JP4628792B2

JP4628792B2 - 免疫疾患治療用ラパマイシン及びｉｌ−１０

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Publication number: JP4628792B2
Application number: JP2004556199A
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Inventors: ロンカルオロ，マリア，グラジア; バッタグリア，マニュエラ
Original assignee: Roncarolo maria grazia
Current assignee: Roncarolo maria grazia
Priority date: 2002-11-29
Filing date: 2003-11-27
Publication date: 2011-02-09
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Description

本発明は、それらを必要としている患者における免疫抑制及び／又は抗原−特異免疫耐性を誘発する方法及び組成物に関する。より詳細には、本発明は、Ｔ細胞によって媒介される、亢進、機能不全又は制御されていない自己又は非自己免疫応答を含む疾患の治療に用いるためのラパマイシン及びＩＬ−１０の組み合わせ製剤を提供する。また、本発明は、ＩＬ−１０及びラパマイシンを含有する医薬組成物及び免疫応答のモデュレータとしてのそれらの使用に指向する。

移植及び免疫抑制薬
移植は、末期の腎不全、ハース（hearth）又は肝疾患、自己免疫タイプＩ糖尿病のほとんどの患者に対する代案治療であり、それは、患者に小腸及び肺機能における欠乏性疾患を発現させる可能性がある。移植片生着は、多くの因子に依存するが、これらの最も顕著なものは強力な免疫抑制剤の投与である。遺伝的に共通点のない個体間の移植は、もし制御できないままであれば、移植された臓器の完全な破壊を招き得る、急速な及び場合によっては破壊的な同種異系反応性免疫応答を誘発する。免疫抑制剤の投与はこの応答を和らげ、よって、急性組織不適合を防止する。しかし、免疫抑制剤を中止すると、拒否反応の再活性化を招き、急速な移植破壊を導くため、移植片生着を継続するためには終身の免疫抑制に依存する。

最近、免疫抑制剤のなかで、シクロスポリンＡ（ＣｓＡ）、ＦＫ５０６及びラパマイシンを含む選択的Ｔ細胞阻害剤が開発されている。ＣｓＡ及びＦＫ５０６の双方は、カルシニュリン機能をブロックすることによってＴ細胞活性化を阻害し、よって、活性化Ｔ細胞の核因子（ＮＦＡＴ）能の発現を防止する。この工程は、ＩＬ−２を含むいくつかのサイトカインのｍＲＮＡを調節（増加）するために不可欠である。ＣｓＡ及びＦＫ５０６の主な制約は、それらの種々の毒性である。さらに、ＣｓＡ及びＦＫ５０６の双方は、Ｔ細胞アポチーシスを防止する（Ｙｕら、２００１年、参照）。

これに反して、ラパマイシンは、細胞質蛋白（ＦＫＢＰ−１２）に結合し、かつＩＬ−２信号経路をブロックすることによって、Ｔ細胞の増殖を阻害する免疫抑制能がある（Sehgal、１９９８）。その複合体はラパマイシンの哺乳類標的（ｍＴＯＲ）に結合し、かつブロックし、サイトカイン誘発Ｔ細胞増殖の阻害をもたらす。重要なことは、ＣｓＡ及びＦＫ５０６に反して、ラパマイシンは、ＴＣＲ−媒介Ｔ細胞活性(Blahaら、２００３)及び活性誘導細胞死（ＡＩＣＤ）に対するＩＬ−２細胞プライミングをブロックしないことである。後者は、末梢移植耐性の誘発の役割を果たすと思われるＴ細胞アポトーシスの一形態である（Wellsら、１９９９）。樹状細胞（ＤＣ）に作用しないＣｓＡとは異なり、ラパマイシンは、ＤＣの表現型及び機能に大いに影響を及ぼす（Hacksteinら、２００２）。それは、それらの抗原取り込み能を著しく減少させ、よって、免疫寛容原性表現型を有するＤＣの分化に有利である。この作用は、低濃度で現われ、ラパマイシンが生理学的に適当な濃度（１ｎｇ／ｍｌ）ではＤＣ成熟とは無関係であり、インビトロ及びインビボの双方で証明されている（Hacksteinら、２００２）。

最近の入手可能な免疫抑制剤は、非常に短期間では非常に有効であるが、実質的な問題は、移植の拒絶を防止する代替の又は高性能な方法を開発することの差し迫った必要を示している。主な障害物は、感染性の病原体に対する有効な免疫応答と、移植に対する破壊的免疫応答との間の区別ができないことである。よって、免疫抑制の治療は、日和見感染のリスクの増大を招くかも知れない。いくつかの研究は、非特異的免疫応答は、移植患者におけるガンの発生率を増加することを導くであろうことを示す（Hojoら、１９９９）。したがって、非特異免疫抑制の代替が見出された場合にのみ、移植の最大の可能性が履行されるであろう。移植免疫の主なねらいは、移植に対する免疫応答を防止するが、残りの免疫システムを完全に損なわれないまま残すプロトコルを開発することである。これを達成することにより、移植耐性がもたらされるであろう。

自己免疫
自己免疫疾患において、自己抗原に対する望まない免疫応答は末梢組織の破壊を招く。自己免疫疾患の治療は、現在、炎症の抑制的調節及び非抗原（Ａｇ）特異免疫抑制に基づいている。同種異系移植片拒絶の防止のために、この戦略は、一旦薬物の投与を中止すると再発の高い危険及び感染及び腫瘍を含む過度の免疫抑制の危険を伴うため、長期においてはしばしば有効ではない。代替のアプローチは、一時的な免疫抑制及び／又は特異免疫耐性の誘導に基づいており、宿主の防衛メカニズムを完全に保全しながら、自己Ａｇに対する「沈黙」の病原性応答を目的としている。

免疫システムは、自己又は有害でない抗原に対する耐性を誘発する２つの異なるメカニズムを引き出している。これらは、中枢及び末梢Ｔ細胞耐性と称される。中枢耐性は、胎児の発育中及び非常に初期の出生時期に実現され、胸腺の発現中に自己反応性Ｔ細胞の特定クローン欠損によって媒介される。末梢メカニズムは、成熟Ｔ細胞における耐性を誘発し、一生の間末梢で起こる。これらのメカニズムは、抗原特異性リンパ球の機能的不活性化（アネルギーと呼ばれる）及び抑制及び調節能を有するＴ細胞のサブセットの活性化（T regulatory cells、Battagliaらにおいて概説されたＴ調節細胞、２００２参照）を含む。

耐性及びＴ調節細胞
近年、移植特異耐性を達成するための戦略として、Ｔ調節（Ｔｒ）細胞の誘導における興味が増加しつつある。ＣＤ８⁺、Ｄ８⁺ＣＤ２８^- 及びＴＣＲ⁺ＣＤ４^-ＣＤ８^-のような他のＴ細胞サブセットが調節能を有する細胞に含まれることが示されているが、今日までに確認されたＴｒ細胞のほとんどは、ＣＤ４⁺集団内に見出されている。ＣＤ４⁺集団では、抑制的な特性を有する種々の分画が確認されている。我々のグループは、タイプ１調節Ｔ細胞（Ｔｒ１）として定義されるＴｒ細胞のサブセットを特徴づけた。それは、Ｔｈ１及びＴｈ２細胞のそれと区別できるサイトカイン産生プロファイルを有する。ヒト及びマウスのＴｒ１細胞は、高レベルのＩＬ−１０、かなりの量のＩＬ−５、ＴＧＦ−β及びＩＦＮ−γを産生するが、ＩＬ−２は低レベルであり、ＩＬ−４は全く産生しない（Grouxら、１９９７）。ＩＬ−１０は、Ｔｒ１細胞の分化及びエフェクター機能にとって重要なサイトカインである。抗原及びＩＬ−１０の存在下でＣＤ４⁺Ｔ細胞を培養すると、インビトロでは、抗原特異Ｔ細胞応答を抑制することができるＴｒ１細胞の発現を導き、インビボでは、自己免疫大腸炎の発現を導く（Grouxら、１９９７）。また、Ｔｒ１細胞は、インビボで発現することができる。Ｔｒ１細胞は、実際、ＳＣＩＤ−再構成患者（高レベルのＩＬ−１０が成功した同種異系幹細胞移植を伴う）の末梢血から単離される（Bacchettaら、１９９４）。

耐性及びＩＬ−１０
ＩＬ−１０は、免疫調節の解決の鍵となる役割を果たす（Mooreらにおいて概説、２００１）。それは、Ｔリンパ球の増殖及びＩＬ−２産生を阻害する。ＩＬ−１０は、活性化された単球／マクロファージ、好中球、好酸球及び肥満細胞によるＴＮＦ−α、ＩＬ−１、ＩＬ−６等の前炎症性サイトカイン及びＩＬ−８、ＭＩＰｌα及びＭＩＰｌβ等のケモカインの産生を阻害することによって、強力な抗炎症作用を有する。さらに、ＩＬ−１０は、ＭＨＣＩＩ及び補刺激性分子を抑制することによる単球／マクロファージ／ＤＣ等の抗原提示細胞の抗原提示能を抑制する。Ｔ細胞媒介および抗炎症免疫応答の誘発及びエフェクター機能を抑制するＩＬ−１０の能力は、骨髄及び臓器移植におけるＩＬ−１０形質発現、機能及び潜在的有用性の多くの研究を導いた。マウスにおける血管新生化心臓同種異形移植の研究では、移植の前の被移植動物のＩＬ−１０処置が移植片生着を高め、一方、移植時またはその後にＩＬ−１０を与えても、ほとんど有用な効果はないか、拒絶を高めるのみであった（Liら、１９９９）。ＢＭＴ前のＩＬ−１０産生レベルの上昇を示した患者は、ＧＶＨＤの発生率が低く、生存を向上させた（Bakerら、１９９９）。これに対して、ポスト−ＢＭＴＧＮＨＤ患者における高ＩＬ−１０レベルは、生存に対する予後ははかばかしくなかった（Hempel、１９９７）。しかし、Blazar及びその同僚は、少量のＩＬ−１０（死亡率を増加させる１０^-3、１０^-4の量）でのマウスの処置は、ＧＶＨＤ関連致死率を防ぐことを示した（Blazarら、１９９８）。

免疫抑制剤とＩＬ−１０との組み合わせ
現在の臨床上の使用における免疫抑制剤の大部分は、Ｔ細胞の活性化を抑制することによって作用し、これにより、移植拒絶を防止する。しかし、これは、適切な状況下としては逆効果かもしれず、Ｔ細胞の活性化は、移植特異耐性の発現を促進するプロセスの誘発を招くかもしれない。したがって、その目的が耐性誘発である場合には、免疫抑制剤の使用は、最適でないかもしれない。この現象の明確な証明は、いかなる免疫抑制治療も行うことなしに、同種造血幹細胞移植術後に耐性を獲得したＳＣＩＤ患者によってもたらされる（Bacchettaら、１９９４）。これらの患者において、ホストアロ抗原に対するＴｒ１細胞特異性を誘導したドナーの存在は、安定な混合キメラ現象、インビボにおける高レベルのＩＬ−１０産生及びいかなる免疫抑制治療も受けない正常免疫機能と相関関係がある。これに対して、急性ＧＶＨＤを管理するために免疫抑制の養生法を受けたＢＭＴ患者では、ホストアロ抗原に対するＴ細胞特異性が誘導されたドナーが検出できたとして、Ｔｒ１細胞は末梢血から単離されないであろう（Bacchettaら、１９９５）。

ラパマイシンは、興味深い免疫調節特性を有する新規な化合物を意味する。この理由のため、我々は、同種移植片拒絶を防止し又はタイプ１糖尿病を和らげ、ならびにインビボにおいてＴｒ細胞を発現させるために、ラパマイシンとＩＬ−１０とのインビボにおける投与を組み合わせた。

従来技術
米国特許第6,277, 635号は、移植による拒絶反応を抑制するためのＩＬ−１０の使用に関連する。この特許は、組織の拒絶反応を治療し、阻害する方法を教示し、ＧＶＨＤ及び抗原特異応答を抑制する。さらに、特定の抗原に対するアネルギーを示すＴ細胞について述べている。
米国特許第6,428, 985号は、ヒトを含む哺乳動物の、ＩＬ−１０ポリペプチドと少なくとも１つの野生型配列における突然変異体（ＭｕｔＩＬ−１０）とを含む免疫抑制組成物であって、その単独又は他の剤との組み合わせのいずれかで、インビトロ及びインビボで、そのような組成物及びそれらの組み合わせを用いる種々の方法について述べている。用途は、免疫抑制剤及び多くの疾患のための組み合わせ治療、ならびに炎症、移植、線維症、傷に関連する障害、及び腫瘍治療を含む。ＭｕｔＩＬ−１０の作用は、動物実験において示されているが、ヒトの臨床上の設定においては示されていない。

米国特許第5,624, 823号は、豚ＩＬ−１０をコードするＤＮＡ、及び異質遺伝子型移植を受ける被移植動物（例えば、霊長類）における耐性の誘導方法を示している。ラパマイシン、サイクロスポリン及びＦＫ５０６は、「剤を減少させる助け」、例えば、サイトカイン放出を減少する剤として記載されている。豚のＩＬ−１０は、胸腺移植のみの文脈で用いられている。
米国特許第6,022, 536号は、自己免疫疾患及びＧＶＨＤの治療のための免疫抑制治療として、ＩＬ−１０及びサイクロスポリンを組み合わせた使用が示されている。低容量のＩＬ−１０及びサイクロスポリンならびに医薬担体の相乗効果のある組み合わせが提案されている。

米国特許第6,403, 562号は、自己免疫疾患に罹患した又は感受性のある人に対して、ＩＬ−１０とともにＴＧＦ−βを一緒に投与することによって、多発性硬化症のような自己免疫関連疾患の治療方法が示されている。これらのサイトカインは、相乗効果のある方法において、自己免疫疾患に含まれる自己反応性Ｔ細胞の活性化を阻害するための抑制因子として作用する。

発明の要旨
本発明は、Ｔ細胞媒介免疫応答の調節における使用のための、特に、それが必要な患者における免疫抑制及び抗原−特異免疫耐性を誘発するためのＩＬ−１０及びラパマイシンを含有する医薬製剤を提供する。Ｔｒ１及びＣＤ４⁺ＣＤ２５⁺Ｔｒ細胞−媒介抗原−特異免疫耐性の誘発は、亢進、機能不全、規制されていない又は管理されていない自己−又は非自己−Ｔ細胞−媒介免疫応答を含む病理学的症状の治療に有用である。

本発明の好ましい実施形態では、ＩＬ−１０及びラパマイシンは、同種異系の臓器拒絶；タイプ１糖尿病；乾癬、多発硬化症、炎症性腸疾患、クローン病、慢性関節リウマチを含む自己免疫及び慢性炎症疾患；又はＧＶＨＤ、喘息、アトピー性皮膚炎のような他のＴ−細胞媒介疾患；慢性閉塞性肺疾患；ならびに遺伝子治療誘発生成物に対する免疫反応の予防又は治療上の処置における同時の、別々の又は連続的な使用のための組み合わせ製剤の形態である。さらに、肝臓及び肺繊維症を含む繊維増多疾患の治療が認識される。
好ましくは、その組み合わせ製剤は、堅固な同種異系臓器拒絶、特に、同種移植片β−島拒絶及び自己免疫疾患、特にタイプ１糖尿病の予防及び治療上の処置に使用される。

その組み合わせ製剤は、ヒト又はウィルス性のＩＬ−１０、それらのアナログ、誘導体又ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）抱合ＩＬ−１０のような、天然分子の生物学的利用率又は生物学的有効性を改善する、それらの抱合体を含んでもよい。ＩＬ−１０機能的アナログは、ＩＬ−１０作用を模倣する小分子及びＩＬ−１０レセプター又はＩＬ−１０融合蛋白に対するモノクローナル抗体（ｍＡｂｓ）を含み、それらはＩＬ−１０情報伝達系を誘引する。

その組み合わせ製剤は、ラパマイシンアナログ又は誘導体を含んでいてもよい。ラパマイシン及びＩＬ−１０、それらの誘導体又はアナログに加えて、その組み合わせ製剤は、さらに免疫抑制剤又は免疫調整剤、モノクローナル抗体又はサイトカインを含んでいてもよい。ＩＬ−１０及びラパマイシンの組み合わせにおいて使用することができる好ましい生物学的に活性な物質は、ａ）サイクロスポリン、ＦＫ５０６（タクロリムス）、ピメクロリムスのようなカルシニュリン阻害剤、ｂ）ミコフェノラートのような他の免疫抑制剤、ｃ）ＣＤ４５の種々のイソ型に対する抗体又はＬＦＡ−１のような接着分子、及びｄ）ＩＬ−２受容体α、β及びγ鎖に対する抗体を含む。適当な免疫抑制剤は、ＩＬ−２情報伝達系によって作用するそれらを含む（例えば、ＪＡＫ１及びＪＡＫ３ならびにＳＴＡＴ５阻害剤）。ラパマイシン＋抗Ｔａｃ（ＩＬ−２受容体α鎖に対するヒト化抗体）＋ＩＬ−１０の組み合わせは、従来の治療プロトコルによって発生した持続性免疫抑制の代わりに耐性の状態を含むことによって、異質遺伝子型拒絶、特に、同種移植片β−島拒絶のマウスモデルの予防において特に有効であることが示された。さらに、ラパマイシン＋ＩＬ−１０の組み合わせは、自己免疫糖尿病の治療及びＮＯＤマウスにおける長期にわたる免疫調節の誘発に有効となることが示された。耐性は、ラパマイシン＋ＩＬ−１０誘発拡大ならびにタイプ１Ｔ調節（Ｔｒ１）及びＣＤ４⁺ＣＤ２５⁺Ｔｒ細胞の区別化の結果として獲得され、それらは、抑制サイトカイン（ＩＬ−１０及びＴＧＦ−β）の生成を含む種々のメカニズム及びＴ細胞活性化の阻害によって、抗原−特異耐性を媒介する。

本発明のラパマイシン＋ＩＬ−１０組み合わせ製剤は、Ｔ細胞免疫能力の回復にかかわらず、長期間の予防に能力を発揮し、それは、薬物の使用中止後に維持することができる。
本発明のさらなる実施形態は、ＩＬ−１０及びラパマイシン、ならびに任意に、免疫抑制剤又は免疫調節剤、モノクローナル抗体及びサイトカインから選択されたさらなる活性成分を、医薬的に許容される賦形剤とともに含む医薬組成物を提供する。適当な医薬組成物は、経口、静脈内、非経口又は皮下経路によって投与され、好ましくは、溶液、懸濁液、注射物質、錠剤又はカプセルの形態である。ラパマイシンの有効量は、０．００１ｍｇ／ｋｇから１００ｍｇ／ｋｇの範囲とすることができ、ＩＬ−１０の有効量は、０．００１μｇ／ｋｇから１０００μｇ／ｋｇの範囲とすることができる。
本発明を、以下の実施例及び添付の図面によってさらに詳細に説明する。

図面の説明
図１ＩＬ−１０プロトコル及びエドモントンプロトコルで処置したマウスは、同程度の移植片生着を示す。
ストレプトゾトシン注入によって糖尿病にされたＢａｌｂ／ｃマウスに、腎臓被膜の下、純粋な異質遺伝子型Ｃ５７ＢＬ／６β−島を移植した。マウスは、処置なし（対照、ｎ＝１３マウス）か、３０日間、ラパマイシン＋抗Ｔａｃ＋ＩＬ−１０で処置された（ＩＬ−１０プロトコル、ｎ＝１６マウス）か、ラパマイシン＋抗Ｔａｃ＋ＦＫ５０６で処置（エドモントンプロトコル、ｎ＝４マウス）された。移植片生着を、血糖レベルによってモニターした。移植片は、血糖が２５０ｍｇ／ｄｌより高いときに拒絶されているとみなした。
ＦＫ５０６（エドモントンプロトコル）をＩＬ−１０（ＩＬ−１０プロトコル）に置き換えることにより、同等の移植片生着を示した。ＩＬ−１０プロトコルで処置したマウスにおいて、移植片生着は８９％であり、一方、１００％の生存がエドモントンプロトコルで処置したマウスで観察された。

図２ＩＬ−１０プロトコルで抗Ｔａｃなしとした場合、わずかに異種遺伝子型β−島拒絶が増加した。
ストレプトゾトシン注入によって糖尿病にされたＢａｌｂ／ｃマウスに、腎臓被膜下、純粋な異質遺伝子型Ｃ５７ＢＬ／６β−島を移植した。マウスは、処置なし（対照、ｎ＝８マウス）か、ラパマイシンとＩＬ−１０との組み合わせ（ラパ＋ＩＬ−１０、ｎ＝８マウス）又はＩＬ−１０のみ（ｎ＝４マウス）で処置された。移植片生着を、血糖レベルによってモニターした。
ＩＬ−１０プロトコルで抗Ｔａｃなしとした場合（図１参照）、わずかに移植片生着に影響を及ぼした。ラパマイシンをＩＬ−１０と組み合わせた場合、移植片生着は動物の７８％で認められた。ＩＬ−１０単独での処置は、移植片拒絶の予防に有効でなかった。
これらのデータは、抗Ｔａｃが同種異系移植拒絶を予防するのに必要でなかったことを示唆する。

図３ＩＬ−１０プロトコルで処置したマウスからのＴ細胞はインビトロで増殖能を維持する。
対照の非移植マウス（白棒）及びＩＬ−１０プロトコル（グレー棒）又はエドモントンプロトコル（黒棒）で処置したマウスからのＴ細胞を脾臓から単離し、インビトロで、抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８ｍＡｂｓで多クローン的に刺激した。エドモントンプロトコルで処置したマウスからの細胞は、インビトロでの増殖能においてそれらを強く減少させ、一方、増殖におけるマイルドな減少のみが、ＩＬ−１０プロトコルで処置したマウスから単離したＴ細胞において観察された。
これらのデータは、ＩＬ−１０プロトコルで処置したマウスからのものはそうでないが、エドモントンプロトコルで処置したマウスから単離したＴ細胞において、免疫抑制が意味深い状態であることを示唆する。

図４ＩＬ−１０プロトコルで処置したマウスからのＴ細胞は、抗原−特異増殖能を防止する。
移植２８０日前およびＩＬ−１０プロトコル（グレー棒）又はエドモントンプロトコル（黒棒）で３０日間のみ処置したマウスに対して、ＣＦＡ＋ＯＶＡで、後足裏のやわらかい部分にインビボにおいて免疫化した。リンパ節流を採取し、ＯＶＡ及び自己ＡＰＣによりインビトロで再刺激した。
ＯＶＡ−特異Ｔ細胞増殖は、エドモントンプロトコルで処置したマウスにおいて非常に減少し、一方、ＩＬ−１０プロトコルで処置したマウスにおけるＯＶＡ−応答は、非移植免疫化マウスで観察されたのと同等であった。
これらのデータは、さらに、ＩＬ−１０プロトコルではそうではないが、エドモントンプロトコルで処置したマウスにおいて、免疫抑制が一般状態であることを証明する。

図５ＩＬ−１０プロトコルで処置したマウスから単離したＴ細胞はＩＬ−１０を産生する。
対照の非移植マウス又はＩＬ−１０プロトコル（グレー棒）及びエドモントンプロトコル（黒棒）で処置したマウスの腎臓から単離したＣＤ４⁺Ｔ細胞を、抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８ｍＡｂｓで、インビトロで刺激した。刺激後９６時間に上清を採取し、ＩＬ−１０産生をＥＬＩＳＡで評価した。
ＩＬ−１０プロトコルで処置したマウスからのＴ細胞は、エドモントンプロトコルで処置したマウス及び対照の非移植マウスと比較して、高いレベルのＩＬ−１０を産生した。

図６ＩＬ−１０産生Ｔ細胞の特異集団は、ＩＬ−１０プロトコルで処置したマウスから単離することができる。
(Ａ)ＩＬ−１０プロトコル、エドモントンプロトコルで処置したマウス及び対照の非移植マウスからのＴ細胞を単離し、インビトロで多クローン的に刺激し、サイトカイン産生を誘導した。３時間後、細胞を、偏在細胞表面マーカーに結合する一つのｍＡｂ及びＩＬ−１０を捕捉できる他のｍＡｂとからなるダイアボディで標識した。次いで、多クローン刺激の間に蓄積されたサイトカインを放出させるために、標識細胞を３７℃でさらに１時間インキュベートした。標識細胞によって産生されたＩＬ−１０をダイアボディによって捕獲した。さらに、細胞を、ＰＥで標識された抗ＩＬ−１０ｍＡｂで標識した。ＩＬ−１０⁺濃縮（密ヒストグラム）及びＩＬ１０^-（空ヒストグラム）細胞を磁気で分離するために、抗−ＰＥマイクロビーズを用いた。ＩＬ−１０⁺濃縮Ｔ細胞の特異集団を、ＩＬ−１０プロトコルで処置した移植マウスからのみ単離した。

(Ｂ) 細胞質内の染色を、この特異ＩＬ−１０⁺濃縮Ｔ細胞に行い、Ｔｒ１サイトカインプロファイル（つまり、ＩＬ−１０⁺、ＩＬ−４^-）を有する細胞の有意な集団を、エドモントンプロトコルで処置したマウス又は対照の非移植マウスではなく、ＩＬ−１０プロトコルで処置したマウスにおいて確認した。

図７ＩＬ−１０は、インビボでのＩＬ−１０産生Ｔ細胞を誘発するために必要である。
インビボでＩＬ−１０⁺Ｔｒｌ細胞を誘発するためにＩＬ−１０投与が必要であることを理解するために、移植マウスを、ＩＬ−１０プロトコル（ラパマイシン＋抗Ｔａｃ＋ＩＬ−１０）又はラパマイシン＋抗Ｔａｃのみで処置した。次いで、マウスの２つの群におけるＣＤ４⁺脾臓Ｔ細胞によるＩＬ−１０の産生を評価した。
ＩＬ−１０プロトコル（グレー棒）又はラパマイシン＋抗Ｔａｃ（黒棒）で処置したマウス又は対照の非移植（白棒）のマウスからのＴ細胞を単離し、インビトロで、多クローン的に、抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８ｍＡｂｓで刺激した。
ＩＬ−１０のかなりのレベルが、ＩＬ−１０プロトコルで処置されたマウスから単離された細胞によってのみ産生した。
これらのデータは、ＩＬ−１０が、インビボでＩＬ−１０産生細胞を誘発するために必要であることを示唆する。

図８ＮＯＤマウスにおけるタイプＩ糖尿病の治療のためのラパマイシン＋ＩＬ−１０での予備的結果
１１週齢のＮＯＤマウスは、糖尿病前症の段階である。これらのマウスはインスリン炎及びすい臓における浸潤性自己免疫Ｔ細胞を有しているが、それらは、いまだ血糖正常とする十分なインスリンを産生することができるの十分に正常なβ−島を有している。
糖尿病前症マウスを、１１週齢からはじめて毎日、ラパマイシン、ラパマイシン＋ＩＬ−１０又はＩＬ−１０単独のいずれかで処置した。処置後６週間で、対照マウスの３３％が糖尿病を発症したが、ラパマイシン及びＩＬ−１０で処置したマウスは、全て血糖正常のままであった。
これらの予備的結果は、ラパマイシン＋ＩＬ−１０は、その初期段階において糖尿病をブロックするために使用することができ、さらに進行した自己免疫糖尿病の自発性の発症を予防することを示唆する。

図９ＩＬ−１０プロトコルは、糖尿病誘発性Ｔ細胞の移植後のＮＯＤ．ＳＣＩＤマウスにおいて誘発した糖尿病を阻害する。
ＮＯＤ糖尿病マウスからの脾細胞５×１０⁶をＮＯＤ．ＳＣＩＤマウスに静脈内移植した。被移植マウスを、移植後４０日間、処置しないか、エドモントンプロトコル（ラパマイシン＋抗Ｔａｃ＋ＦＫ５０６）、ＩＬ−１０プロトコル（ラパマイシン＋抗Ｔａｃ＋ＩＬ−１０）又はラパマイシン＋抗Ｔａｃのいずれかで処置した。
移植後５０日で、全ての対照の被処置マウスは糖尿病になった。
エドモントンプロトコルで処置した全てのマウス及びラパマイシン＋抗Ｔａｃで処置した７５％のマウスは、糖尿病になった。興味深いことに、ＩＬ−１０プロトコルで処置した３３％のみのマウスが糖尿病になった。
これらの予備的データは、ＩＬ−１０プロトコルは、自己免疫糖尿病誘発性ＮＯＤＴ細胞の移植によってＮＯＤ．ＳＣＩＤマウスにおいて誘発されたタイプＩ糖尿病を阻害する。

図１０タイプＩ糖尿病の治療のためのラパマイシン＋ＩＬ−１０の使用
Ａ)ＮＯＤマウスにおける糖尿病の治療
ＮＯＤマウスを１１週齢から３１週齢まで、ＩＬ−１０（ＩＬ−１０、ｎ＝７マウス）又はラパマイシン（ＲＡＰＡ、ｎ＝１３マウス）又はラパマイシン＋ＩＬ−１０（ＲＡＰＡ／ＩＬ−１０、ｎ＝１６マウス）又は賦形剤（ＣＮＴＲ、ｎ＝２２マウス）で処置した。血糖レベルによってモニターした糖尿病発生率は、少なくとも６０週齢まで安定した。ラパマイシン単独投与では、糖尿病発生率が９５％から４６％に減少した。ＩＬ−１０投与では、糖尿病の発症に顕著な効果はなかった。ラパマイシンの予防効果は、ＩＬ−１０を処置に加えた場合に、顕著に改善され、糖尿病発生率を１３％に減少した。

Ｂ)ＮＯＤ．ＳＣＩＤマウスにおける糖尿病の移植に対する処置ＮＯＤマウスからの脾細胞の能力
非処置糖尿病ＮＯＤマウス（ＤＩＡＢＥＴＩＣＮＯＤ、ｎ＝８）又はラパマイシンで処理したマウス（ＲＡＰＡＮＯＤ、ｎ＝５）又はラパマイシン＋ＩＬ−１０（ＲＡＰＡ／ＩＬ−１０ＮＯＤ、ｎ＝１３）からの総脾細胞５×１０⁶を、ＮＯＤ．ＳＣＩＤマウスに移植し、糖尿病発生率を血糖レベルによってモニターした。
ラパマイシン処置マウスからの脾細胞の移植は、糖尿病ＮＯＤマウスからの脾細胞を注入されたマウスに比べて、病気の発症を顕著に遅延させた。重要なことに、ラパマイシン＋ＩＬ−１０で処置されたマウスからの脾細胞も同様に、さらに糖尿病伝達を遅らせた。

図１１ラパマイシン±ＩＬ−１０で処置したマウスにおけるＴｒ細胞の濃度
ＣＤ４⁺Ｔ細胞によって産生されたサイトカイン（左パネル）及びＣＤ４⁺ＣＤ２５⁺Ｔ細胞のパーセント（右パネル）を、非処置糖尿病ＮＯＤマウス（グレー線）、ラパマイシン処置マウス（白棒）又はラパマイシン＋ＩＬ−１０処置マウス（黒棒）の脾臓（上部パネル）、膵臓のリンパ節（ＰＬＮ）（中段パネル）及び島浸潤性細胞（ＩＩＣ）（下部パネル）において、それぞれＣＢＡ及びＦＡＣによって評価した。それらのサイトカイン産生プロファイル（つまり、ＩＬ−１０⁺⁺ＩＬ−１５⁺ＴＧＦ−β⁺）によって測定したように、ＣＤ４⁺Ｔｒ１細胞の高い割合が、ラパマイシン＋ＩＬ−１０（黒棒）で処置した耐性マウスの脾臓にのみ存在した。ＣＤ４⁺ＣＤ２５⁺Ｔ細胞のパーセントは、ラパマイシン単独又はラパマイシン＋ＩＬ−１０（黒棒）で処置したマウスの双方の脾臓、ＰＬＭ及びＩＩＣにおいて高かった。したがって、ラパマイシン＋ＩＬ−１０処置マウスにおいて、Ｔｒ１細胞は脾臓において存在し、ＣＤ４⁺ＣＤ２５⁺Ｔｒ細胞は、脾臓、リンパ節及び膵臓において存在した。

図１２インビトロにおける免疫応答を抑制するＴｒ細胞の能力
インビトロにおいて、ＣＦＳＥで標識し、抗ＣＤ３ｍＡｂの存在中で培養したＣＤ４⁺の実験に未使用のＮＯＤＴ細胞の増殖におけるＴｒ細胞の抑制活性を試験した。ＣＤ４⁺ＩＬ−１０濃縮脾臓Ｔ細胞（純度４０％以下）（左パネル）又はＣＤ４⁺ＣＤ２５⁺Ｔ細胞（ＭＡＣ精製、純度７５％以上）（右パネル）のいずれかを、実験に未使用のＴ細胞と同じ数で加えた抑制細胞として用いた。何も加えない細胞（グレー棒）に区分した実験に未使用のＴ細胞を対照として用いた。非処置糖尿病ＮＯＤマウス（黒棒）又はラパマイシン処置マウス（白棒）又はラパマイシン＋ＩＬ−１０処置マウス（点線）から単離されたＣＤ４⁺ＩＬ−１０濃縮Ｔｒ１細胞又はＣＤ４⁺ＣＤ２５⁺Ｔｒ細胞の存在における細胞区分を評価し、対照に対する抑制パーセントを測定した（各ヒストグラムの上部における数）。ラパマイシン＋ＩＬ−１０処置マウスの脾臓からのＴｒ１細胞は、ＮＯＤマウスから得られたＣＤ４⁺Ｔ細胞の増殖応答を緩やかに抑制する。強力な抑制が、ラパマイシン及びラパマイシン＋ＩＬ−１０処置マウスの双方のＰＬＮ及びＩＩＣから単離されたＣＤ４⁺ＣＤ２５⁺Ｔ細胞で観察された。

実施例１
１．同種異系β−島移植
完全不一致のマウス島同種異系移植のモデル（Ｂａｌｂ／ＣへのＣ５７ＢＬ／６）を用いた。同種異系すい臓β−島移植は、インスリン置換療法又はタイプ１糖尿病の治療のためのすい臓移植への有効な代替となっている。過去数年のうちに、ヒトβ細胞の単離及び保存のための改善された方法及び新たな免疫抑制剤の開発が、これらの移植の臨床成果を顕著に改善している。特に、ラパマイシン＋抗Ｔａｃ＋ＦＫ５０６（エドモントンプロトコル）に基づく新たなステロイドフリーの免疫抑制処方が、近年、移植後１年で、患者の８０％において、インスリン非依存をもたらすことが示されている（Shapiroら、２０００）。これらの結果は、全ての先の免疫抑制剤の組み合わせ治療で得られたものをはるかにしのいでいる。しかし、この処方が耐性を誘発し得るという証明は行われていない。

重要なことは、アポトーシスの防止及びＴ細胞発現の阻害のために、ＦＫ５０６の作用メカニズムが耐性誘発の状態を防止するかもしれないことである。
寛容原性プロトコルの開発の努力において、我々は、エドモントンプロトコルにおけるＦＫ５０６をＩＬ−１０によって置換した（つまり、ＩＬ−１０プロトコル、ラパマイシン＋抗Ｔａｃ＋ＩＬ−１０）処方を設計した。
ストレプトゾトシン注入によって糖尿病にされたＢａｌｂ／ｃマウスに、純粋な異質遺伝子型Ｃ５７ＢＬ／６β−島を、腎臓被膜下、移植した。細胞片生着は、ＩＬ−１０プロトコル及びエドモントンプロトコルで処置したマウスにおいて、それぞれ同様であった（移植後２４０日で８９％及び１００％）（図１）。

抗Ｔａｃのインビボにおける使用は、高いＩＬ２Ｒα鎖発現を伴う活性Ｔ細胞をブロックするための必要性によって、過去数年、強く支持されている。
しかし、Ｔｒ細胞のサブセットは、ＩＬ２Ｒα鎖（つまり、ＣＤ４⁺ＣＤ２５⁺Ｔｒ細胞）を構成的に発現させ、このＴ細胞集団が同種異系移植拒絶を抑制し得ることは広く証明されている（Taylorら、２００２）。

したがって、ＣＤ２５⁺Ｔ細胞集団をブロックするｍＡｂの使用は、インビボにおいて、Ｔｒ細胞によって媒介される耐性誘導が求められる場合には、逆指示（counterindicated）されるかもしれない。この理由に対して、抗Ｔａｃを治療プロトコルからの除外することを評価した。我々は、島拒絶を十分に防止し得るか否かを測定するために、ラパマイシン＋ＩＬ−１０又はＩＬ−１０単独で３０日間、移植マウスを処置した(図２)。長期間の移植片生着が、ＩＬ−１０単独で処置したマウスの３０％で観察され、ラパマイシン＋ＩＬ−１０で処置したマウスにおいては７８％に増加した。この移植片生着のレベルは、さらに抗Ｔａｃで処置したマウスのそれよりもわずかに低いのみであった（図１に示す）。これらのデータは、ＩＬ−１０プロトコルから抗ＴａｃｍＡｂを不在とすることにより、同種異系移植片生着を可能にし、一方、ＣＤ４⁺ＣＤ２５⁺Ｔｒ細胞は影響を受けず、インビボにおいてこれら細胞による耐性誘発を保つことを示す。

所望の成果の一つが免疫抑制よりもむしろ耐性であるため、我々は、ＩＬ−１０及びエドモントンプロトコルで処置したマウスからのＴ細胞が多クローナル及び抗原特異刺激に対して応答したかどうかを試験した。まず、Ｔ細胞を移植後２４０日（治療の中断後２１０日）でマウス脾臓から単離し、抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８ｍＡｂで刺激した（図３）。エドモントンプロトコルで処置したマウスからのＴ細胞の増殖は、対照の非移植マウスからのＴ細胞のそれと比較した場合、強く抑制された。Ｔ細胞増殖の抑制は、ＩＬ−１０プロトコルで処置したマウスでは、それほど強くなかった（図３）。次いで、移植後２８０日（治療の中断後２５０日）のマウスを、後足裏の柔らかいところに、ＣＦＡ＋ＯＶＡで免疫化し、リンパ節流から単離されたＴ細胞の増殖応答を測定した（図４）。エドモントンプロトコルで処置したマウスからのＴ細胞は、ＯＶＡに対する応答において増殖しなかったが、一方、ＩＬ−１０プロトコルで処置したマウスからのＴ細胞は、非移植免疫化対照マウスと同様の応答であった（図４）。

ＦＫ５０６のＩＬ−１０による置換が潜在的にＴｒ１細胞拡大を促進するかどうかを測定するために、島移植の部位に浸潤するＣＤ４⁺Ｔ細胞を、移植後２００日のマウスから単離し、それらのサイトカイン産生を調べた。ＩＬ−１０プロトコルで処置したマウスから単離されたＣＤ４⁺Ｔ細胞は、エドモントンプロトコルで処置されたマウスよりも、抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８ｍＡｂで刺激した後、ＩＬ−１０のかなり高い量を産生した（図５）。次いで、精製脾臓Ｔ細胞を、抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８ｍＡｂで刺激し、ＩＬ−１０分泌細胞を、ＩＬ−１０捕捉ビーズを用いて濃縮した（図６Ａ）。ＩＬ−１０／ＩＬ−４サイトカインプロファイルを、細胞質内染色によって試験した（図６Ｂ）。興味深いことに、ＩＬ−１０⁺ＩＬ−４^-細胞の特異集団（つまり、Ｔｒ１細胞のサイトカインプロファイルを反映する）が、ＩＬ−１０プロトコルで処置したマウスにおいてのみ確認された。

ＩＬ−１０を含まない、ラパマイシン＋抗Ｔａｃで処置されたマウスからの浸潤細胞は、ＩＬ−１０を産生しなかった。これは、インビトロにおいて増加したＩＬ−１０産生は、インビボにおけるＩＬ−１０の投与のためであったことを示す（図７）。

まとめると、これらのデータは、
１．ラパマイシン＋抗Ｔａｃ＋ＦＫ５０６の組み合わせ（エドモントンプロトコル）は、同種異系拒絶からマウスを保護するが、長期の慢性免疫抑制の状態を誘発する、
２．ラパマイシン＋抗Ｔａｃ＋ＩＬ−１０の組み合わせ（ＩＬ−１０プロトコル）は、同種異系拒絶に対する長期保護を与える。この処置は、Ｔｒ１細胞と一致するサイトカインプロファイルを伴うＴ細胞の特異集団の拡大をもたらし、保護は、Ｔ細胞免疫能力の回復にもかかわらず、薬物の中断後まで維持する。

実施例２
１．タイプＩ糖尿病における予備的な結果
ラパマイシン＋ＩＬ−１０の寛容原性作用も、タイプＩ糖尿病の設定において評価した。
我々は、β細胞破壊の防止（それは、タイプＩ糖尿病への進行を伴い、疾患の発症において見られる）が、
１．すい臓内での一般的な「バイスタンダー」炎症の抑制、
２．島特異Ｔエフェクター細胞拡大のブロック、
３．抗原特異Ｔｒ細胞の誘発及び拡大
によって防止することができると考えている。

我々の提案するプロトコルでは、炎症の抑制は、ＩＬ−１０によって達成すべきであり、Ｔエフェクター細胞拡大のブロックは、ラパマイシンによって達成すべきである。ＩＬ−１０及びラパマイシンも、Ｔ細胞プライミングを防止せず、したがってそれらは抗原特異Ｔ調節細胞の誘導を可能にするはずであり、以下に説明するように、ＩＬ−１０はＴｒ１細胞の誘導及び拡大を促進するはずである。我々は、タイプＩ糖尿病のＮＯＤマウスのモデルにおける自己免疫を処置することにおいて、ラパマイシン単独又はＩＬ−１０との組み合わせの効果を調査した。ＮＯＤマウスは、島β−細胞の破壊及び血中グルコースの上昇を伴って、１５から３０週齢で明白な疾患を発現し、多くの主要な特性をヒトの疾患と共有している（Tischら、１９９６、Delovitchら、１９９７）。タイプＩ糖尿病の阻害を、ラパマイシン、ラパマイシン＋ＩＬ−１０又はＩＬ−１０単独で、１１週齢（つまり、ペリ膵島炎（periinsultis）を伴う糖尿病前症のマウス）から毎日、ＮＯＤマウスを処置することによって評価した。処置後６週間で、非処置対照マウスの３３％が糖尿病を発症しはじめ、一方、ラパマイシン＋ＩＬ−１０で処置したマウスはなおも全て正常血糖であった（図８）。

また、我々のプロトコルの有効性を、養子免疫細胞移入ＮＯＤ．ＳＣＩＤマウスのモデルでも試験し、それは、内因性のＴ及びＢ細胞を欠いており、したがって、自発性の糖尿病を発現せず、糖尿病のＮＯＤマウスからの５×１０⁶脾細胞の移入後１５から２０日で糖尿病を発現する。ＮＯＤ．ＳＣＩＤ被移植マウスを、処置しないか、あるいはラパマイシン＋抗Ｔａｃ＋ＦＫ５０６（エドモントンプロトコル）、ラパマイシン＋抗Ｔａｃ＋ＩＬ−１０（ＩＬ−１０プロトコル）及びラパマイシン＋抗Ｔａｃで糖尿病の移入後４０日間処置した(図９)。対照マウスは、移入後１５日で糖尿病を発症し始めた。エドモントンプロトコルで処置した全てのマウス及びラパマイシン＋抗Ｔａｃで処置した７５％のマウスは、移入後３３日以内に糖尿病になった。興味深いことに、ＩＬ−１０プロトコルで処置したうちの１匹のマウスのみ（３３％）が、移入後３５日で糖尿病になった。
これらの予備的データの全体から、ラパマイシン＋ＩＬ−１０の使用によって、タイプＩ糖尿病の発現を完全に阻害することは当然のことである。

２．ラパマイシン＋ＩＬ−１０の処置は、自己免疫糖尿病を阻害し、長期間の耐性を誘発する。ＮＯＤマウスモデルにおいて得られた有望な予備的結果に基づいて（図８）、我々は、ラパマイシン±ＩＬ−１０で、１１週齢（膵臓細胞自己免疫が、膵島炎及び自己インスリン抗体によって判断されるように明らかに確立された時点）から、２０週間ＮＯＤマウスを処置した。ラパマイシン単独の投与は、糖尿病の発生率を９５％から４６％に減少させた（図１０Ａ）。先の観察は、ＮＯＤマウスにおけるＩＬ−１０処置の効果は、経路、用量及び投与のタイミングに依存して変化することを示す（Roncaroloら、２００３）。しかし、ここで、我々は、同じ期間にわたるＩＬ−１０単独の投与は、糖尿病の発現において顕著に作用しなかったことを示す。ラパマイシンの防御効果は、ＩＬ−１０が治療に加えられた際、顕著に改善され、さらに、糖尿病の発生率を１３％に減少させた（図１０Ａ）。興味深いことに、防御は、治療を中止した後３０週間さらに維持され、長期免疫調節が確立されたことを示す。

さらに、ラパマイシン又はラパマイシン＋ＩＬ−１０が自己免疫糖尿病の発現を防止することによるメカニズムを、耐性マウスからの細胞の移植実験で調査した。免疫不全ＮＯＤ．ＳＣＩＤマウスにおける非処置糖尿病ＮＯＤマウスからの脾細胞を移植することによって、糖尿病が迅速に誘発され、一方、ラパマイシン処置マウスからの脾細胞を移植することによって、疾患の発症は顕著に遅延した。興味深いことに、ラパマイシン＋ＩＬ−１０の組み合わせで処置したマウスからの脾細胞を移植することでも、さらに、糖尿病移植を遅延した（図１０Ｂ）。これらのデータは、ラパマイシンで処置することは、脾臓の自己反応性Ｔ細胞における糖尿病を伝達する能力を抑制し、この作用は、ＩＬ−１０が処置に加えられた際に強力に高められることを示す。

長期耐性に横たわるメカニズムを、５０週齢以上の耐性マウスで分析した。非処置糖尿病ＮＯＤマウス又はラパマイシン＋ＩＬ−１０処置マウスからの脾臓細胞は、同程度の細胞数を含み、ＣＤ４⁺及びＣＤ８⁺Ｔ細胞と同じ割合であるが、それらのサイトカイン産生プロファイルは制限される。ＣＤ４⁺Ｔｒ１細胞の高い割合は、それらのサイトカイン産生プロファイル（つまり、ＩＬ−１０⁺⁺ＩＬ−５⁺ＴＧＦ−β⁺）によって示されるように、ラパマイシン＋ＩＬ−１０で処置された耐性マウスの脾臓において存在するが、ラパマイシン単独で処置されたマウス又は非処置糖尿病ＮＯＤマウスの脾臓において存在しない(図１１)。しかし、ＩＬ−４を産生する脾臓のＣＤ４⁺Ｔ細胞の割合は、非処置及び処置マウスの双方において同じである。さらに、脾臓ＣＤ４⁺ＣＤ２５⁺Ｔ細胞のパーセントは、非処置糖尿病ＮＯＤマウスに比較して、ラパマイシン単独又はラパマイシン＋ＩＬ−１０で処置したマウスの双方において高い(図１１)。反対に、Ｔｒ１細胞は、膵臓リンパ節（ＰＬＮ）及び島浸潤性細胞（ＩＩＣ）において検出することができず（図１１）、Ｔｒ１細胞は自己免疫部位に存在しないことを示す。一方、ＣＤ４⁺ＣＤ２５⁺Ｔ細胞は、ＰＬＮにおいて多数観察され、ラパマイシン単独又はラパマイシン＋ＩＬ−１０のいずれかで処置されたマウスのＩＩＣから単離されたＣＤ４⁺Ｔ細胞のほぼ１００％を示すが、非処置糖尿病マウスでは示さない（図１１）。ＩＩＣからのこれらＣＤ４⁺ＣＤ２５⁺Ｔ細胞は、アレルギー性であり、ＴＧＦ−βは別として、サイトカインを有意なレベルで産生しない。

次いで、我々は、ラパマイシン＋ＩＬ−１０処置マウスにおいて存在するＴｒ１細胞及びラパマイシン及びラパマイシン＋ＩＬ−１０処置マウスの脾臓、ＰＬＮ及びＩＩＣからのＣＤ４⁺ＣＤ２５⁺Ｔ細胞が、インビトロにおいて抑制活性を有するか否かを測定した。ラパマイシン＋ＩＬ−１０処置マウスの脾臓からのＴｒ１細胞は、ＮＯＤマウスから得られたＣＤ４⁺Ｔ細胞の増殖応答を緩やかに抑制する（図１２）。また、抑制は、処置及び非処置糖尿病ＮＯＤマウスの双方の脾臓から精製されたＣＤ４⁺ＣＤ２５⁺Ｔ細胞で観察され（図１２）、それは、ＣＤ４⁺ＣＤ２５⁺Ｔｒ細胞は、また糖尿病ＮＯＤマウスの脾臓において存在するが、非常に低い頻度であることを示す（図１１に示す）。興味深いことに、強い抑制は、ラパマイシン又はラパマイシン＋ＩＬ−１０処置マウスの双方のＰＬＮ及びＩＩＣから単離されたＣＤ４⁺ＣＤ２５⁺Ｔ細胞で観察された。反対に、非処置糖尿病ＮＯＤマウスから単離されたＣＤ４⁺ＣＤ２５⁺Ｔ細胞は、測定可能ないかなる抑制活性を有さなかった（図１２）。これらのデータは、糖尿病ＮＯＤの膵臓組織は、Ｔｒ細胞よりもむしろ、活性化Ｔエフェクター細胞を主に含み、一方、処置マウスのＰＬＮ及びＩＩＣは、主にＣＤ４⁺ＣＤ２５⁺サブセットのうちＴｒ細胞を含むことを示す。

概して、これらのデータは、ラパマイシン＋ＩＬ−１０処置の後に観察される定常状態の耐性は、脾臓におけるＴｒ１細胞ならびにリンパ節及び膵臓におけるＣＤ４⁺ＣＤ２５⁺Ｔｒ細胞の蓄積に関連することを示す。

材料及び方法
マウスＢａｌｂ／ｃ、Ｃ５７ＢＬ／６、ＮＯＤ／Ｌｔ及びＮＯＤ．ＳＣＩＤの雌性マウスをCharles River Laboratories (Calco, Italy)から購入した。全てのマウスは、特定の病原体フリーの状態で保持した。尾の静脈血におけるグルコースレベルをGlucometer Elite system (Bayer, Wuppertal, Germany)を用いて定量した。糖尿病を、ストレプトゾトシン（シグマ、セントルイス、ＭＯ）１７０ｍｇ／ｋｇの静脈内注入によって、Ｂａｌｂ／ｃマウスで誘発した。糖尿病の診断を、２５０ｍｇ／ｄｌより高い２回の連続的なグルコース測定の後に行った。

島移植厳選されたＣ５７ＢＬ／６の膵臓島を、３７℃にて一晩培養した後、先に述べたように、Ｂａｌｂ／ｃ糖尿病マウスの腎臓膜の下に移植した（３００島／マウス）（Davalliら、１９９６）。

移植マウスの処置移植されたＢａｌｂ／ｃマウスの処置を、移植して３０日後の日に始めた。ラパマイシン（Rapamune, Wyeth-Ayerst Research, Pearl River, NY）をピーナツ油（シグマ）で希釈し、胃管栄養法によって１ｍｇ／ｋｇの用量で一日１回投与した。ヒトＩＬ−１０（BD Biosciences, Mountain View, CA）をＰＢＳで希釈し、０．０５ｍｇ／ｋｇの用量で、腹腔内に１日２回投与した。ＦＫ５０６（Prograf, Fujisawa, Milano）を生理食塩水で希釈し、０．３ｍｇ／ｋｇの用量で、腹腔内に１日１回投与した。抗ＩＬ−２Ｒα鎖ｍＡｂ（抗Ｔａｃ）（クローン７Ｄ４、ＢＤ）を生理食塩水で希釈し、１ｍｇ／マウスの最終用量になるように、移植後０及び４日目に、腹腔内に投与した。糖尿病の発生を血中グルコースレベルによってモニターした。

糖尿病阻害研究雌性ＮＯＤマウスを、１１週齢から３１週齢まで、移植マウスで用いたのと同じ用量で用いて、ラパマイシン、ラパマイシン＋ＩＬ−１０又はＩＬ−１０単独で処置した。糖尿病の発生を血中グルコースレベルによってモニターした。

糖尿病移植研究糖尿病ＮＯＤ雌性マウスから脾細胞を採取し、ＮＯＤ．ＳＣＩＤにおいて５×１０⁶／マウスの用量で、静脈内に注入した。移植マウスにおいて使用されたのと同じ用量で、被移植マウスを、処置しないか、移植後４０日間、ラパマイシン＋抗Ｔａｃ＋ＦＫ５０６又はラパマイシン＋抗Ｔａｃ＋ＩＬ−１０、又はラパマイシン＋抗Ｔａｃで処置した。糖尿病の発生を血中グルコースレベルによってモニターした。

ＮＯＤ．ＳＣＩＤマウスにおける養子免疫細胞移入対照又は処置ＮＯＤマウスからの脾臓を、治療の中止後採取した。５００万の総脾細胞を、ＮＯＤ．ＳＣＩＤマウスに静脈内注入によって養子免疫細胞移入した。糖尿病の発生を血中グルコースレベルによってモニターした。

インビボにおける免疫化ＣＦＡ(Difco, Detroit, MI)に乳化したオバアルブミン（ＯＶＡ）ペプチド３２３−３３９（Primm, Milano, Italy）を移植Ｂａｌｂ／ｃマウスの後足裏の柔らかい部位の皮下に、１００μｇ／マウスの用量で、一回注入した。リンパ節流を採取し、インビトロアッセイに用いた。

細胞選別浸潤性膵臓の細胞を、説明されたように単離した（Gregoriら、２００３）。得られた細胞集団を、抗ＣＤ９０ｍＡＢ−被覆マイクロビーズとともにインキュベートし、精製Ｔ細胞を得るためにMiniMacs カラム（Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany）に付した。ＣＤ４⁺ＣＤ２５⁺Ｔ細胞を、Multisortキット（Miltenyi）で選別した（平均精製度≧７５％）。いくつかの実験において、ＣＤ４⁺ＣＤ２５⁺Ｔ細胞を、無菌でＦＡＣＳtar細胞ソーター（ＢＤ）で選別した（平均精製度９９％）。ＩＬ−１０産生細胞を、ネズミＩＬ−１０分泌アッセイ濃縮及び検出キット（Miltenyi）で選別した（平均精製度≧４０％）。

ＩＬ−１０陽性細胞の濃縮ＩＬ−１０産生細胞を、市販のキット（Miltenyi）によって濃縮した。精製Ｔ細胞を、不動状態の抗ＣＤ３及び溶解抗ＣＤ２８の存在下、１０⁶／ｍｌの濃度で培養した。培養の３時間後、細胞を回収し、ＣＤ４５及び他のｍＡｂ捕獲ネズミＩＬ−１０に対して指向するｍＡｂからなるダイアボディで、４℃にて１０分間標識した。次いで、細胞を１０⁵／ｍｌの最終濃度で希釈し、３７℃で４５分間サイトカインを分泌させた。サイトカイン捕捉期間の後、細胞を回収し、０．５％のＢＳＡ及び５ｎＭのＥＤＴＡ（バッファ）を含有するＰＢＳに１０⁸／モル再懸濁し、ＰＥ抱合αＩＬ−１０ｍＡｂ（ＢＤ）で４℃にて１０分間染色した。細胞を１回バッファで洗浄し、１０⁸／モル再懸濁し、抗−ＰＥマイクロビーズで４℃にて１０分間染色した。ＩＬ−１０濃縮細胞集団を磁気カラムで単離した。細胞サンプルをＦＡＣＳカリバー・フローサイトメトリー（ＢＤ）で分析した。

細胞培養抑制実験のために、実験に使用していないＣＤ４⁺ＮＯＤのＴ細胞を、他で述べたように（Lyonsら、１９９４）、ＣＦＳＥ（Molecular Probes、Eugene、OR）で染色し、９６ウェルプレート（１×１０⁵ウェル）中にて、抗ＣＤ３ｍＡｂ（ＢＤ）１０μｇ／ｍｌの存在下で培養した。ラパマイシン又はラパマイシン＋ＩＬ−１０で２０週間処置したＮＯＤマウスから得られたＣＤ４⁺Ｔ細胞を、１：１の割合で培養液に加え、分裂した実験に使用していない細胞のパーセントを評価し、なんら加えられていない細胞における分裂細胞のパーセントと比較した。分裂細胞を、総事象ＣＦＳＥ⁺によって増殖集団に含有された分裂事象によって評価した。媒体中に放出されたサイトカインの測定のために、精製Ｔ細胞（１×１０⁵／ウェル）を、９６ウェルプレートで培養し、１０μｇ／ｍｌの免疫化抗ＣＤ３（ＢＤ）及び１μｇ／ｍｌの溶解抗ＣＤ２８（ＢＤ）で刺激した。培養の４８時間（ＩＬ−５検出のために）及び９６時間（ＩＬ−１０及びＴＧＦ−β検出のために）後に上清を採取した。

フローサイトメトリー説明したＡｂｓ（全てＢＤから）で細胞を染色し、CellQuest ソフトウェア (ＢＤ)を装備したＦＡＣスキャンフローサイトメータで分析した。

サイトカイン測定採取された上清中に存在するサイトカインを、標準的な市販のキット（ＢＤ）を用いて、サンドイッチＥＲＩＳＡ又はフローサイトメトリー原理のアッセイ（ＣＢＡ）によって定量した。特定のサイトカインを産生する細胞のパーセントを細胞内染色によって測定した。精製Ｔ細胞を６時間、１０μｇ／ｍｌの免疫化抗ＣＤ３及び１μｇ／ｍｌの溶解抗ＣＤ２８（ＢＤ）で、１×１０⁶／ｍｌの濃度で、染色した。ブレフェドリンＡを培養の最後の３時間添加した。細胞内染色を、先に述べたように（Trembleauら、２０００）行った。

ＩＬ−１０プロトコル及びエドモントンプロトコルで処置したマウスの移植片生着を示す。ＩＬ−１０プロトコルで抗Ｔａｃなしとした場合の異種遺伝子型β−島拒絶の増加を示す。ＩＬ−１０プロトコルで処置したマウスからのＴ細胞について、インビトロでの増殖能を示す。ＩＬ−１０プロトコルで処置したマウスからのＴ細胞についての抗原−特異増殖能を示す。ＩＬ−１０プロトコルで処置したマウスから単離したＴ細胞について、ＩＬ−１０の産生を示す。ＩＬ−１０産生Ｔ細胞の特異集団について、ＩＬ−１０プロトコルで処置したマウスからの単離を示す。ＩＬ−１０によるインビボでのＩＬ−１０産生Ｔ細胞の誘発を示す。ＮＯＤマウスにおけるタイプＩ糖尿病の治療のためのラパマイシン＋ＩＬ−１０での予備的結果を示す。ＩＬ−１０プロトコルが、糖尿病誘発性Ｔ細胞の移植後のＮＯＤ．ＳＣＩＤマウスにおいて誘発した糖尿病を阻害した実験結果を示す。タイプＩ糖尿病の治療のためのラパマイシン＋ＩＬ−１０の使用効果を示す。ラパマイシン±ＩＬ−１０で処置したマウスにおけるＴｒ細胞の濃度を示す。インビトロにおける免疫応答を抑制するＴｒ細胞の能力を示す。

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Claims

有効成分としてＩＬ−１０及びラパマイシンからなる、自己免疫疾患における抗原特異的免疫耐性を誘発するための複合医薬製剤。
自己免疫疾患が、関節リウマチ、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス及びタイプＩ糖尿病から選択される請求項１の複合医薬製剤。
ＩＬ−１０がヒト由来のものである請求項１又は２の複合医薬製剤。
ＩＬ−１０がポリエチレングリコールに抱合されてなる請求項１〜３のいずれかの複合医薬製剤。
抗原特異的免疫耐性が、Ｔｒ１細胞及び／又はＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋Ｔｒ細胞によって媒介される請求項１〜４のいずれかの複合医薬製剤。
溶液、懸濁液、錠剤又はカプセルの形態である請求項１〜５のいずれかの複合医薬製剤。