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Autoimmunerkrankungen
sind durch eine Fehlfunktion des körpereigenen Immunsystems
gekennzeichnet. Dabei werden körpereigene Zellen durch
dieses fehlgesteuerte Immunsystem angegriffen und zerstört.
Zu den bekanntesten Autoimmunerkrankungen gehören: Morbus
Crohn, Psoriasis, Neurodermitis, Multiple Sklerose, Diabetes Typ
I oder Lupus erythematodes. Es sind mehr als 60 Autoimmunerkrankungen
bekannt und jedes Organsystem des Körpers kann von diesen
Erkrankungen betroffen werden. Das geschieht in der Regel dadurch,
dass durch das Immunsystem Antikörper gegen zelluläre Strukturen
gebildet werden. Im Falle von Lupus erythematodes können
das z. B. Histone, U1-RNPs oder die sauren P-Proteine der Ribosomen
sein. Es sind also in der Regel bestimmte Moleküle der
Zellen, die eine solche Immunreaktion hervorrufen. Der Körper bildet
dabei Abwehrstoffe (Antikörper) gegen diese körpereigenen
Moleküle, die dann bewirken, dass die Zellen, die diese
Moleküle enthalten, zerstört werden.
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Bisherige
Therapien beruhen vor allem darauf, dass das Immunsystem des Körpers
unterdrückt wird. Dafür verwendet man verschiedene
Medikamente, wie z. B. Kortison, Aspirin-Abkömmlinge, Immunsuppressiva
oder Zellgifte. Einige jüngere Therapieansätze
basieren auf Apherese-Behandlungen, um das Blut von den krankheitsverusachenden
Bestandteilen zu reinigen, auf Stammzelltransplantationen, um die
zerstörten Zellen zu ersetzen bzw. das Blutbildungssystem
zu erneuern, oder auf gentechnologischen Strategien. Diese noch
nicht etablierten Therapien sind jedoch nicht ohne Risiko oder Belastungen
für den Patienten und ihre Langzeitwirkungen noch nicht
geklärt. Die derzeit hauptsächlich angewandte
Therapie besteht daher nach wie vor in der Unterdrückung
des körpereigenen Immunsystems mit all ihren Nebenwirkungen.
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Vor
diesem Hintergrund wären neue Ansätze zur Bekämpfung
von Autoimmunerkrankungen sehr wünschenswert und der vorliegenden
Erfindung liegt insbesondere die Aufgabe zugrunde, neue Mittel und Methoden
bereitzustellen, welche die Bekämpfung von Autoimmunerkrankungen
in solchen neuen Therapieansätzen ermöglichen.
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Diese
Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst durch
die Bereitstellung des therapeutischen Zusammensetzung nach Anspruch
1 und der Herstellungsverfahren nach Anspruch 4, 6 und 13 sowie
der Vorrichtung zur Durchführung dieser Verfahren nach
Anspruch 16. Weitere spezielle oder bevorzugte Ausführungsformen
der Erfindung sind Gegenstand der abhängigen Ansprüche.
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Der
neue Therapieansatz, welcher der vorliegenden Erfindung zugrunde
liegt, beinhaltet einen neuartigen Wirkmechanismus.
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Wie
die Erfinder feststellen konnten, ist es möglich, das Blutserum
von autoimmun-erkrankten Patienten zu verwenden, um damit (extrakorporal) die
Zielmoleküle (Auto-Antigene) zu binden (4). Ausgehend
von diesem Befund, kamen die Erfinder zu der Schlussfolgerung, dass
auch der umgekehrte Vorgang möglich sein sollte, d. h.
vermittels der Antigene die autoaggressiven Antikörper
zu binden, die im Serum eines Individuums mit einer Autoimmunerkrankung
oft einen hohen Titer aufweisen, und sie damit unschädlich
zu machen. Diese Bindung könnte sowohl extrakorporal (zur
Entfernung der autoaggressiven Antikörper) als auch intrakorporal
(zur Neutralisation der autoaggressiven Antikörper) erfolgen.
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Das
neue Therapiekonzept besteht also darin, bei Patienten mit Autoimmunerkrankungen
in einem ersten Schritt zu bestimmen, welche körpereigenen
Moleküle attackiert werden, indem man ihr antikörperhaltiges
Blutserum zu deren Bindung und Sichtbarmachung verwendet. Diese
generische Bestimmung des Antigens ist für die hier vorgestellte Methode
hinreichend; eine exakte Identifizierung des Zielantigens ist nicht
erforderlich.
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Im
nächsten Schritt werden diese Antigene dann in größeren
Mengen extrakorporal produziert und isoliert und zur Herstellung
einer antigen-enthaltenden therapeutischen Zusammensetzung verwendet.
Diese Zusammensetzung kann dem Patienten in geeigneten Dosen appliziert
(z. B. injiziert) werden, um damit das Immunsystem auf einen Abbau
dieser injizierten Moleküle zu beschränken und
so die Zellen zu schützen, die diese Moleküle
besitzen. Es ist auch möglich, die so gewonnenen Zielmoleküle
(Antigene) einzusetzen, um damit das Blut bei der Apherese von auto-agressiven
Antikörpern zu reinigen.
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Da
diese Zielmoleküle entweder spezifisch von bestimmten Zelltypen
produziert werden (z. B. Beta-Zellen bei Diabetes Typ 1) oder allgemeiner
Natur sind, benötigt man ein System, dass diese Zellen herstellen
kann, bzw. Zellen, die das Antigen produzieren. Eine Möglichkeit
wäre die synthetische Herstellung oder die allogene oder
xenogene Herstellung dieser Zielmoleküle in anderen Säugern.
Eine weitere grundsätzliche Möglichkeit wäre
die Herstellung dieser Substanzen in einem in vitro Translationsystem
oder über biotechnologische Verfahren mit gentechnisch
veränderten Organismen (Milch, E. coli, Pflanzen).
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Die
Methode der Wahl ist allerdings eine autologe Herstellung dieser
Zielsubstanzen. Dazu könnten z. B. nach herkömmlicher
Weise Biopsien der jeweils betroffenen Organsysteme des Patienten verwendet
werden.
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Die
erfindungsgemäß bevorzugte Methode besteht jedoch
in der Verwendung adulter Stammzellen, insbesondere glandulärer
Stammzellen aus Drüsengewebe, wie z. B. in
EP 04 726 508.7 beschrieben. Dies
hat einerseits den Vorteil, dass diese Zellen in verschiedene spezialisierte
Zelltypen differenziert werden können, andererseits können
diese Zellen über einen langen Zeitraum in Kultur gehalten
und vermehrt werden und vor allem bei Patienten mit schubweisen
Erkrankungen bei jedem Schub erneut zur Produktion der injizierbaren
Antigene verwendet werden, ohne dass weitere Biopsien notwendig
würden. Somit kann für solche Patienten eine persönliche
Antigen-„Reserve" angelegt werden, die im Falle eines erneuten
Schubs zum Einsatz kommen kann.
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Das
geschilderte Verfahren ist vorzugsweise vollkommen autolog; sowohl
die Stammzellen, bzw. das Antigen, als auch die Antikörper
stammen von dem erkrankten Patienten. Dadurch werden Komplikationen,
die durch andere Immunreaktionen auftreten können, weitgehend
vermieden und gleichzeitig kann auf Tierversuche verzichtet werden.
Das Verfahren eignet sich auch zur folgenden künstlichen Produktion
von Epitopen (z. B. rekombinant). Überdies sind die gewonnenen
Antikörper als Diagnostikum nutzbar.
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Somit
umfasst die vorliegende Erfindung in einem Aspekt ein Verfahren
zur Herstellung einer therapeutischen Zusammensetzung zur Behandlung einer
Autoimmunerkrankung bei einem Individuum, umfassend die Bereitstellung
einer Zusammensetzung, die mindestes ein Autoimmunreaktionen auslösendes Antigen
enthält, wobei die antigen-enthaltende Zusammensetzung
unter Verwendung von Gewebe und Antikörpern des zu behandelnden
Individuums mit einer Autoimmunerkrankung hergestellt wird. Vorzugsweise
handelt es sich bei dem verwendeten Gewebe um stammzellen-enthaltendes
oder stammzellen-bildendes Gewebe.
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Ein
typisches Verfahren zur Herstellung einer Zusammensetzung, die mindestens
ein Autoimmunreaktionen auslösendes Antigen enthält,
unter Verwendung von Antikörpern mit Spezifität
für das Autoimmunreaktionen auslösende Antigen
und stammzellen-bildendem oder stammzellen-enthaltendem Gewebe eines
Individuums mit einer Autoimmunerkrankung, umfasst die Schritte:
- a) Immobilisieren der Antikörper mit
Spezifität für das Autoimmunreaktionen auslösende
Antigen in einer Trägermatrix;
- b) Bereitstellen einer Zusammensetzung, die mindestens ein Autoimmunreaktionen
auslösendes Antigen enthält, durch Gewinnung aus
einer Zellkultur, die aus Stammzellen, erhalten aus dem stammzellen-bildenden
oder stammzellen-enthaltenden Gewebe des Individuums mit einer Autoimmunerkrankung,
abgeleitet ist;
- c) Kontaktieren der antigen-enthaltenden Zusammensetzung aus
Schritt b) mit den in Schritt a) erhaltenen immobilisierten Antikörpern
gegen das Antigen und selektives Binden des Antigens an die immobilisierten
Antikörper;
- d) Freisetzen des gebundenen Antigens von den immobilisierten
Antikörpern in der Trägermatrix;
- e) Gewinnen des freigesetzten Antigens und Herstellen einer
Zusammensetzung, welche das Antigen in einer gewünschten
Konzentration enthält.
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In
einer spezielleren Ausführungsform umfasst das Verfahren
die Schritte:
- a) Identifizieren von Antikörpern
mit Spezifität für das Autoimmunreaktionen auslösende
Antigen im Serum des Individuums mit einer Autoimmunerkrankung durch
spezifische Bindung an das Antigen und Nachweis der Bindung durch
eine spezifische Markierung und/oder Nachweisreaktion;
- b) Isolieren dieser Antikörper und Immobilisieren in
einer Trägermatrix;
- c) Gewinnen von Stammzellen aus dem stammzellen-bildenden oder
stammzellen-enthaltenden Gewebe und Etablierung einer Stammzellkultur von
dem Gewebe;
- d) Spontanes oder gerichtetes Differenzieren der Stammzellen
in einen Zelltyp, der das/die Autoimmunreaktionen auslösende
Antigen(e) produziert;
- e) Lysieren der antigen-produzierenden Zellen; und
- f) Kontaktieren des antigen-enthaltenden Lysats mit den in Schritt
b) erhaltenen immobilisierten Antikörpern gegen das Antigen
und selektives Binden des Antigens an die immobilisierten Antikörper;
- g) Freisetzen des gebundenen Antigens von den immobilisierten
Antikörpern in der Trägermatrix;
- h) Gewinnen des freigesetzten Antigens und Herstellen einer
Zusammensetzung, welche das Antigen in einer gewünschten
Konzentration enthält.
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Bei
der mit den obigen Verfahren hergestellten Zusammensetzung handelt
es sich vorzugsweise um eine therapeutische Zusammensetzung, die
zur Verabreichung an dasselbe Individuum, von dem das Serum und
das stammzellen-bildende oder stammzellen-enthaltende Gewebe stammt,
bestimmt ist, oder kann durch Zugabe üblicher Exzipienten,
Puffer und Hilfsstoffe zu einer solchen therapeutischen Zusammensetzung
formuliert werden.
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Die
erfindungsgemäße therapeutische Zusammensetzung
zur Behandlung einer Autoimmunerkrankung bei einem Individuum umfasst
also eine Zusammensetzung, die ein oder mehrere Autoimmunreaktionen
auslösende(s) autologe Antigen(e) in einer therapeutisch
wirksamen Menge in einem physiologisch annehmbaren Medium enthält.
Eine therapeutisch wirksame Menge des Antigens bzw. der Antigene
ist dabei in der Regel diejenige Menge, welche die für
das/die Autoimmunreaktionen auslösende(n) autologe(n) Antigen(e)
spezifischen Antikörper im Blut oder Körper des
Individuums mit einer Autoimmunerkrankung ganz oder teilweise neutralisiert.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform liegt die therapeutische
Zusammensetzung in einer zur Injektion geeigneten Form vor und ist
dafür vorgesehen.
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Ein
weiterer spezieller Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein
Verfahren zur Herstellung einer Immunaffinitätsmatrix mit
immobilisierten Antikörpern gegen mindestens ein Zielantigen,
die in den obigen Verfahren eingesetzt werden kann.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform dieses Verfahrens unter
Verwendung von Serum eines Individuums mit diesen Antikörpern
umfasst es die folgenden Schritte:
- a) Herstellen
einer antigen-enthaltenden Proteinzusammensetzung;
- b) Auftrennen der antigen-enthaltenden Proteinzusammensetzung
in einer Trenngelmatrix;
- c) Übertragen der aufgetrennten Proteine mittels Elektrophese
durch eine zweite Matrix auf eine Blottingmembran;
- d) Identifizieren von mindestens einem Zielantigen auf der Membran
durch Bindung an spezifische Antikörper und Nachweis der
Bindung durch eine spezifische Markierung und/oder Nachweisreaktion;
- e) Zuordnen der Position eines Zielantigens auf der Blottingmembran
zu einem Bereich in der zweiten Matrix, in dem sich das Antigen
während der zweiten Elektrophorese aufhält;
- f) Abtrennen der nicht antigen-enthaltenden Bereiche der zweiten
Matrix;
- g) Kontaktieren des antigen-enthaltenden Bereichs der zweiten
Matrix mit einer antikörper-enthaltenden Zusammensetzung
aus dem Serum eines Individuums mit spezifischen Antikörpern
gegen das Zielantigen;
- h) Selektive Bindung der antigen-spezifischen Antikörper
an das mindestens eine Zielantigen in der Matrix und Elution der
unspezifischen Antikörper;
- i) Auflösen der Antigen-Antikörperbindung
und Abtrennen der Antigene durch Elution, während die Antikörper
gleichzeitig oder anschließend gleichmäßig
in der Matrix verteilt werden;
- j) Zugabe eines Vernetzungsmittels zur Vernetzung der spezifischen
Antikörper mit der zweiten Matrix, wodurch die Immunaffinitätsmatrix
gebildet wird
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Die
antigen-enthaltende Proteinzusammensetzung in Schritt a) dieses
Verfahrens ist vorzugsweise ein Zelllysat von antigenproduzierenden
Zellen, die durch Differenzierung aus einer Stammzellkultur wie
oben oder unten beschrieben erhalten wurden.
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Das
Auflösen der Antikörperbindung („Strippen"
der Antikörper) in Schritt i) erfolgt z. B. mit 200 mM
Glycin, pH 2.5, bei 0°C.
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Andere
geeignete Verfahrensweisen sind dem Fachmann grundsätzlich
bekannt und können an die jeweiligen speziellen Anforderungen
angepasst werden. Das Verteilen der Antikörper in der Matrix
kann z. B. durch Anlegen einer Gleichspannung wechselnd in beide
Richtungen oder durch sanftes Spülen erfolgen.
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Die
Vernetzung in Schritt j) kann durch irgendein dem Fachmann bekanntes
geeignetes Vernetzungsmittel, beispielsweise durch Glutaraldehyd oder
einen anderen Dialdehyd oder Bindung an eine durch CNBr, Epoxy oder
NHS aktivierte Matrix erfolgen.
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Erfindungsgemäß besonders
bevorzugt ist das mindestens eine Zielantigen ein Autoimmunreaktionen
auslösendes Antigen, das Serum stammt von einem Individuum
mit einer Autoimmunerkrankung und die Stammzellkultur ist aus Gewebe
desselben Individuums mit einer Autoimmunerkrankung abgeleitet.
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Das
stammzellen-bildende oder stammzellen-enthaltende Gewebe, das in
den Verfahren zur Herstellung einer antigen-enthaltenden Zusammensetzung
oder in dem Verfahren zur Herstellung einer Immunaffinitätsmatrix
der vorliegenden Erfindung eingesetzt wird, ist vorzugsweise Drüsengewebe, insbesondere
exokrines Drüsengewebe, z. B. acinäres Drüsengewebe.
Verfahren zur Gewinnung und Kultivierung von geeigneten adulten
Stammzellen, insbesondere pluripotenten adulten Stammzellen, die
in Zellen aller drei Keimblätter differenzieren können,
sind in
EP 04 726 508.7 beschrieben.
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Die
zu behandelnde Autoimmunerkrankung kann z. B. Lupus erythematosus,
Diabetes Typ I, Morbus Crohn, Psoriasis, Neurodermitis oder Multiple
Sklerose sein, ist jedoch nicht darauf beschränkt, sondern
kann auch irgendeine derzeit bekannte oder noch unbekannte Autoimmunerkrankung
sein.
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Die
erfindungsgemäße Produktion von Auto-Antigenen
wird erleichtert, wenn das oder die relevante(n) Antigen(e) bereits
bekannt ist/sind. Dies ist bei einer Reihe von verbreiteten Automimmunerkrankungen
der Fall. Beispielweise kann bei Lupus erythematodes das Autoimmunreaktionen
auslösende Antigen z. B. ein Histon, U1-RNP oder ein saures
ribosomales P-Protein sein.
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Es
ist jedoch ebenfalls möglich, das oder die Autoimmunreaktionen
auslösende Antigen(e) durch z. B. Bindung an Antikörper,
die im Blut des Patienten mit hohem Titer vorliegen, zu identifizieren,
wie bereits oben ausgeführt. Einen weiteren wesentlichen Aspekt
der vorliegenden Erfindung bilden Vorrichtungen zur Herstellung
einer Immunaffinitätsmatrix und/oder zur Verwendung in
einem erfindungsgemäßen Verfahren zur Herstellung
einer antigen-enthaltenden Zusammensetzung.
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Zweck
der nachfolgend beschriebenen Vorrichtungen ist es, einen Großteil
der in vorliegenden Anmeldung beschriebenen analytischen und präparativen
Verfahrensschritte – ausgehend von einer rohen antigen-enthaltenden
Zusammensetzung, z. B. einem Zelllysat, und einer antikörper-enthaltenden Zusammensetzung,
z. B. autologem Serum – mit einer einzigen Apparatur ("Kit")
zu bewerkstelligen.
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Im
Wesentlichen besteht die Vorrichtung aus zwei senkrecht zueinander
angeordneten Elektrophorese-Laufstrecken und zwei verschiedenen
Matrices, in denen die geladenen Proteine gezielt verteilt werden.
Die erste Elektrophorese dient der Auftrennung der Proteine aus
der antigen-enthaltenden Zusammensetzung nach der Größe
(in einem denaturierenden Gel) oder nach dem isoelelektrischen Punkt
(in einem nichtdenaturierenden Gel)(3a). Die
zweite Elektrophorese dient der Übertragung der aufgetrennten
Proteine auf eine Blottingmembran. Auf der Blottingmembran kann
das gesuchte Antigen oder die gesuchten Antigene durch Bindung an spezifische
Antikörper (z. B. aus der Serum des Patienten identifiziert
werden. (3b).
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Die
Information über die Position des Ziel-Antigens auf der
Blottingmembran, welche wiederum die Position(en) des Antigens in
der zweiten Elektrophoresematrix reflektiert, kann dazu verwendet
werden, den antigen-enthaltenden Abschnitt dieser Matrix zu isolieren
und nur diesen Abschnitt zur Bindung von spezifischen Antikörpern
gegen das Zielantigen zu verwenden (3c).
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In
einem weiteren Schritt kann die Antigen-Antikörper-Bindung
wieder aufgelöst werden, z. B. mit Hilfe eines Stripping-Reagenzes
(z. B. Glycin, pH 2,5, bei 0°C)(3d),
und durch Anlegen einer Spannung und Spülen der Matrix
können die restlichen negativ geladenen Proteine (einschließlich Zielantigen(e)
aus der zweiten Matrix eluiert und die basischen Antikörper
gleichmäßig in der Matrix verteilt werden. Durch
Zugabe eines Vernetzungsreagenzes kann/können der/die für
das Zielantigen spezifische(n) Antikörper an die zweite
Matrix gebunden werden (3e).
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Auf
diese Weise wird eine Immunaffinitätssäule mit
antigenspzifischen Antikörpern hergestellt, die zur Reinigung
und Isolierung von Zielantigen(en) aus einer antigen-enthaltenden
Zusammensetzung, z. B. aus dem oben genannten Zelllysat, verwendet werden
kann.
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Ein
wesentliches Merkmal dieser erfindungsgemäßen
Vorrichtung ist die direkte Kopplung einer Gelchromatographiesäule
mit einer porösen Matrix, die einerseits zunächst
analytisch und später präparativ direkt als Immunaffinitätssäule
genutzt werden kann.
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Eine
erfindungsgemäße Vorrichtung zur Herstellung einer
Immunaffinitätsmatrix umfasst in einer Ausführungsform:
- – eine Proteintrenneinrichtung mit
einem Proteintrennungsgel, das zur Trennung einer Proteinzusammensetzung
in Proteinfraktionen eingerichtet ist, und
- – eine Blottingeinrichtung mit einer Blottingmembran,
die zur Aufnahme mindestens eines Teils der Proteinfraktionen von
dem Proteintrennungsgel eingerichtet ist,
- – eine Trägereinrichtung mit einer porösen
Trägermatrix, die zwischen dem Proteintrennungsgel und
der Blottingmembran angeordnet und zur Übertragung mindestens
eines Teils der Proteinfraktionen von dem Proteintrennungsgel zu
der Blottingmembran eingerichtet ist, wobei
- – die Trägermatrix aus einem Material besteht, das
die Proteinfraktionen von dem Proteintrennungsgel unter den Übertragungsbedingungen nicht
weiter auftrennt und zur Immobilisierung von Antikörpern
geeignet ist, und die Trägermatrix zur Bildung der Immunaffinitätsmatrix
eingerichtet ist. Die Trägermatrix sollte für
Proteinlysate, die das gewünschte Protein enthalten, durchlässig
sein.
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Vorteilhafterweise
werden in dieser Vorrichtung die Proteintrennungsstrecke in der
Proteintrenneinrichtung und die Proteinübertragungsstrecke
zur Blottingmembran senkrecht zueinander liegen.
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Zur
Separierung des Proteintrennungsgels und der porösen zweiten
Trägermatrix ist dazwischen vorzugsweise eine wasserundurchlässige,
nicht-leitende, entfernbare Membran angeordnet, die nach dem ersten
Proteinauftrennungschritt entfernt wird, so dass die Übertragung
der aufgetrennten Proteine auf die Blottingmembran erfolgen kann.
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Als
Material für die Gelchromatographie/Gelektrophorese im
ersten Elektrophoreseschritt kommen grundsätzlich alle
Materialien in Frage, die für die Gelektrophorese von Proteinen
und Peptiden im Stand der Technik bekannt sind. Typischerweise handelt
es sich dabei um ein Material auf Polyacrylamid-, Stärke-
oder Agarosebasis.
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Die
Gelelektrophorese kann unter denaturierenden oder nicht-denaturierenden
Bedingungen nach etablierten Protokollen und in bekannten Pufferlösungen
durchgeführt werden. Für die denaturierende Elektrophorese,
welche in der Regel bevorzugt sein wird, ist ein typischer Laufpuffer
beispielsweise eine Mischung aus 3 g TRIS (2-Amino-2-(hydroxymethyl)-propan-1,3-diol),
14.4 g Glycin + 1 g SDS (Natriumdodecylsulfat) in 1 l Wasser.
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Das
Material der porösen Trägermatrix kann jedes bekannte
Material sein, das einerseits die Übertragung der aufgetrennten
Proteinfraktionen auf die Blottingmembran ohne weitere Trennung
ermöglicht und anderseits als proteinophiles Ausgangsmaterial
für eine Immunaffinitätsmatrix geeignet ist, insbesondere
auch zur Immobilisierung von Antikörpern mit Hilfe eines
geeigneten Vernetzungsmittels. Vorzugsweise ist das Material aus
einer der folgenden Materialgruppen gewählt: Nylon, Nitrocellulose,
Dextran, Sepharose (evtl. zur nachfolgenden Vernetzung CNBr-, Epoxy-
oder NHS-aktiviert), Polyurethan oder Cellulose (evtl. mit Polyethylenimid
beschichtet). Die Konstitution des Materials ist variabel. Es kann
sich z. B. um festes, membranöses, gelartiges, schwammartiges
oder filzartiges Material handeln.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform ist die Vorrichtung dadurch
gekennzeichnet, dass die poröse Trägermatrix aus
mehreren übereinander liegenden Schichten aufgebaut ist.
Dies ermöglicht eine leichtere Abtrennung des antigen-enthaltenden
Bereichs von den anderen Bereichen, indem nur die Schichten mit
dem Antigen oder den Antigenen für die weiteren Schritte
verwendet werden.
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Das
Vernetzungsmittel kann irgendein im Stand der Technik zur Immobilisierung
von Proteinen bekanntes Vernetzungsmittel sein. Vorzugsweise ist das
Vernetzungsmittel aus der Gruppe der Dialdehyde bzw. der CNBr-,
Epoxy- oder NHS-Aktivatoren ausgewählt.
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Zur
leichteren Regeneration oder Anpassung an verschiedene Betriebsbedingungen,
z. B. Isolierung verschiedener Zielantigen mit unterschiedlicher
Größe und Eigenschaften, ist die erfindungsgemäße
Vorrichtung vorzugsweise so aufgebaut, dass das Proteintrennungsgel
und/oder die poröse Matrix entnehmbar oder austauschbar
sind.
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Die
Vorrichtung kann ferner noch eine integrierte oder separate Spüleinrichtung
und/oder eine Beobachtungseinrichtung umfassen.
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In
den Figuren der Zeichnung werden eine zylinder- und eine quaderförmig
ausgeführte Version der Vorrichtung (2a und 2b)
beispielhaft illustriert; alternative Anordnungen sind jedoch für
den Fachmann unschwer ersichtlich und ebenfalls geeignet.
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Figurenbeschreibung
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1 zeigt
schematisch eine beispielhafte Vorgehensweise zur Herstellung eines
erfindungsgemäßen körpereigenen Antigen-Präparats
und zur Behandlung von Autoimmunerkrankungen. Dieses Schaubild zeigt
zum besseren Verständnis nicht nur die eigentlichen Schritte
zur Herstellung der erfindungsgemäßen antigen enthaltenden
Zusammensetzung, sondern auch vor- und nachgelagerte Schritte, die
z. B. Teil eines Behandlungsverfahrens sind.
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2 illustriert zwei beispielhafte Ausführungsformen
einer erfindungsgemäßen Vorrichtung zur Herstellung
einer Immunaffinitätsmatrix und/oder zur Herstellung einer
antigenenthaltenden Zusammensetzung.
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2a zeigt
eine zylindrische Vorrichtung, welche umfasst:
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- a
- eine
innere Elektrode
- b
- ein
Proteintrennungsgel
- c
- eine
wasserundurchlässige, nichtleitende, entfernbare Membran
- d
- eine
durch die Membran von c) von dem Proteintrennungsgel getrennte Trägermatrix
zur Übertragung von im Proteintrennungsgel aufgetrennten
Proteinen auf eine Blottingmembran und zur Immobilisierung von Antikörpern
in dieser Trägermatrix
- e
- eine
Blottingmembran
- f
- eine äußere
Elektrode
- g
- einen
Isoliermantel
- h
- eine
Deckelektrode
- i
- einen
isolierten Deckel
- j
- eine
Bodenelektrode
- k
- einen
isolierten Boden.
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2b zeigt
eine quaderförmige Vorrichtung mit den Komponenten a) bis
f) wie in 2a angegeben.
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3a–3e zeigt
schematisch die wichtigsten Schritte bei der Herstellung einer Immunaffinitätsmatrix,
die zur Herstellung einer autoantigen-enthaltenden Zusammensetzung
verwendet werden kann.
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4 zeigt
den Nachweis der Bindung von humanem Serum eines Patienten mit Lupus
erythematosus an saure ribosomale humane Proteine (Feld a). Eine
Parallelfärbung mit Antiköpern gegen Vigilin, ein
ribosomen-assoziiertes Protein, zeigt das gleiche Bindungsmuster
(Feld b), was belegt, dass das Antiserum an ribosomen-assoziierte
Proteine bindet. Im Immunoblot konnte mit dem gleichen Serum eine deutliche
Anfärbung ribosomaler P-Proteine gezeigt werden (Feld c),
was belegt, dass Antikörper aus diesem Serum an diese Proteine
binden.
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ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur
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- - EP 04726508 [0011, 0026]