ES2645692T3 - Microcápsulas de rapamicina y su uso para el tratamiento del cáncer - Google Patents

Abstract

Una microcápsula que comprende un componente núcleo, que comprende al menos 5 % en peso de un inhibidor del blanco de rapamicina en mamíferos (mTOR), que es rapamicina, en donde dicho componente núcleo se microencapsula y se encierra en un recubrimiento que incluye un copolímero de metacrilato de metilo y ácido metacrílico.

Description

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DESCRIPCION

Microcapsulas de rapamicina y su uso para el tratamiento del cancer Antecedentes de la invencion

1. Campo de la Invencion

La presente invencion se refiere de manera general al campo de la farmacologfa y al tratamiento y la prevencion de los trastornos relacionados con la edad. Mas espedficamente, la invencion se refiere a microcapsulas que incluyen rapamicina como inhibidor del blanco de rapamicina en mairnferos (mTOR), y a los metodos de tratamiento o prevencion de enfermedades, trastornos y afecciones relacionadas con la edad, tal como el cancer, en un sujeto que usa las microcapsulas de la presente invencion.

2. Descripcion de la tecnica relacionada

Debido a que la mayona de las muertes en los pafses desarrollados ocurre a partir de enfermedades cuyas incidencias aumentan rapidamente con la edad, las intervenciones que retardan el envejecimiento pudieran beneficiar mucho mas que las medidas preventivas que solo inciden en las enfermedades espedficas del final de la vida, tales como las enfermedades cardiacas, el cancer o la diabetes. Existe un gran interes en el desarrollo de aditivos dieteticos que retarden el envejecimiento e incrementen la duracion de la vida.

mTOR y cancer. EL TOR en mamfferos es un efector cntico de las vfas de senalizacion desreguladas asociadas con el cancer (Guertin and Sabatini, 2007; Shaw and Cantley, 2006). Las mutaciones en los genes tscl o tsc2, que conducen al smdrome del complejo esclerosis tuberosa (TSC) o de tumores hamartomatosos, sugiere una relacion molecular entre mTOR y cancer. El mTORCI es el unico efector comun conocido aguas abajo de dos de las vfas principales de senalizacion en cancer (Ras y PI3K), y que, ademas, se integra con la senalizacion de los nutrientes para la regulacion del crecimiento ede la celula (masa) (Shaw and Cantley, 2006). La hiperactivacion de la senalizacion de AKT probablemente media la transformacion oncogenica a traves de mTOR (Skeen et al., 2006).

Se sugiere que un efector principal de mTORCI, la quinasa 1 S6 (S6K1), media el efecto deletereo tal como la resistencia a la insulina y la diabetes tipo II (Patti and Kahn, 2004; Tremblay et al., 2005b; Tremblay et al., 2005c; Um et al., 2006). En comparacion con el tipo silvestre, el raton deficiente de S6K1 demuestra una tasa reducida de crecimiento que incluye menos tejido adiposo (WAT) debido a celulas mas pequenas (Shima et al., 1998). De manera interesante, el fenotipo de los ratones deficientes de S6K1 incluye hipoinsulinemia acoplada con un aumento de la sensibilidad a la insulina (Um et al., 2004). A causa de un aumento en la lipolisis y a la tasa metabolica, estos ratones se muestran resistentes a la obesidad inducida por la dieta (Um et al., 2004). En las celulas musculares deficientes de la funcion de S6K1, existe un incremento de AMP y fosfato inorganico, y un aumento consecuente en AMPK activada y en las funciones dependientes de AMPK que incluyen la biogenesis mitocondrial y la y-oxidacion de los acidos grasos (Aguilar et al., 2007). Concomitante con esta respuesta, ademas, hay una disminucion en el contenido lipfdico de las celulas.

Se demostro que la rapamicina actua como un inhibidor potente de la diferenciacion de los adipocitos, un efecto que se revierte por altas concentraciones de FK506, lo que indica un efecto inhibitorio operativo mediado por un complejo entre la inmunofilina y la rapamicina (Yeh et al., 1995). Se propuso un modelo para la funcion cntica de mTOR y su actividad quinasa en la diferenciacion de los preadipocitos 3T3-L1, en donde la via de mTOR y la via del fosfatidilinositol 3- quinasa/Akt actuan en paralelo durante la adipogenesis por mediar la disponibilidad de nutrientes y las senales de la insulina, respectivamente (Kim and Chen, 2004).

Existe la necesidad de tratamientos mas efectivos de enfermedades asociadas a la edad y, la necesidad de una comprension mayor de los agentes que puedan aumentar la duracion de la vida y retardar la aparicion de las enfermedades asociadas a la edad.

Resumen de la invencion

La presente invencion se basa en parte de los descubrimientos de que un estado fisiologico similar a la restriccion de alimentos y/o factores de crecimiento, con retardo en el envejecimiento e incidencia reducida en las enfermedades asociadas a la edad, puede lograrse en mai^eras, que incluye humanos, mediante el bloqueo cronico de un complejo de protemas central en la via de detectar nutrientes y de respuesta a factores de crecimiento llamada blanco de rapamicina en marnfferos (mTOR), mediante formulaciones de un inhibidor de mTOR en una formulacion que se encapsula. Por ejemplo, los inventores encontraron que la alimentacion, con rapamicina microencapsulada, en la vida adulta extiende la duracion de la vida en ratones geneticamente heterogeneos. Ademas, la rapamicina microencapsulada se encontro que rescata la cognicion y atenua la patologfa en los modelos murinos de la enfermedad de Alzheimer. La microencapsulacion mejora la eficacia terapeutica en comparacion con formulaciones que no estan encapsuladas. La inhibicion cronica de mTOR puede aplicarse para mejorar la salud y el bienestar de los individuos, que incluye adultos maduros, mediante la mejona de diversas categonas principales de enfermedades que dependen de la

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edad, por lo que aumenta la calidad y la cantidad de anos de vida productiva, mientras proporciona un beneficio economico significativo.

La presente invencion tiene que ver con microcapsulas que incluyen un componente nucleo que incluye un inhibidor de mTOR, que es rapamicina, en donde el componente nucleo se encierra en un recubrimiento que incluye un copolfmero de metil metacrilato y acido metacnlico. En modalidades particulares, el recubrimiento proporciona una liberacion retardada del inhibidor de mTOR y/o libera de manera preferencial el agente terapeutico en el tracto intestinal de un sujeto (es dear, un recubrimiento enterico). El recubrimiento enterico puede ser cualquiertal recubrimiento conocido por los expertos en la tecnica. En algunas modalidades particulares, el recubrimiento incluye Eudragit S100. El recubrimiento puede incluir una mezcla de uno o mas de Eudragit S100, ftalato de acetato de celulosa (CAP), un copolfmero de metil metacrilato y acido metacnlico, succinato de acetato de celulosa, ftalato de hidroxi propil metil celulosa, ftalato de acetato de polivinil (PVAP), y un copolfmero de metil metacrilato y acido metacnlico.

Una "microcapsula" como se usa en la presente descripcion se define como un vetuculo para la liberacion de un agente terapeutico en un sujeto, que incluye uno o mas nucleos, donde el nucleo(s) se encierra en un recubrimiento como se expuso anteriormente. En modalidades particulares, la microcapsula incluye un nucleo unico que se encierra en un recubrimiento. En modalidades adicionales, la microcapsula incluye una pluralidad de nucleos encerrados en un recubrimiento, donde el nucleo con el recubrimiento que lo rodea se agregan juntos para formar una estructura unica para suministrar el farmaco. El nucleo puede ser un solido o este puede ser un lfquido, y su estado puede depender de la temperatura ambiente.

Las microcapsulas pueden ser de cualquier forma. Las formas geometricas basicas pueden ser, por ejemplo, esferas, varillas, cilindros, cubos, cuboides, prisma, piramides, conos, conos truncados y piramides truncadas. Son adecuados, ademas, estrellas moldeadas, cruces moldeadas, aborlonados moldeados y trilobados. Pueden incorporarse dentro de las microcapsulas cavidades, tal como tubos incorporados.

Las microcapsulas pueden ser de forma regular o pueden ser de forma irregular. La superficie de la microcapsula puede ser lisa, escarpada, o dentada. Ellas pueden ser amorfas, esfericas, o puntiagudas, en dependencia del metodo de produccion respectivo. Las microcapsulas pueden formarse mediante el uso de cualquier metodo conocido por los expertos en la tecnica. Los ejemplos no limitantes de tales metodos se discuten en mayor detalle mas abajo. En una dosificacion unica que incluye microcapsulas, las microcapsulas pueden ser de tamano y forma uniforme, o pueden ser de tamanos y formas variables.

El diametro maximo de la microcapsula puede ser de aproximadamente 100 nm, 1 pm, 10 pm, 50 pm, 100 pm o cualquier intervalo de diametros maximos derivado dentro de los diametros mencionados anteriormente.

La microcapsula puede comprender al menos 5%, al menos 10%, al menos 20%, al menos 30%, al menos 40%, al menos 50%, al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 99% o mas de rapamicina en peso (w/w).

El inhibidor de mTOR es rapamicina. En modalidades mas particulares, el mTORC1 es rapamicina y el recubrimiento es Eudragit S100.

En algunas modalidades, las microcapsulas de la presente invencion incluyen uno o mas agentes farmaceuticos o nutraceuticos. Los ejemplos no limitantes de tales agentes incluyen una vitamina, un agente de hierbas (tal como ginkgo biloba o te verde), aceite de pescado (acidos grasos omega 3), un agente antimicrobiano, un antioxidante, un farmaco, o un agente antiinflamatorio. Por ejemplo, el componente nucleo puede incluir un segundo compuesto que es vitamina E, vitamina A, un antibiotico antibacteriano, un antioxidante, L-carnitina, acido lipoico, metformina, resveratrol, leptina, un farmaco antiinflamatorio no esteroideo, un inhibidor de COX, vitamina D, un mineral tal como magnesio, calcio, zinc o potasio, un elemento traza tal como molibdeno o iodo, un carotenoide (tal como vitamina A), una enzima tal como lipasa o amilasa, o un aminoacido (tal como lisina, arginina, taurina, o prolina). El farmaco puede ser un agente que se conoce, o se sospecha, es beneficioso en el tratamiento o la prevencion de una enfermedad, trastorno o afeccion asociados a la edad. Por ejemplo, el farmaco puede ser un agente que se conoce, o se sospecha, es beneficioso en el tratamiento o la prevencion de una enfermedad neurodegenerativa, perdida de memoria, metabolismo anormal de la glucosa, o cancer. Los ejemplos no limitantes de tales agentes se discuten en la especificacion mas abajo. El nucleo y/o el recubrimiento de las microcapsulas expuestas en la presente descripcion pueden incluir uno o mas materiales complementarios, tales como portadores, aglutinantes, y lo similar, que son bien conocidos por los expertos en la tecnica.

En algunas modalidades, la microcapsula consiste esencialmente de un componente nucleo que comprende rapamicina, en donde el componente nucleo se encierra en un recubrimiento que incluye un copolfmero de metil metacrilato y acido metacnlico. En modalidades particulares, el recubrimiento es Eudragit S100. En modalidades mas particulares, el recubrimiento es Eudragit S100 y el nucleo incluye rapamicina. La microcapsula puede incluir uno o mas materiales complementarios como se discutio anteriormente.

El nucleo puede incluir uno o mas componentes adicionales ademas de uno o mas inhibidores de mTOR. Por ejemplo, el nucleo puede incluir los diluyentes que se seleccionan del grupo que comprende manitol, lactosa, celulosa

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microcristalina, fosfato dicalcico, almidon, almidon pregelatinizado, sorbitol o mezclas de estos. El nucleo puede incluir desintegrantes tales como almidon de glicolato de sodio, croscarmelosa de sodio, crospovidona, almidon o mezclas de estos. El nucleo puede incluir un aglutinante tal como hidroxipropil celulosa, hidroxi etil celulosa, etil celulosa, hidroxipropil metilcelulosa, metilcelulosa o mezclas de estos. El nucleo puede incluir un lubricante tal como estearato de calcio, estearato de magnesio, estearil de fumarato de sodio, talco, dioxido de silicona coloidal o mezclas de estos.

Otras modalidades de la presente invencion tienen que ver con composiciones farmaceuticas o nutraceuticas para el tratamiento o la prevencion del cancer como enfermedad, afeccion o trastorno asociado a la edad, que incluye una microcapsula que incluye un componente nucleo que comprende un inhibidor de mTOR que es rapamicina, en donde el componente nucleo se encierra en un recubrimiento que incluye un copolfmero de metil metacrilato y acido metacnlico. La microcapsula puede ser cualquiera de las microcapsulas de la presente invencion. Las composiciones farmaceuticas expuestas en la presente descripcion pueden incluir uno o mas agentes farmaceuticamente aceptables, muchos de los cuales son bien conocidos por los expertos en la tecnica.

En algunas modalidades, las microcapsulas se formulan con una sustancia digerible. La sustancia digerible puede ser un alimento o un aditivo de alimentos. Opcionalmente la composicion puede incluir uno o mas agentes adicionales que pueden aplicarse en el tratamiento o la prevencion de cualquier enfermedad, trastorno, o afeccion asociada a la salud. Por ejemplo, la enfermedad puede ser una enfermedad asociada a la edad, tal como una enfermedad neurodegenerativa, metabolismo anormal de la glucosa, o cancer. Las composiciones pueden formularse con uno o mas agentes nutraceuticos, muchos de los cuales son bien conocidos por los expertos en la tecnica. Por ejemplo, el agente nutraceutico puede ser una vitamina, un suplemento nutricional, o un agente derivado de hierbas o plantas que se conoce, o se sospecha, es beneficioso para promover la salud y el bienestar de un sujeto.

La presente invencion tiene que ver, ademas, con el uso de las microcapsulas de la presente invencion para tratar o prevenir el cancer como enfermedad, afeccion, o trastorno asociados a la edad. El sujeto puede ser cualquier sujeto, tal como un mairnfero. Los ejemplos no limitantes de mairnferos incluyen ratones, ratas, conejos, perros, gatos, vacas, ovejas, caballos, cabras, primates, y humanos. En modalidades particulares, el sujeto es un humano. El humano puede ser un humano que se conoce, o se sospecha, que tiene una enfermedad asociada a la edad. En algunas modalidades, el humano es un humano mayor de 50 anos de edad, mayor de 55 anos de edad, mayor de 60 anos de edad, mayor de 65 anos de edad, mayor de 70 anos de edad, mayor de 75 anos de edad, o mayor de 80 anos de edad.

Con respecto al cancer, los ejemplos no limitantes incluyen cancer de mama, cancer de pulmon, cancer de prostata, cancer de ovario, cancer del cerebro, cancer de hugado, cancer de cervix, cancer de colon, cancer renal, cancer de piel, cancer de cabeza y cuello, cancer de hueso, cancer de esofago, cancer de vejiga, cancer de utero, cancer linfatico, cancer de estomago, cancer de pancreas, cancer de testfculos, linfoma y leucemia.

El sujeto puede tener una enfermedad, afeccion o trastorno, existente, asociado a la edad, o el sujeto puede estar en riesgo de desarrollar una enfermedad, afeccion o trastorno asociado a la edad. El sujeto en riesgo puede ser un sujeto que previamente recibio tratamiento para una enfermedad, afeccion, o trastorno asociado a la edad, donde previamente la enfermedad, afeccion, o trastorno fue tratado exitosamente. El sujeto puede estar en riesgo a causa de otros factores de riesgos, tales como factores de riesgo genetico o factores de riesgo ambiental.

La presente invencion tiene que ver, ademas, con un metodo para prolongar la duracion de la vida de un sujeto mairnfero que consiste en administrar a un sujeto una cantidad con eficacia terapeutica de microcapsulas de la presente invencion, en donde se prolonga la duracion de la vida. La prolongacion de la duracion de la vida, como se usa en la presente invencion, se refiere a una mayor duracion de la vida de un sujeto con respecto a la que, de cualquier otra manera, el sujeto pudiera vivir en ausencia de las microcapsulas de la presente invencion. Puede obtenerse un estimado de la duracion de la vida que el sujeto pudiera vivir, de cualquier otra manera, en ausencia de las microcapsulas, por ejemplo, a partir de estudios demograficos, Tablas de la Administracion Social y de Seguro de Vida, y de la literatura cientffica que tiene que ver con la duracion de la vida. La presente invencion tiene que ver, ademas, con los metodos para reducir el deterioro cognitivo asociado a la edad en un sujeto mairnfero, que consisten en administrar al sujeto una cantidad con eficacia terapeutica de microcapsulas de la presente invencion, en donde se reduce el deterioro cognitivo asociado a la edad. La reduccion del deterioro cognitivo asociado a la edad puede evaluarse mediante la comparacion del sujeto con un mdice cognitivo conocido a partir de un sujeto o sujetos controles.

Las microcapsulas pueden administrarse mediante el uso de cualquier metodo conocido por los expertos en la tecnica. Los ejemplos no limitantes de las vfas de administracion incluyen, la via oral, por tubo nasogastrico, la via rectal, la via intraperitoneal, la via topica, la via subcutanea, intravenosa, intrarterial, intramuscular, por enema, e intratecal. En algunas modalidades, las microcapsulas se administran mediante la combinacion de las microcapsulas con una composicion que incluye una sustancia digerible.

La dosis de las microcapsulas que se administra puede determinarse por un medico practico mediante el uso de cualquier metodo conocido por los expertos en la tecnica. En algunas modalidades, la dosis del inhibidor de mTOR es aproximadamente 1 microgramo a aproximadamente 100 mg por kg de peso corporal del sujeto. La informacion adicional que tiene que ver con los regfmenes de dosificacion se discute en la especificacion mas abajo.

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Otros aspectos de la presente invencion tienen que ver con los metodos de fabricacion de una microcapsula, que incluye un inhibidor de mTOR, que consisten en aplicar un recubrimiento farmaceutico a una partfcula de nucleo que comprende un inhibidor de mTOR, en donde la partfcula de nucleo queda cubierta con el recubrimiento. El recubrimiento puede ser un recubrimiento enterico. El recubrimiento puede ser cualquiera de los recubrimientos discutidos antes y en cualquier parte en esta descripcion. En modalidades espedficas, el recubrimiento es Eudragit S100.

Cualquier metodo conocido por los expertos en la tecnica puede usarse para aplicar el recubrimiento a la partfcula. En modalidades espedficas, la aplicacion de un recubrimiento enterico consiste en el uso de un disco atomizador rotatorio, otros metodos pueden incluir el recubrimiento por capas, recubrimiento por suspension en aire, extrusion por centrifugacion, boquilla vibracional, secado por pulverizacion, polimerizacion de la interface, polimerizacion in situ, polimerizacion de la matriz

Otros aspectos de la presente invencion tienen que ver con estuches que incluyen un primer recipiente sellado que incluye una microcapsula o microcapsulas de la presente invencion. El estuche puede incluir un primer recipiente sellado que incluye cualquiera de las microcapsulas de la presente invencion. En algunas modalidades, el estuche incluye, ademas, instrucciones para usar las microcapsulas de la presente invencion. En algunas modalidades, el estuche incluye, ademas, un segundo compuesto. El segundo compuesto puede contenerse en el primer recipiente sellado, o puede contenerse separadamente tal como en un segundo recipiente sellado.

Debe entenderse que la descripcion precedente enfatiza en ciertas modalidades espedficas de la invencion y que todas las modificaciones o alternativas equivalentes de esta manera estan dentro del esprntu y del alcance de la invencion como se expone en las reivindicaciones anexas.

Se contempla espedficamente que cualquier limitacion discutida con respecto a una modalidad de la invencion puede aplicarse a cualquier otra modalidad de la invencion. Ademas, cualquier composicion de la invencion puede usarse en cualquier metodo de la invencion, y cualquier metodo de la invencion puede usarse para producir o para usar cualquier composicion de la invencion.

El uso del termino “o” en las reivindicaciones se usa para significar “y/o” a menos que se indique explfcitamente para referirse solo a las alternativas, o las alternativas se excluyen mutuamente, aunque la descripcion apoya una definicion que se refiere solo a las alternativas y “y/o”.

Atraves de esta solicitud, el termino “aproximadamente” se usa para indicar que un valor incluye la desviacion estandar del error del dispositivo y/o metodo que se emplea para determinar el valor.

Como se usa en la presente descripcion la especificacion, "un" o "una" puede significar uno o mas, a menos que se indique claramente de cualquier otra manera. Como se usa en la presente descripcion en la reivindicacion(s), cuando se usa junto con la palabra "comprende," las palabras "un" o "una" puede significar uno o mas que uno. Como se usa en la presente descripcion "otro" puede significar, al menos, un segundo o mas.

Cualquier modalidad de cualquiera de los dispositivos medicos, sistemas de perfusion, y estuches presentes puede consistir de, o consistir esencialmente de, en vez de comprende/incluye/contiene/tiene, las caractensticas descritas y/o las etapas. Por tanto, en cualquiera de las reivindicaciones, el termino "consiste de" o "consiste esencialmente de" puede sustituirse por cualquiera de los verbos de union de extremo abierto enumerados anteriormente, para cambiar el alcance de una reivindicacion dada, a partir de que pudiera usarse el verbo de union de extremo abierto de cualquier otra manera.

Otros objetivos, caractensticas y ventajas de la presente invencion se tornaran evidentes a partir de la siguiente descripcion detallada.

Breve descripcion de las figuras

Las siguientes figuras forman parte de la presente especificacion y se incluyen para demostrar, ademas, ciertos aspectos de la presente invencion. La invencion puede comprenderse mejor mediante referencias a una o mas de esas figuras en combinacion con la descripcion detallada de las modalidades espedficas presentadas en la presente descripcion.

FIG. 1. Graficos de supervivencia para ratones machos (izquierda) y ratones hembras (derecha), que compara ratones controles con respecto a aquellos alimentados con enalapril, CAPE o rapamicina agrupados a traves de tres sitios experimentales. Enalapril y CAPE se anadieron a la dieta a los 4 meses de edad, y rapamicina a los 20 meses. Los valores de P se calcularon mediante la prueba de los rangos logantmicos.

FIG. 2. Graficos de supervivencia para ratones machos y hembras, que compara ratones controles con respecto a aquellos alimentados con rapamicina en la dieta que comenzo a los 600 dfas de edad, agrupados a traves de tres sitios experimentales. Los valores de P se calcularon mediante la prueba de los rangos logantmicos. El cuatro por ciento de los ratones controles y el tres por ciento de los ratones asignados al grupo de rapamicina se eliminaron del experimento por razones tecnicas. Solo cinco animales (tres controles, dos rapamicina) se eliminaron despues de empezar el tratamiento con rapamicina a los 600 dfas. Por tanto, no existieron diferencias entre los grupos en evaluacion.

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FIG. 3. Supervivencia de los ratones controles y tratados con rapamicina para machos y hembras de cada uno de los tres sitios experimentales separadamente. Los valores de P representan los resultados de la prueba de los rangos logantmicos. Las lmeas verticales a los 600 dfas de edad indican la edad en la cual los ratones se expusieron por primera vez a rapamicina.

FIG. 4A,4B, 4C. Caracterizacion de los ratones que reciben rapamicina a partir de los 270 dfas de edad. A, Graficos de supervivencia de ratones machos y hembras, que compara los ratones controles con respecto a los ratones tratados con rapamicina de una poblacion separada (Cohorte 2006), en la cual los ratones se trataron con rapamicina a partir de los 270 dfas de edad. Debido a que en el tiempo del analisis interino todos los ratones vivos eran de 800 y 995 dfas de edad, solo la informacion limitada sobre la forma de la curva de supervivencia en las edades superiores a los 900 dfas, y el cambio evidente en la pendiente en las edades mayores (>990 dfas) reflejan esta ambiguedad experimental. Los valores de P se calcularon mediante la prueba de los rangos logantmicos. B, Efectos de la rapamicina en la dieta sobre un efector de mTOR en el pamculo de grasa visceral, a partir de los 750 dfas de edad hasta los 880 dfas de edad, en ratones machos y hembras. La protema de la subunidad ribosomal S6 (rpS6) y su estado de fosforilacion (P-rpS6, doble flecha) se evaluaron con pruebas inmunologicas en lisados de tejidos preparados a partir de ratones que consumen dietas de rapamicina microencapsulada o dietas control. Los anticuerpos usados se muestran a la izquierda. Los valores de la relacion de intensidad para P-rpS6/rpS6 se muestran en los graficos para ratones machos y hembras. Ademas, se realizo un inmunoensayo para Pan actina en las bandas para proporcionar una indicacion del contenido de protemas para cada lmea. C, Contenido de rapamicina en sangre completa en ratones machos y hembras de 750 dfas de edad hasta 880 dfas de edad. En B y C, las barras de error muestran los errores estandar de la media.

FIG. 5. Reduccion de P-rpS6(Ser240/244) en Tejido Adiposo Blanco.

FIG. 6. Reduccion de P-rpS6(ser240/244) en Hfgado.

FIG. 7. Efectos no detectables sobre P-rpS6(Ser240/244) en cerebro.

FIG. 8. Aumento en 4E-BP1 en el tejido adiposo blanco de machos.

FIG. 9. Efectos no detectables sobre 4E-BP1 en Hfgado.

FIG. 10. Activacion de Akt en el tejido adiposo blanco de machos.

FIG. 11. Activacion de Akt en Imgado de machos.

FIG. 12. Activacion de Akt en cerebro.

FIG. 13. Estabilidad de rapamicina en los alimentos.

FIG. 14. La encapsulacion de rapamicina mejora la estabilidad en la comida de laboratorio. Se anadio rapamicina a una comida de laboratorio, preparada comercialmente, a 7 ppm y el alimento se evaluo para el contenido de rapamicina. Los niveles de rapamicina son menores que lo esperado, lo que sugiere que la rapamicina se degrado durante la preparacion o el almacenamiento de los alimentos (barra abierta). La microencapsulacion de la rapamicina redujo la degradacion (barra sombreada).

FIG. 15. La rapamicina se detecta en sangre completa despues de la alimentacion con una dieta que contiene rapamicina encapsulada o no encapsulada. Los ratones se alimentaron con rapamicina encapsulada o no encapsulada (7 ppm) durante 3 semanas y la sangre se evaluo para detectar niveles de rapamicina. La encapsulacion resulto en niveles de rapamicina en sangre significativamente mayores que los observados mediante el uso de rapamicina no encapsulada.

FIG. 16. Microencapsulacion.

FIG. 17. Niveles de rapamicina en sangre.

FIG. 18. Reduccion de la senalizacion de mTOR en ratones sometidos a restriccion calorica.

FIG. 19. La rapamicina no tuvo efecto sobre el peso corporal.

FIG. 20. La rapamicina atenua la disminucion de la actividad locomotriz general asociada a la edad.

FIG. 21. Efectos no significativos sobre la adiposidad en ratones alimentados con rapamicina a partir de los 9 meses de edad.

FIG. 22. Efecto de la restriccion calorica sobre la duracion de la vida.

FIG. 23. Analisis de la P-Ser473 Akt en el pamculo de grasa visceral: 20 meses de tratamiento.

FIG. 24. Analisis de la P-Ser473 Akt en el musculo gastrocnemio.

FIG. 25. No existen diferencias en el peso corporal de ratones, con o sin rapamicina, por una alimentacion con una dieta

alta en grasas durante 12 semanas.

FIG. 26. La rapamicina causa intolerancia a la glucosa en ratones HET3 alimentados con una dieta alta en grasas.

FIG. 27. Efectos del aumento de factores dieteticos grasos o de calonas sobre los efectos de la rapamicina en el metabolismo de la glucosa.

FIG. 28A, 28B,28C, 28D. La rapamicina elimina los deficits de memoria en los ratones 3xTg-AD y hAPP(J20), modelos de la AD. A y C, Las latencias promedio en alcanzar una plataforma oculta se redujeron significativamente en los ratones 3xTg-AD y hAPP(J20) alimentados con rapamicina con respecto a los grupos Tg alimentados con dieta control (*P< 0.044; y *P=0.036, respectivamente). El aprendizaje fue efectivo en ambos grupos hAPP(J20) y 3xTg-AD [F(3,120)=10.29, P<0.0001 y F(4,220)=16.95, P<0.0001, respectivamente]. No se observaron interacciones significativas entre el numero del dfa y el genotipo; portanto, a grandes rasgos, el genotipo tuvo el mismo efecto en todos los tiempos durante el entrenamiento. B y D, La retencion del sitio de la primera plataforma se afecto en los ratones 3xTg-AD y hAPP(J20) de los grupos alimentados con la dieta control [P<0.01 y P<0.001, prueba de comparacion multiple de Tukey aplicada para un efecto significativo del genotipo (P=0.01 y P<0.0001, respectivamente) en un ANOVA de una via], pero no fue significativamente diferente de aquellos de los grupos no Tg con respecto a los animales 3xTg-AD y hAPp(J20) alimentados con rapamicina. Los datos son la media ± SEM.

FIG. 29A, 29B,30C,29D, 29E, 29F, 29G,29H, 29I. La rapamicina disminuye los niveles y la deposicion de Ap42. A y B, Trasferencias Western representativas de las protemas extrafdas de los cerebros de ratones 3xTg-AD y hAPP(J20),

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respectivamente. C, D, y E, El analisis cuantitativo de APP, C99 y C83 (normalizado respecto a los niveles de p-actina) muestra que la rapamicina no tuvo efecto significativo en el procesamiento de APP en ambas lmeas transgenicas. F y G, Las mediciones por ELISA indican que la rapamicina no modifico los niveles de As40 en los cerebros de los ratones 3xTg-AD (F; P=0.89) o hAPP(J20) (G; P=0.29). Por el contrario, la rapamicina disminuyo significativamente los niveles de As42 soluble en los ratones 3xTg-AD y hAPP(J20) (P=0.02 y 0.04, respectivamente). H e I, Microfotograffas ilustrativas que representan las neuronas piramidales de CA1, de los ratones 3xTg-AD, tenidas con un anticuerpo anti- As42. Las evaluaciones estad^sticas se realizaron mediante el uso de la prueba t de Student no pareada, de dos colas. FIG. 30A, 30B, 30C, 30D, 30E, 30F, 30G, 30H, 30I. La administracion de rapamicina disminuye significativamente la patologfa de tau en los ratones 3xTg-AD. A y B, Las microfotograffas ilustrativas de las neuronas piramidales de CA1 tenidas con el anticuerpo anti tau AT270, el cual reconoce a tau fosforilada en la Thr181, indican claramente una disminucion en la inmunoreactividad a AT270 en los ratones tratados con rapamicina. C y D, Vistas con mayor magnificacion de los paneles A y B, respectivamente. E y F, Secciones seriadas de aquellas mostradas anteriormente se tineron con el anticuerpo anti tau, conformacional espedfico, MC1. Mientras que los ratones 3xTg-AD de 8 meses de edad comenzaban a mostrar inclusiones positivas para MC1 en algunas neuronas del hipocampo (E), no fuimos capaces de detectar ninguna inclusion positiva para MC1 en los ratones 3xTg-AD tratados con rapamicina. G, Transferencia Western representativa de las protemas extrafdas de los cerebros de ratones 3xTg-AD e incubadas con el anticuerpo anti tau espedfico para su estado fosforilado, AT270, y con /A-actina como control de carga. H, El analisis de cuantificacion de las transferencias en el panel G indica que la rapamicina redujo significativamente los niveles constitutivos de la tau fosforilada en la Thy181 (P=0.006). I, Las mediciones por ELISA muestran que los niveles de tau soluble se redujeron significativamente en el cerebro de los ratones tratados con rapamicina (P=0.0l). No se detectaron cambios en los niveles de tau insoluble (P>0.05). Las evaluaciones estadfsticas se realizaron mediante el uso de la prueba t de Student no pareada, de dos colas, y el ANOVA de una via, para los niveles de inmunoreactividad de AT270 y para las determinaciones por ELISA, respectivamente. La escala de la barra es 12.5 pm para los paneles A, B, E y F; 100 pm para los paneles C, D.

FIG. 3lA, 31B, 31C, 31D, 31E,31F. La administracion de rapamicina aumenta la autofagia en el cerebro de los ratones hAPP(J20) y 3xTg-AD. A, Transferencia Western representativa de las protemas extrafdas de los cerebros de los ratones 3xTg-AD. B, E, El analisis de cuantificacion (los datos se normalizan con respecto a s-actina) indica que la rapamicina aumenta significativamente los niveles constitutivos de ATG7 (B; P=0.03) y del complejo ATG5/ATG12 (C; P=0.04), lo que indica un aumento en los niveles de autofagia en los ratones tratados con rapamicina. Mientras que no se observaron cambios significativos en los niveles de LC3I (D; P>0.05), la rapamicina aumento significativamente los niveles cerebrales de LC3II (E; P=0.03), lo que indica, ademas, un aumento en la autofagia. E y F, Imagenes epifluorescentes representativas del hipocampo en CA1 en el cerebro de los ratones alimentados con dieta control (E) y alimentados con rapamicina (F) hAPP(j20) tenidas con un anticuerpo anti LC3. Se observo un aumento marcado en la inmunoreactividad espedfica a LC3 en las proyecciones de CA1 despues de la administracion de rapamicina. Inserto, contraste z de las imagenes confocales de la misma region. Se muestran secciones 2D representativas a traves de los volumenes.

FIG. 32A, 32B. Activacion de Akt en la grasa visceral de ratones machos UM-HET3 tratados con rapamicina durante 5 semanas. A) Se muestran los inmunoensayos con los anticuerpos usados a la izquierda de cada transferencia (P-Akt es espedfico para la Ser 473). B) Los datos se cuantificaron y se muestran como graficos. Para el analisis estadfstico se eliminaron las intensidades de las bandas de la hembra #21 porque ellas estaban fuera del lfmite del intervalo de confianza de 95 % de la media.

FIG. 33. Reduccion de la activacion de Akt en la grasa visceral de ratones machos UM-HET3 tratados con rapamicina durante 20 meses con rapa. Se muestran, ademas, los datos de ratones hembras. Los anticuerpos usados se muestran a la izquierda de cada transferencia (P-Akt es espedfico para la Ser 473). Los datos se cuantificaron y se muestran como graficos mas abajo de las inmunotransferencias.

FIG. 34. Tratamiento con rapamicina a corto plazo versus tratamiento a largo plazo en el musculo gastrocnemio. Se muestran los graficos de la cuantificacion de los valores de intensidad de las relaciones P-473Ser Akt/Akt. A) Cinco semanas de tratamiento. B) Veinte meses de tratamiento. Note que las hembras muestran un aumento significativo en la fosforilacion de la Ser473 en las hembras tratadas durante 5 semanas con rapamicina, con la misma tendencia en los machos. En 20 meses de tratamiento, no hay aumento en la fosforilacion de Akt ni en hembras ni en machos.

FIG. 35. Ensayo de inmunotransferencia de S6K1 en tumores de hffgado de ratones tratados con rapamicina (R) y ratones control (C) en la cohorte 3. Estos ratones estuvieron con alimentos rapa durante 20 meses. P-Thr(389)p70 es la senal del anticuerpo que depende de la fosforilacion, y p70 es la senal del anticuerpo que no depende de la fosforilacion.

FIG. 36A, 36B. La rapamicina disminuye la fosforilacion de la quinasa p70. A, El analisis cuantitativo de la inmunoreactividad de p-P70 en las transferencias de lisados de hipocampo de ratones controles o tratados con rapamicina demuestra que la rapamicina disminuye la fosforilacion de la quinasa p70, lo que es consistente con la inhibicion de mTOR por rapamicina. B, Transferencia Western representativa de las protemas extrafdas a partir del hipocampo de ratones hAPP(J20) controles o tratados con rapamicina (conocidos, ademas, como ratones PDAPP). Las evaluaciones estadfsticas se realizaron mediante el uso de la prueba t de Student no pareada, de dos colas.

Descripcion de las modalidades ilustrativas

La presente invencion toma ventaja del reconocimiento de que la microencapsulacion de un inhibidor de mTOR mejora la estabilidad del inhibidor, lo que a su vez mejora la eficacia del inhibidor en reducir el envejecimiento celular, la longevidad de los organismos, y las enfermedades del envejecimiento asociadas a la edad. Por ejemplo, para mejorar la

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estabilidad del farmaco en la dieta, los inventores desarrollaron un procedimiento de microencapsulacion que mejora la fraccion de rapamicina que sobrevive a la preparacion de los alimentos en unas 3 a 4 veces. Los ratones que consumen alimentos con rapamicina microencapsulada tienen concentraciones en sangre aproximadamente 10 veces mas alta que aquellos que comen alimentos con rapamicina no encapsulada. La microencapsulacion de rapamicina propicio que esta evaluacion fuera posible financieramente, ya que los costos estimados para la rapamicina no encapsulada de esta evaluacion eran extremadamente altos. Despues de que al menos el 50 % de los ratones habfan muerto, los ratones en el grupo de rapamicina mostraron una supervivencia mas alta que los controles (p < 0001, machos y p < 0.0007, hembras). Estos datos sustentan fuertemente el concepto de que la inhibicion cronica de la via de mTOR a traves de cualquier via de suministro de rapamicina mejorara las enfermedades asociadas a la edad tales como, cancer, smdromes metabolicos y enfermedades neurodegenerativas, por lo cual mejoran la salud y el bienestar general de los adultos maduros.

A. Inhibidores de mTOR y rapamicina

Cualquier inhibidor de mTOR se contempla para la inclusion en las presentes microcapsulas y metodos. En modalidades particulares, el inhibidor de mTOR es rapamicina. La rapamicina (conocida, ademas, como sirolimus y comercializada bajo el nombre comercial Rapamune.RTM.) es un macrolido conocido. La formula molecular de rapamicina es C.sub.51H.sub.79NO.sub.13. El nombre qmmico es

(3S,6R,7E,9R,10R,12R,14S,15E,17E,19E,21S,23S,26R,27R,34aS)-9,10, 12, 13, 14, 21, 22,

23,24,25,26,27,32,33,34,34a-hexadecahidro-9,27-dihidroxi-3- [(1R)-2-[(1S,3R,4R)-4-hidroxi-3-metoxiciclohexil]-1-

metiletil]-10,21-dimetoxi-6,8,12,14,20,26-hexametil-23,27-epoxi-3H-pirido[2,1-c][1,4] oxaazaciclohentria- contina-

1,5,11,28,29 (4H,6H,31H)-pentona.

La rapamicina se une a un miembro de la familia de protema de union a FK (FKBP), FKBP 12. El complejo rapamicina/FKBP 12 se une a la protema quinasa mTOR para bloquear la activacion de las vfas de transduccion de la senal. Debido a que la red de senalizacion de mTOR incluye multiples genes supresores de tumor, que incluyen PTEN, LKB1, TSC1, y TSC2, y multiples protooncogenes que incluyen PI3K, Akt, y eEF4E, la senalizacion de mTOR juega un papel central en la supervivencia y proliferacion celular. La union del complejo rapamicina/FKBP a mTOR causa detencion del ciclo celular en la fase G1 (Janus et al., 2005).

Los inhibidores de mTOR incluyen, ademas, los analogos de rapamicina. Muchos analogos de rapamicina son conocidos en la tecnica. Los ejemplos no limitantes de analogos de rapamicina incluyen, pero no se limitan a, everolimus, tacrolimus, CCI-779, AbT-578, AP-23675, AP-23573, AP-23841, 7-epi-rapamicina, 7-tiometil-rapamicina, 7- epi-trimetoxifenil- rapamicina, 7-epi-tiometil-rapamicina, 7-demetoxi-rapamicina, 32-demetoxi-rapamicina, 2-desmetil- rapamicina, prerapamicina, temsirolimus, y 42-O-(2-hidroxi)etil rapamicina.

Otros analogos de rapamicina incluyen: oximas de rapamicina (Patente de los EE.UU. num. 5.446.048); aminoesteres de rapamicina (Patente de los EE.UU. num. 5.130.307); dialdehfdos de rapamicina (Patente de los EE.UU. num. 6.680.330); enoles-29 de rapamicina (Patente de los EE.UU. num. 6.677.357); derivados de rapamicina O-alquilada Patente de los EE.UU. num. 6.440.990); esteres de rapamicina solubles en agua (Patente de los EE.UU. num. 5.955.457); derivados alquilados de rapamicina (Patente de los EE.UU. num. 5.922.730); amidino carbamatos de rapamicina (Patente de los EE.UU. num. 5.637.590); esteres de biotina de rapamicina (Patente de los EE.UU. num. 5.504.091); carbamatos de rapamicina (Patente de los EE.UU. num. 5.567.709); hidroxiesteres de rapamicina (Patente de los EE.UU. num. 5.362.718); sulfonatos-42 y (N-carbalcoxi)sulfamatos-42 de rapamicina(Patente de los EE.UU. num. 5.346.893); isomeros oxepano de rapamicina (Patente de los EE.UU. num. 5.344.833); derivados imidazolidil de rapamicina (Patente de los EE.UU. num. 5.310.903); alcoxiesteres de rapamicina (Patente de los EE.UU. num. 5.233.036); pirazoles de rapamicina (Patente de los EE.UU. num. 5.164.399); derivados de acilo de rapamicina (Patente de los EE.UU. num. 4.316.885); productos de la reduccion de rapamicina (Patente de los EE.UU. nums. 5.102.876 y 5.138.051); esteres amida de rapamicina (Patente de los EE.UU. num. 5.118.677); esteres fluorinados de rapamicina (Patente de los EE.UU. num. 5.100.883); acetales de rapamicina (Patente de los EE.UU. num. 5.151.413); oxorapamicinas (Patente de los EE.UU. num. 6.399.625); y silil esteres de rapamicina (U.S. Pat. No. 5.120.842).

otros

7.476.

7.220. 5.912. 5.550. 5.516. 5.488. 5.434. 5.362

5.221. 5.130.

analogos de rapamicina incluyen aquellos descritos en Patente de los EE.UU. Nums. 7.560.457;

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7.470.682; 7.455.853; 7.446.111; 7.445.916; 7.282.505; 7.279.562; 7.273.874

7.160.867; 6.329.386; RE37.421; 6.200.985; 6.015.809; 6.004.973; 5.985.890

5.780.462; 5.665.772; 5.637.590; 5.567.709; 5.563.145; 5.559.122; 5.559.120

5.541.192; 5.541.191; 5.532.355; 5.530.121; 5.530.007; 5.525.610;

5.508.399; 5.508.290; 5.508.286; 5.508.285; 5.504.291; 5.504.204;5.491.231;

7.268.144

5.955.457

5.559.119

5.521.194;

5.489.680;

5.486.524; 5.486.523; 5.486.522; 5.484.791; 5.484.790; 5.480.989; 5.480.988; 5.463.048

5.411.967; 5.391.730; 5.389.639; 5.385.910; 5.385.909; 5.385.908; 5.378.836; 5.378.696

5.358.944; 5.346.893; 5.344.833; 5.302.584; 5.262.424; 5.262.423; 5.260.300; 5.260.299

5.221.670; 5.202.332; 5.194.447; 5.177.203; 5.169.851; 5.164.399; 5.162.333; 5.151.413 5.120.842; 5.120.727; 5.120.726; 5.120.725; 5.118.678; 5.118.677; 5.100.883; 5.023.264;

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5.922.730

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5.519.031

5.489.595

5.446.048

5.373.014

5.233.036

5.138.051

5.023.263

5.023.262. Analogos y derivados adicionales de rapamicina pueden encontrarse en las siguientes Publicaciones de las Solicitudes de Patente de los EE.UU. Nums.: 20080249123. 20080188511; 20080182867; 20080091008;

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20080085880; 20080069797; 20070280992; 20070225313; 20070203172; 20070203171; 20070203170; 20070203169; 20070203168; 20070142423; 20060264453; y 20040010002.

La rapamicina o un analogo de rapamicina pueden obtenerse a partir de cualquier fuente conocida por los expertos en la tecnica. La fuente puede ser una fuente comercial, o una fuente natural. La rapamicina o un analogo de rapamicina puede sintetizarse qmmicamente mediante el uso de cualquier tecnica conocida por los expertos en la tecnica. Los ejemplos no limitantes de la informacion que tiene que ver con la smtesis de rapamicina pueden encontrarse en Schwecke et al., 1995; Gregory et al., 2004; Gregory et al., 2006; Graziani, 2009.

B. Preparacion de microcapsulas

Las microcapsulas de la presente invencion pueden prepararse mediante el uso de cualquier metodo conocido por los expertos en la tematica. Cualquier metodo conocido por los expertos en la tecnica puede usarse para obtener el nucleo. Despues, el nucleo se recubre mediante el uso de cualquier metodo conocido por los expertos en la tecnica. En modalidades particulares, el recubrimiento es un recubrimiento enterico. Algunos ejemplos de recubrimiento se discuten mas abajo. En modalidades espedficas, la aplicacion de un recubrimiento enterico consiste en usar un disco atomizador rotatorio, otros metodos pueden incluir el recubrimiento por capas, recubrimiento por suspension en aire, extrusion por centrifugacion, boquilla vibracional, secado por pulverizacion, polimerizacion de la interface, polimerizacion in situ, polimerizacion de la matriz.

Los metodos adicionales para la preparacion de microcapsulas se discuten en las siguientes Publicaciones de Solicitudes de Patente de los EE.UU. Num.: 20080022965, 20080193653, 20070138673; 20070082829; 20060234053, 20060121122, 20050113282, 20040121155, 20040074089, y20020009473, y las siguientes Patentes de los EE.UU.: 7.576.903, 7.037.582, 6.936.644, 6.653.256, 6.592.916, 6.486.099, 4.460.722.

C. Nucleos

El nucleo, como se usa en la presente descripcion, se refiere a la porcion de la microcapsula que incluye en agente activo, donde el agente activo se encierra en un recubrimiento. Los agentes activos se discutieron anteriormente y en cualquier lugar en esta descripcion.

El nucleo puede incluir cualquier numero de agentes terapeuticos adicionales, o cualquier numero de ingredientes complementarios adicionales. Por ejemplo, el nucleo puede incluir, ademas, al menos uno de un potenciador de la absorcion, un aglutinante, un agente potenciador de la dureza, opcionalmente, un desintegrante y otro excipiente. Los ejemplos de aglutinantes incluyen povidona (PVP: polivinil pirrolidona), HPC de bajo peso molecular (hidroxipropil celulosa), HPMC de bajo peso molecular (hidroxipropil metilcelulosa), carboxi metil celulosa de bajo peso molecular, etilcelulosa, gelatina de oxido de polietileno, acacia, dextrina, silicato de magnesio aluminio, almidon, y polimetacrilatos. El nucleo puede incluir un estabilizador tal como al menos uno de butil hidroxianisol, acido ascorbico y acido cftrico. El nucleo puede incluir un desintegrante seleccionado a partir del grupo que consiste en croscarmelosa de sodio, crospovidona (uniones cruzadas de polivinil pirrolidona) almidon de carboximetil de sodio (almidon de glicolato de sodio), uniones cruzadas de carboximetil celulosa de sodio (Croscarmelosa), almidon pregelatinizado (almidon 1500), almidon microcristalino, almidon insoluble en agua, carboximetil celulosa de calcio, silicato de magnesio y aluminio y una combinacion de estos.

El nucleo puede incluir un relleno tal como un relleno como monohidrato, celulosa microcristalina, almidon, lactitol, lactosa, una sal de calcio inorganico adecuada, sucrosa, o una combinacion de estos.

El nucleo puede incluir un antioxidante que se selecciona a partir del grupo que consiste en 4,4 (2,3 dimetil tetrametileno dipirocatecol), extracto rico en tocoferol (vitamina E natural), alfa tocoferol (vitamina E sintetica), beta tocoferol, gamma tocoferol, delta tocoferol, Butilhidroxinon, Butil hidroxianisol (BHA), Butil hidroxitolueno (BHT), Propil Galato, Octil Galato, Dodecil Galato, Butilhidroquinona terciaria (TBHQ), Acido Fumarico, Acido Malico, Acido Ascorbico (vitamina C), Ascorbato de Sodio, Ascorbato de Calcio, Ascorbato de Potasio, Ascorbil palmitato, Ascorbil estearato, Acido Cftrico, Lactato de Sodio, Lactato de potasio, lactato de calcio, lactato de magnesio, anoxomero, acido eritorbico, eritorbato de sodio, acido eritorbin, eritorbin de sodio, etoxiquin, glicina, goma guaica, citrato de sodio (citrato monosodico, citrato disodico, citrato trisodico), citratos de potasio (citrato monopotasico, citrato tripotasico), lecitina, polifosfato, acido tartarico, tartrato de sodio (tartrato monosodico, tartrato disodico), tartratos de potasio (tartrato monopotasico, tartrato dipotasico), tartrato de potasio y sodio, acido fosforico, fosfato de sodio (fosfato monosodico, fosfato disodico, fosfato trisodico), fosfatos de potasio (fosfato monopotasico, fosfato dipotasico, fosfato tripotasico), tetraacetato de etileno diamino calcio disodico (calcio disodico EDTA), acido lactico, trihidroxi butirofenona y acido tiodipropionico.

El nucleo puede incluir un agente quelante tal como antioxidantes, edentato de dipotasio, edentato de sodio, edetato disodico de calcio, acido edetico, acido fumarico, acido malico, maltol, edentado de sodio, edetato trisodico.

El nucleo puede incluir un lubricante tal como sales de estearato; acido estearico, aceite corola, palmitoestearato de glicerilo, aceite vegetal hidrogenado, oxido de magnesio, aceite mineral, poloxamero, polietilenglicol, alcohol polivinilo, estearato de magnesio, benzoato de sodio, talco, estearil fumarato de sodio, compritol (behenato de glicerol), y lauril

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sulfato de sodio (SLS) o una combinacion de estos. Una modalidad preferida de la formulacion, de conformidad con la presente invencion, presenta, preferentemente, un nucleo que contiene material hidrofflico, hinchable, que forma hidrogeles, cubierto por un recubrimiento que incluye un polfmero insoluble en agua y un agente hidrofflico permeable al agua, a traves del cual el agua penetra en el nucleo. Despues, en el nucleo, el material hinchable que forma hidrogeles se hincha y estalla el recubrimiento, despues de lo cual el nucleo, mas preferentemente, se desintegra lentamente o de cualquier otra manera libera el ingrediente activo. Otra modalidad opcional, pero preferida, se refiere a un nucleo que controla la liberacion con un recubrimiento seco que se erosiona lentamente.

D. Recubrimientos

Muchas formas de dosificacion farmaceutica irritan el estomago debido a sus propiedades qmmicas o se degradan por el acido del estomago a traves de la accion de las enzimas, portanto se tornan menos efectivas. El recubrimiento puede ser un recubrimiento enterico, un recubrimiento que previene la liberacion y la absorcion de los ingredientes activos hasta que ellos alcancen el intestino. El termino "enterico" se refiere al intestino delgado, y portanto, los recubrimientos entericos facilitan la liberacion de los agentes en el intestino delgado. Algunos recubrimientos entericos facilitan la liberacion de los agentes en el colon. En algunas modalidades, el recubrimiento enterico es un recubrimiento EUDRAGIT (®). Los recubrimientos Eudragit incluyen Eudragit L100-44 (para la liberacion en el duodeno), Eudragit L 30 D-55 (para la liberacion en el duodeno), Eudragit L 100 (para la liberacion en el yeyuno), Eudragit S100 (para la liberacion en el fleon), y Eudragit FS 30D (para la liberacion en el colon). Otros recubrimientos incluyen Eudragit RS, Eudragit RL, etilcelulosa, y acetato de polivinilo. Los beneficios incluyen la liberacion del farmaco en dependencia del pH, la proteccion de los agentes activos sensibles al fluido gastrico, la proteccion de la mucosa gastrica de los agentes activos, el incremento en la efectividad del farmaco, buena estabilidad durante el almacenamiento, y alcanzar el GI y el colon.

Algunos ejemplos de componentes de recubrimiento enterico incluyen ftalato de acetato de celulosa, copolfmeros de metil acrilato y acido metacnlico, succinato de acetato de celulosa, ftalato hidroxi propil metil celulosa, hidroxi propil metil celulosa acetato succinato, ftalato de acetato polivinilo, copolfmeros de metil metacrilato y acido metacnlico, alginato de sodio, y acido estearico. El recubrimiento puede incluir polfmeros gelificantes hidrofflicos adecuados que incluyen pero no se limitan a polfmeros celulosicos, tales como metilcelulosa, carboximetilcelulosa, hidroxipropilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, hidroxietilcelulosa, y lo similar; polfmeros de vinilo, tales como polivinilpirrolidona, alcohol polivinilo, y lo similar; polfmeros acnlicos y copolfmeros, tales como polfmeros de acido acnlico, copolfmeros de acido metacnlico, copolfmeros de etil acrilato y metil metacrilato, gomas naturales y sinteticas, tales como goma guar, goma arabica, goma xantan, gelatina, colageno, protemas, polisacaridos, tales como pectina, acido peptico, acido algmico, alginato de sodio, poliaminoacidos, polialcoholes, poliglicoles; y lo similar; y mezclas de estos. Cualquier otro agente de recubrimiento conocido por los expertos en la tecnica se contempla para incluirlo en los recubrimientos de las microcapsulas expuestas en la presente descripcion.

El recubrimiento puede comprender, opcionalmente, un plastificante, tal como dibutil sebacato, polietilenglicol y polipropilenglicol, dibutil ftalato, dietil ftalato, trietil citrato, tributil citrato, monoglicerido acetilado, acetil tributil citrato, triacetin, dimetil ftalato, benzoato de benzilo, butil y/o esteres glicol de acidos grasos, aceites minerales refinados, acido oleico, aceite de castor, aceite de mafz, alcanfor, glicerol y sorbitol o una combinacion de estos. El recubrimiento puede incluir, opcionalmente, una goma. Los ejemplos no limitantes de gomas incluyen homopolisacaridos tales como goma de algarroba, galactanos, mananos, gomas vegetales tales como alginatos, goma karaya, pectina, agar, tragacanto, acacia, carragenano, tragacanto, quitosan, agar, acido algmico, otras gomas polisacaridos (por ejemplo, hidrocoloides), acacia catechu, salai guggal, bodelum indio, goma copaiba, asafetida, goma cambi, Enterolobium cyclocarpum, goma para sellar, goma benzoma, sandaraca, goma gambier, butea frondosa (Goma Llama de Selva), mirra, manano konjak, goma guar, goma welan, goma gellan, goma tara, goma de algarroba, goma caragenano, goma glucomanano, goma galactan, alginato de sodio, tragacanto, quitosan, goma xantan, goma xantan deacetilado, pectina, polipectato de sodio, gluten, goma karaya, goma tamarindo, goma ghatti, goma Accaroide/Yacca/goma roja, goma dammar, goma enebro, goma ester, goma semilla ipil-ipil, goma talha (acacia seyal), y goma de celulas de plantas cultivadas que incluyen aquellas de las plantas del genero: acacia, actinidia, aptenia, carbobrotus, chickorium, cucumis, glicina, hibiscus, hordeum, letuca, lycopersicon, mals, medicago, mesembryanthemum, oryza, panicum, phalaris, phleum, poliathus, policarbofil, sida, solanum, trifolium, trigonella, goma de semilla Afzelia africana, goma Treculia africana, goma detarium, goma casia, goma algarrobo, goma Prosopis africana, goma Colocassia esulenta, goma Hakea gibbosa, goma khaya, scleroglucan, zea, mezclas de cualquiera de los anteriores, y lo similar.

E. Aplicaciones

1. Definiciones

Los terminos "tratamiento" y "tratar" como se usan en la presente descripcion se refieren a la administracion o a la aplicacion de un agente terapeutico a un sujeto, o la realizacion de un procedimiento o modalidad sobre un sujeto, para el proposito de obtener un beneficio terapeutico de una enfermedad o afeccion asociada a la salud. Por ejemplo, las microcapsulas de la presente invencion pueden administrarse a un sujeto para el proposito de tratar una enfermedad neurodegenerativa en un sujeto. El termino tratar, como se usa en la presente descripcion, se refiere a la cura de todos los signos y smtomas de la enfermedad, o a la reduccion en la severidad de los signos y smtomas de una enfermedad.

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Los terminos "beneficio terapeutico" o "con eficacia terapeutica" como se usan a lo largo de esta solicitud, se refieren a cualquier cosa que promueva o aumente el bienestar del sujeto con respecto al tratamiento medico de esta afeccion. Esto incluye, pero no se limita a, una reduccion en la frecuencia o severidad de los signos o smtomas de una enfermedad. Por ejemplo, la administracion de las microcapsulas de la presente invencion para reducir los signos y smtomas de una enfermedad neurodegenerativa.

Los terminos "prevencion" y "prevenir" se usan de acuerdo con sus significados comunes y su intencion claramente es para dar a entender "actuar antes" o tal como una accion. En el contexto de una enfermedad particular o afeccion asociada a la salud, esos terminos se refieren a la administracion o a la aplicacion de un agente, farmaco, o medicamento a un sujeto, o a la realizacion de un procedimiento o modalidad sobre un sujeto con el proposito de bloquear el comienzo de una enfermedad o afeccion asociada a la salud. Por ejemplo, la administracion de las microcapsulas de la presente invencion con el proposito de bloquear el comienzo de una enfermedad neurodegenerativa en una persona envejecida.

2. Enfermedades asociadas a la edad que se relacionan con la via de mTOR

Las microcapsulas de la invencion pueden usarse para tratar o prevenir las enfermedades, afecciones o trastornos asociadas a la edad. Los ejemplos no limitantes de enfermedades, afecciones o trastornos asociados a la edad incluyen la resistencia a la insulina (es dear, alteracion en la tolerancia a la glucosa), hiperplasia prostatica benigna, perdida de la audicion, osteoporosis, degeneracion macular asociada a la edad, enfermedades neurodegenerativas, una enfermedad de la piel, envejecimiento de la piel, o cancer. En una modalidad de los metodos de la invencion, la enfermedad, afeccion o trastorno asociados a la edad es una enfermedad de la piel. Los ejemplos de enfermedad de la piel para los que pueden usarse los metodos de la invencion incluyen queratosis seborreica, queratosis actmica, queloides, psoriasis, y sarcoma de Kaposi.

Los ejemplos no limitantes de enfermedades neurodegenerativas incluyen enfermedad de Alzheimer; epilepsia; enfermedad de Huntington; enfermedad de Parkinson; infarto cerebral; lesion de la medula espinal; lesion traumatica cerebral; demencia de cuerpos de Lewy; enfermedad de Pick; enfermedad de Niewmann-Pick; angiopatfa amiloide; angiopatfa cerebral amiloide; amiloidosis sistemica; hemorragia cerebral hereditaria con amiloidosis del tipo Dutch; miositis de cuerpos de inclusion; deterioro cognitivo moderado; smdrome de Down; y trastornos neuromusculares que incluyen la esclerosis lateral amiotrofica (ALS), esclerosis multiple, y las distrofias musculares que incluyen las distrofia de Duchenne, la distrofia muscular de Becker, la distrofia muscular Facioscapulohumeral (Landouzy-Dejerine), y la distrofia muscular de la cintura de los miembros (LGMD). Se incluyen, ademas, la enfermedad neurodegenerativa debido a infarto cerebral, trauma craneal, dano espinal, u otras lesiones al cerebro, sistema nervioso periferico, central o neuromuscular.

En otra modalidad de los metodos de la invencion, la enfermedad, afeccion o trastorno asociado a la edad es una afeccion del envejecimiento de la piel. Los ejemplos de afecciones del envejecimiento de la piel para los que los metodos de la invencion pueden usarse incluyen las manchas asociadas a la edad, las manchas oscuras, arrugas, piel envejecida por la luz, o manchas angiogenicas. En aun otra modalidad de los metodos de la invencion, el inhibidor de TOR se administra para extender la duracion de la vida saludable del individuo.

Los metodos de la invencion pueden usarse para inhibir eventos celulares o del organismo. En una modalidad de la invencion, el evento celular que se inhibe es el envejecimiento celular. En otra modalidad de la invencion el evento celular que se inhibe es la hipertrofia celular. En aun otra modalidad de la invencion, el evento celular que se inhibe es el envejecimiento del organismo.

Otros ejemplos de enfermedades asociadas a la edad para los que se demostro la implicacion de mTOR incluyen los siguientes: hiperplasia prostatica benigna (BPH), hipertrofia prostatica benigna, crecimiento benigno de la prostata (BEP), smdrome metabolico que incluye la resistencia a la insulina y sus complicaciones, obesidad (especialmente la obesidad abdominal), hipertension arterial, trombosis, hipertension y ateroesclerosis, hipertrofia cardfaca, y osteoporosis. Con respecto a enfermedades neurodegenerativas espedficas, se demostro que la via de mTOR se involucra con la enfermedad de Alzheimer mediante un aumento en la smtesis de la protema Tau (Li et al., 2005). Ademas, en individuos que sufren de la enfermedad de Alzheimer se establecio una correlacion entre la activacion de mTOR en los linfocitos de la sangre y el deterioro cognitivo y de la memoria (Paccalin et al., 2006).

Con respecto al cancer, los ejemplos no limitantes incluyen cancer de mama, cancer de pulmon, cancer de prostata, cancer de ovario, cancer de cerebro, cancer de tngado, cancer de cervix, cancer de colon, cancer renal, cancer de piel, cancer de cabeza y cuello, cancer de hueso, cancer de esofago, cancer de vejiga, cancer de utero, cancer linfatico, cancer de estomago, cancer de pancreas, cancer de testmulos, linfoma, o leucemia. Otros ejemplos espedficos de cancer incluyen carcinoma de celulas escamosas, carcinoma de celulas basales, adenoma, adenocarcinoma, linitis plastica, insulinoma, glucagonoma, gastrinoma, vipoma, colangiocarcinoma, carcinoma hepatocelular, carcinoma adenoide qrnstico, tumor carcinoide, prolactinoma, oncocitoma, adenoma de celulas de Hurthle, carcinoma de celulas renales, adenoma endometrioide, cistadenoma, pseudomixoma peritonei, tumor de Warthin, timoma, tecoma, tumor de celulas granulosas, arrenoblastoma, tumor de celulas de Sertoli/Leydig, paraganglioma, feocromocitoma, tumor glomus,

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melanoma, sarcoma de tejidos blandos, tumor desmoplastico de celulas redondas pequenas, fibroma, fibrosarcoma, mixoma, lipoma, liposarcoma, leiomioma, leiomiosarcoma, mioma, miosarcoma, rabdomioma, rabdomiosarcoma, adenoma pleomorfico, nefroblastoma, tumor de Brenner, sarcoma sinovial, mesotelioma, disgerminoma, tumores de celulas germinales, carcinoma embrionario, tumor del saco vitelino, teratomas, quistes dermoides, coriocarcinoma, mesonefromas, hemangioma, angioma, hemangiosarcoma, angiosarcoma, hemangioendotelioma, hemangioendotelioma, sarcoma de Kaposi, hemangiopericitoma, linfangioma, linfangioma qmstico, osteoma, osteosarcoma, osteocondroma, exostosis cartilaginosa, condroma, condrosarcoma, tumores de celulas gigantes, sarcoma de Ewing, tumores odontogenicos, cementoblastoma, ameloblastoma, craniofaringioma gliomas mixtos, oligoastrocitomas, ependimoma, astrocitomas, glioblastomas, oligodendrogliomas, neoplasmas neuroepiteliomatosos, neuroblastoma, retinoblastoma, meningiomas, neurofibroma, neurofibromatosis, schwanoma, neurinoma, neuromas, tumores de celulas granulares, sarcoma alveolar de partes blandas, linfomas, linfomas no Hodgkin, linfosarcoma, enfermedad de Hodgkin, linfoma linfocftico pequeno, linfomas linfoplasmacfticos, linfoma de celulas del manto, linfomas de efusion primario, linfoma mediastinal (ffmico) de celulas grandes, linfoma difuso de celulas B grandes, linfoma intravascular de celulas B grandes, linfoma de Burkitt, linfoma esplenico de la zona marginal, linfoma folicular, linfoma extranodal de la zona marginal de celulas B de tejido linfoide asociado a mucosas (linfoma MALT), linfoma nodal marginal de la zona de celulas B, micosis fungoides, smdrome de Sezary, linfoma periferico de celulas T, linfoma angioinmunoblastico de celulas T, linfoma subcutaneo de celulas T similar a la paniculitis, linfoma anaplastico de celulas grandes, linfoma hepatoesplenico de celulas T, linfoma de tipo enteropatico de celulas T, papulosis linfomatoide, linfoma anaplastico cutaneo primario de celulas grandes, linfoma extranodal de celulas NK/T, linfoma blastico de celulas NK, plasmacitoma, mieloma multiple, mastocitoma, sarcoma de celulas mastodticas, mastocitosis, leucemia de celulas mastodticas, histiocitosis de celulas de Langerhans, sarcoma histiodtico, sarcoma de celulas de Langerhans, sarcoma de celulas dendnticas, sarcoma folicular de celulas dendnticas, macroglobulinemia de Waldenstrom, granulomatosis linfomatoide, leucemia aguda, leucemia linfodtica, leucemia linfoblastica aguda, leucemia linfodtica aguda, leucemia linfodtica cronica, leucemia/linfoma de celulas T adultas, leucemia de celulas plasmaticasa, leucemia linfocftica de celulas T granulares grandes, leucemia prolinfodtica de celulas B, leucemia prolinfodtica de celulas T, leucemia linfoblastica de precursores de las celulas B, leucemia linfoblastica de precursores de las celulas T, leucemia eritroide aguda, leucemia de celulas de linfosarcoma, leucemia mieloide, leucemia mielogenosa, leucemia mielogenosa aguda, leucemia mielogenosa cronica, leucemia promielodtica aguda, leucemia promielocftica aguda, leucemia

mielomonodtica aguda, leucemia basofflica, leucemia eosinofflica, leucemia basofflica aguda, leucemia mieloide aguda, leucemia mielogenosa cronica, leucemia monocftica, leucemia monoblastica y monoctica aguda, leucemia

megacarioblastica aguda, leucemia mieloide aguda y smdrome mielodisplastico, cloroma o sarcoma mieloide, panmielosis aguda con mielofibrosis, leucemia de celulas peludas, leucemia mielomonodtica juvenil, leucemia de celulas NK agresivas, policitemia vera, enfermedad mieloproliferativa, mielofibrosis idiopatica cronica, trombocitemia esencial, leucemia neutrofflica cronica, leucemia eosinofflica cronica/smdrome hipereosinofflico, trastorno

linfoproliferativo posterior al trasplante, enfermedad mieloproliferativa cronica, enfermedades mielodisplasticas/mieloproliferativas, leucemia mielomonocftica cronica y smdrome mielodisplastico. En ciertas modalidades, la lesion hiperproliferativa es una enfermedad que puede afectar la boca de un sujeto. Los ejemplos incluyen leucoplasia, lesiones hiperplasicas de celulas escamosas, lesiones epiteliales premalignas, lesiones intraepiteliales neoplasicas, hiperplasia epitelial focal, y lesion de carcinoma escamoso.

Las microcapsulas de la presente invencion pueden aplicarse en el tratamiento de cualquier enfermedad en las que se contempla el uso de un inhibidor de mTOR. Las siguientes Patentes de los EE.UU. describen varias propiedades y usos de rapamicina. La Patente de los EE.UU. Num. 5.100.899 describe la inhibicion del rechazo al trasplante por rapamicina; La Patente de los EE.UU. Num. 3.993.749 describe propiedades antifungicas de rapamicina; La Patente de los EE.UU. Num. 4.885.171 describe la actividad antitumoral de rapamicina contra leucemia linfatica, canceres de colon y mamarios, melanocarcinoma y ependimoblastoma; La Patente de los EE.UU. Num. 5.206.018 describe el tratamiento con rapamicina de carcinomas malignos mamarios y de piel, y neoplasmas del sistema nervioso central; La Patente de los EE.UU. Num. 4.401.653 describe el uso de rapamicina en combinacion con picibanil en el tratamiento de tumores; La Patente de los EE.UU. Num. 5.078.999 describe un metodo para el tratamiento del lupus eritematoso sistemico con rapamicina; La Patente de los EE.UU. Num. 5.080.899 describe un metodo para el tratamiento de la inflamacion pulmonar con rapamicina que es util en el alivio de los smtomas de la enfermedad en la cual la inflamacion pulmonar es un componente, es decir, asma, enfermedad pulmonar obstructiva cronica, enfisema, bronquitis, y smdrome de distres respiratorio agudo; La Patente de los EE.UU. Num. 6.670.355 describe el uso de rapamicina en el tratamiento de la enfermedad cardiovascular, cerebrovascular o vascular periferica; La Patente de los eE.UU. Num. 5.561.138 describe el uso de rapamicina en el tratamiento de la anemia asociada a la respuesta inmune; La Patente de los EE.UU. Num. 5.288.711describe un metodo de prevencion o tratamiento con rapamicina para la enfermedad vascular hiperproliferativa que incluye la hiperplasia de las celulas del musculo liso en la capa mtima, la reestenosis, y la oclusion vascular; y La Patente de los EE.uU. Num. 5.321.009describe el uso de rapamicina en el tratamiento de la diabetes mellitus dependiente de insulina. En general, cualquier enfermedad que pueda mejorarse, tratarse, curarse, o prevenirse mediante la administracion de rapamicina o un derivado de rapamicina, puede tratarse mediante la administracion de las microcapsulas descritas en la presente descripcion. Los ejemplos no limitantes de tales enfermedades incluyen - rechazo al trasplante de organos o tejidos, enfermedad de injerto contra huesped, enfermedad autoinmune y afecciones inflamatorias, artritis (por ejemplo, artritis reumatoide, artritis cronica progresiva y artritis deformante) y enfermedades reumaticas, enfermedades autoinmunes, trastornos hematologicos autoinmunes, lupus eritematoso sistemico, escleroderma, granulomatosis de Wegener, dermatomiositis, hepatitis activa cronica, miastenia gravis, psoriasis, smdrome de Steven-Johnson, esprue idiopatico, enfermedad autoinmune inflamatoria de los intestinos (que incluye la

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colitis ulcerativa y la enfermedad de Crohn), oftalmopatfa endocrina, enfermedad de Graves, sarcoidosis, esclerosis multiple, cirrosis biliar primaria, diabetes juvenil, uveitis, queratoconjuntivitis sicca, queratoconjuntivitis primaveral, fibrosis intersticial del pulmon, artritis psoriatica, glomerulonefritis, enfermedad de rinon poliqmstico autosomica dominante, dermatomiositis juvenil, asma, enfermedad pulmonar obstructiva cronica, enfisema, bronquitis, y smdrome de distres respiratorio agudo, tumores, trastornos hiperproliferativos de la piel, infecciones fungicas, ojo seco, enfermedad vascular, diabetes, y enfermedad ocular (tales como neovascularizacion del ojo debido a la degeneracion macular asociada a la edad).

3. Terapias Preventivas

Ciertas modalidades de los usos de las microcapsulas de la invencion expuestas en la presente descripcion pertenecen a microcapsulas para usar en la prevencion de una enfermedad o una afeccion asociadas a la salud en un sujeto. Las estrategias preventivas son de importancia clave en la medicina actual.

La cantidad de la composicion farmaceutica para administrarse, de acuerdo con la dosis, el numero de tratamientos y la duracion de los tratamientos, depende del sujeto a tratar, el estado del sujeto, la naturaleza de la enfermedad a prevenirse y la proteccion deseada. Las cantidades precisas de la composicion terapeutica dependen, ademas, del juicio del medico practico y son peculiares para cada individuo. Por ejemplo, la frecuencia de aplicacion de la composicion puede ser una vez al dfa, dos veces al dfa, una vez a la semana, dos veces a la semana o una vez al mes. La duracion del tratamiento puede variar desde un mes a un ano o mas. Nuevamente, el regimen preventivo preciso dependera en gran medida del sujeto, la naturaleza del factor de riesgo y el juicio del medico practico.

B. Composiciones

Algunos de los metodos expuestos en la presente descripcion se refieren a metodos que involucran la administracion de una composicion que comprende las microcapsulas de la presente invencion.

Como se usa en la presente descripcion, "portador farmaceuticamente aceptable" incluye todos y cada uno de los disolventes, medios de dispersion, recubrimientos, surfactantes, antioxidantes, conservantes (por ejemplo, agentes antibacterianos, agentes antifungicos), agentes isotonicos, agentes retardadores de la absorcion, sales, conservantes, farmacos, estabilizadores de farmacos, geles, aglutinantes, excipientes, agentes de desintegracion, lubricantes, agentes edulcorantes, agentes de sabor, colorantes, tales materiales similares y combinaciones de estos, como conocena un experto en la tecnica (Remington's, 1990). Excepto en la medida en que cualquier portador convencional sea incompatible con el ingrediente activo, se contempla su uso en las composiciones terapeuticas o farmaceuticas. Las composiciones usadas en la presente invencion pueden comprender diferentes tipos de portadores en dependencia de si es para administrarse en forma solida, lfquida o en aerosol, y si este necesita ser esteril para vfas de administracion tales como la inyeccion.

El uso de tales medios y agentes para sustancias farmaceuticas activas es bien conocido en la tecnica. Excepto en la medida en que cualquier medio o agente convencional sea incompatible con el ingrediente activo, se contempla su uso en las composiciones terapeuticas. Ademas, pueden incorporarse ingredientes activos suplementarios en las composiciones, y estos se discuten con mayor detalle mas abajo. Para la administracion en humanos, las preparaciones deben satisfacer las normas de esterilidad, pirogenicidad, seguridad general y pureza como se requiere por las normas de la Oficina de Biologicos de la FDA.

La formulacion puede variar en dependencia de la via de administracion. Para la administracion parenteral en una solucion acuosa, por ejemplo, si es necesario la solucion debe tamponarse adecuadamente y el diluyente lfquido primeramente se torna isotonico con suficiente solucion salina o glucosa. En relacion con esto, los medios acuosos esteriles que pueden emplearse seran conocidos por los expertos en la tecnica a la luz de la presente descripcion.

En ciertas modalidades, la composicion farmaceutica incluye al menos aproximadamente el 0.1 % en peso del compuesto activo. En otras modalidades, la composicion farmaceutica incluye de aproximadamente el 2 % a aproximadamente el 75 % del peso de la composicion, o entre aproximadamente el 25 % a aproximadamente el 60 % en peso de la composicion, por ejemplo, y cualquier intervalo derivable de esta manera.

La composicion farmaceutica de la presente invencion puede comprender diversos antioxidantes para retardar la oxidacion de uno o mas componentes. Ademas, puede realizarse la prevencion de la accion de los microorganismos mediante conservantes tales como diversos agentes antibacterianos y antifungicos, que incluyen pero no se limitan a parabenos (por ejemplo, metilparabenos, propilparabenos), clorobutanol, fenol, acido sorbico, timerosal o combinaciones de estos. La composicion debe ser estable bajo las condiciones de fabricacion y almacenamiento, y preservarse contra la accion contaminante de microorganismos, tales como bacterias y hongos.

1. Vfas de Administracion

Las microcapsulas pueden administrarse al sujeto mediante el uso de cualquier metodo conocido por los expertos en la tecnica. Por ejemplo, puede administrarse una cantidad farmaceuticamente efectiva de la composicion en una

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composicion que incluye un medio acuoso que se administra intravenosamente, intracerebralmente, intracranealmente, intratecalmente, en la sustancia negra o la region de la sustancia negra, intradermicamente, intraarterialmente, intraperitonealmente, intralesionalmente, intratraquealmente, intranasalmente, topicamente, intramuscularmente, intraperitonealmente, subcutaneamente, oralmente, topicamente, localmente, por inhalacion (por ejemplo, inhalacion por aerosol), inyeccion, infusion, infusion continua, perfusion localizada que bana directamente las celulas diana, atraves de un cateter, a traves de un enema, en cremas, en composiciones lfpidas (por ejemplo, liposomas), o mediante otro metodo o cualquier combinacion de los anteriores, tal como lo sabna un experto en la tecnica (Remington's, 1990). Las composiciones solidas de microcapsulas pueden administrarse oralmente.

En modalidades particulares, la composicion se administra a un sujeto mediante el uso de un dispositivo de liberacion de farmacos. Se contempla cualquier dispositivo de liberacion de farmacos para usar en la liberacion de una cantidad farmaceuticamente efectiva del inhibidor de mTOR.

2. Dosificacion

Una cantidad farmaceuticamente efectiva de un inhibidor de mTOR se determina en base al objetivo que se pretenda. La cantidad para administrarse, tanto en funcion del numero de tratamientos como de la dosis, depende del sujeto a tratar, el estado del sujeto, la proteccion deseada y la via de administracion. Las cantidades precisas del agente terapeutico dependen, ademas, del criterio del medico practico y son peculiares para cada individuo.

Las cantidades de rapamicina a administrarse dependeran de la enfermedad a tratar, la longitud de la duracion deseada y el perfil de biodisponibilidad del implante, y el sitio de administracion. Generalmente, la cantidad efectiva estara dentro de la discrecion y la sabiduna del medico que atiende al paciente. Las pautas para la administracion incluyen intervalos de dosis de aproximadamente 0.01 mg a aproximadamente 500 mg de rapamicina.

Por ejemplo, una dosis del inhibidor de mTOR puede ser aproximadamente 0.0001 miligramos a aproximadamente 1.0 miligramo, o aproximadamente 0.001 miligramos a aproximadamente 0.1 miligramos, o aproximadamente 0.1 miligramos a aproximadamente 1.0 miligramo, o incluso aproximadamente 10 miligramos por dosis o mas. Ademas, pueden administrarse multiples dosis. En algunas modalidades, una dosis es al menos aproximadamente 0.0001 miligramos. En modalidades adicionales, una dosis es al menos aproximadamente 0.001 miligramos. En aun otras modalidades adicionales, una dosis es al menos aproximadamente 0.01 miligramos. En aun otras modalidades adicionales, una dosis es al menos aproximadamente 0.1 miligramos. En modalidades mas particulares, una dosis puede ser al menos 1.0 miligramo. En modalidades incluso mas particulares, una dosis puede ser al menos 10 miligramos. En modalidades adicionales, una dosis es al menos 100 miligramos.

En otros ejemplos no limitantes, una dosis puede comprender, ademas, desde aproximadamente 1 microgramo/kg/peso corporal, aproximadamente 5 microgramos/kg/peso corporal, aproximadamente 10 microgramos/kg/peso corporal, aproximadamente 50 microgramos/kg/peso corporal, aproximadamente 100 microgramos/kg/peso corporal, aproximadamente 200 microgramos/kg/peso corporal, aproximadamente 350 microgramos/kg/peso corporal, aproximadamente 500 microgramos/kg/peso corporal, aproximadamente 1 miligramo/kg/peso corporal, aproximadamente 5 miligramos/kg/peso corporal, aproximadamente 10 miligramos/kg/peso corporal, aproximadamente 50 miligramos/kg/peso corporal, aproximadamente 100 miligramos/kg/peso corporal, aproximadamente 200 miligramos/kg/peso corporal, aproximadamente 350 miligramos/kg/peso corporal, aproximadamente 500 miligramos/kg/peso corporal, aproximadamente 1000 mg/kg/peso corporal, o mas por administracion, y cualquier intervalo derivado de esta manera. En los ejemplos no limitantes de un intervalo derivado a partir de los numeros incluidos en la presente descripcion, un intervalo de aproximadamente 5 mg/kg/peso corporal a aproximadamente 100 mg/kg/peso corporal, aproximadamente 5 microgramos/kg/peso corporal a aproximadamente 500 miligramos/kg/peso corporal, etc., puede administrarse, en base a los numeros descritos anteriormente.

La dosis puede repetirse segun sea necesario segun lo determinen los expertos en la tecnica. Por tanto, en algunas modalidades de los metodos expuestos en la presente descripcion, se contempla una sola dosis. En otras modalidades, se contemplan dos o mas dosis. Cuando se administra mas de una dosis a un sujeto, el intervalo de tiempo entre las dosis puede ser cualquier intervalo de tiempo determinado por los expertos en la tecnica. Por ejemplo, el intervalo de tiempo entre las dosis puede ser de aproximadamente 1 hora a aproximadamente 2 horas, de aproximadamente 2 horas a aproximadamente 6 horas, de aproximadamente 6 horas a aproximadamente 10 horas, de aproximadamente 10 horas a aproximadamente 24 horas, de aproximadamente 1 dfa a aproximadamente 2 dfas, de aproximadamente 1 semana a aproximadamente 2 semanas, o mas, o cualquier intervalo de tiempo derivado dentro de cualquiera de estos intervalos enumerados.

En ciertas modalidades, puede desearse proporcionar un suministro continuo de una composicion farmaceutica al paciente. Esto podna lograrse mediante cateterizacion, seguido de la administracion continua del agente terapeutico. La administracion podna ser intraoperatoria o postoperatoria.

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3. Tratamiento Secundario

Ciertas modalidades de la presente invencion proporcionan la administracion o aplicacion de una o mas formas de terapias secundarias. El tipo de terapia depende del tipo de enfermedad que se trata o se previene. La forma de terapia secundaria puede ser la administracion de uno o mas agentes farmacologicos secundarios que pueden aplicarse en el tratamiento o la prevencion de una enfermedad asociada con el envejecimiento, que incluye cualquiera de las enfermedades expuestas anteriormente.

Si la terapia secundaria es un agente farmacologico, este puede administrarse antes de, simultaneamente o despues de la administracion del inhibidor de mTOR.

El intervalo entre el inhibidor de mTOR y la terapia secundaria puede ser cualquier intervalo determinado por los expertos en la tecnica. Por ejemplo, el intervalo puede ser de minutos a semanas. En las modalidades en las que los agentes se administran separadamente, en general se asegurana que no transcurra un penodo de tiempo significativo entre el momento de cada administracion, de modo que cada agente terapeutico todavfa pueda ejercer un efecto ventajosamente combinado sobre el sujeto. Por ejemplo, el intervalo entre los agentes terapeuticos puede estar entre aproximadamente 12 horas a aproximadamente 24 horas entre cada uno y, mas preferentemente, entre aproximadamente 6 horas a aproximadamente 12 horas entre cada uno. En algunas situaciones, puede desearse extender significativamente el penodo de tiempo para el tratamiento, sin embargo, cuando varios dfas (2, 3, 4, 5, 6 o 7) a varias semanas (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8) se extienden entre las administraciones respectivas. En algunas modalidades, el momento de administracion de un agente terapeutico secundario se determina en base a la respuesta del sujeto al inhibidor de mTOR.

G. Ejemplos

Los siguientes ejemplos se incluyen para demostrar las modalidades preferidas de la invencion. Debe apreciarse por aquellos expertos en la tecnica que los procedimientos descritos en los ejemplos a continuacion representan procedimientos descubiertos por el inventor para funcionar bien en la practica de la invencion, y por tanto pueden considerarse que constituyen modos preferidos para su practica. Sin embargo, los expertos en la tecnica deben apreciar, a la luz de la presente descripcion, que pueden hacerse muchos cambios en las modalidades espedficas que se describen y aun obtener un resultado igual o similar sin apartarse del esprntu y alcance de la invencion.

Ejemplo 1

Extension de la Duracion de la vida por la Alimentacion con Rapamicina en Ratones Geneticamente Heterogeneos a partir de los 20 Meses de Edad

Metodos

Produccion de ratones, mantenimiento, y estimacion de la duracion de la vida. Se produjeron ratones en cada uno de los tres sitios de prueba mediante el apareamiento de las hembras CB6F1 con machos C3D2F1 para producir una poblacion geneticamente heterogenea. Los detalles de los metodos utilizados para el monitoreo de la salud se proporcionaron previamente (Miller et al., 2007); en resumen, cada una de las tres colonias se evaluo cuatro veces al ano para detectar agentes infecciosos, incluido el oxiuro. Todas estas pruebas fueron negativas durante todo el penodo de estudio. Cada sitio de prueba incluyo aproximadamente el mismo numero de animales destetados de 19 - 21 dfas de edad cada mes durante un penodo de seis meses, se albergaron 3 machos o 4 hembras/caja. Cada sitio uso dietas que el fabricante afirmo se basaron en el estandar NIH-31 para jaulas de cna y el penodo entre el destete y el inicio de dietas experimentales, fue de la siguiente manera: Para jaulas de cna, UM uso Purina 5008, UT uso Teklad 7912, y TJL uso Purina 5K52. Para los destetados antes de los 4 meses de edad, UM uso Purina 5008, UT uso Teklad 7912 y TJL uso Purina 5LG6. A partir de los 4 meses de edad, los ratones en los grupos Control, Enalapril y CAPE recibieron Purina 5LG6 en los tres sitios, sin aditivos (grupo de control) o con el agente de prueba. Los ratones en el grupo Rapa permanecieron en la dieta para el destete hasta que comenzaron a recibir rapamicina, en Purina 5LG6, a los 600 dfas de edad. Se establecieron cohortes separadas de ratones controles y tratados con rapamicina de la misma manera un ano mas tarde, nuevamente en cada sitio de prueba, pero se comenzo con rapamicina a los 270 dfas en vez de a los 600 dfas de edad. Los detalles adicionales sobre la cnas, que incluyen las cuentas de las pruebas para la distribucion de subconjuntos de celulas T y la actividad administrada a un subconjunto de cada grupo, se proporcionan en cualquier otra literatura (Nadon et al., 2008). La variable final principal fue la edad a la muerte (para los ratones que se encontraron muertos en las inspecciones diarias) o la edad en que se practica la eutanasia (para los ratones considerados poco probables para sobrevivir durante mas de 48 horas adicionales).

Eliminacion de ratones de la poblacion de longevidad. La poblacion de estudio Cohorte 2005, distribuida casi por igual entre los tres sitios de prueba, consistio inicialmente en 1960 ratones, de los cuales 674 se asignaron al grupo control y 317 a 328 a cada uno de los cuatro grupos de tratamiento. De estos, se eliminaron 51 ratones del estudio debido a peleas (31 ratones), muerte accidental (tal como por la implantacion de chip o inundacion de jaulas, 13 ratones), o por error tecnico (error en la asignacion de genero o seleccion de dieta; 7 ratones). Para los analisis de supervivencia, los

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ratones se trataron como vivos en la fecha de su eliminacion del protocolo, y se perdieron durante el seguimiento a partir de entonces. Estos ratones censurados no se incluyeron en los calculos de la longevidad media.

Estimacion de la edad al momento de la muerte (duracion de la vida). Los ratones se examinaron al menos diariamente para detectar signos de mala salud, y se sacrificaron por razones humanitarias si estaban tan gravemente moribundos que se considero, por un tecnico experimentado, poco probable que sobrevivieran durante mas de 48 horas adicionales. Un raton se considera gravemente moribundo si muestra mas de uno de los siguientes signos clmicos: (a) incapacidad para comer o beber; (b) letargo grave, como lo indica una falta de respuesta, tal como la renuencia a moverse cuando se le pincha suavemente con un forceps; (c) equilibrio severo o alteracion de la marcha; (d) perdida rapida de peso durante un penodo de una semana o mas; o (e) un tumor gravemente ulcerado o sangrante. La edad a la que se sacrifico a un raton moribundo se tomo como la mejor estimacion disponible de la duracion de su vida. Los ratones encontrados muertos se registraron, ademas, en cada inspeccion diaria. Los cuerpos se guardaron para su analisis posterior, para describirse en cualquier otro acapite del informe.

Dietas control y experimentales. TestDiet, Inc. (Richmond, IN) preparo lotes de alimentos Purina 5LG6 que conteman cada una de las sustancias de prueba, asf como tambien lotes de la dieta control, a intervalos de aproximadamente 120 dfas, y enviaron cada lote de alimentos al mismo tiempo a cada uno de los tres sitios de prueba. El enalapril se adquirio de Sigma (catalogo E6888-5G) y se uso a 120 mg por kg de alimento; en el supuesto de que el raton promedio pesa 30 gramos y consume 5 gramos de alimentoMa, esta dosis suministra 20 mg de enalapril por kg de peso corporal/dfa. El CAPE, es dear, el ester fenetilico de acido cafeico, se adquirio en Cayman (Ann Arbor, MI, Catalogo 70750) y se uso en cualquiera de las dos dosis: la dosis alta fue de 300 mg/kg de alimento (50 mg/kg de peso corporal/dfa) y la dosis baja fue de 30 mg/kg de alimento (5 mg/kg de peso corporalMa). El enalapril se evaluo porque en los humanos ancianos y en los modelos de hipertension en roedores, obesidad, diabetes e insuficiencia cardfaca congestiva, se describe que mejora muchas de estas afecciones. El CAPE se evaluo porque se describe que este agente posee capacidades antioxidantes, antiinflamatorias e inmunomoduladoras, asf como toxicidad espedfica para las celulas transformadas y tumorales. La duracion de la vida de los ratones que recibieron enalapril o CAPE se compara con los controles y con los que recibieron rapamicina en la FIG. 1. La rapamicina se adquirio en LC Labs (Woburn, MA). El proceso de microencapsulacion de rapamicina se realizo por el Instituto de Investigacion de Southwest (San Antonio, TX), mediante el uso de un proceso de atomizacion de disco rotatorio con el material de recubrimiento enterico Eudragit S100 (Rohm Pharma, Alemania). Este polfmero de metacrilato es estable a niveles de pH por debajo de 7 y por tanto protege la rapamicina de las condiciones acidas del estomago; el recubrimiento protector se disuelve en el intestino delgado, lo que permite la absorcion del agente activo. Este material de recubrimiento termoplastico aumento, de 3 a 4 veces, la fraccion de rapamicina que sobrevivio al proceso de preparacion de alimentos. Debido a que el material de recubrimiento solamente es soluble en agua en condiciones no acidas, la rapamicina encapsulada se libera en el intestino delgado en vez de en el estomago. Un estudio piloto demostro que la rapamicina encapsulada condujo a concentraciones en sangre de aproximadamente 10 veces mayores que las alcanzadas por dosis equivalentes de rapamicina no encapsulada. La rapamicina encapsulada se administro a 14 mg/kg de alimento (2.24 mg de rapamicina por kg de peso corporalMa). Despues, la rapamicina encapsulada se incorporo a la comida para ratones 5LG6 y se distribuyo a los tres sitios de prueba.

Medicion de Rapamicina. La rapamicina se obtuvo de los laboratorios LC (Woburn, MA). La 32-desmetoxirapamicina (32-RPM) se obtuvo de Sigma Chemical Company (St. Louis, MO). El metanol y acetonitrilo de calidad HPLC se adquirieron de Fisher (Fair Lawn, NJ). Todos los demas reactivos se compraron a Sigma Chemical Company (St. Louis, MO). Para la preparacion de todas las soluciones se uso agua Milli-Q. El sistema HPLC consiste en una bomba de HPLC Waters 510, un muestreador automatico Waters 717, un detector UV Waters 2487 y un programa cromatografico Waters Empower (Waters, Milford, MA). La columna analftica de HPLC fue una Grace Alltima C18 (4.6 x 150 mm, 5 micras) comprada de Alltech (Deerfield, IL). La fase movil fue del 64 % (v/v) de acetonitrilo y 36 % de agua. La velocidad de flujo de la fase movil fue de 1.5 mL/minutos y la longitud de onda de la absorbancia fue de 278 nm. La temperatura de la columna analftica de HPLC se mantuvo a 70 °C durante las corridas cromatograficas mediante el uso de un calentador de columna Eppendorf CH-30. La rapamicina y el polvo de 32 RPM se disolvieron en metanol a una concentracion de 1 mg/mL y se almacenaron en aifcuotas a -80 °C. Se preparo una solucion madre de trabajo cada dfa a partir de las soluciones madre de metanol a una concentracion de 1 pg/mL y se uso para espigar los calibradores. Las muestras de calibracion se prepararon diariamente mediante la adicion, ya sea de sangre completa o de alimentos de raton, a las soluciones madre para lograr concentraciones finales de 0, 4, 8, 12, 24, 100 y 200 ng/mL.

La rapamicina se cuantifico en sangre de raton mediante el uso de HPLC con deteccion UV. Brevemente, se mezclaron 0.5 mL de calibradores y de muestras desconocidas con 75 pL de 32-desmetoxi rapamicina (estandar interno) a 1.0 pg/mL, 1.0 mL de ZnSO4 (50 g/L) y 1.0 mL de acetona. Las muestras se agitaron vigorosamente en vortex durante 20 segundos, despues se centrifugaron a 2.600 g a temperatura de 23 °C durante 5 minutos (las centrifugaciones posteriores se realizaron bajo las mismas condiciones). Los sobrenadantes se transfirieron a tubos de ensayo limpios, despues, se agregaron 200 pL de NaOH 100 mM, seguido de agitacion vigorosa en vortex. Despues, se agregaron 2 mL de 1-clorobutano y se taparon las muestras, se agitaron vigorosamente en vortex (1 minuto) y se centrifugaron. Los sobrenadantes se transfirieron a tubos de vidrio de 10 mL y se secaron hasta residuo bajo una corriente de nitrogeno a temperatura ambiente. Los extractos secos se disolvieron en 750 pL de fase movil y despues se agregaron 2 mL de hexano a cada tubo. Los tubos se taparon, se agitaron en vortex durante 30 segundos y se centrifugaron durante 2 minutos. Las capas de hexano se eliminaron y se descartaron. Los extractos restantes se secaron bajo nitrogeno y se

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reconstituyeron en 250 pL de fase movil, y despues se inyectaron 200 pL de los extractos finales en la HPLC. Para cuantificar la rapamicina se comparo la relacion del area de pico de rapamicina con respecto a la del estandar interno (relacion de respuesta) para cada muestra desconocida, con una regresion lineal de las relaciones de respuesta del calibrador. La concentracion de rapamicina se expreso en ng/mL de sangre completa.

El contenido de rapamicina del alimento de raton se verifico mediante el uso de HPLC con deteccion UV. Brevemente, se trituraron con un mortero y una mano de mortero 100 mg de comida para ratones para espigar los calibradores y muestras desconocidas, despues, se agitaron vigorosamente con 20 pL de 32-RPM (estandar interno) 100 pg/mL y 0.5 mL de metanol. Despues, las muestras se agitaron mecanicamente durante 10 minutos. Posteriormente, se anadio 0.5 mL de agua Millipore y las muestras se agitaron vigorosamente en vortex durante 20 segundos. Las muestras se centrifugaron durante 10 minutos y despues se inyectaron 40 pL en el HPLC. Para cuantificar la rapamicina se comparo la relacion del area de pico de rapamicina con respecto a la del estandar interno (relacion de respuesta) contra una regresion lineal de las relaciones de respuesta del calibrador a las concentraciones de 0, 2, 4, 8, 10, y 20 ng/mg de rapamicina de los alimentos. La concentracion de rapamicina en los alimentos se expresa como ng/mg de alimentos (partes por millon).

Eficacia de la rapamicina Para evaluar el estado de un efector aguas abajo de mTORC1, la fosforilacion de la protema ribosomal S6 (Ser240/244), un sustrato de la quinasa 1 S6, se midio en lisados de tejido adiposo visceral en ratones alimentados con una dieta de rapamicina encapsulada durante 420 dfas o con una dieta control con microcapsulas vadas. Los tejidos se diseccionaron y se congelaron en nitrogeno lfquido para su almacenamiento a -80 °C, se molieron en polvo bajo nitrogeno lfquido y se disolvieron en 10 volumenes de tampon (Tris-HCl 50 mM (pH 7,5), NaCl 120 mM, NP-40 al 1 %, EDTA 1 mM, NaF 50 mM, 2-glicerofosfato 40 mM, ortovanadato de Na 0.1 mM (pH 10), benzamidina 1 mM y coctel inhibidor de proteasa 1X completo (Roche). Despues de la sonicacion y la microcentrifugacion, se cuantificaron los lisados, 30. Se cargaron 40 pg de protema soluble de cada extracto en una PAGE gradiente al 4-12 % y se sometieron a electroforesis durante la noche a 5V. Los geles se transfirieron a membranas de nitrocelulosa (procedimiento en seco), se bloquearon y se incubaron con los anticuerpos primarios [Protema Ribosomal S6 (5G10) AcM en conejos cat. #2217; Anticuerpo Protema Ribosomal Fosfo-S6 (Ser235/236) cat. #2215; y Cat. #4968 Anticuerpo Pan Actina; Cell Signaling Technologies, Danvers MA], seguido por el anticuerpo secundario [IgG anti conejo, (H+L), Anticuerpo Conjugado a Peroxidasa, cat. #31460 Pierce, Rockford IL] para la deteccion mediante quimioluminiscencia. Las intensidades de las senales de cada inmunotransferencia se capturaron mediante el uso de una Estacion de Imagen Kodak, las que se analizaron mediante el uso de un programa de analisis de imagen Kodak 1D.

Resultados

En ratones machos y hembras, en cada uno de los tres sitios de investigacion colaborativos, la mediana y la maxima duracion de la vida de los ratones se extendieron por la alimentacion con rapamicina encapsulada a partir de los 600 dfas de edad (FIG. 2). El conjunto de datos se analizo con 2 % (38 de 1.901) de ratones todavfa vivos. Con los datos agrupados de todos los sitios, una prueba de rangos logantmicos rechazo la hipotesis nula acerca de que los grupos de tratamiento y control no fueran diferentes (P <0,0001); los ratones alimentados con rapamicina tuvieron una vida mas prolongada que los controles (P <0,0001) en ambos, machos y hembras. Expresado como la media de la duracion de la vida, el efecto del tamano fue del 9 % para los machos y del 13 % para las hembras en el conjunto de datos agrupados. Expresado como la esperanza de vida a los 600 dfas (la edad de la primera exposicion a rapamicina), el efecto del tamano fue del 28 % para los machos y del 38 % para las hembras. Los ratones tratados con otros agentes (enalapril y CAPE (acido cafeico fenetilester)) evaluados en paralelo no difieren de los controles en las dosis usadas (FIG. 1).

Los ratones alimentados con rapamicina y control se compararon por separado para cada combinacion de sitio y genero. La rapamicina tuvo un beneficio consistente, en comparacion con los controles, con valores de P que oscilaron entre 0.03 y 0.0001 (FIG. 3). En los tres sitios Los ratones hembras mejoraron la supervivencia despues de la alimentacion con rapamicina (FIG. 3). Los aumentos en la media de la duracion de la vida para las hembras fueron 15 %, 16 % y 7 % (TJL, UM y UT, respectivamente), y la esperanza de vida a los 600 dfas aumento en 45 %, 48 % y 22 % para las hembras, en los tres sitios. Los estimados de la media de la duracion de la vida de las hembras controles fueron consistentes en todos los sitios (881-895 dfas), y fueron similares a los valores observados en la Cohorte 2004, que oscilo entre 858 y 909 dfas (Miller et al., 2007). Portanto, la mejora en la supervivencia observada en las hembras alimentadas con rapamicina no es un artefacto de baja supervivencia para los controles hembras. Ademas, los ratones machos en los tres sitios mejoraron la supervivencia despues de la alimentacion con rapamicina (FIG. 3). Los aumentos en la media de la duracion de la vida para los machos fueron 5 %, 8 % y 15 % (TJL, UM y UT, respectivamente), y la esperanza de vida masculina en los machos a los 600 dfas aumento en 16 %, 23 % y 52 %. La interpretacion se complica por las diferencias, en la supervivencia de los machos, entre los tres sitios y porque los ratones asignados al grupo alimentado con rapamicina en UT, y tal vez en UM, tuvieron una mortalidad menor antes de los 600 dfas en comparacion con los controles. Los ratones controles en UT y UM difirieron de aquellos alimentados con rapamicina no solo en exposicion a rapamicina a partir de los 600 dfas de edad, sino ademas, en la formulacion espedfica de los alimentos para ratones (todos basados en el estandar NIH-31) usados entre el destete y los 600 dfas. Por tanto, no puede descartarse la posibilidad de que la supervivencia mejorada entre los machos en el grupo de rapamicina, en UT y en UM, pueda reflejar diferencias en el estado nutricional o de salud entre el control y los grupos de rapamicina antes de los 600 dfas, en vez de reflejar unicamente los efectos de rapamicina. Cabe destacar que los beneficios significativos de rapamicina en la supervivencia masculina (y femenina) en tJl no pudieron haberse visto afectados por la dieta antes de

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la administracion del farmaco, ya que en TJL tanto el control como los ratones alimentados con rapamicina recibieron el mismo alimento para ratones (Purina 5LG6) a lo largo de este penodo. La maxima duracion de la vida aumento por la alimentacion con rapamicina. La Tabla 1 muestra las edades en el percentil 90 para los ratones controles y los tratados con rapamicina, junto con el lfmite de confianza superior del 95 % para los controles.

Tabla 1 El efecto de rapamicina en la maxima duracion de la vida

Comparacion

Sitios Edad en dfas en el percentil 90 para los controles (lfmite de confianza superior)* Edad en dfas en el percentil 90 para los ratones tratados con rapamicina Aumento de porcentajes

Hembras

Rapamicina versus controles

Todos los sitios 1.094 (1.136) 1,245 14

Rapamicina versus controles

TJL 1.100 (1.165) 1,282 17

Rapamicina versus controles

UM 1.094 (1.149) 1,250 14

Rapamicina versus controles

UT 1.089 (1.159) 1,179 8

Machos

Rapamicina versus controles

Todos los sitios 1.078 (1.111) 1,179 9

Rapamicina versus controles

TJL 1.035 (1.091) 1,142 10

Rapamicina versus controles

UM 1.141 (1.177) 1,188 4

Rapamicina versus controles

UT 1.020 (1.101) 1,179 16

Rapamicina versus controles

Todos los sitios 1.078 (1.111) 1,179 9

* El lfmite superior del 95 % del intervalo de confianza para los ratones controles se indica entre parentesis. Por ejemplo, en la fila superior, para las hembras agrupadas de los diferentes sitios, el intervalo de confianza del 95 % para los controles llega hasta 1.136 dfas, y la estimacion de la supervivencia del percentil 90 para los ratones tratados con rapamicina es de 1.245 dfas. Esto proporciona una buena evidencia de que la supervivencia del percentil 90 para ratones tratados con rapamicina (1.245) esta sustancialmente por encima de la de los controles (1.094).

Para cada sitio y genero, la edad del percentil 90 para los ratones tratados con rapamicina es mayor que el lfmite superior para el grupo de control correspondiente, lo que demuestra que la rapamicina aumenta la edad para la supervivencia del percentil 90.

Para determinar si el aumento en la maxima duracion de vida debido a la alimentacion con rapamicina es estadfsticamente significativo, se comparo en la tabla conjunta, la proporcion de ratones vivos en cada grupo despues que el 90 % habfa muerto (Wang et al.,2004) (Tabla 2).

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Tabla 2 - Detalles del calculo para la comparacion de la proporcion de supervivencia de los ratones en el percentil 90 de la edad.

Sitio

Sexo Edad para el percentil 90 Grupo Numero de vivos Numero de muertos Total % Vivos Raton vivo mas joven valor-p

TJL

F 1167 Controles 4 91 95 4.2 % 1192 P = 0.0006

Rapa 11 37 48 22.9 % 1192

UM

F 1162 Controles 2 93 95 2.1 % 1187 P = 0.0001

Rapa 13 35 48 27.1 % 1147

UT

F 1123 Controles 8 91 99 8.1 % 1180 P = 0.22

Rapa 7 41 48 14.6 % 1189

Agrupados

F Controles 14 275 289 4.8 % P < 0.0001

Rapa 31 113 144 21.5 %

TJL

M 1088 Controles 8 118 126 6.3 % 1146 P = 0.008

Rapa 11 46 57 19.3 % 1243

UM

M 1154 Controles 9 103 112 8.0 % 1161 P = 0.07

Rapa 9 42 51 17.6 % 1228

UT

M 1112 Controles 4 115 119 3.4 % 1157 P = 0.0001

Rapa 14 48 60 23.3 % 1156

Agrupados

M Controles 21 336 357 5.9 % P < 0.0001

Rapa 34 134 168 20.2 %

En la tabla se enumeran, para cada combinacion de sitio, genero y grupo de tratamiento, el numero de ratones que estaban vivos (y numero de muertos) a la edad (columna 3) en el que el 90 % de la distribucion conjunta (control mas rapamicina para la combinacion sitio/genero) ha^a muerto. Por ejemplo, para las hembras TJL, el 4.2 % de los controles (4/95) y el 22.9 % de los ratones tratados con rapamicina (11/48) segrnan vivos a la edad de 1167 dfas. En el momento del analisis (1 de febrero de 2009), no habfa ratones controles vivos a edades inferiores a la edad del percentil 90 en ninguno de los grupos. Solo habfa una hembra viva, en UM, a una edad inferior al umbral del percentil 90, pero este raton estaba en el grupo de rapamicina, y su edad al morir no tendna un efecto importante en las estadfsticas y valores de P listados en la tabla.

En la sumatoria a lo largo de los tres sitios, el 4.8 % de los ratones controles hembras estaban vivos a estas edades, en comparacion con el 21.5 % de las hembras tratadas con rapamicina (P <0.0001). Para los machos, los valores correspondientes fueron 5.9 % de los controles y 20.2 % de los ratones tratados con rapamicina (P<0,0001). Los calculos espedficos del sitio documentaron un efecto significativo en las hembras, tanto en TJL (P <0.0006) como en UM (P <0.0001); para los machos, se observo un efecto significativo, tanto en TJL (P50.008) como en UT (P50.0001), con un efecto marginal en UM (P50.07). La alimentacion con rapamicina iniciada a los 600 dfas de edad conduce a un aumento significativo en la maxima duracion de la vida.

Para evaluar si el espectro de lesiones se altero por la rapamicina en la dieta, se realizaron necropsias completas en 31 controles y 40 ratones alimentados con rapamicina que se encontraron muertos o se sacrificaron por estar moribundos (Tabla 3). Aunque la rapamicina retarda la muerte, esta no cambio la distribucion de las presuntas causas de muerte.

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Tabla 3 - Lesiones en ratones tratados con rapamicina y en controles al momento de la muerte.

Causa de muerte

Controles Rapamicina

Abscesos

1 1

Tumor adrenal

1

Carcinoma (GI)

1

Carcinoma (renal)

1

Regeneracion Cardfaca

1

Cardiomiopatfa

1

Fibrosarcoma

2

Ulcera Gastrica

1

Insuficiencia cardfaca

2 1

Fibrosis cardfaca

Hemangiosarcoma

3 5

Hepatocarcinoma

3 3

Leiomiosarcoma

1

Linfoma

10 15

Adenocarcinoma mamario

1

Infarto de miocardio

1

Pleuritis

1

Prostatitis

2

Tumor pulmonar

4 7

Septicemia

1

Casos diagnosticables

31 40

Autolisis

17 12

Desconocido

2 1

Gran total

50 53

La edad media a la muerte fue de 977 para los controles (N = 31) y 1005 dfas para los ratones tratados con rapamicina (N = 40), entre aquellos animales para los que se pudo determinar una presunta causa de muerte. La causa de la muerte se infirio, siempre que fue posible, sobre la base de una evaluacion a groso modo, seguida del examen histopatologico de un conjunto estandar de tejidos de cada raton por un veterinario patologo experimentado. Los tumores se consideraron la causa de la muerte segun el tipo de tumor, el tamano, el numero y la distribucion. La causa de la muerte de ratones con lesiones inflamatorias o degenerativas se baso en la ubicacion y la gravedad de las lesiones y en la probabilidad de que tales lesiones fueran lo suficientemente graves como para causar morbilidad y mortalidad. Muchos animales teman tumores pequenos y localizados y varias lesiones degenerativas, que se consideraron improbables de haber contribuido a sus muertes. La autolisis impidio el diagnostico en 29 casos, y la causa de la muerte no pudo determinarse en otros tres casos como se indico.

Se uso un grupo separado de ratones para evaluar los efectos de la dieta con rapamicina encapsulada que se inicio a los 270 dfas de edad (FIG. 4A). En el momento del analisis, el 51 % de las hembras y el 68 % de los machos habfan muerto, y una prueba de rango logantmica estratificada mostro un riesgo de mortalidad significativamente menor en los ratones tratados con rapamicina en comparacion con los controles, agrupados en los tres sitios de prueba (P = 0,0002 para machos y P <0,0001 para hembras). Cuando cada sitio se evaluo por separado, el efecto beneficioso de rapamicina para las hembras fue significativo en cada sitio (P <0.005); para los machos el efecto fue significativo (P <0.025) en UM y en UT, pero no en TJL. La rapamicina parece reducir el riesgo de mortalidad a la mitad de la vida cuando se inicia el tratamiento a los 270 dfas de edad, pero se necesitan datos adicionales para proporcionar una estimacion precisa del tamano del efecto y para evaluar los efectos sobre la longevidad maxima.

Para documentar los efectos bioqmmicos de la rapamicina a la dosis utilizada para los estudios de duracion de la vida, se evaluo el estado de fosforilacion de la subunidad de protema ribosomal S6 (rpS6) -un sustrato blanco de la quinasa 1 S6 en la via de senalizacion mTOR20- en tejido adiposo blanco visceral (un indicador sensible de la inhibicion de mTOR

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por el tratamiento con rapamicina in vivo). FIG. 4B muestra que la alimentacion con rapamicina redujo los niveles de rpS6 fosforilada 4-5 veces cuando se alimenta desde el d^a 270 hasta aproximadamente los 800 dfas de edad. Los niveles sangumeos de rapamicina en los ratones tratados fueron equivalentes en machos y hembras, entre 60 y 70 ng/mL.

La evidencia inicial de que la funcion de TOR reducida puede prolongar la longevidad proviene principalmente de estudios en levaduras (Kaeberlein et al., 2005; Powers et al., 2006) e invertebrados (Jia et al., 2005; Kapahi et al., 2004; Vellai et al., 2003). Los efectos beneficiosos de la restriccion de la dieta (Masoro, 2005) y las mutaciones enanas, pues ambos extienden la vida util de los roedores, pueden ser, hasta cierto punto, resultado de la represion de la via del complejo 1 de mTOR (mTORCI) (Sharp and Bartke, 2005; Hsieh y Papaconstantinou, 2004).

Aun no se conoce hasta que punto la inhibicion de mTOR recapitulara otros aspectos de los fenotipos asociados con la restriccion de la dieta o las mutaciones enanas. La demostracion de que la alimentacion con rapamicina aumenta la duracion de la vida, incluso cuando comenzo tarde en la vida, asf como tambien la ausencia de cambios en el peso corporal, distingue estos resultados de los estudios que usan la restriccion de la dieta: en todos los casos, la restriccion de la dieta reduce el peso corporal y en la mayona de los reportes (Masoro, 2005), aunque no en todos (Dhahbi et al., 2004), la restriccion de la dieta produce pocos beneficios, si los hay, si comienza despues de los 550 dfas de edad.

Para ilustrar los efectos bioqmmicos de la dosis de rapamicina usada en este estudio, el estado de fosforilacion de la subunidad de la protema ribosomal S6 (rpS6), un sustrato blanco de la quinasa 1 S6 en la via de senalizacion mTOR (Petroulakis et al., 2007) se evaluo, en el tejido adiposo blanco (WAT) en un grupo separado de ratones adultos jovenes UM-HET3, alimentados durante 5 semanas con alimentos que contema rapamicina. La rpS6 fosforilada se reduce considerablemente, y es apenas detectable en ratones alimentados con rapamicina, en relacion con el total de rpS6 (FIG. 5). Si bien la mayona de los ratones controles tienen una senal robusta para rpS6 fosforilada, algunos tienen muy poco de esta modificacion. Es importante destacar que todos los ratones alimentados con rapamicina tienen muy poca rpS6 fosforilada.

El Imgado y el cerebro se analizaron para determinar si esta dosis de rapamicina en los alimentos afectaba la fosforilacion de rpS6 en otros sistemas organicos. La FIG. 6 muestra los ensayos de inmunotransferencia de la fosforilacion de rpS6 en el Imgado. La cuantificacion de la relacion de rpS6 fosforilada con respecto a la protema rpS6 total a esta dosis de rapamicina (ver graficos para hembras, machos y ambos) es mas pronunciada en machos que en hembras, la ultima de las cuales alcanza significacion estadfstica en este ensayo. El analisis de rpS6 fosforilada combinada de machos y hembras mostro niveles significativamente mas bajos en los ratones tratados. Nuestra conclusion para la actividad de la quinasa 1 S6 en el Imgado es que ambos sexos estan respondiendo a esta dosis de rapamicina, pero los machos son mas receptivos.

La FIG. 7 muestra un analisis de la actividad de S6K1 en el cerebro a partir de ratones UM-Het3 tratados con rapamicina y no tratados. El efecto sobre mTOR/S6K1 medido por este ensayo es mucho menos pronunciado en el cerebro en comparacion con el WAT y el Imgado. Dado que la rapamicina atraviesa facilmente la barrera hematoencefalica (Pong y Zaleska, 2003), esta respuesta es interesante y podna ser relevante desde el punto de vista biomedico.

Cuando los nutrientes, la energfa y los factores de crecimiento son favorables para la activacion de la actividad quinasa mTORCI, otro de sus sustratos blanco es 4E-BP1, un represor de la traduccion dependiente de cap (Gingras et al., 2001). La fosforilacion de 4E-BP1 inhibe su funcion represora. La rapamicina inhibe la fosforilacion de 4E-BP1 mediada por mTORC1. El analisis de 4E-BP1 en el WAT en ratones UM-Het3 tratados cronicamente con rapamicina revelo que la proporcion de 4E-BP1 fosforilada no era diferente en un analisis combinado de machos y hembras (FIG. 8). Hay un aumento significativo en el total de protemas 4E-BP1, en relacion con la 13-actina, en la grasa de los ratones macho que consumen rapamicina. El WAT de las hembras tratadas cronicamente con rapamicina no mostro diferencias en la proporcion de 4E-BP1 fosforilada en comparacion con 4E-BP1 total, o en los niveles de protema 4EBP1 en comparacion con 13-actina. Existe una mayor sensibilidad de los machos al tratamiento con rapamicina; las relaciones de 4E-BP1 fosforilada con respecto a la protema total son estadfsticamente diferentes en relacion con los controles. Ademas, hay un aumento en las protemas totales 4E-BP1 en comparacion con la 13-actina. Estos datos son consistentes con estudios basados en celulas que muestran una inhibicion diferencial de S6K1 y 4E-BP1, que es espedfico al tipo celular (Choo et al., 2008.). Mientras que la rapamicina inhibe la actividad de S6K1 en el transcurso de sus experimentos (24 - 48 horas), la fosforilacion de 4E-BP1 se recupera en 6 horas.

La FIG. 9 muestra los ensayos de inmunotransferencia de fosforilacion de 4E-BP1 en el Imgado de ratones tratados cronicamente con rapamicina. De nuevo, consistente con los experimentos basados en celulas, no hubo diferencias estadfsticas en la relacion de fosforilacion de 4E-BP1 en machos o hembras, de hecho, la fosforilacion aumento modestamente en las cinco hembras evaluadas en este experimento. Dado que la 13-actina no se ensayo en estos experimentos, los niveles de 4E-BP1 no se analizaron.

Note que 4E-BP2 es la forma dominante de las protemas 4E-BP expresadas en el cerebro (Banko et al., 2005). Los reactivos inmunologicos usados anteriormente son espedficos para 4E-BP1, por tanto un analisis de estos represores de traduccion en el cerebro esta pendiente de desarrollar anticuerpos espedficos 4E-BP2.

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Laevidenciain vivo indica que la activacion de S6K1 actua para suprimir la senalizacion de la insulina a traves de la modulacion del IRS1 (Um et al., 2006). Esto predice que el tratamiento con rapamicina deroga esta senalizacion, lo que lleva a un aumento en la fosforilacion de Akt. Los resultados de inmunotransferencia de los analisis de la fosforilacion de Akt en WAT obtenidos de ratones que consumen alimentos que contienen rapamicina mostraron que en las hembras no hay diferencias en el nivel de fosforilacion de Akt en respuesta al tratamiento con rapamicina. Los resultados en machos en la FIG. 10 muestran un aumento evidente en la fosforilacion de Akt en comparacion a los controles. Cuando se combinan, los datos sobre machos y hembras son altamente significativos.

La FIG. 11 muestra datos de inmunoensayo para la activacion de Akt en el hngado de ratones UM-Het3 que consumen alimentos que contienen rapamicina. Como se documenta en WAT anteriormente, observamos un aumento significativo en la fosforilacion de Akt en hngado en machos, pero no en hembras.

La FIG. 12 muestra datos de inmunoensayo para la activacion de Akt en el cerebro de ratones UM-Het3 que consumen alimentos que contienen rapamicina. Curiosamente, parece haber un aumento significativo en la fosforilacion de Akt en ratones tratados con rapamicina, tanto machos como hembras. Al resumir estos inmunoensayos para determinar los efectos espedficos en los organos, a partir de la exposicion cronica a la rapamicina en la dieta, todos los organos analizados muestran evidencias de los efectos esperados sobre los efectores aguas abajo y aguas arriba de mTORC1. Para la actividad de S6K1, el WAT parece ser hipersensible a la dosis de 7 ppm en comparacion con el hngado. El WAT en machos parece ser mas sensible que en hembras. La actividad cerebral de S6K1 no fue diferente en los ratones tratados con rapamicina en comparacion con los controles. Para la fosforilacion de 4E-BP1, se documentaron pocos efectos en cualquier tejido ensayado, consistente con experimentos basados en celulas que muestran la recuperacion de la fosforilacion de 4E-BP1 despues de 6-24 horas de tratamiento. Se documento un aumento inesperado en los niveles de 4E-BP1 en el WAT de machos. La activacion de Akt se observo en machos pero no en el WAT e hfgado de hembras. En cerebro Akt fue elevado por rapamicina en machos y hembras. Por tanto, parece haber respuestas espedficas de organos y genero al nivel de rapamicina evaluado, lo que de nuevo es consistente con los analisis de los efectos de la rapamicina basados en celulas. Con base en estos resultados, se concluye que la rapamicina en la dieta tiene los efectos biologicos esperados en los organos blancos evaluados.

Ejemplo 2

Estudios para Examinar la Estabilidad de la Rapamicina en los Alimentos

Se realizaron estudios para examinar la estabilidad de rapamicina en los alimentos. La rapamicina se envio al Instituto de Investigacion del Sudoeste (San Antonio) para la microencapsulacion mediante la disolucion de la rapamicina en un disolvente organico que contema un recubrimiento enterico disuelto, Eudragit S100. Este polfmero es estable a niveles de pH por debajo de 7, como se discutio en el Ejemplo 1. Se incorporaron muestras de rapamicina encapsulada y no encapsulada en una comida comercial para ratones a una concentracion de 0.7, 7 y 70 ppm y se analizaron los niveles de rapamicina en el alimento (FIG 13-14). La rapamicina encapsulada sobrevivio al proceso de incorporacion a la comida para ratones mejor que la rapamicina no encapsulada, como lo demuestra la concentracion detectada de rapamicina, 3 veces mayor en la dieta hecha con rapamicina encapsulada con respecto a la dieta hecha con rapamicina sin encapsular. Con las dietas hechas de rapamicina encapsulada y no encapsulada se alimentaron a ratones durante 4-5 semanas y se determinaron las concentraciones de rapamicina en 200 pL de muestras de sangre completa mediante el uso de HPLC con deteccion UV. El nivel sangumeo promedio observado despues de alimentar con la rapamicina encapsulada fue superior a 25 ng/mL, lo que se compara favorablemente con los niveles terapeuticos en protocolos de tratamiento humano de al menos 12 ng/mL (FIG 15). Por el contrario, los ratones alimentados con la dieta preparada con rapamicina no encapsulada teman menos de 2.5 ng/mL, que es el lfmite de deteccion del ensayo. Como un resultado, la dosis se aumento a 14 ppm en la dieta para los estudios de longevidad del Ejemplo 1.

Ejemplo 3

La rapamicina Recupera la Cognicion y Atenua la Patologfa en los Modelos Murinos de Enfermedad de Alzheimer. Metodos

Ratones. La administracion de rapamicina y los experimentos de comportamiento que involucraron a ratones hAPP (J20) se llevaron a cabo en el Instituto Buck. Los grupos experimentales fueron: control de alimento no Tg, n=10; alimentado con rapamicina no Tg, n=10; control de alimento Tg, n=12; alimentado con rapamicina Tg, n=12, todos los animales fueron machos y de 7 meses. La administracion de rapamicina y los experimentos conductuales que involucraron ratones 3xTg-AD se realizaron en el UTHSCSAy los grupos experimentales fueron: alimento control no Tg, n=13; alimentado con rapamicina no Tg, n=14; alimento control 3xTg-AD, n=14; alimentado con rapamicina 3xTg-AD, n=16; se incluyeron machos y hembras en iguales proporciones. La derivacion y la caracterizacion de los ratones 3xTg- AD y hAPP(J20) se describe en varias fuentes (Hsia et al., 1999; Mucke et al., 2000; Oddo et al., 2003). Los ratones hAPP(J20) se mantuvieron mediante cruzamiento heterocigotico con ratones C57BL/6J (Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME). Los ratones hAPP(J20) eran heterocigoticos con respecto al transgen. Las cnas no Tg se usaron como

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controles. Los ratones 3xTg-AD eran homocigoticos para los transgenes APP y tau y para la mutacion M146V anulada en el gen PS1.

Tratamiento con rapamicina. Los ratones se alimentaron con comida para ratones que contiene tanto la rapamicina microencapsulada a 2.24 mg/kg o una dieta control como se describe en el Ejemplo 1. Durante la duracion del tratamiento, todos los ratones tuvieron acceso ad libitum a los alimentos con rapamicina o control y al agua.

Evaluaciones conductuales. El MWM (protocolo detallado en Informacion Complementaria) se uso para evaluar el aprendizaje espacial y la memoria. El laberinto acuatico de Morris (MWM) (Morris, 1984) se uso para evaluar la memoria espacial. Durante el entrenamiento previo todos los animales demostraron no tener deficiencias para nadar, nadar en una direccion o para subirse a una plataforma escondida, y no teman deficiencias sensoriales y motoras como se determino mediante un conjunto de tareas que miden el comportamiento neurologico, realizadas antes de la evaluacion. Todos los grupos se evaluaron para la capacidad de nadar en un trayecto directo (15 por 200 cm) que contiene una plataforma sumergida (1 cm) de 12 x 12 cm, 2 dfas antes de la prueba. El procedimiento descrito por Morris et al., 2006 se siguio como se describe por (Galvan et al., 2006; Galvan et al., 2008). Brevemente, los ratones J20 recibieron una serie de seis ensayos, separados entre sf por una hora, en un tanque de color claro lleno de agua opaca blanqueada por la adicion de pintura no toxica a una temperatura de 24.0±1.0 °C. En la parte visible del protocolo, que prueba el aprendizaje no espacial, los animales se entrenaron para encontrar una plataforma sumergida de 12x12 cm (1 cm debajo de la superficie del agua) que se marco con un poste de color que sirvio como punto de referencia y que se coloco en cuadrantes diferentes de la piscina. En cada ensayo los animales se colocaron en la piscina frente a la pared de la piscina y se liberaron en diferentes lugares. A cada animal se le proporciono un maximo de 60 segundos para encontrar la plataforma sumergida. Si no encuentra la plataforma en ese momento, el animal se grna suavemente hacia el. Despues de permanecer en la plataforma durante 20 segundos, el animal se extrae y se coloca en una jaula seca. Veinte minutos despues, a cada animal se le proporciono una segunda prueba, mediante el uso de una posicion de liberacion diferente. Este proceso se repitio un total de 6 veces para cada raton, con 20 minutos de diferencia entre cada ensayo. En la parte del protocolo no oculta, el agua del tanque se rodea por unos paneles opacos oscuros a aproximadamente 30 cm del borde de la piscina. Cuatro figuras rectangulares con disenos geometricos en blanco y negro se espaciaron uniformemente sobre los paneles para servir como pistas distales ocultas. Los animales se entrenaron para encontrar la plataforma sumergida, y esto consistio en nadar 6 veces cada dfa durante 2 dfas y se siguio el mismo procedimiento descrito anteriormente para el entrenamiento de las pistas. Despues, a esos 6 ensayos le siguio un ensayo de prueba para el cual la plataforma se elimino de la piscina. En el ensayo de prueba, a cada animal se le permitio nadar durante 30 segundos antes de extraerse de la piscina. El porcentaje de tiempo que pasa en el area que anteriormente contema la plataforma, asf como el numero de veces que cada animal cruzo la ubicacion de la plataforma anterior, se determino como una medida de la retencion de la ubicacion de la plataforma. Debido a que los roedores son buenos nadadores y se vigilan mientras estan en el agua, nunca se ahogan y no sufren efectos adversos significativos de esta prueba. Durante el curso de las pruebas, los animales se monitorearon diariamente, y sus pesos se registraron semanalmente. La realizacion de todas las tareas se registro mediante un sistema de seguimiento de video basado en computadora (Water2020, HVS Image, U.K). Los datos se analizaron sin conexion en lmea, mediante el uso de imagen HVS y se procesaron con Microsoft Excel. La prueba de MWM para los ratones 3xTg-AD se realizo en un tanque circular de 1.5 metros de diametro ubicado en una habitacion con senales adicionales de laberinto. La ubicacion de la plataforma (14 cm de diametro) se mantuvo constante para cada raton durante el entrenamiento y estaba 1.5 cm por debajo de la superficie del agua, la que se mantuvo a 25 °C durante la duracion de la prueba. Durante el entrenamiento, los ratones recibieron cuatro ensayos al dfa que se alternaron entre cuatro puntos de inicio pseudoaleatorios, con un intervalo de 25 segundos entre los ensayos. Si un raton fallaba en encontrar la plataforma en 60 segundos, este era guiado por el investigador a la plataforma y lo mantema allf durante 10 segundos. Los ensayos de las evaluaciones se realizaron veinticuatro horas despues del ultimo ensayo de entrenamiento. Durante los ensayos de las evaluaciones, la plataforma se elimino y los ratones nadaron libremente en el tanque durante sesenta segundos. Los ensayos de entrenamiento y de las evaluaciones se registraron por una camara de video montada en el techo y los datos se analizaron mediante el uso del sistema de seguimiento EthoVisioXT.

Transferencia Western, determinaciones de AU e inmunohistoqmmica. El tejido se proceso y se analizo como se describio previamente 13, 25, 26 y se describe en detalle en la Informacion complementaria. AU y tau se midieron mediante el uso de ensayos ELISA espedficos.

Los ratones 3xTg-AD se sacrificaron por asfixia con CO2. Los cerebros se extrajeron y se cortaron sagitalmente a la mitad y el tejido se proceso como se describe (Oddo et al., 2008). Los ratones hApP (J20) se sacrificaron mediante una sobredosis de isoflurano. Los hemicerebros se congelaron rapidamente. Uno de los hemicerebros se homogeneizo en N2 lfquido mientras que el otro se uso en las determinaciones inmunohistoqmmicas. Para los analisis de transferencia Western, las protemas de ambas fracciones solubles, hAPP (J20) y 3xTg-AD, se separaron mediante SDS/PAGE (Invitrogen, Temecula, CA) en condiciones reductoras y se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa o PVDF. La membrana se incubo en una solucion de leche sin grasa al 5 % o en BSA al 5 % durante 1 hora a 20 °C. Despues de la incubacion durante la noche a 4 °C con el anticuerpo primario apropiado, las transferencias se lavaron en Tween 20TBS (T-TBS) (Tween 20 0.02 %, Tris 100 mM, pH 7.5, NaCl 150 nM) durante 20 minutos, y se incubaron a 20 °C con el anticuerpo secundario. Despues, las transferencias se lavaron en T-TBS por 3 veces durante 20 minutos cada una y luego se incubaron durante 5 minutos con Super Signal (Pierce, Rockford, IL), se lavaron nuevamente y se expusieron a la pelfcula. Los niveles de AU40 y AU42 se midieron a partir de las fracciones solubles e insolubles mediante el uso de

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un protocolo de ELISA tipo sandwich como se describio anteriormente (Oddo et al., 2005). Se cuantificaron AI40 y AIM2 de ratones hAPP (J20) en homogenados de los hemicerebros en guanidina de Tg hAPP (J20) como se describe (Galvan et al., 2006) mediante el uso de ensayos ELISA espedficos (Invitrogen, Carlsbad, CA).

En cuanto a la inmunohistoqmmica, las criosecciones de diez micrometros de los cerebros congelados instantaneamente se fijaron posteriormente en paraformaldehndo al 4% y se tineron con anticuerpos espedficos de LC3 (10 |jg/mL, Nous, Littleton, CO), seguido del anticuerpo anti IgG de conejo generado en burro conjugado a AlexaFluor488 (1: 500, Molecular Probes, Invitrogen, CA), y se realizaron imagenes con un microscopio de epifluorescencia (Nikon Eclipse E800 con un cubo FITC) y con un microscopio confocal de escaneo laser (Zeiss LSM 510) mediante el uso de un laser Argon 488 y un filtro 505 de paso largo. Las imagenes se obtuvieron mediante el uso de los objetivos 20X y 60X. Los contrastes z de las imagenes confocales se procesaron mediante el programa LSM Viewer (Zeiss). La inmunohistoqmmica de AI y tau se realizo en secciones de 50 jm de espesor obtenidas mediante el uso de un sistema de corte vibratorio y protocolos estandar. Las imagenes se obtuvieron con una camara digital Zeiss y se analizaron con ImageJ.

Analisis estadfstico. Los analisis estadfsticos se realizaron mediante el uso del programa GraphPad Prism (GraphPad, San Diego, CA) y StatView. En los experimentos de dos variables, se usaron ANOVA de dos vfas seguido por la prueba post-hoc de Bonferroni para evaluar el significado de las diferencias entre las medias de los grupos. Cuando se analizaron los experimentos de una sola variable con mas de 2 grupos, el significado de las diferencias entre las medias se evaluo mediante el ANOVA de una via seguido por la prueba post-hoc de Tukey. La evaluacion de las diferencias entre dos grupos se evaluo mediante el uso de la prueba t de Student. Los valores de P< 0.05 se consideraron significativos.

Resultados

Se realizaron estudios para determinar si la rapamicina previene o retrasa la enfermedad asociada a la edad, tal como la AD. Se alimento a los ratones 3xTg-AD y hAPP (J20) con una dieta suplementada con rapamicina, que era identica a la dieta que prolongo la duracion de la vida en ratones (como se expone en el Ejemplo 1), o con un alimento control para ratones. Se midieron los resultados funcionales y bioqmmicos en dos laboratorios independientes, en ubicaciones separadas. Los ratones 3xTg-AD y hAPP (J20) y los controles no transgenicos apropiados se trataron durante 10 y 12 semanas a partir de los 6.5 y 7 meses de edad, respectivamente. Al final del tratamiento, se evaluaron el aprendizaje y la memoria mediante el uso del laberinto acuatico de Morris (MWM). Se observaron deficits significativos en el aprendizaje y la memoria en animales Tg alimentados con la dieta control (FIG. 28), consistente con las observaciones previas en ambos modelos de ratones (Oddo et al., 2008; Galvan et al., 2006; Galvan et al., 2008; Saganich et al., 2006; Billings et al., 2005). Sin embargo, los ratones Tg alimentados con rapamicina mostraron un mejor aprendizaje y memoria (FIG. 28). Sorprendentemente, en los ratones Tg alimentados con rapamicina, la retencion de la ubicacion anterior de la plataforma de escape se restablecio a niveles indistinguibles de aquellos de los ratones no Tg en ambos modelos de raton (FIG. 28B, 28D). En conjunto, estos datos indican que el tratamiento con rapamicina puede mejorar los deficits de aprendizaje y eliminar los problemas de la memoria en dos modelos de ratones, independientes, de la enfermedad de Alzheimer. Al final de la evaluacion del comportamiento, todos los ratones se sacrificaron y sus cerebros se aislaron y procesaron para la evaluacion neuropatologica o bioqmmica. Para dilucidar el mecanismo subyacente a la mejora en el aprendizaje y la memoria en los ratones transgenicos tratados con rapamicina, se analizo el procesamiento de APP mediante transferencias Western. Se midieron, en primer lugar, los niveles de APP de longitud completa en ratones transgenicos alimentados con dieta de rapamicina o control mediante el uso de 22C 11 (un anticuerpo espedfico del N terminal de APP). Se descubrio que los niveles del estado estacionario de APP no se alteraron significativamente por la administracion de rapamicina (FIG. 29A, 29C). Para investigar los niveles del estado estacionario de los principales derivados C-terminales, se evaluaron los extractos de protemas con un anticuerpo espedfico del extremo C terminal de la APP. Los resultados indican que los niveles de C99 y C83 no se modificaron despues de la administracion de rapamicina en ambas lmeas transgenicas (FIG. 29A, 29B, 29D, 29E). Estos resultados indican que la administracion de rapamicina no altero los niveles del estado estacionario de APP ni su procesamiento en el raton transgenico. Al final del tratamiento, los ratones 3xTg-AD y hAPP(J20) teman 8 y 7 meses de edad, respectivamente. A esta edad ambos ratones transgenicos muestran un aumento de los niveles de Ap soluble, pero los ratones 3xTg-AD exhiben una acumulacion intraneuronal de Ap 8, 12, 17. Estudios previos demuestran que los depositos extracelulares de Ap no son evidentes a esta edad en ninguna lmea transgenica (Hsia et al., 1999; Oddo et al., 2003). Mientras que los niveles de AI40 permanecieron sin cambios, se encontro que la rapamicina disminuyo significativamente los niveles de AI42 soluble en 32.78 ± 6.68 % en los cerebros de ratones 3xTg-AD y en 52.35 ± 13.14 % en los cerebros de ratones hAPP(J20) (FIG. 29F, 29G, 29H). Los niveles de AI40 y AI42 insolubles estaban por debajo de la deteccion en ambos modelos de ratones transgenicos, consistente con informes anteriores (Hsia et al., 1999; Mucke et al., 2000; Oddo et al.,2003). Para determinar si la acumulacion de AI intracelular se afecto por la rapamicina, las secciones del hipocampo de los cerebros de 3xTg-AD tratados y no tratados se incubaron con un anticuerpo espedfico para AI. Los resultados indican una disminucion significativa en el numero de neuronas positivas para AI en los hipocampos de ratones 3xTg-AD tratados con rapamicina en comparacion con ratones 3xTg-AD alimentados con la dieta control (FIG. 29H, 29I). Ademas de la acumulacion de AI, los ratones 3xTg-AD desarrollan una acumulacion de tau fosforilada y agregada dependiente de la edad (Oddo et al., 2003a; Oddo et al.,2003b; Oddo et al., 2007). A los 8 meses de edad, los ratones 3xTg-AD mostraron acumulacion somatodendntica de especies de tau solubles, que estan fosforiladas en diferentes epftopos, en las neuronas piramidales de CA1. Despues de la

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administracion de rapamicina, se observo una reduccion marcada de la inmunoreactividad de tau mediante el uso de los anticuerpos anti tau AT270 y MC-1, que reconocen tau fosforilada en Thr181 y un cambio conformacional en tau, respectivamente (FIG. 30A, 30B, 30C, 30D). Se cree que estos cambios en tau ocurren precozmente en el proceso de la enfermedad. Aunque las neuronas positivas para MC1 se hacen evidentes a esta edad en los hipocampos de ratones 3xTg-AD (FIG. 30E), no se detectaron neuronas positivas para MC1 en ratones tratados con rapamicina (FIG. 30E, 30F). Los datos inmunohistoqmmicos se confirmaron, ademas, mediante analisis de transferencia Western (FIG. 30G, 30H). Para cuantificar mejor los cambios en tau, medimos los niveles de tau soluble e insoluble mediante ELISA tipo sandwich y descubrimos que la rapamicina disminuyo selectivamente los niveles de tau soluble (FIG. 30I). En conjunto, estos datos indican que la patologfa temprana de tau en ratones 3xTg-AD de 8 meses de edad disminuye significativamente despues de la administracion de rapamicina. La disminucion de la patologfa AU y tau puede deberse a una disminucion en su produccion o a un aumento en su degradacion. Los datos presentados aqu indican que la reduccion mediada por rapamicina en los niveles de AU y tau no se debe a cambios en la produccion debido a que los niveles en estado estacionario de C99/C83 (que resultan de la escision de la APP por U- y a-secretasa, respectivamente) asf como tambien el transgen tau, no se alteraron.

Para comprender mejor el mecanismo subyacente a la reduccion mediada por rapamicina en la patologfa AU y tau, se midio la autofagia, una via de degradacion celular importante. Mientras que aun se investigan los mecanismos espedficos que subyacen a la induccion de la autofagia, los datos actuales indican una serie de protemas conocidas como protemas relacionadas con la autofagia (Atg) (Mizushima et al., 1998). La formacion de un complejo covalente entre dos protemas relacionadas con la autofagia, Atg5 y Atg12, parece ser esencial para la induccion de autofagia (Mizushima et al., 1998; Suzuki et al.,2001). La formacion de este complejo se regula por Atg7 y Atg10. La induccion de autofagia puede controlarse, ademas, mediante la medicion de los niveles de la cadena ligera 3 II (LC3-II), que se incorpora en la membrana del autofagosoma durante su formacion (Kabeya et al., 2000). Se encontro que los niveles de Atg7 y el complejo Atg5/Atg12 aumentaron significativamente en ratones transgenicos tratados con rapamicina en comparacion con los ratones de la dieta control (FIG. 31A, 31B, 31C, 31D, 31E), lo que indica un aumento de la autofagia mediado por rapamicina. El aumento en la autofagia se confirmo, ademas, por un aumento significativo en los niveles totales de LC3-II, segun se determino mediante transferencia Western y por un aumento de la inmunoreactividad de LC3 en secciones del hipocampo (FIG. 31A, 31E, 31F). Si bien no podemos excluir otros mecanismos que puedan involucrarse en la disminucion de los niveles de AU y tau mediada por rapamicina, estos datos apoyan la participacion de la autofagia en la mejona del fenotipo neuropatologico tipo AD en ambos modelos animales.

Una disminucion en los niveles de AU puede contribuir, ademas, a la mejora observada en la patologfa de tau en ratones 3xTg-AD porque se ha demostrado que la reduccion de AU reduce la patologfa de tau (Oddo et al., 2008; Oddo et al., 2006; Oddo et al., 2004). Estos datos son consistentes con un informe reciente en ratones transgenicos que muestra que la disminucion de la autofagia aumenta los niveles de AU mientras que el aumento de la autofagia disminuye los niveles de AU (Pickford et al., 2008). Estos resultados, obtenidos de dos laboratorios independientes, muestran que la rapamicina tiene un efecto protector robusto en el desarrollo de la neuropatologfa tipo AD, y rescata la perdida de memoria en dos modelos transgenicos de AD muy diferentes. Estos datos demuestran que la rapamicina, a una dosis que aumenta la duracion de la vida de los ratones, aumenta la autofagia y reduce la patologfa de AD.

Ejemplo 4

El Inicio Tardm o el Cancer Menos Severo Contribuye a Prolongar la Longevidad en Ratones Het3 tratados Cronicamente con Rapamicina Suministrada Entericamente.

Datos nuevos sobre la senalizacion de mTORC1 en ratones Het3 tratados cronicamente con rapamicina administrada entericamente, sustentan que esto es consistente con el inicio tardm o el cancer menos grave como uno de los mecanismos que contribuyen a la prolongacion de la longevidad.

Dado que el cancer afecta principalmente a personas con una edad promedio de 68 anos (Edwards et al., 2002), las personas de edad avanzada tienen un mayor riesgo de contraer esta enfermedad. A la luz de esta demograffa, es significativo que el tratamiento cronico con rapamicina, que comienza a los 20 meses de edad (60 en anos humanos), extendiera la duracion de la vida en los ratones geneticamente heterogeneos que se evaluaron; la principal causa de muerte fue el cancer, como se expone en el Ejemplo 1. Por tanto, la tecnologfa para la prevencion del cancer clmicamente manifestado en esta poblacion es un objetivo de la investigacion sobre el cancer en todo el mundo.

Para aplicaciones clmicas, una preocupacion importante es que la aplicacion cronica de rapamicina o sus analogos, en un protocolo de prevencion del cancer puede resultar en un aumento en la fosforilacion de la Ser463 de Akt, que, como un estfmulo a favor del crecimiento (revisado en Guertin and Sabatini 2009; Lane and Breuleux, 2009), contrarrestana cualquier efecto represivo. Un dato reciente de inmunotransferencia de nuestro laboratorio indica que esto no ocurre en el tejido graso normal, ni en el musculo esqueletico, en un tratamiento establecido de larga duracion. Para ilustrar, la FIG. 32 muestra ensayos de inmunotransferencia de la grasa visceral disecada a partir de ratones que consumieron alimentos con rapamicina durante 5 semanas. Hubo una induccion significativa en la fosforilacion de la Ser473 de Akt en respuesta a este tratamiento relativamente corto.

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Por el contrario, la grasa visceral de ratones tratados con rapamicina durante 20 meses no muestra esta activacion, y en los machos se reduce significativamente (FIG. 33). La misma tendencia se observa en el musculo esqueletico (FIG. 34).

Estos datos sugieren que el tratamiento cronico con rapamicina administrada entericamente no potencia la activacion de Akt promotora de tumor, en tejidos somaticos, sino que puede reducirlo.

Si el tratamiento cronico con rapamicina enterica retrasa el cancer o reduce su gravedad para que no presente srntomas hasta muy tarde en la vida, una prediccion es que el potencial promotor del crecimiento de la senalizacion de mTORCI debe reprimirse en los ratones tratados. En dos de los ratones supervisados de la cohorte 3, se analizaron dos machos con carcinoma hepatocelular, uno tratado con rapamicina y el otro con un control.

La FIG. 35 muestra datos del inmunoensayo de estos dos tumores, que indican que la rapamicina enterica cronica reprime significativamente la fosforilacion de la Thr389 inducida por mTORCI. Portanto, la inhibicion de este efector de mTORCI sugiere fuertemente que el inicio tardfo o el cancer menos grave es un mecanismo importante de prolongacion de la duracion de la vida en ratones que consumen alimento para ratones con rapamicina. Esto es consistente, ademas, con la respuesta tumoral en ratones con restriccion calorica y de factores de crecimiento (ratones enanos). En resumen, estos datos apoyan firmemente el concepto de que es factible la prevencion de la presentacion del cancer en personas moderadamente mayores mediante la administracion enterica de rapamicina.

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5,023,263

5,023,263

5,023,264 5,023,264 ; 5,078,999 ; 5,080,899 5,100,883 5,100,883 5,100,883 5,100,899

5,102,876

5,118,677 5,118,677 5,118,677 5,118,678 5,118,678 5,120,725 5,120,725 5,120,726 5,120,726

5,120,727

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5,120,842 5,120,842 5,120,842 5,130,307 5,130,307 5,130,307 5,138,051 5,138,051

5,138,051

5,151,413 5,151,413 5,151,413 5,162,333 5,162,333 5,164,399 5,164,399 5,164,399 5,169,851

5,169,851

5,177,203 5,177,203 5,194,447 5,194,447 5,202,332 5,202,332 5,206,018 5,221,670 5,221,670

5,221,740

5,221,740

5,233,036 5,233,036 5,233,036 5,260,299 5,260,299 ; 5,260,300 ; 5,260,300 ; 5,262,423;

5,262,423

5,262,424 5,262,424 5,288,711 5,302,584 5,302,584 5,310,903 ; 5,344,833 ; 5,344,833 5,344,833

5,346,893

5,346,893

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5,358,944 5,358,944 5,362,718 5,362,718 5,362,718 5,373,014 5,373,014

5,378,696

5,378,696

5,378,836 5,378,836 5,385,908 5,385,908 5,385,909 ; 5,385,909 5,385,910 5,385,910

5,389,639

5,389,639

5,391,730 5,391,730 5,411,967 5,411,967 5,434,260 ; 5,434,260 ; 5,446,048 ; 5,446,048;

5,446,048

5,463,048 5,463,048 5,480,988 5,480,988 5,480,989 5,480,989 ; 5,484,790 ; 5,484,790 5,484,791

5,484,791

5,486,522 5,486,522 5,486,523 5,486,523 5,486,524 5,486,524 ; 5,488,054 ; 5,488,054 ; 5,489,595;

5,489,595

5,489,680 5,489,680 5,491,231 5,491,231 5,504,091 5,504,204 ; 5,504,204 ; 5,504,291 5,504,291

5,508,285

5,508,285

5,508,286 5,508,286 5,508,290 5,508,290 5,508,399 ; 5,508,399 5,516,780 5,516,780

5,519,031

5,519,031

5,521,194 5,521,194 5,525,610 5,525,610 5,530,007 ; 5,530,007 5,530,121 5,530,121

5,532,355

5,532,355

5,541,191 ; 5,541,191 ; 5,541,192; 5,541,192;5,550,133; 5,550,133; 5,559,112 5,559,112

5,559,119

5,559,119

5,559,120 5,559,120 5,559,122 5,559,122 5,561,138 5,563,145 5,563,145 ; 5,567,709;

5,567,709

5,567,709

5,637,590 ; 5,637,590 ; 5,637,590 5,665,772 5,665,772 ; 5,780,462 ; 5,780,462 5,912,253

5,912,253

5,922,730 5,922,730 ; 5,922,730; 5,955,457; 5,955,457;5,955,457; 5,985,890; 5,985,890; 6,004,973;

6,004,973

6,015,809 6,015,809 ; 6,200,985 ; 6,329,386 6,399,625 6,440,990 ; 6,486,099 6,592,916 ; 6,653,256;

6,670,355

6,677,357 6,680,330 ; 6,936,644 ; 7,037,582 7,160,867 7,220,755 7,241,771 7,268,144 ; 7,273,874;

7,279,562

7,282,505; 7,445,916; 7,446,111; 7,455,853; 7,470,682; 7,476,678; 7,538,119; 7,560,457; 7,576,903;

Solicitud de patente de Estados Unidos 20080249123; 20080188511; 20080182867; 20080091008; 20080085880

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20070142423; 20060264453;20040010002; 20080022965; 20080193653; 20070138673; 20070082829; 20060234053

20060121122; 20050113282;20040121155; 20040074089; 20020009473

Solicitud PCT WO2008/022256

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Claims (12)

1. 5

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   Reivindicaciones

   1. Una microcapsula que comprende un componente nucleo, que comprende al menos 5 % en peso de un inhibidor del blanco de rapamicina en mai^eras (mTOR), que es rapamicina, en donde dicho componente nucleo se microencapsula y se encierra en un recubrimiento que incluye un copolfmero de metacrilato de metilo y acido metacnlico.
2. 2. La microcapsula de conformidad con la reivindicacion 1, en donde el componente nucleo comprende, ademas, un segundo compuesto que es vitamina E, vitamina A, un antibiotico antibacteriano, un antioxidante, L-carnitina, acido lipoico, metformina, resveratrol, leptina, un farmaco antiinflamatorio no esteroideo o un inhibidor de COX.
3. 3. La microcapsula de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, en donde el recubrimiento es Eudragit S100.
4. 4. Una composicion farmaceutica o nutraceutica que comprende microcapsulas de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.
5. 5. La composicion farmaceutica o nutraceutica de conformidad con la reivindicacion 4, en donde la composicion comprende de 25 % a 60 % en peso de la composicion del inhibidor del blanco de rapamicina en mairnferos.
6. 6. La composicion farmaceutica o nutraceutica de conformidad con la reivindicacion 4 o la reivindicacion 5, en donde un alimento o un aditivo para alimentos contiene la composicion.
7. 7. Una composicion farmaceutica o nutraceutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6 para usar en el tratamiento o la prevencion del cancer en un sujeto mam^era, en donde se prolonga la esperanza de la vida del sujeto mamffero.
8. 8. La composicion farmaceutica o nutraceutica para usar de conformidad con la reivindicacion 7, en donde el cancer se selecciona de cancer de mama, cancer de pulmon, cancer de prostata, cancer de ovario, cancer de cerebro, cancer de hngado, cancer de cervix, cancer de colon, cancer renal, cancer de piel, cancer de cabeza y cuello, cancer de huesos, cancer de esofago, cancer de vejiga, cancer de utero, cancer linfatico, cancer de estomago, cancer de pancreas, cancer de testfculos, linfoma y leucemia.
9. 9. Una composicion farmaceutica o nutraceutica para usar de conformidad con la reivindicacion 7 o la reivindicacion 8, en donde el sujeto es un ser humano.
10. 10. La composicion farmaceutica o nutraceutica para usar de conformidad con la reivindicacion 9, en donde el ser humano se conoce o se sospecha que tiene una enfermedad asociada a la edad y que tiene una edad mayor de 50 anos.
11. 11. La composicion farmaceutica o nutraceutica para usar de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 7 a

    10, en donde la cantidad con eficacia terapeutica de las microcapsulas se administra por via oral, opcionalmente mediante la combinacion de dichas microcapsulas con una sustancia digerible, a traves de un tubo nasogastrico, por via rectal, intraperitoneal, topica, subcutanea o intravenosa.
12. 12. La composicion farmaceutica o nutraceutica para usar de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 7 a

    11, en donde la dosis del inhibidor de mTOR es aproximadamente 1 microgramo a aproximadamente 100 mg por kg de peso corporal del sujeto.