CZ244399A3

CZ244399A3 - Použití sloučeniny anti-CD40L pro výrobu léku pro léčení imunologických onemocnění

Info

Publication number: CZ244399A3
Application number: CZ992443A
Authority: CZ
Inventors: Susan L. Kalled; David W. Thomas
Original assignee: Biogen, Inc.
Priority date: 1997-01-10
Filing date: 1998-01-09
Publication date: 1999-10-13
Also published as: EA199900633A1; KR20050088494A; AU721697B2; CA2277223A1; IS5101A; IL130785A0; BR9807471A; EE9900275A; US20020071840A1; ATE356634T1; NO993275L; NZ337073A; EP0966302B1; KR100632846B1; JP2001508450A; EA001426B1; WO1998030241A1; NO993275D0; HK1024424A1; AU5735398A

Description

Předkládaný vynález se týká režimu léčebného podávání sloučenin anti-CD40L pacientovi.

Dosavadní stav techniky

Jednou z nezbytných reakcí při vytváření protilátek je interakce CD40 na B buňkách s ligandem CD40 (CD40L) na aktivovaných T buňkách, což je krok, který je nutný pro růst B buněk a následnou tvorbu protilátek. CD40L byl také v literatuře nazýván gp39 a molekula T buněk aktivující B buňky (T-BAM). Budiž tedy jasné, že v tomto textu CD40L, gp39 a T-BAM označují jednu a tutéž molekulu. Jak bude ještě dále popsáno, byla připravena řada sloučenin anti-CD40L, a některé byly dokonce testovány na zvířatech, zda a s jakou účinností ovlivňují průběh nemocí spojených s protilátkami. Tak např. PCT publikace WO 93/09812 (27. květen 1993) popisuje myší monoklonální protilátku označenou 5c8, která se specificky váže na T-BAM na povrchu aktivovaných T buněk, čímž inhibuje aktivaci B buněk T buňkami.

Protokoly použité v popisovaných experimentech, kdy se testoval účinek sloučenin anti-CD40L na zvířatech s poruchami imunity, užívaly dávky sloučenin podávané zvířatům v intervalech dvou týdnů nebo kratších, přičemž typické intervaly byly 1 až 7 dnů (viz např. Mohan et al., J. Immunol. 154: 1470-1480, 1995; Early et al., J. Immunol.

157: 3159-3164, 1996; Stober et al., J. Exp. Med. 183: 693···· ·· * ··· · * · ·· 0 0 0 ··«· • ♦ '· · · · 9 9 9 999 999 • 9 9 9 9 9 9 9 ·

0· 00 0 ·· 9 9

698, 1996;	Chen	et al.	., J.	Immunol. 155:	2833-2840, 1995;
Gerritse et	al.,	Proč.	Nati.	Acad. Sci. 93:	2499-2504, 1996;
Green et al	., J.	Virol	. 70:	2569-2575, 1996; Durie et al. ,
Science 261:	1328	-1330,	1993;	Durie et al.,	J. Clin. Invest.

94: 1333-1338, 1994; Larsen et al. , Transplantation 61: 4-9, 1996 a Griggs et al., J. Exp. Med 183: 801-810, 1996).

Dosud nebyl· publikován žádný návrh toho, že by méně časté podávání sloučenin anti-CD40L bylo. účinné, v inhibici produkce patologických protilátek nebo ve zlepšení průběhu imunologických onemocnění.

Podstata vynálezu

Původci prokázali, že podávání sloučenin anti-CD40L v intervalech 3 týdnů nebo' delších je účinné pro léčení poruch s patogenezi spojenou s protilátkami. Vynález se týká způsobů léčení pacienta s nemocí související s protilátkami, kdy se podá terapeuticky účinné množství sloučeniny anti-CD40L první den a opět druhý den, přičemž mezi prvním a druhým dnem je interval nejméně 3 týdnů. Obdobná množství sloučeniny anti-CD40L se mohou následně podat ' pacientovi s alespoň 4 týdenními intervaly mezi dalšími dávkami. V jednom provedení·vynálezu je interval mezi dávkami nejméně 4 týdny.

Další aspekt vynálezu se týká způsobu léčení pacienta s nemocí související s protilátkami, kdy se pacientovi podává terapeuticky účinné množství sloučeniny anti-CD40L v prvním léčebném období v intervalech kratších než 3 týdny, a pak se pacientovi podává terapeuticky účinné množství sloučeniny anti-CD40L ve druhém léčebném období v intervalech nejméně 3 týdnů nebo nejméně 4 týdnů.

• » • · • ·· · • · • · • 0 «0

I 0 β 0 r» ·· • 0 0 0 0 ·· • · 0 0 · · · 00 0 • 0 · 0 · • · ® *· «α léčení chronických systémový lupus

Výše popsaný léčebný režim se také muže uplatnit pro léčení pacientů s chronickými poruchami imunitního -systému, jako je např. lupénka, alergie, artritida nebo roztroušená skleróza.

Jiné provedení předkládaného vynálezu je vhodné pro autoimunitních onemocnění jako je erythematodes, myasthenia gravis, autoimunitní hemolytická anemie, idiopatická trombocytopenická purpura nebo -anti-fosfolipidový syndrom.

Další aspekt předkládaného vynálezu se týká způsobu inhibice rejekce (odvržení) transplantované tkáně u pacienta, kdy. se podává terapeuticky účinné množství sloučeniny antí-CD40L první den a opět druhý den, přičemž mezi prvním a druhým dnem je interval nejméně 3 týdnů. Následné dávky se mohou podávat pacientovi v různých intervalech, ale v jednom provedení vynálezu je druhá dávka podána v intervalu alespoň 3 týdnů nebo alespoň 4 týdnů. Transplantovaná tkáň může být orgán nebo tkáň, které jsou vhodné pro transplantaci. Zvláště vhodné pro transplantaci jsou kůže, ledviny, srdce, kostní dřeň nebo tkáň oka. Štěp může být buďto aloštěp nebo xenoštěp.

Použití vynálezu může být vhodné také pro. potlačení imunitní reakce po genové terapii.

Popis obrázků

Obr. 1. Časový průběh některých měřených charakteristik krve a moči kontrolních a ošetřovaných (SWR X NZB) Fi myší v Pokusu II. Monoklonální protilátka anti-CD40L MR1 byla podána jednou v i. p. dávce 500 pg/zvíře, když byla myš stáří 4 měsíce, pak znovu v 7 měsících a znovu v 9 měsících, a pak opakovaně v měsíčních intervalech. Pět horních řádků tabulky • · ·* · · · · · · ·· «· • · · · · · · · · · · • · ·· 9 9 9 9 9 9 9 • ·φ 9 · « 9 9 9 999 999

9 9 9 9 9 9 · « ·* ·· 9 9 9 ·· 9-9 označených AR až BN obsahuje data pro kontrolní zvířata, a spodních 6 řádků označených CL až CR obasuhje údaje o jednotlivých ošetřovaných zvířatech. Studie byla zahájena v únoru 1996, když byla zvířata ve stáří 4 měsíců. Vertikální dvojité čáry oddělují 4 skupiny údajů, kdy každá skupina představuje údaje o krvi a moči naměřené k jednomu datu odběru uvedenému - v záhlaví. Hladina proteinurie (PU) je hodnocena od hladiny stopy až po hodnocení 4. Hodnocení 1 odpovídá hladině albuminu v moči 30 mg/dl, hladina 2 odpovídá 100 mg/dl, hladina 3 300 mg/dl a hladina 4 více než 2000 mg/dl. Hladiny protilátek anti-MRl (uvedené ve sloupci označeném anti-MRl), protilátek anti-ssDNA a anti-dsDNA jsou uvedeny v p,g/ml krve·. Kde je to vhodné, jsou hodnoty směrodatná indikuj e, odchylka ve že vzorek tvarunebyl uvedeny jako průměr(s.odchyl odebrán/změřen, neprovedeno.

průměr a ) . Čárka zpravidla kvůli smrti zvířete. ND znamená

Obr. 2. Tabulka měření proteinurie v závislosti na čase u zvířat v Pokusu II. V prvním sloupci jsou uvedena čísla zvířat podobně jako v tabulce 1. V úvodu každého sloupce jsou uvedena data dnů, kdy sě odbíraly vzorky. · NC znamená neodebrány.

Obr. 3. Charakteristiky krve a moči kontrolních a ošetřovaných myší v Pokusu V, kde bylo léčení zahájeno ve stáří 4,5 měsíce. MR1 byla podána i. p. v dávce 500 ^ig/zvíře ve staří 4,5 měsíce, a pak opakovaně měsíčně v i. p. dávce 500 μις. Horních 7 řádků označených AR až BLR obsahuje data jednotlivých kontrolních zvířat, sedm spodních řádků označených CR až CLR uvádějí data pro léčená zvířata. Studie byla -zahájena v květnu 1996, kdy zvířata' byla stará 4,5 • · 4» • 4 4 4 · · • · · · 4 4 4 • 44 44· 4 4

4 · · « 4 4 ·· 44 44 4

4 4 4

444 444

4 ·4

měsíce.	Ostatní informace	v tabulce jsou stejné	j ako
v tabulce	1.
Obr.	4 .	Tabulka měření	proteinurie v závislosti na	čase

u zvířat v Pokusu. V. Čísla zvířat jsou stejná jako na obr. 3. Ostatní popisy jsou shodné s obr. 2.

Obr. 5. Tabulka charakteristik krve a moči v kontrolních a léčených myší v Pokusu VII, kde ošetřování bylo- zahájeno ve stáří 5,5 měsíců. MR1 byla podávána i. p. v dávce 500 μς/zvíře jednou týdně po dobu 6 týdnů, a pak opakovaně měsíčně v i. p. dávce 500 μς. Horní tří řádky tabulky označehé AN až BL uvádějí data pro jednotlivá kontrolní zvířata (jak je poznamenáno u obr. 6 - některá kontrolní zvířata uhynule před tím, než byly naměřeny údaje uvedené na obr. 5) a každý ze 7 dolních řádků označených CR až DN obsahuje data pro léčená zvířata. Studie byla zahájena v červnu 1996, kdy zvířata byla stará 4,5 měsíce. Ostatní informace v tabulce jsou stejné jako v tabulce 1.

Obr. 6. tabulka měření proteinurie v závislosti na čase u zvířat v pokusu VII. Každý ze 7 horních řádků označených AR až BN obsahuje data jednotlivých kontrolních zvířat, sedm spodních řádků označených CR až CD uvádějí data ' pro jednotlivá léčená zvířata. Ostatní informace v tabulce jsou stejné jako na obr. 2.

Obr. 7 Tabulka charakteristik krve a moči v závislosti na čase u kontrolních a léčených myší v Pokusu X, kde ošetřování bylo zahájeno ve stáří 5,5 měsíců. MR1. byla podávána i. p. v dávce 500 μρ/zvíře jednou týdně po dobu týdnů, a pak opakovaně „měsíčně v i. p. dávce 200 μς.

• · · · · · • · ·· « · · • ·· · » · « é • · · · · · β ·· · í> ·· <

• · ·· » · · · » · · · ··· ··· ··

Horních 8 řádků tabulky označené AR. až BLR uvádějí data pro jednotlivá kontrolní zvířata a 8 dolních řádků označených CR až DLP. obsahuje -data pro jednotlivá léčená zvířata. Studie byla zahájena v říjnu 1996, kdy zvířata byla stará 5,5 měsíce. Ostatní popisy jsou stejné jako v tabulce 1.

Obr. 3. tabulka závislosti proteinurie na čase zvířat v pokusu X. V prvním sloupci jsou. uvedena -čísla zvířat shodně s obr. 7. Ostatní popis je shodný s obr. 2. .

Obr. 9. Tabulka charakteristik krve a moči v závislosti na čase u kontrolních a léčených myší v Pokusu VI, kde ošetřování bylo zahájeno ve stáří 7 měsíců. MR1 byla podávána 4 zvířatům i. p. v dávce 500 μια/zvíře jednou týdně po dobu 6 týdnů, a pak opakovaně měsíčně v i. p. dávce 500 μις. Každý ze 4 dolních řádků označených - DN až EN obsahuje data pro jednotlivá léčená zvířata. V době sběru dat pro tuto studii všechna kontrolní zvířata uhynula, jak je zmíněno na obr. 10. Studie byla zahájena v červnu 1996, kdy zvířata byla stará

5,5 měsíce. Ostatní popisy jsou stejné jako na obr. 1

Obr. 10 tabulka závislosti proteinurie na čase u zvířat v pokusu VI. Každý ze 4, horních řádků tabulky označených AR až CN uvádí data pro jedno z kontrolních zvířat a každý ze spodpích 4 řádků označených DN až 'EN obsahuje data pro jednotlivá léčená zvířata. Ostatní popisy jsou stejné jako na obr. 2.

Podrobný popis vynálezu

Předkládaný vynález se týká léčení, prevence, zvrácení nebo stabilizace stavu pacienta trpícího onemocněním «· 9111

9

11 · « · • · · · · « • 11 111 1

1111 19 19 19 11 ·«

19 11 » 111 1 1 1 111 119 1 li

9 1 11 souvisejícím s protilátkami, a to tím,' že se podává pacientovi anti~CD40L sloučenina v intervalech delších než dva týdny. Tato sloučenina blokuje interakci CD40L na T buňkách s CD40 na B buňkách, což jak se ukázalo inhibuje produkci patologických protilátek odpovědných za mnoho patologických účinků při různých autoimunitních nemocech a chronických poruchách imunity.

Sloučeniny

Terapeutické' sloučeniny vhodné pro použití podle předkládaného vynálezu zahrnují jakékoliv sloučeniny, které blokují interakci CD40 na B buňkách s CD40L exprimovaným na povrchu aktivovaných T buněk. Ke sloučeninám anti-CD40L specificky protilátky chimérické patří polyklonální protilátky a monoklonální (mAb), a také protilátkové deriváty jako jsou molekuly, humanizované ' molekuly, molekuly s redukovanou efektorovon funkcí, bispecifické molkeuly a konjugáty protilátek. Ve výhodném provedení předkládaného vynálezu je použita protilátka 5c8, která je popsána v patentu US 5 474 771, na jehož popis se tímto odkazujeme. K dalším známým protilátkám proti antigenu 5c8 patří protilátky ImxM90, ImxM91 a ImxM92 (získané od firmy Immunex), monoklonální protilátky anti-CD40L komerčně dostupné od firmy Ancell (Bayport, MN, klon 24-31, katalog, č. 353-020), a monoklonální protilátky anti-CD40L komerčně dostupné od firmy Genzyme (Cambridge, MA, katalog, č. 803703-01). A také monoklonální protilátky anti-CD40L komerčně dostupné od firmy PharMingen (San Diego,. katalog, č. 3-3580D) . Mnoho dalších protilátek anti-CD40L bylo připraveno a charakterizováno (viz např. dokument WO 96/23071, BristolMyers Squibb, na jehož popis se zde odkazujeme).

·* «· • · 9 · 9 9

9 99 9 9 · • · · »00 · 0

9 9 9 0 9 «

99 9 9 « ·♦ ····

9 9 9

0 0 0 • 9 9 9

999 999

9

99

Předkládaný vynález se také týká anti-CD40L molekul jiných typů, jako jsou např. celé fragmenty Fab, sloučeniny F(ab')·, úseky VH, úseky Fv, jedenořetězcové protilátky (viz např.· WO 96123071), polypeptidy, fúzní konstrukty polypeptidů, fúzní konstrukty CD40 (jako např. CD40Ig, viz Hollenbaugh et al., J. Immunol. Meth. 188: 1-7, 1995, na nějž se plně odkazujeme) a sloučeniny s malými molekulami jako jsou např. malé semipeptidové sloučeniny nebo nepeptidové sloučeniny, které jsou přitom všechny schopné blokovat interakci CD40-CD40L. Způsoby pro projektování, screening a optimalizaci malých . molekul jsou popsány v patentové přihlášce PCT/US96/110664 (podané 21. června 1996 a publikované 9. ledna 1997 jako dokument WO 97/00895), na kterou se tímto odkazujeme.

Různé formy protilátek lze také připravit pomocí standardních metod rekombinantní DNA (Winter a Milstein, Nátuře 349: 293-99, 1991). Tak např. mohou se připravit chimérické protilátky, ve kterých je doména-vážící antigen ze zvířecí protilátky spojena s lidskou konstantní doménou (protilátka původně pocházející ze savce jiného než člověka, ve které se metodami rekombinantní DNA nahradily buďto části nebo všechny části kloubové oblasti a konstantních úseků těžkého řetězce a/nebo konstantního úseku lehkého řetězce odpovídajícími úseky z lehkého nebo těžkého řetězce lidského imunoglobulinu, viz např. Cabilly et al., Patent US 4 816 567; Morrison et al., Proč. Nati. Acad. Sci. 81: 6851-55, 1984). Chimérické protilátky redukují immunogenní odpověď vyvolanou zvířecími protilátkami, když se používají v humánní klinické praxi'.

Navíc je možné syntetizovat i rekombinantní humanizované protilátky. Humanizované protilátky jsou protilátky původně pocházející ze savce jiného než člověka, •9 9999 • · 99

9 9 9 9 9 • 9 »9 9 9 • · 9 9 9 9 9 • 9 9 9 9 9 . 9 9 99 • 9 · fc • 9 9 9

9 9 9

99« 999

9

9 «9 ve kterých se metodami rekombinantní DNA nahradily některé nebo všechny aminokyseliny, které nejsou nezbytné pro vazbu antigenu, aminokyselinami z odpovídajících úseků lehkého nebo těžkého řetězce lidského imunoglobulinu (chiméry obsahují většinou sekvence lidského IgG, do nichž byly vloženy úseky odpovídající za. specifickou vazbu antigenu, viz např. patentová přihláška PCT WO 94/04679). Zvířata se imunizují požadovaným antigenem, pak se izoluje odpovídající protilátka a část sekvencí variabilního úseku odpovědných za specifickou vazbu antigenu se vyjme. Úseky vázající antigen pocházející ze zvířecí protilátky se pak klonují do vhodných míst v genech lidských protilátek, ze kterých byly úseky vázající antigen deletovány (odstraněny). Humanizované protilátky minimalizují použití heterologních (mezidruhových) sekvencí v lidských protilátkách a s mnohem menší pravděpodobností vyvolávají imunitní reakci u léčeného subjektu.

Pro přípravky a použití podle předkládaného vynálezu jsou také užitečné protilátky primátů nebo tzv. primatizované protilátky.

Fragmenty protilátek a univalentní protilátky se také mohou použít v přípravcích a způsobech předkládaného vynálezu. Univalentní protilátky představují dimer obsahující těžký řetězec a lehký řetězec navázaný na úsek Fc (stonek), druhého těžkého řetězce. Úsek Fab znamená takové části řetězců, které jsou zhruba ekvivalentní nebo analogické sekvencím, které obsahují úsek těžkého řetězce větvící se ve tvaru Y, a celému lehkému řetězci, a které společně (jako agregáty) vykazují protilátkovou aktivitu. Protein Fab obsahuje agregáty jednoho těžkého řetězce a jednoho lehkého řetězce (obecně známé jako Fab'), a také tetramery odpovídající rozvětveným segmentům protilátky ve tvaru Y (obecně známé jako F(ab)J, ať jsou agregovány kovalentnimi

9 99 9 9

99

9 9 9 9 9 9 9 9 9 99 9 9 9 » 9 9 9· • ·· 999 9 9 ί ····*· «···««« 9 « *··· 99 9 9999

- 10 nebo nekovalentními vazbami, pokud jsou agregáty schopny selektivně reagovat s daným antigenem nebo antigenovou rodinou.

Navíc je možné použít standardní techniky rekombinantní DNA k tomu, aby se změnily vazebné afinity rekombinantních protilátek s jejich antigeny, a to tím, že se z.amění aminokyselinové zbytky v blízkosti vazebného místa pro antigen. Vazebná afinita k antigenu u humanizované protilátky může být zvýšena mutagenezí založenou na molekulovém modelování (Queen et al., Proč. Nati. Acad. Sci. 86:10029-33, 1989; patentová přihláška PCT WO'94/04679). Může být žádoucí zvýšit nebo snížit afinitu protilátek k CD40L, v závislosti na cílové tkáni a zamýšlenému konkrétnímu rozvrhu léčby. Toho lze dosáhnou metodou phage display (viz např. Winter et al., Ann. Rev. Immunol. 12:433-455, 1994; Schier et al.,

J. Mol. Biol. 255:28-43, 1996, na které se tímto odkazujeme). Např. může být výhodné podávat pacientovi konstantní hladinu protilátek. se sníženou afinitou k CD40L jakožto semi-profylaktické opatření. A podobně zase protilátky se zvýšenou afinitou k CD40L mohou být výhodné pro krátkodobé léčení.

Subjekty

Termín pacient se užívá k označení jakéhokoliv savce, kterému se podávají sloučeniny anti-CD40L. Termín pacient, pro kterého je specificky vynález zamýšlen, zahrnuje člověka a také ostatní primáty, ovce, koně, krávy, kozy, prasata, kočky, psy, králíky, morčata, křečky, pískomily, krysy, myši, ale také jednotlivé orgány, tumory, a buňky pocházející z takových hostitelů.

Subjekt, pro který je vynález určen, trpí nemocí související s tvorbou protilátek.

00 • 0 0 0

0 00

0 0 0 • 0 0 0

00 • 0 00

0 0 0 0 0 0

0

0 00

0 «

0 0

000 000

0

0 0 0

Způsoby podávání

Sloučeniny podle předkládaného vynálezu se mohou podávat jakýmkoliv způsobem, který je lékařsky přijatelný. K takovým způsobům patří parenterální podání injekcí jako např. injekce intravenózní, intravaskulární, intraarte-riální, subkutánní, intramuskulární, intratumorové, intraperitoneální, intraventrikulární, intraepidurální, a dále podání perorální,, nazální, oftalmické, rektální nebo. ťopické. Podání ve formě přípravku s prodlouženým uvolňováním léčiva spadá také do předmětu vynálezu, např. v podobě depotních injekcí. Některé formy sloučenin anti-CD40L mohou být vhodné pro perorální podávání, a mohou být formulovány jako suspenze nebo pilulky.

Dávkování a. frekvence podávání

Velikost a ’ frekvence dávek jakékoliv sloučeniny, která se podává pacientovi s určitou nemocí imunitního systému, je důsledkem úsudku ošetřujícího lékaře, který vychází z mnoha faktorů. Základní dávkování se stanoví v předklinických a klinických studiích, kdy se provádějí velmi extenzivně pokusy ke stanovené prospěšných a škodlivých účinků různých dávek na pacienta. Ale dokonce i když takovéto doporučení existuje, lékař často upraví dávkování pro různé pacienty v závislosti na faktorech, které zváží, jako je např. věk pacienta, zdravotní stav, hmotnost, pohlaví a souběžné léčení jinými léky. Stanovení optimální dávky pro každou z anti-CD40L sloučenin použitých k léčení je pro odborníka z oboru farmacie a lékařství rutinní záležitostí.

Abychom uvedli nějaký příklad úvah o dávkování, uvádíme příklad strategie podávání pro monoklonální protilátku anti-CD40L. Dávky se mohou snadno upravit pro jiné typy anti-CD40L sloučenin. Obecně lze říci, že jednotlivé dávky »« ··« ·

9 9 9 9

99 9 9 4

9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 » · ♦ 9 · >

• » » · r · · » · · ·

999 999 »

• · · · jsou mezi 0,05 a 50 mg/kg hmotnosti pacienta, nejčastěji v rozmezí 1 až 20 mg/kg. Pro akutní léčení je účinná dávka protilátky v rozmezí od 1 mg/kg tělesné hmotnosti do asi 20 mg/kg tělesné hmotnosti/ podávaná denně po dobu 1 až 5 dnů, výhodně jako bolusová intravenózní dávka. Stejná dávka a dávkovači rozvrh se mohou užít v zátěžové fázi podle schématu zátěž-udržování, kdy se v udržovací fázi podávají protilátky intravenózně nebo intramuskulárně v rozmezí od 0,1 mg/kg až 20 mg/kg tělesné hmotnosti, s intervaly po období léčení v rozmezí jednoho týdne až po 3 měsíce. Chronická léčení se mohou provádět také v udržovacím režimu, kdy se podávají protilátky intravenózně nebo intramuskulárně v rozmezí od 0,1 mg/kg až 20 mg/kg tělesné hmotnosti, s intervaly po období léčení v rozmezí' jednoho týdne až po 3 měsíce. Kromě toho je chronické léčení možné provádět intermitentním '(přerušovaným) bolusovým intravenózním režimem, kdy se podávají protilátky v dávce 1,0 mg/kg tělesné hmotnosti až 100 mg/kg tělesné hmotnosti s intervaly mezi následujícími podáními v délce 1 až ' 6 měsíců. Kromě případů intermitentního bolusového režimu se mohou protilátky podávat také způsobem perorálním, pulmonárním, nazálním nebo subkutánním.

Obecně se léčení provádí s nízkými dávkami protilátek. Např. počáteční dávka protilátek se podá pacientovi injekcí nebo infúzí. Tato počáteční dávka může obsahovat mezi 1,0 až 30 mg protilátek na den pro 70kg pacienta. Pro opakované podávání po několika dnech lze podávat denně, každý druhý až šestý den, jednou týdně, jedenkrát za dva až čtyři týdny nebo jednou za měsíc, dokud se nepozoruje požadované potlačení příznaků nemoci. Ovšem i jiné režimy podávání :mohou být užitečné. Když se symptomy potlačí na požadovanou úroveň, léčení se může ukončit. Avšak pacient může ‘dlouhodobě • 4

9 4 44· • · · · · · • 9 ·· 4 · · 4 · · 4 9

9 9 · 99

99

9 9 9 9

4 4 4 4 * * ··♦ 999 • 4 4

99 99

- 13 vyžadovat občasné léčení pokud se znovu objevují symptomy nemoci.

Podle jiného provedení vynálezu při léčení lupus nebo jiných onemocnění souvisejících s protilátkami může být účinnost protilátek zvýšena pravidelným podáváním nebo kombinací s konvenčními přípravky a léčivy pro léčení lupus jako jsou např. salicyláty, kortikosteroidy nebo imunosupresiva. Alternativně mohou být protilátky konjugovány s konvenčními přípravky'. To pak výhodně umožňuje podávání konvenčního přípravku v množství menším než je obvyklá dávka, např. méně než 50 % obvyklé dávky, když by se podával přípravek v monoterapii. Tudíž lze zabránit mnohým' vedlejším účinkům spojených s konvenčním přípravkem.

Kombinované terapie podle · předkládaného vynálezu pro lupus zahrnují použití protilátek anti-CD40L_: společně s činidly zaměřenými na B buňky, jako jsou ^protilátky anti-CD19, anti-CD28 nebo anti-CD20 (nekonjugované nebo radioaktivně značené), antagonisté IL-14, LJP394 (LaJolla Pharmaceuticals blokátor receptoru ’ firmy ' LaJolla Pharmaceuticals), IR-1116 (malá molekula firmy Takeda) a anti-Ig idiotypové monoklonální protilátky. Alternativně mohou kombinace obsahovat činidla cílená na T buňky/B buňky, jako jsou např. CTLA4Ig, antagonisté IL-2, antagonisté IL-4, antagonisté IL-6, antagonisté receptorů, monoklonální protilátky anti-B7, TNF, LFA1/ICAM antagonisté, VLA4/VCAM antagonisté, brequinar a konjugáty toxinu IL-2 (např. DAB) , predníson, cyklofosfamid a jiná imunosupresiva. Kombinace mohou také zahrnovat činidla namířená na T buňky jako jsou antagonisté CD4, antagonisté CD2 a IL-12..

Kombinovaná terapie pro pacienty s jiným onemocněním imunitního systémů než je lupus může obsahovat podávání sloučenin anti-CD40L a také činidel, která by se normálně • ft ·· • · · · · ·

4 94 4 4 4

4 4 9 9 4 9 4

4 4 9 9 9 9

94 44 4 ·· ····

4 9 4

4 4 4

444 444

9

9 44

- 14, typicky podávala v případě daného onemocnění imunitního systému.

Jakmile je jednou dosaženo zlepšení pacientova stavu, podávají se udržovací dávky protilátek antí-CD40L, buďto samotných nebo v kombinaci s konvenčními přípravky (proti lupus), pokud je to třeba. Následně se může redukovat dávka nebo frekvence podávání, nebo obojí, v závislosti na míře příznaků, na úroveň, která umožňuje udržet zlepšený stav. Když byly příznaky potlačeny na požadovanou úroveň, léčení se může ukončit. V ostatních případech, podle úsudku ošetřujícího lékaře, přerušované léčení může být potřebné, např. v intervalech čtyř. týdnů nebo delších. Pacient však může vyžadovat i dlouhodobé přerušované léčení pokud se příznaky znovu objevují.

Přípravky

Sloučeniny anti-CD40L použité podle předkládaného vynálezu se podávají ve farmaceuticky účinném množství, což je množství, které vyvolá léčebně prospěšný účinek u pacienta s nemocí související s protilátkami, poruchou imunitního, systému nebo u pacienta s transplantátem nebo transgenem, u kterého je žádoucí potlačit rejekci (odvržení).

K léčebně propěšným účinkům patří buďto zabránění zhoršení nebo zlepšení pacientova zdravotního stavu. Jako příklad orgánu, který je často’ poškozen patologickými protilátkami, uveďme ledviny pacientů s SLE. U těchto pacientů, při léčení podle předkládaného vynálezu, lze zdravotní stav a renální funkce monitorovat jedním nebo několika laboratorními testy, které měří koncentraci příslušných látek v moči nebo krvi, případně sledovat další charakteristiky moči nebo rychlost clearance příslušných látek z krve do moče. Hodnoty získané v těchto testech, buďto ·« ····

• · · · 9 • · ·· 9

9 9 9 9 9

9 9 9 9

99

9

9 samostatně nebo v kombinaci, slouží lékaři k hodnocení funkce nebo poškození· ledvin. Příkladem takových hodnot jsou koncentrace močoviny v. krvi, koncentrace kreatininu nebo proteinů v krvi, koncentrace proteinů v moči, koncentrace různých krevních buněk jako jsou erytrocyty nebo leukocyty v moči, měrná hmotnost moči,^v obsah močoviny, rychlosti clearance insulinu, kreatininu, močoviny nebo kyseliny aminohipurové, a také přítomnost hypertenze nebo edému. K léčebně prospěšným účinkům také patří snížení hladiny autoprotilátek, jako jsou např. anti-dsDNÁ protilátky v séru u pacientů s lupus.

Sloučeniny anti-CD40L podle předkládaného vynálezu se podávají pacientovi ve farmaceuticky přijatelné lékové formě, která může obsahovat farmaceuticky přijatelný nosič. Takový nosič je relativně netoxický a neškodný pro pacienta v koncentracích, které jsou v souladu s účinnou aktivitou sloučeniny anti-CD40L nebo jinou účinnou složkou, čili žádný z vedlejších účinků, způsobených nosičem neruší prospěšný účinek účinné složky v přípravku. Přípravek může obsahovat, ještě další kompatibilní látky, přičemž termín kompatibilní v tomto případě znamená, že složky farmaceutického přípravku jsou schopné se mísit se sloučeninou anti-CD40L a navzájem, a to takovým způsobem, že nedochází k žádné interakcí, která by podstatně snížila terapeutickou účinnost přípravku. Přípravky ve formě nasálního spreje obsahují purifikované vodné roztoky účinné látky s konzervačními a isotonickými činidly. Takové přípravky jsou výhodně upraveny na hodnotu pH a isotonický stav kompatibilní s nosními sliznicemi. Přípravky podle předkládaného vynálezu vhodné pro perorální podávání mohou být ve formě diskrétních jednotek jako jsou tobolky, škrobové tobolky, tablety, pilulky nebo pastilky, přičemž každá z nich obsahuje předem stanovené množství ♦ · ·· • · · * • · ·· · · • 9 9 9 9 9 9 9

9 9 9 · « « ·♦ 99 99 9

99

9 9 9

999 999

9

99 ·» ··<· • « ·

- 16 sloučeniny anti-CD40L v podobě prášku nebo granulátu, nebo ve formě liposomú, nebo jako suspenze ve vodné kapalině, nebo také v jiné kapalné formě jako je sirup, tinktura, emulze nebo výluh.

Příklady provedení vynálezu

Použití sloučenin antí-CD40L podávaných v dlouhých intervalech k léčení lupus nephritis u subjektů kromě člověka

Pro demonstraci účinnosti podávání sloučenin anti-CD40L jsme vybrali zvířecí model lupus nephritis. Systémový lupus erythematodes (SLE) je život ohrožující onemocnění, charakterizované tvorbou autoprotilátek proti různým tkáním, a často také proti DNA. SLE trpí 'přibližně 140 000 lidí ve' Spojených Státech a 150 000 v západní Evropě, zejména žen v plodném věku. U většiny pacientů, imunoglobuliny spojené s onemocněním a imunitní komplex jsou uloženy v glomerulech ledvin, kde způsobují zhoršování funkce ledvin. Pokud by dávky anti-CD40L sloučenin ve velkém rozestupu byly účinné pro selektivní potlačení tvorby protilátek, takový dávkovači režim by měl' prospěšný účinek při lupus nephritis. To by se mělo projevit na léčených myších zpomalením postupu lupus nephritis, oslabením stupně onemocnění, zvýšenou mírou přežití a dokonce zlepšením funkce ledvin u některých zvířat.

Testovali jsme působení křeččí monoklonální protilátky anti-muCD40L MR1 na průběh nefritidy u samců myší (SWR X ZNB) Fl v několika studiích popsaných v následujících příkladech. Kontrolní zvířata dostala buďto injekci polyklonální křeččí' protilátky Ig nebo protilátky Ha4/8, což je monoklonální protilátka arménského křečka namířená, proti KLH. Hladina • ti ····

ti ti · ti ti • ti titi ti • titi tititi • tititi ti titi titi • ti ti ti ti ti titi ti • tititi tititi • ti titi titi proteinurie (PU) byla hodnocena od hladiny stopy až po hladinu 4. Hodnocení 1 odpovídá hladině albuminu v moči 30 mg/dl, hladina 2 odpovídá 100 mg/dl, hladina 3 odpovídá 300 mg/dl a hladina 4 více než 2000 mg/dl. Hladina 2 je považována za slabou nefritidu a od.hladiny 2,5 výše se jedná o silnou nefritidu.

Pokud nebyly léčeny, nebo byly léčeny podáváním nespecifické křečci protilátky kontrolním zvířatům, uhynuly normálně myši ve věku 12 měsíců. Zatímco nástup proteinurie u neošetřovaných zvířat byl proměnlivý, ve věku 3 měsíců měla většina zvířat slabou nebo mírnou proteinurii, která jevila tendenci zhoršovat se s rostoucím věkem. Ve věku 5 měsíců měla typicky všechna zvířata detekovatelné protilátky anti-dsDNA a většina měla detekovatelné i anti-s-sDNA, což je v kontrastu s nedetekovatelnou hladinou těchto protilátek u normálních myší, jako jsou samice (SWR) rodičovské generace myší (SWR X ZNB) Fl.

'Příklad 1

Pokus II: Léčení bylo zahájeno ve stáří 4 měsíce (obr. 1, 2.)

Léčení MR1 bylo zahájeno, když myši byly ve stáří 4 měsíců. MR1 byla podána jednou v i. p. dávce 500 pg/zvíře, když byla myš stáří 4 měsíce, pak znovu v 7 měsících, znovu v 9 měsících, a pak opakovaně v měsíčních intervalech. Po 4 měsících léčení 4 z 5' kontrolních myší uhynuly, ale 4 ze 6 léčených zvířat byl ještě naživu. 3 ·ζ těchto přeživších léčených zvířat uhynuly, a sice ve stáří 12, 13 a 13,5 měsíců. Jedno zvíře přežilo déle než 15 měsíců, což je mimořádná délka života pro myši z tohoto křížení. Velmi zajímavé je to, že toto přežívající zvíře (označení DN na obr. 2) mělo., mírnou nefritidu (proteinurie 2+) ve věku 8 až • ft ···· • · ·· • · · · • ftft ·

9· ft· ft • · • · • « • · ' • ft • · ··· ft·· • · ·· ·· měsíců, která se snížila na hladinu detekovatelných stop. proteinurie po následující dva měsíce. To je první demonstrace' funkční reverze nefritidy u myší tohoto kmene.

Příklad 2

Pokus V: Léčení bylo zahájeno ve stáří 4,5 měsíce (Obr. 3, 4)

Léčení MR1 bylo zahájeno, když myši byly ve stáří 4,5 měsíce. MR1 byla podána jednou v i. p. dávce 500 pg/zvíře, když byla myš stáří 4 měsíce, a pak opakovaně dostával jednu i. p. injekci s , 500 mg v měsíčních intervalech. Po 4,5 měsících léčení 6 ze 7 kontrolních myší uhynulo, ale šest ze sedmí léčených přežilo. Po 8 měsících byly všechny kontroly mrtvé, ale ze 7 léčených myší zhynuly jen 3. Jak je ukázáno na obr. 4, u čtyřech ze sedmi léčených myší došlo, k obratu v nefritidě, což dokumentuje trvale se snižující hladina proteinurie. Tato zvířata byla stále ještě na živu ve stáři

12,5 měsíce.

Příklad 3

Pokus VII: Léčení bylo zahájeno ve stáří 5,5 měsíce (Obr. 5, 6)

Léčení MR1 bylo zahájeno, když myši byly ve stáří 5,5 měsíce. MR1 byla podávána po dobu šesti týdnů jednou týdně v i. p. dávce 500, pg/zvíře, a pak opakovaně dostávala jednu injekční dávku v měsíčních intervalech. Po 5 měsících léčení ve stáří 10,5 měsíců 6 ze 7 kontrolních myší uhynulo, ale všechna kontrolní zvířata byla živá ještě ve stáří 12 měsíců. Následující hodnoty byly změřeny na zvířatech která byla naživu ještě po 8,5 měsících (viz následující tabulka):

····

• · • 4 4 · • 4 · • · 4 4 · · · ·· ·· ··

	anti-sDNA	anti-dsDNA	PU
Kontrola	2,4	0	4
8,8	6,3	4
6, 3	10,1	4
Průměr(směr. odchyl.)	5, 8(2, 6)	5,4(4,1)	4 (0)
MR1	. 2,7	0	1
2,0	. 0	1,5
2,0.	1,5	3
o	0	, 2
2,7	0	1
0	0	2
3,5	0	1,5
Průměr(směr. odchyl.)	1,8 (1,2)	0,2(0,5)	1,7 ()

Příklad 4

Pokus X: Méně intenzivní léčení zahájené ve stáří 5,5 měsíce (obr. 7 a 8)

Léčení MR1 bylo zahájeno, když myši byly ve stáří 5,5 měsíce. MR1 byla podávána po dobu čtyř týdnů jednou týdně v i. p. dávce 500 μς/zvíře, pak v měsíčních intervalech v dávce 200 μς i.p. Ze 16 zvířat ve studii (po 8 v každé skupině kontrolních a léčených zvířat) do stáří 8,5 měsíce uhynula pouze jedna myš, a sice kontrola .ve stáří 7,5 měsíce. Jak je ukázáno na obr. 8, sedm z osmi kontrolních zvířat mělo proteinurii trvale rostoucí k vysokým hodnotám, v průměru + 3,4 pro 7 přeživších myší. Až na jednu z osmi, MR1 léčené myši udržovaly nízkou proteinurii, a sice s průměrem +2 pro 8 léčených myší na konci sledování. Jak je uvedeno na obr. 7, ··

·· • · · · • · ·· • · · * * · · · »« ·· ··.·

- 20 šest léčených zvířat, ale jenom jedno z kontrolních, mělo nedetekovatelnou hladinu anti-dsDNA protilátek.

Příklad 5

Pokus VI: Léčení bylo zahájeno ve stáří 7 měsíců (Obr. 9, 10)

Léčení MR1 bylo zahájeno, když myši. byly ve stáří sedm měsíců. MR1 byla podávána 4 léčeným zvířatům po dobu šesti týdnů v i. p. dávce 500 μς/zvíře jednou týdně, a pak opakovaně dostával jednu i. p. injekci s 500 mg v měsíčních intervalech. Ve věku 10 měsíců všechny 4 kontrolní myši uhynuly. Zatímco dvě · léčené myši uhynuly ve stáří 11 měsíců a třetí ve stáří 13 měsíců, jedna ze čtyř léčených myší byla stále ještě naživu ve stáří 14 měsíců, tj . po 7 měsících léčení. Přežívající léčené zvíře (č. VI:ER) mělo na konci sledování hladinu proteinurie hodnocenou 1 a detekovatelné protilátky anti-dsDNA a anti-ssDNA.

Výsledky pokusů uvedených v příkladech ukazují, že léčení myší (SWR x NZB)FI monoklonálná protilátkou anti-CD40L, podávanou po určitou dobu s intervaly delšími než 3 týdny, významně a konzistentně prodloužilo přežívání ve srovnání s kontrolními zvířaty, a zpomalilo rozvoj nefritidy, jak je ukázáno hladinami proteinurie. U některých zvířat dokonce léčení zvrátilo nefritidu, jak ukazuje snížení hladiny proteinurie. Z celkového počtu 32 léčených zvířat u 11 došlo ke snížení hladiny proteinů v moči při léčení monoklonální protilátkou anti-CD40L, ale u žádného kontrolního zvířete nedošlo k podobnému snížení. Z celkového počtu 24 zvířat, u kterých se měřila hladina močovinového dusíku v krevním séru (BUN) , u 3 se hladina BUN snížila po ošetření, což se nestalo u žádného kontrolního zvířete. Kromě • φ φ φ • φ φφ • · · φ • · φ φ φφ φφ φφ

ΦΦΦ φφ • · • · • φ • φ φ φ

toho, léčení MR1 často vedlo ke snížení protilátek anti-dsDNA a anti-ssDNA, které se normálně tvořily u neošetřovaných zvířat.

Výsledky těchto pokusů, kdy došlo ke zlepšení stavu nebo k prevenci nemoci, ukazují, že sloučeniny anti-CD40L se mohou úspěšně využít pro léčení nemocí nebo poruch spojených s protilátkami, pokud se podávají v intervalech delších, než 3 týdny. To je překvapivé a neočekávané zjištění, které představuje významnou výhodu ve srovnání s dříve známými dávkovacími rozvrhy. Zvláště u pacientů, kteří' se léčí s chronickým onemocněním, snížená frekvence léčení vede ke snížení nákladů, ke zmenšení obtíží a nepohodlí, zvláště při injekčním nebo intravenózním podávání. Kromě toho lze očekávat, že při podávání dávek v delších intervalech budou zmenšeny jakékoliv vedlejší účinky léčení.

Ačkoliv předkládaný vynález byl popsán podrobně pomocí ilustrací a příkladů, aby byl jasně a úplně vyložen, odborníkovi j$ zřejmé, že lze vynález do jisté míry modifikovat, aniž by došlo k odchýlení od předmětu vynálezu, který je vymezen pouze následujícími patentovými nároky.

• flfl.· · • · flfl · • flfl · » · • flflfl fl • fl flfl

fl fl • fl ·· • · · • · · • · · flflfl • fl • fl flfl

Claims

Ρ A Τ Ε N TO VE N A ROK Y

1. Použití sloučeniny anti-CD40L pro výrobu léku pro léčení pacienta s autoimunitním onemocněním nebo chronickou poruchou imunitního systému, kdy se pacientovi podává terapeuticky účinné množství uvedené sloučeniny v prvním období léčení v dávkách oddělených intervaly kratšími než 3 týdny, a v druhém období léčení se pacientovi podává terapeuticky účinné množství uvedené sloučeniny v dávkách oddělených intervaly nejméně 3 týdnů.
2. Použití podle nároku 1, kdy nemoc nebo porucha je vybrána ze skupiny, kam patří systémový lupus ervthematodes, myasthenia gravis, autoimunitní hemolytická anemie, idiopatícká trombocytopenická purpura, anti-fosfolipidový syndrom, psoriáza, alergické stavy, artritida a roztroušená skleróza mozkomíšní (sclerosis multiplex).
3. Použití podle nároku 1 nebo 2, kdy

a) sloučenina anti-CD40L je protilátka nebo protilátkový fragment, a

b) protilátka je monoklonální protilátka, nebo

c) protilátka je 5c8.
4. Použití podle nároku 1 nebo 2, kdy během prvního období léčení

a) mezi dávkami jsou týdenní intervaly, nebo

b) mezi dávkami jsou intervaly dvou až šesti dnů, nebo

c) mezi dávkami jsou jednodenní intervaly.

·· « .·* ·* *··· ·· »· ··* ·· · ···· ♦ Φ· ·· · ···· • · · · ♦ · · · ··· ··· ······ · · ··.··· Φ· ··

- '23 - .
5. Použití podle nároku 1 nebo 2, kdy během druhého období léčení jsou mezi dávkami intervaly nejméně 4 týdny.
6. Použití podle nároku 1 nebo 2, přičemž, terapeuticky účinné množství sloučeniny anti-CD40L je množství, které je dostatečné k tomu, aby

a) zabránilo zhoršení zdravotního stavu pacienta, nebo b) způsobilo zlepšení zdravotního stavu pacienta.
7. Použití sloučeniny anti-CD40L pro výrobu léku pro léčení pacienta s autoimunitním onemocněním nebo chronickou poruchou imunitního systému, kdy se -pacientovi podává terapeuticky účinné množství uvedené sloučeniny v prvním období léčení nejméně ve čtyřech dávkách v týdenních intervalech a v druhém období léčení se pacientovi podává terapeuticky účinné množství uvedené sloučeniny v dávkách

oddělených měsíčními intervaly. 8. Použití podle nároku 7, kdy j e šest dávek během prvního období léčení. 9 . Použití sloučeniny anti-CD40L pro výrobu léku pro zabránění rejekce (odvržení) transplantované' tkáně

pacientem, kdy se pacientovi podává terapeuticky účinné množství uvedené sloučeniny v prvním období léčení v dávkách oddělených intervaly kratšími než 3 týdny, a v druhém období léčení se pacientovi podává terapeuticky účinné množství uvedené sloučeniny v dávkách oddělených intervaly nejméně 3 týdny.
10. Použití podle nároku 9, kdy transplantovaná tkáň je aloštěp nebo xenoštěp.

·· ·Φ
11 φφφφ • · φ » φ φ φ φ φφφ φ · φ φ φφ φφφ φφ φφφ φ φ · φ φ* φφ φφ · φφ φφ φ φ · φ φ φ φ φ •Φφ φφφ φ φ φφ φφ

- 24 11. Použití podle nároku 9, kdy transplantovaná tkáň je. ze skupiny obsahující kůži., ledviny, játra, srdce, kostní dřeň a tkáň oka.
12. Použití sloučeniny anti-CD40L pro výrobu léku pro potlačení imunitní reakce vyvolané transgenním produktem v důsledku genové terapie pacienta, kdy se pacientovi podává terapeuticky účinné množství uvedené, sloučeniny v prvním období léčení v dávkách oddělených intervaly kratšími než 3 týdny, a v druhém období léčení se pacientovi podává terapeuticky účinné množství uvedené sloučeniny v dávkách oddělených intervaly nejméně 3 týdny.
13. Použití podle kteréhokoliv pacientem je člověk.

Použití podle kteréhokoliv sloučenina anti-CD40L je anti-CD40L. ' z předchozích nároků,