ES2205792T3

ES2205792T3 - Celulas madre mesenquimatosas como inmunosupresores.

Info

Publication number: ES2205792T3
Application number: ES99911322T
Authority: ES
Inventors: Joseph D. Mosca; Kevin R. Mcintosh
Original assignee: Osiris Therapeutics Inc
Current assignee: Osiris Therapeutics Inc
Priority date: 1998-04-03
Filing date: 1999-03-12
Publication date: 2004-05-01
Anticipated expiration: 2019-03-12
Also published as: WO1999051275A3; ATE246938T1; EP1066060A2; CA2326838C; US20020044923A1; EP1066060B1; WO1999051275A2; AU2999199A; JP2002510655A; US6797269B2; DE69910362D1; DE69910362T2; CA2326838A1; DK1066060T3; PT1066060E

Abstract

1. Uso de células madre mesenquimatosas modificadas para presentar antígeno para la preparación de una composición para inhibir una respuesta por células T al antígeno. Las células madre mesenquimatosas expresan también una molécula que bloquea la coestimulación de las células T.

Description

Células madre mesenquimatosas como inmunosupresores.

Esta solicitud se basa en, y reivindica prioridad para, la solicitud provisional de EE.UU. de nº de serie 60/080.678 presentada el 3 de abril de 1998.

La presente invención se refiere al campo de la inducción de inmunosupresión mediante el uso de células madre mesenquimatosas para inhibir la activación de células T frente a antígenos.

Antecedentes de la invención

En una respuesta inmunológica normal, las células T son activadas por una primera señal, específica del antígeno, que estimula las células T a través del receptor de la célula T para el antígeno y confiere a la respuesta inmunológica una especificidad para el antígeno; y una segunda señal, coestimuladora, entregada por moléculas coestimuladoras que se encuentran a la superficie de las células presentadoras de antígeno. Ambas señales son necesarias para inducir la proliferación de las células T. Si no se produce la segunda señal coestimuladora, o si la vía de la coestimulación se encuentra bloqueada o reprimida, la activación de las células T quedará reducida o eliminada. Esto tiene por consecuencia una hiporreactividad de las células T frente a los antígenos y puede inducir un estado de anergia de las células T, o una insensibilidad de las células T, en la que las células T no proliferarán cuando se las presente el antígeno.

Las moléculas coestimuladoras en las células presentadoras de antígeno que mejor caracterizadas están son las glicoproteínas estructuralmente emparentadas B7-1 (CD80) y B7-2 (CD86). Éstas son miembros homodiméricos de la superfamilia de las inmunoglobulinas que se encuentran exclusivamente a la superficie de células capaces de estimular el desarrollo de las células T. El receptor para las moléculas B7 en la célula T es CD28, otro miembro de la superfamilia de las inmunoglobulinas. La unión de CD28 con B7-1 o B7-2 o con anticuerpos anti-CD28 producirá una coestimulación del desarrollo de las células T inmaduras, mientras que anticuerpos contra las moléculas B7, que inhiben la unión de B7 con CD28, inhiben las respuestas por células T.

El sistema inmunológico tiene por función la eliminación de células extrañas que puedan contener patógenos, mientras conserva una insensibilidad o tolerancia frente a los antígenos propios. La tolerancia se manifiesta a través de la anergia de las células T, que se caracteriza por la supervivencia, pero insensibilidad, de las células T. Sin embargo, el sistema inmunológico puede atacar constituyentes propios, provocando una enfermedad autoinmune. Se cree que las enfermedades autoinmunes tienen su origen en la respuesta inmunológica anormal a antígenos propios, bien como consecuencia de una modificación de los antígenos propios, bien como consecuencia de la exposición a antígenos con reactividad cruzada. Las enfermedades autoinmunes provocadas por respuestas inmunológicas de mediación humoral a los antígenos propios incluyen enfermedades como la artritis reumatoide, el lupus eritematoso sistémico y las enfermedades inflamatorias del intestino.

Es deseable mejorar los tratamientos actuales de las enfermedades autoinmunes o de otras reacciones inmunológicas indeseables que usan agentes inmunosupresores generales tales como los corticosteroides, la azatioprina, o la ciclosporina A. Estos tratamientos son no selectivos y no hacen la diferencia entre respuestas inmunológicas normales y anormales. Estos fármacos tienen a menudo efectos secundarios adversos, incluida la supresión general del sistema inmunológico con riesgos de infecciones y neoplasias, así como del desarrollo de enfermedades tales como la diabetes, la osteoporosis, la leucopenia y la hipertensión.

Por lo tanto, en ciertas circunstancias, tales como una enfermedad autoinmune, puede que no se desee una respuesta inmunológica particular. Se necesitan aproximaciones alternativas para el tratamiento de estos estados para pacientes que no pueden resistir, o no responden, a la terapia farmacológica no específica crónica convencional.

Resumen de la invención

Se ha descubierto que las células madre mesenquimatosas humanas pueden usarse para entregar antígenos al sistema inmunológico de tal manera que la respuesta inmunológica al antígeno resultará inhibida, es decir, eliminada, reducida o mejorada. La reducción o eliminación de una respuesta inmunológica por las células madre mesenquimatosas como se describe en la presente invención puede usarse para mejorar una respuesta inmunológica en un receptor frente a una enfermedad autoinmune.

Por lo tanto, los usos de la presente invención tal y como se reivindican en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17 son particularmente útiles para eliminar, reducir o mejorar respuestas inmunológicas por células T anormales o no deseadas. En una vertiente, el uso implica la administración de células madre mesenquimatosas que han sido modificadas para llevar un antígeno a un animal. La presentación del antígeno a la célula T en ausencia de una señal coestimuladora induce un estado de hiporreactividad o incluso de insensibilidad o anergia específico para el antígeno en la célula T frente a un desafío posterior de la célula T por el antígeno. Por lo tanto, se reduce o elimina una respuesta inmunológica. La eliminación, reducción o mejora de una respuesta inmunológica como se describe en la presente invención puede usarse para tratar o inhibir una respuesta inmunológica anormal o no deseada como la que se produce en una enfermedad autoinmune.

En otra vertiente de la presente invención, se pueden usar células madre mesenquimatosas para la preparación de una composición farmacéutica para presentar al sistema inmunológico moléculas que bloquean las vías de coestimulación que son necesarias para lograr una respuesta inmunológica. La eliminación, reducción o mejora de una respuesta inmunológica como se describe en la presente invención puede usarse para tratar o inhibir una respuesta inmunológica anormal o no deseada como la que se produce en una enfermedad autoinmune. El bloqueo de la señal coestimuladora inhibe la activación de la célula T por señales específicas del antígeno presentadas por las células presentadoras de antígeno que pueden encontrarse en las proximidades de las células T.

En otra vertiente adicional aún de la invención, se usan las células madre mesenquimatosas para la preparación de una composición farmacéutica para entregar a las células T un antígeno y una molécula que inhibe la entrega de una señal de coestimulación a las células T. La entrega de un antígeno específico a células T diana junto con el bloqueo de la señal coestimuladora inhibe la activación específica de las células T en presencia de una señal específica del antígeno presentada por la célula madre mesenquimatosa presentadora del antígeno. En una realización preferida, las moléculas que bloquean la coestimulación de las células T se seleccionan entre la proteína asociada a los linfocitos T citotóxicos 4 (CTLA-4) o CTLA-4Ig, una proteína de fusión entre CTLA-4 y la región constante de la IgG-1 humana.

Breve descripción de los dibujos

La fig. 1 muestra una reducción de la respuesta proliferativa de células T específicas para el toxoide tetánico a la reestimulación mediante el uso de células mononucleares de la sangre periférica como células presentadoras de antígeno después de que las células T hayan permanecido en cocultivo con células madre mesenquimatosas que habían sido sometidas a impulso con el toxoide tetánico.

Fig. 2 Análisis por citometría de flujo de células madre mesenquimatosas humanas que confirman la transducción de las células con CTLA-4 (unido a membrana) (Fig. 2A) y CTLA4-Ig en forma soluble (Fig. 2B).

Fig. 3 Inhibición de la estimulación de las células T por células madre mesenquimatosas humanas transducidas con CTLA-4.

Fig. 4 Inhibición de la estimulación de las células T por células madre mesenquimatosas humanas transducidas con CTLA4-Ig.

Descripción detallada de realizaciones preferidas

Esta invención se refiere a usos como se reivindican en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17 para reducir, inhibir o mejorar una respuesta inmunológica a un antígeno específico, in vivo, mediante el empleo de células madre mesenquimatosas como células presentadoras de antígeno para presentar antígeno al animal. Las células madre mesenquimatosas mejoran, inhiben o reducen la respuesta por células T al antígeno porque las células madre mesenquimatosas no producen, o no producen cantidades suficientes de, la señal coestimuladora necesaria para activar las células T. En lugar de ello, las células madre mesenquimatosas inducen hiporreactividad de una población de células T tomadas por diana frente al antígeno, es decir, hay una respuesta inmunológica por células T al antígeno mejorada, inhibida o reducida en el momento de la presentación posterior del antígeno a la célula T.

Por lo tanto, se puede modificar las células madre mesenquimatosas para presentar antígeno a una población de células T diana que comprende células T que poseen receptores para el antígeno en cuestión. En una realización, las células madre mesenquimatosas se modifican por contacto con antígeno in vitro. En otra realización, las células madre mesenquimatosas se manipulan genéticamente para expresar una molécula antigénica. Las células mesenquimatosas son preferiblemente autólogas con respecto al receptor de las células madre mesenquimatosas.

Tal y como se usa en la presente invención, se pretende que el término antígeno incluya una proteína, un polipéptido, un lípido, una glicoproteína, etc. En una vertiente de la invención, las células madre mesenquimatosas se modifican para poseer como mínimo un fragmento de antígeno exógeno unido a una proteína principal de superficie de la célula de manera que como mínimo un fragmento de antígeno sea presentado para inhibir o reducir la respuesta proliferativa de los linfocitos. En una realización, la célula madre mesenquimatosa se pone en contacto con como mínimo un antígeno (impulso con el antígeno). La célula madre mesenquimatosa procesa el antígeno para convertirlo en un fragmento de antígeno para la presentación por las células madre mesenquimatosas. En otra realización, la célula madre mesenquimatosa se manipula genéticamente para expresar una molécula antigénica.

En otra vertiente de la invención, se contempla que las células madre mesenquimatosas se modifiquen para expresar un autoantígeno específico, en particular un autoantígeno mediador de la respuesta inmunológica en enfermedades autoinmunes.

La presente invención se refiere además a usos conforme a una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17 para la preparación de una composición farmacéutica para inhibir, mejorar o reducir una respuesta por células T a un antígeno específico mediante la administración, in vivo, de células madre mesenquimatosas usadas como células presentadoras de antígeno, siendo las células madre mesenquimatosas además modificadas con una molécula que bloquea la entrega de una señal de coestimulación para las células T a la célula T tomada por diana. La población de células T diana puede, o no, haber sido presentada anteriormente al antígeno una vez. Por consiguiente, además de inducir hiporreactividad en las células T frente al desafío por el antígeno, las células madre mesenquimatosas mejoran, inhiben o reducen aún más la respuesta inmunológica por células T mediante el bloqueo de señales coestimuladoras a la célula T que pueden ser proporcionadas por una célula presentadora de antígeno. Este tratamiento inhibe la activación completa de las células T y da lugar a hiporreactividad o incluso insensibilidad de las células T.

Con respecto a esta vertiente de la invención, las células presentadoras de antígeno que proporcionan señales coestimuladoras a las células T pueden ser células presentadoras de antígeno endógenas o pueden ser la célula madre mesenquimatosa presentadora de antígeno. En el caso de que se usen las células madre mesenquimatosas que pueden expresar la señal coestimuladora necesaria para la activación de las células T, estas células madre mesenquimatosas se modificarán adicionalmente con una molécula que impide la entrega de la señal coestimuladora.

De acuerdo con esta vertiente de la invención, se contempla que las células madre mesenquimatosas se modifiquen para expresar un autoantígeno específico, en particular un autoantígeno mediador de la respuesta inmunológica en las enfermedades autoinmunes.

De acuerdo con el uso de la presente invención, una molécula que inhibe la entrega de una señal coestimuladora a una célula T es una que interfiere con la vía de coestimulación de la célula T de tal forma que las células T no proliferan en respuesta al antígeno como ocurre en una respuesta inmunológica normal. Tal y como se usa el término en la presente invención, se entrega una señal coestimuladora para la célula T cuando una molécula coestimuladora interactúa con su receptor en la célula T. Por lo tanto, en una realización preferida, el procedimiento implica la expresión de una molécula por las células madre mesenquimatosas que impedirá o interferirá con tal interacción. Al impedir esta interacción en células T cebadas (es decir, células T a las que ya se presentó la primera señal específica del antígeno), se inhibe la activación completa de las células T por las células presentadoras de antígeno. Las células T exhiben hiporreactividad o insensibilidad frente al antígeno, lo cual da lugar a una mejora, reducción o eliminación de una respuesta inmunológica por las células T frente al antígeno.

En una realización preferida de esta vertiente de la invención, las moléculas coestimuladoras son B7-1 y B7-2 y el receptor de las células T es CD28. De acuerdo con esta realización, la célula madre mesenquimatosa se prepara preferiblemente por ingeniería genética de modo que expresa CTLA-4 o CTLA4-Ig. Tanto CTLA-4 como CTLA4-Ig interfieren con la interacción de B7 y CD28, e inhiben por lo tanto la entrega de la señal coestimuladora por el antígeno a la célula T.

Las células T activadas expresan el receptor CTLA-4, además de CD28, que se une a las moléculas B7 con una afinidad mayor a la de CD28. CTLA-4 es muy parecida a CD28 en cuanto a la secuencia, y las dos moléculas están codificadas por genes estrechamente relacionados. CTLA-4 es un agonista competitivo de CD28. CTLA-4 inhibe la entrega de la señal coestimuladora, bien al competir con ventaja con CD28 para la unión a B7 o al reprimir la señal, lo cual da lugar a la inhibición de la activación completa, y por lo tanto de la proliferación de la célula T que la expresa.

Una forma soluble de CTLA-4 es la proteína de fusión CTLA4-Ig. La molécula CTLA-4 está incorporada como parte de una proteína de fusión que contiene una región que aumenta la estabilidad y la solubilidad de la molécula. El bloqueo de la activación de células T por CTLA4-Ig, la proteína de fusión específica para B7, ha sido descrita igualmente (Kirk, y col., PNAS 1997).

En otra vertiente aún, el uso de la presente invención reduce, inhibe o mejora una respuesta inmunológica a un antígeno, in vivo, mediante el empleo de células madre mesenquimatosas como vehículo para presentar al sistema inmunológico una molécula que bloquea la coestimulación de las células T. Las células madre mesenquimatosas inducen una hiporreactividad o insensibilidad de la célula T frente a un antígeno por interferencia con la entrega de una señal coestimuladora a la célula T. Esto tiene por consecuencia una reducción, mejora o eliminación de la respuesta inmunológica por células T a un antígeno después de la presentación del antígeno a la célula T.

Por lo tanto, las células madre mesenquimatosas se pueden modificar para presentar al sistema inmunológico una molécula que bloquea o interfiere con la entrega de una señal coestimuladora a una célula T que puede haber sido ya cebada con una señal específica de un antígeno a partir de una célula presentadora de antígeno endógena. Las células madre mesenquimatosas se modifican preferiblemente para expresar CTLA-4 o CTLA4-Ig. En una realización, se manipulan genéticamente las células madre mesenquimatosas para que expresen las moléculas bloqueantes antes del contacto con las células T. De acuerdo con esta vertiente, después de que se administren las células madre mesenquimatosas, el procedimiento tiene por consecuencia el bloqueo de la coestimulación de las células T por las células presentadoras de antígeno y, por consiguiente, se obtiene una respuesta inmunológica por células T posterior reducida.

En una realización preferida de esta vertiente de la invención, se usan las células madre mesenquimatosas como plataforma para expresar la proteína asociada a los linfocitos T citotóxicos 4 (CTLA-4) o CTLA4-Ig, una proteína de fusión de CTLA-4 y la región constante de la IgG1 humana, moléculas que bloquean la coestimulación de las células T.

De acuerdo con esta vertiente de la invención, se hace posible la mejora, reducción o eliminación de una respuesta inmunológica no específica. El uso no se restringe a una población de células T específica para un antígeno particular, sino que se puede usar con respecto a cualquier respuesta inmunológica mediada por células T específica para un antígeno para mejorar, reducir o eliminar la respuesta inmunológica. En esta realización, las células madre mesenquimatosas se administran preferiblemente localmente. Las células madre mesenquimatosas pueden ser bien alogénicas, bien autólogas con respecto al individuo al que se están administrando, preferiblemente autólogas.

Las células madre mesenquimatosas se encuentran normalmente presentes en pequeñas cantidades en la médula ósea, sin embargo, se ha desarrollado un procedimiento para aislar, purificar y replicar en gran cantidad estas células en cultivo, es decir, in vitro. Véase Caplan y Haynesworth, patente de Estados Unidos nº 5.486.359.

Las células madre mesenquimatosas humanas pueden usarse como huéspedes para genes extraños, para la expresión de los productos de los genes en dianas sistémicas o localizadas. Las células madre mesenquimatosas humanas de la invención pueden ser manipuladas por ingeniería (transducidas o transformadas o sometidas a transfección) con material genético de interés. Las células madre mesenquimatosas humanas manipuladas por ingeniería pueden cultivarse en medios nutritivos convencionales apropiadamente modificados para activar promotores, seleccionar transformantes, o amplificar genes exógenos en las mismas. Las condiciones de cultivo tales como la temperatura, el pH y similares pueden ser aquellas que se usaron con anterioridad con células madre mesenquimatosas humanas manipuladas por ingeniería. Véase, por ejemplo, Gerson y col., patente de Estados Unidos nº 5.591.625. Las células madre mesenquimatosas pueden ser tratadas con IFN-gamma para estimular la presentación de MHC por las células madre mesenquimatosas.

A menos que se especifique lo contrario, las manipulaciones genéticas se efectúan como se describe en Sambrook y Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1989.

Aunque no se restrinjan al uso conforme a una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17 para la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento de enfermedades autoinmunes, las células madre mesenquimatosas y el uso de la invención pueden usarse en consecuencia apropiadamente con respecto a estrategias de tratamiento que requieren reactivos inmunosupresores. También se contempla la modificación y expansión de células madre mesenquimatosas in vitro, para uso en inmunoterapia celular, la administración in vivo de las células madre mesenquimatosas inmunosupresoras para el tratamiento o la prevención de respuestas inmunológicas no deseadas. Una vertiente de la invención es la conversión de las células madre mesenquimatosas en un vehículo para entregar señales inhibidoras o antígeno para dirigirse a una respuesta celular específica, el desarrollo de vacunas con las células madre mesenquimatosas modificadas como se describe en la presente invención para la entrega bien específica para una diana, bien sistémica, de inmunosupresión para la profilaxis y la terapia de enfermedades.

Por lo general, en la profilaxis o el tratamiento de estados de enfermedad, muy preferiblemente sólo se le pide al receptor que se someta a una única administración después de la cual se produce la remisión de la enfermedad de forma permanente. Si no, en función de las observaciones del seguimiento, cualquier administración posterior puede ser de dosis mayores o menores. Tales procedimientos y regímenes de seguimiento son bien conocidos para aquellos expertos en el campo de la inmunoterapia, las enfermedades infecciosas, la oncología, la epidemiología y similares.

La posología de los ingredientes activos varía dentro de unos límites amplios y, por supuesto, se la adaptará a las necesidades individuales en cada caso particular. Por lo general, en el caso de administración parenteral, se suele administrar desde aproximadamente 0,5 a aproximadamente 5 millones de células por kilogramo de peso corporal del receptor. El número de células que se usarán dependerá del peso y del estado del receptor y otras variables conocidas para aquellos expertos en la materia. Las células se pueden administrar por una vía que es adecuada para el estado de enfermedad particular que haya que tratar. En el caso de una inducción no específica de hiporreactividad de la respuesta inmunológica, se pueden administrar células madre mesenquimatosas modificadas con CTLA-4, por ejemplo, por vía sistémica, es decir, parenteral, intravenosa, o mediante una inyección. En el caso de inducción de hiporreactividad específica para un antígeno, se pueden dirigir las células madre mesenquimatosas modificadas con el antígeno hacia un tejido u órgano particular, tal como la médula ósea.

Se puede poner las células en suspensión en un diluyente apropiado, a una concentración de aproximadamente
5 \texttimes 10^{6} a aproximadamente 50 \texttimes 10^{6} células/ml. Los excipientes adecuados para soluciones de inyección son aquellos que son biológicamente y fisiológicamente compatibles con el receptor, tal como una solución salina amortiguada. La composición para la administración debería ser estéril, estable, y similares, según conviene para la administración en un individuo.

Una ventaja de los usos de la presente invención con respecto al tratamiento actual para las respuestas inmunológicas no deseadas es su especificidad; las células madre mesenquimatosas están dirigidas para reducir una respuesta inmunológica específica sin afectar negativamente otros segmentos del sistema inmunológico. La mejora, reducción o eliminación de una respuesta inmunológica específica para un antígeno permite el tratamiento o la prevención de una respuesta inmunológica no deseada o anormal a un antígeno específico. Una ventaja adicional es que las células madre mesenquimatosas ofrecen una expresión localizada de una molécula de interés. La expresión localizada de una molécula, por ejemplo, que bloquea la coestimulación, p. ej., CTLA4-Ig, puede dar lugar a una inflamación reducida y menos efectos secundarios. Los ejemplos de enfermedades que se prestarían particularmente bien al tratamiento con las células madre mesenquimatosas de la presente invención incluyen la tiroiditis, la artritis reumatoide, y la diabetes mellitus insulinodependiente. Las células madre mesenquimatosas pueden proporcionar además
un suministro continuo de la molécula de interés.

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Los usos de la presente invención son particularmente aplicables a la preparación de una composición farmacéutica para la terapia de una enfermedad autoinmune y deberían preferiblemente inactivar o eliminar específicamente la respuesta al autoantígeno, sin comprometer otros aspectos del sistema inmunológico.

La invención puede utilizarse para la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento de enfermedades autoinmunes en las que el autoantígeno mediador de la enfermedad es conocido. El uso implica la manipulación genética por ingeniería de células madre mesenquimatosas, preferiblemente aisladas de la médula ósea del propio paciente, para expresar un autoantígeno con el fin de inducir una inmunoterapia específica para inactivar o eliminar respuestas inmunológicas anormales sin interferir con otras funciones del sistema inmunológico.

Los siguientes ejemplos ilustran adicionalmente vertientes de la presente invención. Sin embargo, no constituyen restricción de modo alguno de las enseñanzas o descripción de la presente invención tal como se expuso en la presente.

Ejemplos Materiales

Se expresaron CTLA-4 y CTLA-4Ig en las células madre mesenquimatosas humanas transducidas con la secuencia de ADNc de CTLA-4 obtenida de Gene Bank nº de entrada L15006. La forma Ig se construyó por fusión de la porción extracelular de CTLA-4 con la porción Fc de la cadena pesada de la IgG humana mediante una bisagra flexible de 4 glicinas y 2 serinas. Se obtuvieron células mononucleares de la sangre periférica (PBMC) por aféresis de los mismos donantes de las células madre mesenquimatosas. Se obtuvo CTLA4-Ig disponible en el mercado de R&D Systems (Minneapolis, MN). La Ly6A.2 de ratón se consiguió del Dr. Ethan Shevach, y se clonó dentro de un vector retroviral MuL V.

Se prepararon células T específicas frente al toxoide tetánico por estimulación de PBMC con 1 \mug/ml de toxoide tetánico (Connaught Laboratories, Toronto, Canada) durante 6 días. Se recogieron las células, se lavaron y se volvieron a poner en cultivo durante 7 días suplementarios en 20 unidades/ml de IL2 humana recombinante (Proleukin) para expandir las células T específicas contra el toxoide tetánico. Se recogieron las células, y se purificaron las células T por eliminación de las células B y los monocitos por separación magnética. La línea de células T contra el toxoide tetánico se repartió en alícuotas y se congeló en nitrógeno líquido hasta su uso posterior.

Ejemplo 1 Inducción de hiporreactividad de las células T frente al toxoide tetánico mediante el uso de células madre mesenquimatosas

Se sembraron en placa las CMM del donante 155 en 4 matraces T185^{2} y se trató un matraz con 100 U/ml de IFN-gamma. Al cabo de cuatro días, se recogieron las CMM (tanto las tratadas con IFN-gamma como las no tratadas). Se sembraron en placa 3 \texttimes 10^{5} CMM en cada pocillo de una placa de cultivo de tejidos de 6 pocillos

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1 pocillo con CMM tratadas con IFN-gamma, 1 pocillo con CMM no tratadas. Se sometieron las CMM tratadas con IFN-gamma a impulso con 50 \mug/ml de toxoide tetánico durante la noche. Se lavaron todos los pocillos muy concienzudamente con solución salina amortiguada de Hanks 1X y se añadieron 5 \texttimes 10^{6} células T autólogas específicas para el toxoide tetánico (células Tet T) (Donante 155) por pocillo. Se incubaron los cultivos durante 5 días. Se volvió a estimular las células T recogidas con el toxoide tetánico (0, 0,2, 1,0 y 5,0 \mug/ml)

\fre

se usaron CMM (5 \texttimes 10^{5}/pocillo) como CPA y se incubó el ensayo de proliferación durante 3 días. A continuación, se sometieron las células a impulso con 1 \muCi de [^{3}H]timidina durante la noche y se recogió el ensayo 18 horas después.

Los resultados ilustrados en la figura 1 (se sustrajeron las cuentas del control 0 \mug/ml como fondo) muestran una disminución (de aproximadamente 30-40%) de la respuesta proliferativa o el potencial de reestimulación de las células Tet T al cabo de 5 días de cocultivo con las CMM tratadas con IFN-gamma/toxoide tetánico en comparación con la respuesta proliferativa de las células Tet T puestas en cocultivo con CMM no tratadas.

Ejemplo 2 Bloqueo de la activación de las células T por el toxoide tetánico con células madre mesenquimatosas transducidas con CTLA-4 (unido a la membrana)

Se sometieron células madre mesenquimatosas humanas a transducción, bien con el gen CTLA-4 humano de tamaño completo, bien con una molécula de superficie de ratón (Ly6A.2 de ratón) como control. La figura 2A muestra el análisis por citometría de flujo de las células madre mesenquimatosas humanas transducidas con CTLA-4. Las células madre mesenquimatosas humanas transducidas con el control y con CTLA-4 se trataron con IFN-gamma durante tres días para aumentar la expresión de MHC de clase II y se sometieron a impulso con toxoide tetánico a alta dosis (100 \mug/ml) durante un día. Después de retirar el IFN-gamma y el toxoide tetánico de los cultivos, se añadió una línea de células T específica para el toxoide tetánico (TetC) a las células madre mesenquimatosas humanas y se incubaron los cultivos durante 3 días. Se evaluó la linfoproliferación de la línea de células T por consumo de [^{3}H]timidina durante las últimas 8 horas del periodo de cultivo.

Los resultados, presentados en la figura 3, indicaron que las células madre mesenquimatosas humanas con transducción control presentaban el toxoide tetánico a las células T presentes en la preparación de PBMC, y dieron lugar a una proliferación de las células T (18.000 cpm), mientras que las células madre mesenquimatosas humanas transducidas con CTLA-4 no indujeron una respuesta por parte de las células T (200 cpm). Estos resultados demostraron que la expresión de la molécula CTLA-4 en las células madre mesenquimatosas humanas suprimió la respuesta de las células T.

Ejemplo 3 Bloqueo de la activación de las células T por el toxoide tetánico con células madre mesenquimatosas transducidas con CTLA4-Ig (forma soluble)

Se sometieron células madre mesenquimatosas humanas a transducción, bien con CTLA4-Ig en forma soluble, que se compone de la porción extracelular del gen CTLA-4 humano fusionada con la región constante de la IgG1 humana, bien con una molécula de superficie de ratón (Ly6A.2 de ratón) como control. La figura 2B presenta el análisis por citometría de flujo de las células mesenquimatosas transducidas con CTLA4-Ig. A cultivos en subconfluencia de las células madre mesenquimatosas humanas transducidas con el control y con CTLA4-Ig se les añadieron antígeno toxoide tetánico (1 \mug/ml) y células mononucleares de la sangre periférica (PBMC) (100.000 células/pocillo). Se evaluó la linfoproliferación de las células T presentes dentro de la preparación de PBMC por consumo de [^{3}H]timidina durante las últimas 8 horas del periodo de cultivo (Fig. 4). Se llevaron a cabo controles adicionales en los que se expusieron las PBMC al antígeno en presencia de proteína CTLA4-Ig disponible en el mercado en ausencia de células madre mesenquimatosas humanas. Los resultados muestran que las células madre mesenquimatosas humanas transducidas con CTLA4-Ig proporcionaban una inhibición del 81% de la linfoproliferación (4.000 cpm), mientras que las células madre mesenquimatosas humanas transducidas con el control no inhibieron la proliferación de las células T presentes en la preparación de PBMC en respuesta al toxoide tetánico (19.000 cpm). La inhibición (81%) de la linfoproliferación observada con células madre mesenquimatosas humanas que expresan CTLA4-Ig fue mayor que el nivel de inhibición observado con la proteína CTLA4-Ig (5 \mug/ml) disponible en el mercado, que inhibió la linfoproliferación en PBMC por sólo 51%. Por lo tanto, la expresión de la molécula CTLA4-Ig en las células madre mesenquimatosas humanas suprimió las respuestas de las células T a niveles bien por debajo de los mostrados para CTLA4-Ig disponibles en el mercado.

Claims

1. Uso de células madre mesenquimatosas modificadas para presentar antígeno para la preparación de una composición para inhibir una respuesta por células T al antígeno.

2. Uso según la reivindicación 1 en el que las células madre mesenquimatosas expresan también una molécula que bloquea la coestimulación de las células T.

3. Uso de células madre mesenquimatosas humanas modificadas para presentar antígeno para la preparación de una composición farmacéutica para inhibir una respuesta por células T a dicho antígeno.

4. El uso de la reivindicación 3 en el que el antígeno es un autoantígeno.

5. El uso de la reivindicación 4 en el que las células mesenquimatosas son autólogas con respecto al huésped.

6. Uso de células madre mesenquimatosas humanas que expresan una molécula que bloquea la coestimulación de las células T de tal manera que la respuesta por células T a un antígeno se encuentra inhibida para la preparación de una composición para inhibir una respuesta por células T a un antígeno.

7. El uso de la reivindicación 6 en el que la molécula se encuentra unida a la membrana.

8. El uso de la reivindicación 7 en el que la molécula es CTLA-4.

9. El uso de la reivindicación 6 en el que la molécula es una proteína soluble en la célula.

10. El uso de la reivindicación 9 en el que la molécula es una proteína de fusión CTLA4-Ig.

11. Uso de células madre mesenquimatosas humanas que se han modificado para expresar a) un antígeno específico; y b) una molécula que bloquea la coestimulación de las células T para la preparación de una composición para inhibir una respuesta por células T al antígeno.

12. El uso de la reivindicación 11 en el que el antígeno es un autoantígeno.

13. El uso de la reivindicación 11 en el que las células mesenquimatosas son autólogas con respecto al huésped.

14. El uso de la reivindicación 11 en el que la molécula se encuentra unida a la membrana.

15. El uso de la reivindicación 14 en el que la molécula es CTLA-4.

16. El uso de la reivindicación 11 en el que la molécula es una proteína soluble en la célula.

17. El uso de la reivindicación 16 en el que la molécula es una proteína de fusión CTLA4-Ig.