med. 158:546]. 제 5도는 cGVHD의 개시 7 내지 14일 후, 비장이 cGVHD가 없는 마우스와 비교하여 거의 2배의 백혈구를 함유함을 나타낸다. cGVHD의 개시에서 마우스를 항-gp39(250㎍/마우스, 0, 2, 4 및 6일)로 처리하는 것은, cGVHD 마우스의 백혈구/비장의 수를 질환이 없는 마우스에서 확인된 값으로 감소시켰다.
다클론성 면역글로불린의 GVHD-유도된 과잉생성. 공여자 T 세포와 B 세포 사이의 동종 상호작용으로 인해, cGVHD 마우스에서 Ig의 과잉생성이 발생함이 보고되어 있다 [참조 : Morris, S.E. at aI. (1990) J. Exp. Med. 171:503], 항-gp39가 Ig의 과잉생성을 억제하는 지를 결정하기 위해, cGVHD 마우스에 항-gp39를 투여하였다. 7 또는 14일째에, 대조군 및 cGVHD 마우스로부터 비장을 절제하고, 시험관내에서 IgGl및 IgA의 자발적생성에 대해 B 세포를 검정하였다. cGVHD 마우스로부터의 비장 세포는 시험관내에서 IgA 및 IgG1(제 6A도 및 6B도)를 높은 레벨로 생성시켰다. 그러나, 항-gp39로 처리된(0, 2, 4 및 6일) cGVHD 마우스로부터의 비장 세포는 질환이 없는 마우스와 동일한 레벨의 IgG1및 IgA를 생성시켰다. cGVHD 마우스로부터의 비장 세포의 배양액에 항-gp39의 첨가는, 시험관내에서 Ig 생성의 레벨을 감소시키지 않았으며, 이는 항-gp39가 생체내에서 이의 효과를 발휘하였음을 시사한다.
햄스터 Ig(Hlg)를 이러한 실험의 대조군으로서 사용하는 경우, GVHD의 유도에서 억제 역할을 나타내지 않지만, 사실상, 다클론성 Ig 생성 및 초래된 거비증에서 질환을 두드러지게 함이 밝혀졌다. 처리되지 않은 1주된 GVHD-유도 마우스와 비교하여, 1주 HIg 처리된 GVHD-유도 마우스에 의해 생성되는 Ig의 레벨로 8배 증가가 검출되었다. HIg가 그 자체로 면역원임은 명백하였다. 결과적으로, 관련된 대조군으로서 비처리 F1수용자 마우스를 지정하기로 결정하였다.
GVHD-유도된 혈청 하이퍼-IgE 및 항-DNA 자가향체에 대한 항-gp39의 효과. 이중 가닥 DNA에 대한 혈청 IgE 및 항체의 증가에 의해 cGVHD의 경과를 모니터링할 수 있었다 [참조 : Morris, S.E. et aI. (1990) J. Exp. Med. 171:503]. 혈청 IgE의 레벨을 IgE 특이적 ELISA를 사용하여 측정하였다. 만성 GVHD 유도된 마우스를 항-gp39로 0, 2, 4 및 6일째에 처리하였고, 더 이상의 항체는 투여하지 않았다. 마우스를 매주 간격으로 채혈하고, 혈청 IgE의 레벨을 평가하였다 (제 7A도). cGVHD는 혈청 IgE 레벨에 있어서 10 내지 15배 증가를 유도하였다. 항-gp39의 투여는 질환의 개시 후 8주까지 혈청 IgE의 cGVHD-유도된 증가를 억제하였다. 상승된 혈청 IgE의 억제 이외에, 항-gp39의 투여는 또한 혈청 항-DNA 자가항체의 발생을 블록킹하였다. 만성 GVHD는 발견된 항-DNA 항체의 레벨에 있어서 5 내지 10배 증가를 유도하였으며, 이는 항-gp39 처리에 의해 감소되었다 (제 7B도).
선행 연구에서, 항-gp39(MR1 클론)의 반감기가 12일임이 입증되었다. [참조 : Foy, T.M. et aI. (1993) J. Exp. Med, 178:1567-1575] 항-gp39의 검출에 대해 특이적인 ELISA 검정은 치료 8주 후에, 처리된 마우스의 혈청에서 항-gp39가 검출될 수 없음을 나타내었다. 따라서, 지속적인 항-gp39는 cGVHD의 연장된 억제를 설명할 수 없었다, cGVHD 마우스 및 항-gp39를 투여한 마우스로부터의 비장 세포가 cGVHD를 전달할 수 있는 지를 조사하기 위해, 이식 연구를 수행하였다. cGVHD 및 항-gp39를 투여한 마우스로부터의 비장 세포는 선택 이식시에 IgE 및 항-DNA 자가항체의 혈청 농도의 증가를 유도시킬 수 없지만; cGVHD 마우스로부터의 비장 세포는 향상된 sIgE 및 항-DNA 항체를 유도하였다. 이러한 데이터는, 동종반응성 T 세포가 항-gp 처리의 결과로서 무반응성이 되도록 유도됨을 시사한다.
동종반응성 공여 세포의 검출. cGVHD 유도된 마우스를 이들의 비장 내의 공여자 유도 세포의 존재에 대해 분석하는 경우, H-2Kb및 H-2Dd에 대해 이중 포지티브하게 염색된 정상 BDF1과 비교하여, cGVHD가 약 5 내지 7% 공여자 세포를 함유하는 것으로 밝혀졌다. 이러한 세포는 유도된 DBA/2이고, 따라서 H-2Dd에 대한 단일 포지티브를 염색하였다. 이러한 세포는 항-gp39 처리와 무관한 것으로 나타났다. 이는 항-gp39 처리가 비처리 cGVHD 군에서 다클론성 Ig 생성을 유발시키는 수용자 B 세포에 대한 헬퍼 기능을 유도하지 않으면서 공여자 세포의 이식을 가능하게 함을 예증한다.
급성 GVHD는 유도에서의 항-gp39 처리의 효과. 급성 GVHD는 증 가된 항-동종 CTL 반응의 유도과 관련된다. gp39-CD40 상호작용이 Th-B 세포 상호작용에 중요함은 분명하지만, 항-gp39 치료법에 의해 그밖의 면역 이펙터 메커니즘이 또한 변경될 수 있는 지는 분명하지 않다. AGVHD를 F1수용자에게 C57BL/6 비장을 투여하여 유도하였다. 제 8도에 도시된 바와 같이 동종 세포의 이식 후 8 및 12 일에, 강한 H-2b항 H-2dCTL 반응을 측정하였다. HIg가 아닌 항-gp39로 마우스를 처리하였을 때, H-2b항 H-2dCTL의 발생이 억제되었다 (제 8도). 두 실험 중 하나에서, 항-gp39에 의한 처리는 CTL 반응을 나이브 비장 세포에서 관찰된 것보다 낮게 감소시켰다. 이는 GVHD 마우스의 비장 세포가 시험투여된 경우를 시사하였다. 이러한 비장 세포를 방사선 조사된 P815의 세포의 존재하에 7일 동안 배양한 후, CTL 분석을 수행한 경우, 이들 세포는 P815 세포에 대한 이차 자극을 개시하지 못했지만, 정상 BDF1비장은 일차 반응을 개시하였다. 비처리 GVHD 유도 마우스는 예상한대로 이차 면역 반응을 개시하였다. 이러한 결과는 급성 GVHD 마우스를 항-gp39로 처리하였을 때, CD8+ 군집이 이차 시험투여에 반응하지 않게 됨을 나타낸다.
논의
GVH-유도 마우스에서 항-gp39 투여에 의한 거비증의 반전(제 5도), 과다 Ig 생성의 억제(제 6A도 및 제 6B도), lgE 및 항-DNA 자가 항체 생성의 혈청 레벨의 억제(제 7A도 및 제 7B도)는, 항-gp39가 숙주 B 세포 활성화를 유도하기 위한 이식된 T 세포의 능력을 블로킹시킴을 시사한다. 거비증 및 다클론성 IgG1및 IgA 생성의 이러한 억제는 항체 투여 종료 7일 후에 낮게 유지된다. IgE 및 항-DNA 항체의 감소는 처리가 종료된 후에도 8주 동안 지속된다. 이러한 결과는 T 세포 기능이 반응성 T 세포의 클론성 제거에 의해 영향을 받거나, T 세포 면역성 결여가 발생함을 나타낸다. 면역화된 마우스의 동일계내 연구에서, 사이토카인 생성 세포의 레벨이 항체 처리된 마우스에서 정상으로 유지된다는 점은 이전에 밝혀졌다. [참조 : Van den Eertwegh at aI. (1993) J. Exp. Med. 178:1555-1565]. 이는 T 세포가 처리의 결과로서 제거되지 않았음을 나타낸다. cGVHD 마우스를 공여자 유도 세포의 존재에 대해 분석하는 경우, 이들은 동물이 항-gp39로 처리되었든지 또는 처리되지 않았든지 간에 존재하는 것으로 밝혀졌다. 따라서, 항-gp39는 이러한 공여자 T 세포에 대한 무반응 상태를 유도하여, 항체 반응의 억제를 유도시키는 능력을 가지고 있다. 사실상, 이러한 동물로부터의 비장을 나이브 수용자에 전달하면, 공여자 비장이 비처리 cGVHD인 경우에는 항체의 레벨이 상승되지만, 항-gp39 처리된 cGVHD 마우스는 전달시에 이차 cGVHD 상태를 개시할 수 없다. 이러한 데이터는 항-gp39가 강한 GVHD 임상적 면역병리학 및 거비증을 유도하는 T 세포의 능력에 간섭하여, 항체 투여가 CD4+하위 군집에 대한 무반응을 유도함을 시사한다.
프렌드(Friend) 뮤린 백혈병 바이러스-유도 백혈병에 대한 보호성 T 세포 면역성의 유도에 대한 B 세포 결핍 마우스를 연구함으로써 나타나는 바와 같이, B 세포가 CTL의 유도를 보조하는데 요구됨이 보고되었다 [참조 : Schultz, K.R. et aI.(1990) Science 249]. 따라서, GVHD 유도 마우스에서, 항-gp39가 B 세포의 활성화를 억제하고, 항원 제시를 억제하여, CD8+T 세포를 프라이밍시키는 것으로 고려될 수 있다. 또한, 이는 CD8+CTL의 발생은 클래스 II-제한 Th 세포와의 상호작용을 필요로 하고(참조 : von Boehmer, H. et al. (1979) J. Exp. Med. 150:1134; Keene, J. et al. (1982) J. Exp. Med. 155:768), TCR 친화성이 낮은 경우에, 생체내에서 CD4+ 매개 T 세포 보조가 요구됨(참조 : Gao, X. et al. (1991) J. Immunol, 147:3268)을 시사하였다.
CD8+CTL 반응의 유도에서의 CD28-B7/BB1 상호작용의 역할을 찾기 위한 연구가 수행되어 왔다. CD28-B7/BB1 상호작용은 클래스 I MHC-특이적 CTL의 발생을 위해 필요하고 충분함이 밝혀졌다 [참조 : Harding, F.A. and Allison, J.P. (1993) J. Exp. Med. 177:1791]. CD40에 대한 항체에 의한 정상 및 백혈병 B 세포 상의 B7 발현의 억제와 관련된 연구에서 입증된 바와 같이, CD40에 대한 리간드가 B7에 대한 중요한 유발물질일 수 있음이 제안되었다 [참조 : Ranheim, E.A. and Kipps, T.J. (1993) J. Exp. Med. 177:925]. 이러한 연구는 항-gp39가 CD4+ T 세포와 B 세포의 상호작용을 블로킹하여, B 세포가 T 세포를 효과적으로 활성화시켜서 사이토카인을 증식시키고 생성시키기는 것을 허용하는 B7의 발현을 유도하지 못하게 할 수 있음을 가르킨다. 종합하면, 이러한 데이터는 gp39와 이의 리간드 CD40 사이의 T-B 세포 동종 상호작용에 의한 최초 CTL 형성의 유도를 위해 CD4+T 세포가 요구됨을 시사한다. 그 후에, B 세포 상에서의 CD40의 시그널링은 B7/BB1의 상향조절을가능하게 한다. T 세포 상에서의 B7/BB1과 이것의 리간드 CD28의 상호작용은 향상된 T 세포 증식 및 사이토킨 생성을 가능하게 한다. 그러나, 하나의 시그널만이 T 세포에 제공되고, 즉 CD40과의 gp39 상호작용만이 제공되고, 제 2의 시그널이 수득되지 않는 경우, T 세포 내에서 무반응이 유도되어, 내성화되거나 또는 면역성이 결여되게 된다.
이러한 연구는 GVHD가 마우스에서 유도되는 경우, 항-H-2d반응이 얻어짐을 가르킨다. 그러나 동물을 항-gp39로 처리하는 경우, 어떠한 CTL 반응도 관찰되지 않는다. 항-gp39가 이미 기술된 방법에 의해 CTL 형성을 억제함은 자명해질 수 있다 [참조 : Schultz, K.R. et aI. (1990) Science 249]. B 세포는 CD40 연결을 통해 활성화되지 못하고, 따라서 CTL의 유도를 촉진시킬 수 없다. 또한, 본 발명자들의 연구는 비장 세포가 P815 세포와 함께 시험관내에서 시험투여되는 경우, 생체내에서 항-gp39에 노출된 세포는 이차 항-H-2d CTL을 개시할 수 없게됨을 제시한다. 따라서, 이는 gp39가 CD40에 관여할 수 없어서, B7/BB1이 상향조절되지 않고, T 세포가 더 이상 활성화되지 않고 무반응으로 유지되기 때문에, 항-gp39가 T 세포 구획에 대한 내성 상태를 유도하여 왔음을 제시할 수 있다. 휴지 B 세포가 일반적으로, 항-IgM 항체, PMA 또는 LPS에 의해 예비활성화되지 않는 한은, 혼합된 림프구 반응에서 동종 T 세포의 비효과적인 자극자임이 또한 공지되어 있다 [참조 : Inaba, K. and Steinman, R.M. (1989) J. Exp. Med. 160:1717; Metley, J.P. et aI. (1989) J. Exp. Med 169:239; Frohman, M. and Cowing, C. (1985) J. Immuuol.134:2269]. 또한, 생체내에서 제시를 위한 B 세포에 대한 가용성 단량체 항원은 특이적 T 세포 면역 결여를 발생시킬 수 있다 [참조 : Eynon, E.E. and Parker, D. (1992) J. Exp. Med. 175:131). 따라서, 관련된 항원 및 APC의 투여 방법에 따라, 면역 결여 또는 내성이 유도될 수 있음은 명백한 것으로 보인다. 비장의 CD8+ T 세포 구획에 대한 P815 세포의 시험투여시에, B 세포는 항원 제시를 위해 필요하지 않으며, 동종항원은 직접 제시되어 CTL이 유도될 수 있다. 이차 자극에 대한 비장의 무반응성은 이 시스템에서 동종 특이적 내성이 유도되었음을 제시한다.
이는 내성이 항원 특이적 시스템에서 항체에 의해 유도되지 않음을 가르키는 종래의 결과와는 반대되는 것이다 [참조 : Foy, T.M. et aI. (1993) J. Exp. Med. 178:1567-1575]. GVHD 모델이 항원 제시 세포에 이미 결합되어 있는 동종항원을 제시하는 반면, 항원 특이적 시스템에서는 항원이 투여되고, 생체내에서 흡수되고, 처리되고, 프로페셔널 APC에 의해 제시되기 때문에, 이들 2가지 시스템은 상이하다. 따라서, 항-gp39는 사용되는 항원 및 제시 방법에 따라 상이한 작용을 할 수 있는 것으로 보인다.
항-gp39가 면역계의 CD4+ 및 CD8+ 구획 둘 모두에서 동종 특이적 내성을 유도할 수 있고, 이는 이식 면역학 및 면역요법을 고려할 때, 명백히 유익한 치료학적 개입일 수 있음이 결론지어질 수 있다. 골수 이식 수술을 받은 환자의 치료를 위해, 항gp39 치료법이 이식편에 대한 내성을 유도시키기에 충분하고, GVHD와 같은 이식 치료의 결과의 유도를 방지할 것임이 고려될 수 있다.
실시예 6
: 항-gp39 항체의 생성 및 특징화
실험 1 - 사람 gp39에 대한 항체
사람 피검자의 항원 특이적 T세포 내성의 유도를 위해, 사람 gp39에 대한 항체를 투여하는 것이 바람직하다. 하기 방법을 사용하여 마우스 항-사람 gp39 단클론성 항체를 생성시켰다. Balb/c 마우스를 완전 프로인트 애쥬번트(IFA) 중의 가용성 gp39 융합 단백질인 gp39-CD8로 면역화시켰다. 계속해서, 마우스를 6주 후에 비완전 프로인트 애쥬번트(IFA) 중의 가용성 gp39-CD8로 시험투여하였다. 2차 면역화시킨지 4주 후에, 가용성 gp39-CD8를 가용성 형태로 투여하였다. 그 다음, 마우스를 2주 후에 활성화된 사람 말초혈 림프구로 추가접종시킨 후, 2주 후에 가용성 gp39-CD8로 최종 추가접종시켰다. 비장 세포를 표준 프로토콜에 따라 최종 면역화시킨 후 4일째에 NS-1 융합 파트너와 융합시켰다.
항-사람 gp39 항체를 생성시키는 클론을 다중 스크리닝 방법을 기초로 하여 선택하였다. 클론을 초기에 gp39-CD8을 사용하는 플레이트 결합 검정에 의해 스크리닝하였다. 그 다음, 포지티브 클론을 대조군 CD8 융합 단백질인 CD72-CD8에 대해 스크리닝하였다. CD8-CD72 플레이트 결합 검정에 대해 포지티브한 스코어를 갖는 클론을 제거하였다. 후속적으로, 나머지 클론을 유동 혈구계산 분석법에 의해 휴지상태 및 6시간 활성화된 사람 말초혈 림프구(PBL)에 대해 스크리닝하였다. 휴지 상태가 아닌 하이브리도마 염색 활성화 상태의 PBL을 포지티브한 것으로 간주하였다. 최종적으로, 나머지 클론을 gp38가 결합된 플레이트에 CD40Ig가 결합하는 것을 블로킹 하는 능력에 대해 시험하였다.
약 300개의 클론을 초기에 플레이트 결합 검정에서 gp39-CD8 및 CD72-CD8에대해 스크리닝하였다 이러한 클론 중에서, 30개는 CD8이 아닌 플레이트-결합된 gp39를 검출하는 것으로 밝혀졌다. 후속적으로, 이들 클론을 활성화된 사람 PBL 상에서의 gp39의 검출을 위해 스크리닝하였다. 약 15개의 클론이 휴지 세포가 아닌 활성화된 PBL 상에서 분자를 검출하였다. 플레이트-결합된 gp39의 CD40Ig 검출을 블록킹하는 클론의 능력을 결정함으로써 특이성을 추가로 확인하였다. 시험된 10개의 클론 중 3개가 이러한 검정에서 CD40Ig 결합을 블록킹하였다. 이들 클론은 3E4, 2H5 및 2H8이었다. 이러한 클론은 본원에 기술된 방법에 사용하기가 바람직하다. 또한, 휴지 상태가 아닌 활성화 상태의 PBL에 대해 포지티브한 시험된 클론도 활성화된 래트 T세포 클론인 POMC8과의 반응성에 대해 스크리닝하였다. 클론 2H8은 이러한 래트 T 세포주와의 교차반응성을 나타내었다.
실험 2 - 사람 gp39에 대한 항체
실험 1에 기재한 것과 유사한 면역화 방법을 사용하여 사람 gp39에 대한 추가의 항체를 생성시켰다, 한 마리의 Bal/c 마우스를 CFA 중의 가용성 gp39-CD8로 면역화시킨 다음, 4주 후에 6시간 활성화시킨 사람 말초혈 림프구로 시험투여하였다. 후속적으로, 마우스를 표준 프로토콜에 따라 비장 세포와 NS-1 융합 파트너의 융합 4일 전에 가용성 gp39-CD8로 추가접종 시켰다. 하이브리도마 클론을 6시간 활성화시킨 사람 PBL을 유동 혈구계산 염색법에 의해 스크리닝하였다, 휴지 상태가 아닌 클론 염색 활성화된 사람 PBL을 선택하였다 추가적인 분석을 위해 6개의 클론, 즉 4D9-8, 4D9-9, 24-31, 24-43, 89-76 및 89-79를 선택하였다.
선택된 항체의 특이성을 몇 가지 검정에 의해 확인하였다. 첫 번째로, 유동혈구계산 분석을 통해 6개의 mAb 염색 전부가 휴지상태가 아닌 말초혈 T세포를 활성화시킴이 밝혀졌다 (대표적 실시예에 대해 제 9B도 및 제 9C도 참조, 이들은 각각 4D9-8 및 4D9-9에 의한 활성화된 T세포의 염색을 나타낸다). 6개의 항체 각각에 의해 인식된 분자의 발현은 활성화 후 4시간 이내에 검출가능하고, 활성화 후 6 내지 8시간 사이에 최대가 되며, 활성화 후 24시간이 지나면 검출이 불가능해졌다. 6개의 mAb는 모두, 주로 CD4+표현형의 활성화된 CD3+PBL 상에서 발현되는 분자를 인식하지만, CD8+T세포의 일부가 또한 이 분자를 발현시켰다. 6개의 mAb에 의해 인식되는 분자의 발현은 gp39의 발현과 같이, 배양 배지 내에 시클로스포린 A의 존재에 의해 억제되었다 (대표적 실시예에 대해 제 10A도 및 제 10B도 참조, 이들은 각각 4D9-8 및 4D9-9에 의한 시클로스포린 처리된 T세포의 염색을 나타낸다). 이러한 mAb에 의해 인식된 분자의 발현의 역학 및 분포는 사람 CD40Ig의 융합 단백질에 의해 검출되는 바와 같이 gp39에 대해서와 동일하다. (대표적 실시예에 대해 제 11A도 및 제 11B도 참조, 이들은 각각 4D9-8 및 4D9-9의 존재하에 CD40Ig에 의한 gp39 염색의 억제를 나타낸다). ELISA 검정에서, 6개의 mAb가 모두 gp39 분자의 가용성 융합 형태인 gp39-CD8을 인식하였다. 더욱이 6개의 mAb는 모두35S-메티오닌 표지된 활성화된 사람 PBL로부터 약 36 kd의 분자를 면역침전시켰다. 면역침전된 분자는 사람 CD40Ig 융합 단백질에 의해 침전된 분자와 동일하였다.
6개의 선택된 mAb(4D9-8, 4D9-9, 24-32, 24-43, 89-76 및 89-79)의 기능적 활성을 하기와 같이 검정하였다. 첫 번째로, IL-4 및 가용성 gp39와 함께 배양시킨정제된 사람 B 세포의 증식을 억제하는 mAb의 능력을 측정 하였다. 정제된 사람 B 세포를 정제된 단클론성 항체 또는 CD40Ig의 존재 또는 부재하에, 0 내지 12.5㎍/㎖의 용량으로 gp39 및 IL-4와 함께 배양시켰다. B세포 증식을 3일 후에 배양액 중에서 티미딘 혼입에 의해 측정하였다. 결과(제 12도에 도시됨)는 6개의 mAb가 모두 gp39 및 IL-4에 의해 유도된 B 세포 증식을 억제할 수 있음을 나타낸다. mAb 89-76 및 24-31은 유도된 B세포 증식을 억제하는 데에 가장 효과적이었다. IC50(B 세포 증식을 50%까지 억제하는 데에 필요한 항체의 농도)은 89-76에 대해서 약 1㎍/㎖이고, 24-31에 대해서는 약 1.25㎍/㎖이었다.
다음으로, 항-CD3 활성화된 T세포 및 IL-2에 의해 유도된 Ig 생성에 의해 측정한 바와 같이, B세포 분화를 억제시키는 mAb의 능력을 시험하였다. 정제된 IgD+사람 B세포를 FACS에 의한 포지티브 선택에 의해 준비한 다음, 6일 동안 정제된 항-gp39 단클론성 항체의 존재 또는 부재하에 0 내지 10㎍/㎖의 용량으로서 항-CD3 활성화된 사람 T 세포(미토마이신 C 처리됨) 및 IL-2와 함께 배양시켰다. 결과(하기 표 3에 기재됨)는 6개의 항체가 모두 IgM, IgG 및 IgA 생성에 의해 측정한 바와 같이 T세포 의존성 B 세포 분화를 억제할 수 있음을 나타낸다. IC50(Ig 생성을 50% 까지 억제하는 데에 필요한 항체의 농도)은 24-31 및 89-76 항체를 포함하는, 6개의 mAb에 대해서 1.0 ㎍/㎖ 내지 0.1 ㎍/㎖ 미만이었다.
[표 3]
T세포 반응에 대한 항-gp39 mAb의 효과를 시험하기 위해, mAb를 표준 혼합된 림프구 반응(MLR)에 포함시켰다. 300,000개의 사람 말초혈 림프구(반응자=R)를 항-gp39 mAb(10㎍/㎖)의 존재 또는 부재하에 100,000개의 조사된 동종 말초혈 림프구(자극자=S)와 함께 배양시켰다. 배양액을 4, 5 또는 6일째에 3H-티미딘으로 펄스시키고, 18시간 후에 회수하였다. 6개의 항-사람 gp39 mAb 전부는 MLR에 의해 측정한 바와 같이 동종 특이적 반응을 억제하였다 (대표적 실시예에 대해 제 11도 참조, 이는 R 및 5를 24-31 또는 89-76의 존재하에 배양시킨 경우 동종 특이적 반응을 나타내고 ; CTLA4-면역글로불린 융합 단백질 및 항-CD28 mAb를 포지티브 대조군으로서 사용하였다).
6개의 mAb가 사람 gp39 분자 상의 독특한 에피토프를 인식하는지를 측정하기 위해, 교차블록킹 실험을 수행하였다, 활성화된 사람 PBL을 먼저 6개의 mAb(25㎍/㎖의 컨쥬게이션되지 않은 항체)로 블록킹시켰다. 세포를 세척한 후, 10㎍/㎖의 바이오틴 컨쥬게이션된 항원으로 염색시킨 다음, 피토에리트린(Phytoerythrin) 컨쥬게이션된 아비딘(PE-Av)과 반응시켰다. PE-Av에 의한 세포의 염색을 FACS에 의해 분석하였다. 결과를 하기의 표 4에 기재하였다.
[표 4]
염색의 강도 및 포지티브 세포의 %를 + 기호로 나타내었다 (++++ = MI > 200; +++ = MI > 125; ++ = MI > 50; + = MI ＞ 25; - = 백그라운상에 염색 없음). ND = 미확정.
모든 항체는 활성화된 사람 PBL에 대한 CD40Ig의 결합을 블로킹하였다, 그러나, 표 4에 기재된 데이터는 일부 항체가 활성화된 사람 PBL에 대한 다른 항체들의 결합을 블로킹하지 못하였음을 명백히 나타내며, 이는 이들 항체가 사람 gp39 분자상의 독특한 에피토프를 인식한다는 것을 시사하는 것이다.
89-76 및 24-31 항체를 각각 생성시키는 89-76 및 24-3l 하이브리도마 각각은 부다페스트 조약하에 미들랜드 록스빌 파아크론 드라이브에 소재하는 아메리칸 타입 컬춰 컬렉션에 1994년 9월 2일에 기탁되었다. 89-76 하이브리도마의 ATCC 수탁 번호는 HB 11713이고, 24-31 하이브리도마의 ATCC 수탁 번호는 HB 11712이다. 24-31 및 89-76 항체는 IgG1 이소타입을 갖는다.
실험 3 - 마우스 gp39에 대한 항체
본 발명의 한 구체예에서, gp39 길항제는 항-마우스 gp39 단클론 항체인 MR1이다. 하기 방법을 사용하여, MR1 단클론성 항체를 생성시키고, gp39에 대한 다른 항체를 생성시키는 데에 사용할 수 있었다.
햄스터를 6주 동안 1주 간격으로 5-106개의 활성화된 Thl 세포(d1,6)를 사용하여 복강내적으로 면역화시켰다. 뮤린 Thl에 대한 혈청 역가가 약 1:l0,000보다 커졌을 때, 세포 융합을 면역 햄스터 비장 세포 및 NS-1을 사용하여 글리에틸렌 글리콜로 수행하였다. 성장중인 하이브리도마를 함유하는 웰로부터의 상층액을 휴지 및 활성화된 Th1 상에서 유동 혈구계산법으로 하였다. 활성화된 Th를 선택적으로 인식하는 Mab를 생성시키는 하나의 특정 하이브리도마를 추가로 시험하고 서브클로닝하여 MR1을 유도하였다· MR1을 복수에서 생성시키고, 이온 교환 HPLC에 의해 정제하였다. 하이브리도마 MR1를 아메리칸 타입 컬춰 컬렉션에 기탁하였으며, 수탁 번호는 HB11048이다.
균등물
당업자들은 일상적인 실험만을 사용하여, 본원에 기술된 본 발명의 특정 구체예에 대한 많은 균등물이 있음을 인지하거나 확인할 수 있을 것이다. 이러한 균등물을 하기의 특허청구의 범위에 포함시키고자 한다. 본원 전체에 걸쳐 인용된 모든 문헌 및 공개된 특허 출원의 내용을 본원에 참고 문헌으로 인용하였다.
Claims (15)
- 히브리도마 24-31(ATCC HB 11712)에 의해 제공되는 단클론성 항체를 포함하거나 히브리도마 24-31(ATCC HB 11712)에 의해 제공되는 단클론성 항체와 동일한 gp39에 대한 에피토프 결합 특이성 및 결합 친화성을 갖는 항-사람 gp39 단클론성 항체 또는 gp39 단백질과 특이적으로 반응하는 상기 항체의 단편.
- 제 1항에 있어서, 키메라 또는 인화된 것임을 특징으로 하는 항-사람 gp39 단클론성 항체.
- 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 표준 시험관내 검정에서 0.01 내지 5.0 ㎍/㎖의 IC50으로 B 세포 증식을 억제함을 특징으로 하는 항-사람 gp39 단클론성 항체.
- 제 3항에 있어서, 표준 시험관내 검정에서 0.1 내지 2.5 ㎍/㎖의 IC50으로 B 세포 증식을 억제함을 특징으로 하는 항-사람 gp39 단클론성 항체.
- 제 4 항에 있어서, 표준 시험관내 검정에서 0.1 내지 1.25 ㎍/㎖의 IC50으로 B 세포 증식을 억제함을 특징으로 하는 항-사람 gp39 단클론성 항체.
- 제 3항에 있어서, B 세포 증식이 B 세포를 인터루킨-4 및 가용성 gp39로 처리함으로써 시험관내에서 유도됨을 특징으로 하는 항-사람 gp39 단클론성 항체.
- 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 표준 시험관내 검정에서 0.01 내지 1.0 ㎍/㎖의 IC50IgM, IgG 또는 IgA의 B 세포 생성을 억제함을 특징으로 하는 항-사람 gp39 단클론성 항체.
- 제 7항에 있어서, 표준 시험관내 검정에서 0.01 내지 0.1㎍/㎖의 IC50으로 IgM, IgG 또는 IgA의 B 세포 생성을 억제함을 특징으로 하는 항-사람 gp39 단클론성 항체.
- 제 7항에 있어서, IgM, IgG 또는 IgA의 B 세포 생성이 B세포를 항-CD3 활성화된 T 세포와 함께 배양시킴으로써 유도됨을 특징으로 하는 항-사람 gp39 단클론성 항체.
- 히브리도마 24-31 (ATCC HB 11712)에 의해 생성된 항-사람 gp39 단클론성 항체.
- 제 1항, 제 2항 또는 제10항에 따른 항-사람 gp39 단클론성 항체를 생성하는히브리도마 또는 세포주.
- 히브리도마 24-31 (ATCC HB 11712).
- 제 1항 또는 제 2항 또는 제 10항 중 어느 한 항에 따른 항-사람 gp39 단클론성 항체 또는 gp39 단백질과 특이적으로 반응하는 상기 항체의 단편 및 약제학적으로 허용되는 담체를 함유하는, 이식에 사용되는 약제학적 조성물.
- 제 1항에 있어서, 사람 불변 영역을 포함함을 특징으로 하는 항-사람 gp39 단클론성 항체.
- 제 1항에 있어서, 사람 감마 1 불변 영역을 포함함을 특징으로 하는 항-사람 gp39 단클론성 항체.
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|---|---|---|---|---|
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| CZ244399A3 (cs) * | 1997-01-10 | 1999-10-13 | Biogen, Inc. | Použití sloučeniny anti-CD40L pro výrobu léku pro léčení imunologických onemocnění |
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| US20030170231A1 (en) * | 2000-03-06 | 2003-09-11 | Toshihiko Yamauchi | Remedies and preventives for antiphospholipid antibody syndrome |
| WO2001079555A2 (en) | 2000-04-14 | 2001-10-25 | Millennium Pharmaceuticals, Inc. | Roles of jak/stat family members in tolerance induction |
| US7829084B2 (en) * | 2001-01-17 | 2010-11-09 | Trubion Pharmaceuticals, Inc. | Binding constructs and methods for use thereof |
| US7754208B2 (en) * | 2001-01-17 | 2010-07-13 | Trubion Pharmaceuticals, Inc. | Binding domain-immunoglobulin fusion proteins |
| US20030133939A1 (en) * | 2001-01-17 | 2003-07-17 | Genecraft, Inc. | Binding domain-immunoglobulin fusion proteins |
| US20040058445A1 (en) * | 2001-04-26 | 2004-03-25 | Ledbetter Jeffrey Alan | Activation of tumor-reactive lymphocytes via antibodies or genes recognizing CD3 or 4-1BB |
| US20030219436A1 (en) * | 2002-03-15 | 2003-11-27 | Ledbetter Jeffrey A. | Compositions and methods to regulate an immune response using CD83 gene expressed in tumors and using soluble CD83-Ig fusion protein |
| JP2006512895A (ja) * | 2002-06-28 | 2006-04-20 | ドマンティス リミテッド | リガンド |
| US9701754B1 (en) | 2002-10-23 | 2017-07-11 | City Of Hope | Covalent disulfide-linked diabodies and uses thereof |
| US7754209B2 (en) | 2003-07-26 | 2010-07-13 | Trubion Pharmaceuticals | Binding constructs and methods for use thereof |
| US7563443B2 (en) * | 2004-09-17 | 2009-07-21 | Domantis Limited | Monovalent anti-CD40L antibody polypeptides and compositions thereof |
| NI200800032A (es) * | 2005-07-25 | 2009-03-23 | Reducción de célula b utilizando moléculas de unión específicas cd37 y cd20 | |
| ES2363891T3 (es) * | 2006-03-20 | 2011-08-18 | The Regents Of The University Of California | Anticuerpos contra el antígeno de células troncales de la próstata (psca) modificados genéticamente para el direccionamiento al cáncer. |
| MX2008015524A (es) * | 2006-06-12 | 2009-01-13 | Trubion Pharmaceuticals Inc | Proteinas de union multivalentes monocatenarias con funcion efectora. |
| WO2009032949A2 (en) * | 2007-09-04 | 2009-03-12 | The Regents Of The University Of California | High affinity anti-prostate stem cell antigen (psca) antibodies for cancer targeting and detection |
| WO2009046294A2 (en) * | 2007-10-03 | 2009-04-09 | Cornell University | Treatment of proliferative disorders using antibodies to psma |
| SI2132228T1 (sl) * | 2008-04-11 | 2011-10-28 | Emergent Product Dev Seatle | CD37 imunoterapevtik in kombinacija z njegovim bifunkcionalnim kemoterapevtikom |
| US20100069616A1 (en) * | 2008-08-06 | 2010-03-18 | The Regents Of The University Of California | Engineered antibody-nanoparticle conjugates |
| EP2398504B1 (en) * | 2009-02-17 | 2018-11-28 | Cornell Research Foundation, Inc. | Methods and kits for diagnosis of cancer and prediction of therapeutic value |
| WO2011069019A2 (en) | 2009-12-02 | 2011-06-09 | David Ho | J591 minibodies and cys-diabodies for targeting human prostate specific membrane antigen (psma) and methods for their use |
| MX2016012285A (es) | 2014-03-24 | 2017-01-23 | Genentech Inc | Tratamiento de cáncer con antagonista de c-met y correlación de estos con la expresión de hgf. |
| KR20180050321A (ko) | 2015-08-07 | 2018-05-14 | 이미지냅 인코포레이티드 | 분자를 표적화하기 위한 항원 결합 구조체 |
| WO2017053469A2 (en) | 2015-09-21 | 2017-03-30 | Aptevo Research And Development Llc | Cd3 binding polypeptides |
| US20170101471A1 (en) * | 2015-10-08 | 2017-04-13 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Blockade of tim-1 for treating graft-versus-host disease |
| US11266745B2 (en) | 2017-02-08 | 2022-03-08 | Imaginab, Inc. | Extension sequences for diabodies |
| KR102086649B1 (ko) * | 2017-04-18 | 2020-04-23 | 주식회사 굳티셀 | Lrig-1 단백질에 특이적인 결합 분자 및 이의 용도 |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE69233402T3 (de) * | 1991-10-25 | 2009-06-25 | Immunex Corp., Seattle | Neue cytokine |
| US5474771A (en) * | 1991-11-15 | 1995-12-12 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Murine monoclonal antibody (5c8) recognizes a human glycoprotein on the surface of T-lymphocytes, compositions containing same |
| CA2089229C (en) * | 1992-02-14 | 2010-04-13 | Alejandro A. Aruffo | Cd40cr receptor and ligands therefor |
| AU5098493A (en) * | 1992-08-21 | 1994-03-15 | Schering Corporation | Cd40 ligand, anti cd40 antibodies, and soluble cd40 |
| US5540926A (en) * | 1992-09-04 | 1996-07-30 | Bristol-Myers Squibb Company | Soluble and its use in B cell stimulation |
-
1994
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR100468330B1 (ko) * | 1994-04-25 | 2005-12-30 | 유니버시티 오브 매사추세츠 메디칼 센터 | 조직또는기관이식편에대한t세포내성을유도하는방법 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
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