DD145705A1 - Herstellungsverfahren von organspezifischen retrovirusimmunpraeparaten fuer prophylaxe,therapie und diagnostik - Google Patents

Abstract

Das Herstellungsverfahren von organspezifischen Retrovirusimmunpräparaten für Prophylaxe, Therapie und Diagnostik ist anwendbar auf dem Gebiet der Humanmedizin und ist dadurch gekennzeichnet, daß in befallenen Organen und Geweben bzw. ihren Tumoren ent haltene Retroviren direkt oder nach Zwischenschaltung von Zellkulturpassagen angereichert und gereinigt werden und daß die wirksamen, aber unschädlichen bzw. inaktivierten Virusbestandteile als organspezifisches Prophylaktikum, Therapeutikum bzw. Diagnostikum zur spezifischen serologischen und organspezifischen Diagnostik zellvermittelter Immunreaktionen bei durch Retroviren bedingten Infektionen (Geschwülste) des Menschen einsetzbar sind.

Description

Herstellungsverfahren von organspgzif_ischen Retrovirtisimmun-. präparaten für Prophylaxe, Therapie und Diagnostik

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft die massenweise, hochgereinigte'-Gewinmmg von humanen Retroviren aus erkrankten Geweben, Organen und deren Tumoren einschließlich ihrer Züchtung in Warmblüter-. zellkultur en. Die Erfindung betrifft'weiter die Anwendung der gewonnenen virushaltigen Immunpräparate zur organspezif !.sehen Diagnostik und Therapie, der durch Retroviren induzierten Infektionen des Menschen»

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

Die in der Patentanmeldung A 61 K/214 631 "Verfahren zur Herstellung von Immunpräparaten gegen Geschwulstkrankheiten" geschützten Erfindungen haben zum Ziel, Infektionen und Geschwülste, die durch Retroviren ausgelöst v/erden, zu bekämpfen« Die Wirksamkeit der ^iren beruht auf ihrer außerordentlich großen Interspeziesverwandtschaft. Diese gestattet es, die Retrovirusinfektion des GesamtOrganismus, zu diagnostizieren, .zu therapier en oder Prophylaxe zu üben« Ein zusätzlicher gewe"bs- oder organspezifischer Effekt ist nicht vorhanden«

Ziel der Erfindung -

Der nützliche Effekt bei der Anwendung der Erfindung, der im Vergleich zu den bereits bekannten Lösungen erreicht wird.,- besteht in Folgendem: Die Retroviren werden aus erkrankten Geweben und Organen bzw.

deren Tumoren oder über Zwischenschaltung von Warmbluterzellkulturpässagen gewonnen-, gereinigt, konzentriert und zu einem Immunpräparat aufgearbeitet, wobei die spesifische Dichte dieser Viren 1,Ί6 bis 1/18 g/ml beträgt und Berücksichtigung findet.. Das'Präparat wird auf Reinheit: geprüft.

Dem Herstellungverfahren liegt die Absicht zugrunde, das gesamte Virus mit allen virus- und herkunftsspesifischen Strukturen zu erhalten« Der bedeutendste Vorzug dieses Torgehens besteht darin, die diagnostische und therapeutische Spesifitat nicht nur für eine Retrovirusinfektion einzusetzen, sondern die Retrovirusinfektion eines bestimmten Organs oder Organsystems des Menschen, zu erkennen und zu behandeln.

Wesen der Erfindung .

Die Retroviren besitsen auf ihrer Oberfläche nicht nur die zu -0 ihrer Virusart (Typ, Gruppe, Familie) gehörenden Strukturen (Antigene), sondern sie entnehmen den- Organen und Herkunfts-~ gewöben, d.h. ihrem "Vecrihehrüngsort spesifische Strükturelemen.t€ (Antigene). Somit sind die Retroviren auch den Zellober— flächen ihres Herkunftsortes entigenverv/andt.

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Bei dem angewandten Verfahren zur Gewinnung und Reinigung der Retroviren werden alle Retrovirusoberflächenstrukturen erhalten und ermöglichen die organspezifische Anwendung der Immunpräparate,' vorausgesetzt, daß Retroviruspräparationen entsprechend ihres Herkunftsgewebes, d.h. organspezifisch eingesetat werden« .

Es wurde gefunden, daß mit Hilfe von Anreicherungs- und Reinigungsverfahren einschließlich der Dichtegradientenzentrifugatiön und Chromatographie, Retroviren des Menschen zu hochgereinigten Immunpräparaten aufbereitet werden können· Für die Gewinnung dieser Viren werden infizierte Gewebe, Organe und deren Tumoren des Menschen verwendet. Die so gewonnenen Immunpräparate können direkt isoliert oder nach Zwischenschaltung von V/armblüterzellkulturpassagen gewonnen werden, . . '.. ' . ' . .' ' .

Es wurde weiter gefunden, daß .nach Anwendung gebräuchlicher Reinigungsverfahren das ungeschädigte Virus.mit einer speai-' fischen Dichte τοη 1,15 bis 1,18 g/ml gewonnen werden kann und nach Prüfung auf Reinheit mit Hilfe der Elektronenmikroskopie, inimunchemischer und anderer Verfahren als diagnostisches therapeutisches Immunpräparat mit hoher Gewebs— und Organ- bzw. Krankheitsspesifität zur Verfügung steht.

Die Anwendung kann erfolgen:

- sit und.ohne thermische Inaktivierung ...

- mit und ohne inaktivierende Zusätze

- mit und ohne Adjuvantien

-als komplettes.Virion oder als Mischantigen von immunisierenden· Virusbestandteilen bay/, als Präparat eines immunisierenden Virusbestandteiles . .. . , .

- als wässrige Suspension oder als I^ophilisat

Die aus infizierten Geweben, Organen und deren Tumoren gewönnenen Operationspräparate werden in der 10 fachen Menge einer gepufferten Lösung homogenisiert. Das Homogenisat wird zur Be™' seitigung Von Zellbestandteilen zentrifugiert und anschließend mit der Ultrazentrifuge "oder anderen geeigneten Verfahren weiter gereinigt und konzentriert. Nach Aufspaltung des Virions in seine antigenen Komponenten und deren Isolierung können diese für die organspezifische Tumordiagnostik eingesetzt werden«

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Ausführungsbeispiele ^:

· Das Retrovirus der Harnblasenpapillomatose und des Harnblasenkarzinoms des Menschen sowie das Retrovirus des Prostatakarzinoms des Menschen v/erden aus Operations-· präparieren gewonnen.. Die-Präparate werden sofort nach der Entnahme aufgearbeitet oder im tiefgefrorenen Zustand "bis zur "Verarbeitung gelagert,

Die Präparate werden in der 10 fachen Menge Tris-NaCl-

Puffer, pH 7,6 (0,05 M Tris, 0,15 M NaCl) im Eisbad ho-• mogenisiert und mindestens 4 Std. bei Kühlschranktemperatur eluiert. Der Zelldetritus wird durch Zentrifugation bei 7000 g und O⁰C für 15 Min, aus der virushaltigen Flüssigkeit entfernt. Die Virusflüssigkeit wird anschließend 2 Std, bei etwa 100 000 g und O⁰C zentrifugiert. Die Sedimente werden in Tris-lfeCl-Puffer, pH 7>6 im Yerhältnis zum Ausgangsmaterial 100-1000 fach angeredchert aufgenommen, homogenisiert und mindestens 4 Std. bei Kühlschranktemperatur eluiert. Das durch Ultrazentrifugation angereicherte Virus v/ird durch Dichtegradientenzentrifugation in Saccharose (10-50^) bei 25 000 U/Min, und 0°C im 3x5 ml-Rotor bzw. im 3x35 ml-Rotor einer VAC 602 (VEB Zentrifugenbau Engelsdorf) für 16-22 Std. einer v/eiteren Reinigung unterzogen.

Mittels Fraktionierung und Messung der UV-Adsorption · der einseinen Fraktionen im UV-Durchflußphotömeter Uvicord III bei 206 und 254 nm wird die virushaltige Dichteschiclit bestimmt und gewonnen. Die immunologisch wirk-. samen Bestandteile des Virus werden durch Aufspaltung in 8 M Harnstoff unter Zusatz von 0,05% Triton und anschließender chromatographischer Reinigung der einzelnen Proteinkomponehten gewonnen.

Die so hergestellten Antigene bzw. deren Antiseren können in markierter oder unmarkierter Form für die spezifische Diagnostik einer humoralen Immunität genannter Tumorerlirankungen eingesetzt werden. Als Antigene zur Ermittlung zellvermittelter Immunreaktionen sind sie zur . organspezifischen. Tumordiagnostik geeignet,.

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2· Zur Verwendung als Impfstoff für die spezifische Organtumortherapie, bei denen Erkrankungen durch eine Retrovirusinfektion vorliegen, wird Organmaterial wie unter Punkt 1 beschrieben aufgearbeitet. Das durch Aufspaltung in 8 1 Harnstoff unter Zusatz von 0,05% iüriton gewonnene Antigengemisch wird durch Zusatz von Formalin in einer Endkonzentration von 1:4000 inaktiviert. Zur Verwendung als Impfstoff wird die inaktivierte Virusflüssigkeit mit.oder ohne Zusatz von Adjuvanzien in Mengen von 5 ml in Ampullen abgefüllt und bei 4⁰C aufbewahrt. Die impfstoffprüfung auf Antigengehalt und Reinheit wird elektronenmikoskopisch nach Kegativkontrastierung mit ^hosphorwoIframsäure vorgenommen. Die serologische Identität wird mit spezifischen Hyperimmunseren unter Verwendung der einfachen radialen Immundiffusion nach EiAHCIlJI (MAN-CINI, 0.,CARBOMRA, A.O., u. HEREMAlTS, J.P.: Immunochem. 2 (1965), 235) oder der Überwanderungselektrophorese (nach J¹RISMEL, H. : Immunologische Arbeitsmethoden, VEB Gustav Fischer Verlag Jena, 1976) bestimmt. Die Sterilität wird nach den im AB 2 der DDR gegebenen Richtlinien durchgeführt. Die Unschädlichkeit wird im Tierversuch an Säuglingsmäu-seη, Meerschweinchen und Kaninchen bei verschiedenen Applikationsverfahren geprüft. Mit Antilymphozytenseren behandelte Mäuse dienen zum Ausschluß einer onkogenen Aktivität.

Claims (1)

1. Erfindungsanspruch

   !♦'Verfahren zur Herstellung von Präparaten zur spezifischen serologischen Diagnostik bzw, örganspesifischeEt Diagnostik zellvermittelter Ißimunreaktionen sowie zur parenteralen Applikation als Impfstoff bei Geschwulsterkrankungen des Menschenj die durch Retroviren verursacht werdenj -vornehmlich von Papillomatosen und Karzinomen der Harnblase und der Prostata, gekennzeichnet durch die Isolierung und Reinigung von humanen Retroviren direkt aus befallenen Organen und Geweben bzw« durch Ζγ/ischenschaltung von Zellkulturpassagen sowie durch ihre Verwendung als komplettes Virion bzw· als Gemisch seiner immunologisch aktiven Bestandteile oder als Präparat eines immunologisch aktiven Bestandteiles in konzentrierter oder unkonzentrierter Form mit Inaktivierungszusätzensowie mit oder ohne Adjuvantien,