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Verfahren zur Reinigung und Konzentrierung von lebendem Poliomyelitisvirus oder dem entsprechenden Antigenmaterial
Die vorliegende Erfindung betrifft eine verbesserte Herstellung von Poliomyelitis-Vaccine.
Die Herstellung von Poliomyelitis-Vaccinen umfasst verschiedene Stufen einschliesslich der Züchtung des lebenden Virus auf einem geeigneten Substrat, der Desaktivierung des lebenden Virus unter Bildung von Antigenmaterial, das den desaktivierten Virus enthält, und Reinigung des erwähnten Materials, wo- bei man das zur Verabreichung geeignete fertige Vaccine-Produkt erhält.
Es ist ein Ziel der vorliegenden Erfindung, ein verbessertes Verfahren zur Reinigung und bzw. oder
Konzentrierung eines Materials, das den lebenden oder desaktivierten Virus enthält, zu liefern, welches in jeder gewünschten Stufe der Vaccine-Produktion angewendet werden kann.
Gemäss der österr. Patentschrift Nr. 202274 wurde die Verwendung von Aluminiumphosphat als Ad- sorbens für Poliomyelitisviren vorgeschlagen. Aus dieser Druckschrift lässt sich jedoch nicht entnehmen, dass durch Ausführung der Adsorption des Virus oder desAntigen-Materialsunter bestimmten Bedingungen, wie sie die vorliegende Erfindung lehrt - nämlich aus saurem Medium - und anschliessende Eluierung unter wieder ganz bestimmten Bedingungen - nämlich unter Verwendung eines wässerig-alkalischen Eluierungsmediums-eine Reinigung des intermediär adsorbierten Materials von Verunreinigungen erzielt werden kann.
Schliesslich bietet das erfindungsgemässe Verfahren den weiteren, bisher nicht bekannten Vorteil, dass gleichzeitig mit der Reinigung eine Konzentrierung desMaterialserzieltwerden kann, indem man das Volumen des Eluiermittels niedriger hält, als jenes des wässerigen Mediums, aus welchem die Adsorption erfolgt.
Das erfindungsgemässe Verfahren zur Reinigung und Konzentrierung von lebendem Poliomyelitisvirus oder dem entsprechenden Antigenmaterial unter Verwendung von Aluminiumphosphat-Gel als Adsorbens ist somit dadurch gekennzeichnet, dass das lebende Virus oder das entsprechende Antigen-Material auf Aluminiumphosphat bei einem pH-Wert unter 7 aus einem wässerigen Medium adsorbiert wird und dass anschliessend das lebende Virus oder das Antigen-Material mittels eines wässerigen, vorzugsweise gepufferten Mediums bei einem pH über 7, vorzugsweise zwischen 8 und 11 eluiert und durch Verwendung eines kleineren Volumens an Eluierungsmittel als jenes des wässerigen Mediums, aus welchem die Adsorption erfolgte, gleichzeitig konzentriert wird.
Der pH, bei dem die Adsorption des lebenden Virus oder des Antigen-Materials stattfindet. hängt von dem angewendeten Virusstamm und von der anwesenden Menge Aluminiumphosphat ab. Im allgemeinen ist der maximale pH-Wert, bei dem die Adsorption erreicht werden kann, umso niedriger, je geringer die angewendete Aluminiumphosphatmenge ist. Die Variation des maximalen pH-Wertes, bei dem die Adsorption je nach den angewendeten Stämmen stattfindet, wird dadurch gezeigt, dass bei einem Virus vom Typ I ein pH von unter 5,8 wünschenswert ist, während mit den Typen II und III die Adsorption vorzugsweise bei einem pH von weniger als 6, 8 durchgeführt wird, obwohl pH-Werte von weniger als jeweils 6, 5 und 6,0 wünschenswert sind..
Bei Verwendung eines Virus vom Typ I liegt der bevorzugte PH bei 4, 7-5, 2, während für die Typen II und III der bevorzugte pH bei 5, 0-5, 5 liegt. Die pH-Bereiche, die zur Adsorbierung von Anti-
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genen erforderlich sind, sind im allgemeinen dieselben wie für das lebende Virus, von dem das Antigen erhalten wurde. Innerhalb der bevorzugten pH-Bereiche erfolgt die Adsorbierung im wesentlichen vollstän- dig, und es wird zumindest eine teilweise Trennung von andern anwesenden Proteinen gewährleistet. Im allgemeinen kann bei pH-Werten unter 4,5, wobei die Adsorption des Virus oder Antigen-Materials vollständig sein kann, im wesentlichen die Gesamtmenge jedes andern anwesenden Proteins ebenfalls adsorbiert werden, wobei die Vorteile der Reinigung verlorengehen.
Eine Konzentrierung kann jedoch noch erreicht werden.
Das als Adsorbens angewendete Aluminiumphosphat wird vorzugsweise in Form eines frisch hergestellten Gels verwendet, das beispielsweise durch Vermischen einer Aluminiumchloridlösung mit einer Lösung von Trinatriumphosphat hergestellt wird, wobei das Gel von der überstehenden Flüssigkeit nach einer entsprechenden Zeit abgetrennt wird, z. B. durch Dekantieren oder Zentrifugieren der überstehenden Flüssig- keit. Die Konzentration desAlPO./mg des wie oben hergestellten Gels kann leicht durch Eindampfen einer Probe desselben zur Trockne und Bestimmung des Gewichtes des Rückstandes ermittelt werden.
Die Adsorption des Virus oder Antigens kann durch Zugabe einer solchen Gelmenge zu der das Virus oder das Antigen enthaltenden Flüssigkeit erreicht werden, dass die erforderliche Aluminiumphosphatkonzentration erhalten wird. Verschiedene Konzentrationen an Aluminiumphosphat können zur Adsorption
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sehr gute Ergebnisse werden im allgemeinen bei einer Konzentration von 0, 1 bis 1 mg AIPO/ml erhalten.
Die Adsorption wird gewöhnlich so bewirkt, dass Aluminiumphosphat in der virushaltigen Flüssigkeit verrührt wird, bis die Adsorption vollständig ist.
Die Eluierung wird vorzugsweise bei einem PH über 8 durchgeführt. Geeignete Eluierungsmittel sind wässerige alkalische Lösungen, wie z. B. wässerige Lösungen von Alkalien, z. B. Alkali-und Erdalkali- hydroxyde,-carbonate und-bicarbonate, insbesondere Natrium- oder Kaliumhydroxyd oder-carbonat.
Gepufferte Lösungen werden im allgemeinen als Eluiermittel angewendet, und wässerige Lösungen von Dinatrium- oder Dikaliumhydrogenphosphat sind besonders geeignet. Ein bevorzugtes Eluierungsmittel ist eine 0, 2n-wässerige Lösung von Dinatriumhydrogenphosphat. Die Eluierung kann bei einem PH von etwa
10,5 bis 11 durchgeführt werden, jedoch werden darüberliegende pH-Werte vorzugsweise vermieden, da diese eine Schädigung des Virus oder Antigen-Materials verursachen können. Gegebenenfalls kann als Eluierungsmittel beispielsweise eine physiologische Kochsalzlösung oder ein Nährmedium angewendet werden, das auf den zur Eluierung erforderlichen PH-Wert eingestellt ist.
Eine im wesentlichen vollständige Eluierung kann durch Verwendung einer geringen Menge Flüssigkeit als Eluierungsmittel, im Vergleich zu der Flüssigkeitsmenge, aus der das Virus und bzw. oder das Antigen-Material adsorbiert wurde, erreicht werden, so dass dabei eine Konzentrierung der Aktivität erreicht wird.
Die Eluierung kann in jeder gewünschten Weise durchgeführt werden, es hat sich jedoch als vorteilhaft gezeigt, nur das Aluminiumphosphat, das die adsorbierte Substanz enthält, zu dem Eluiermittel zu geben, und die Mischung genügend lange stehenzulassen, damit eine Eluierung bewirkt wird, beispielsweise 0, 1 - 2 h und vorzugsweise 0, 25 - 0, 5 h. Die Eluierung kann durch Dispergierung des Adsorptionsmittels in dem Eluierungsmittel erleichtert werden, was z. B. durch Schütteln, Vermischen oder durch irgendeine andere gewünschte Methode erfolgt.
Das erfindungsgemässe Verfahren kann auf die Herstellung von Poliomyelitis-Vaccin von jeder Poliomyelitis-Virusart, wie z. B. Typ I, II oder III angewendet werden.
Das Verfahren kann in jeder geeigneten Stufe bei der Vaccinherstellung angewendet werden, entweder vor oder nach der Desaktivierung des Virus. Somit kann man die Viruskultur direkt dem erfindungsgemässen Verfahren, vorzugsweise nach Entfernung der Zellreste unterwerfen, um eine Konzentrierung und Reinigung des Virus zu erzielen. Man kann das erfindungsgemässe Verfahren auch auf die virushaltige Flüssigkeit anwenden, nachdem der Virus desaktiviert wurde, z. B. durch Behandlung mit Formaldehyd, wodurch eine Konzentrierung und Reinigung des Antigen-Materials erzielt wird.
Bei der Herstellung von Vaccinen ist eine der Hauptverunreinigungen in der. virushaltigen Flüssigkeit ein proteinartiges Material, das von dem tierischen Zellsubstrat herrührt, z. B. Nierenzellengewebe, das zur Züchtung des Virus verwendet wurde. Durch das erfindungsgemässe Verfahren ist es möglich, zumindest eine teilweise Trennung des lebenden Virus oder des entsprechenden Antigen-Materials von solchen proteinartigen Verunreinigungen zu erreichen, da das Virus oder das Antigen-Material in einem andern Mass als die proteinartigen Verunreinigungen auf dem Aluminiumphosphat adsorbiert bzw. von diesem eluiert werden.
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<tb> leichtPH <SEP> der <SEP> Vaccine <SEP> mg/ml <SEP> Überstehende <SEP> Flüssigkeit <SEP> Eluate
<tb> AIPO4-Suspen- <SEP> AIPO4 <SEP> (100 <SEP> ml) <SEP> (5 <SEP> ml)
<tb> sion <SEP> in <SEP> der <SEP> Mischung <SEP> Polio <SEP> M. <SEP> K. <SEP> Polio <SEP> M. <SEP> K. <SEP>
<tb>
4,5 <SEP> 1,0 <SEP> (konz. <SEP> x <SEP> 8) <SEP> 1/1 <SEP> (rein) <SEP> 1/1 <SEP> (rein) <SEP> 1/4 <SEP> (rein) <SEP> 1/32
<tb> 0. <SEP> 4 <SEP> (konz. <SEP> X <SEP> 30) <SEP> 1/1 <SEP> (rein) <SEP> 1/1 <SEP> (rein) <SEP> 1/5 <SEP> (rein) <SEP> 1/16
<tb> 0, <SEP> 1 <SEP> (konz. <SEP> X <SEP> 16) <SEP> 1/1 <SEP> (rein) <SEP> l/l <SEP> (rein) <SEP> 1/5 <SEP> (rein) <SEP> 1/16
<tb> 5,0 <SEP> 1,0 <SEP> (konz. <SEP> x <SEP> 17) <SEP> 1/1 <SEP> (rein) <SEP> 1/1 <SEP> (rein) <SEP> 1/4 <SEP> (rein) <SEP> 1/16
<tb> 0. <SEP> 4 <SEP> (konz. <SEP> X <SEP> 6) <SEP> 1/1 <SEP> (rein) <SEP> 1/1, <SEP> 5 <SEP> (rein) <SEP> 1/5 <SEP> (rein) <SEP> 1/1 <SEP>
<tb> 0, <SEP> 1 <SEP> (konz. <SEP> x <SEP> 11) <SEP> 1/1 <SEP> (rein) <SEP> 1/2 <SEP> (rein) <SEP> 1/4 <SEP> (rein) <SEP> 1/1
<tb> 5. <SEP> 5 <SEP> 1. <SEP> 0 <SEP> (konz.
<SEP> x <SEP> 11) <SEP> 1/1 <SEP> (rein) <SEP> 1/3 <SEP> (rein) <SEP> 1/4 <SEP> (rein) <SEP> 1/7 <SEP>
<tb> 0. <SEP> 4 <SEP> (konz. <SEP> x <SEP> 15) <SEP> 1/1 <SEP> (rein) <SEP> 1/4 <SEP> (rein) <SEP> 1/2 <SEP> (rein) <SEP> 1/1
<tb> 0. <SEP> 1 <SEP> (konz. <SEP> x <SEP> 30) <SEP> 1/2 <SEP> (rein) <SEP> 1/4 <SEP> (rein) <SEP> 1/1, <SEP> 5 <SEP> (rein) <SEP> 1/1.
<tb>
6, <SEP> 0 <SEP> 1,0 <SEP> (konz. <SEP> x <SEP> 10) <SEP> 1/2 <SEP> (rein) <SEP> 1/4 <SEP> (rein) <SEP> 1/1 <SEP> (rein) <SEP> 1/1
<tb> 0, <SEP> 4 <SEP> (konz. <SEP> X <SEP> 15) <SEP> 1/3 <SEP> (rein) <SEP> 1/4 <SEP> (rein) <SEP> 1/1 <SEP> (rein) <SEP> 1/1
<tb> 0, <SEP> 1 <SEP> (konz. <SEP> x <SEP> 17) <SEP> 1/3 <SEP> (rein) <SEP> 1/5 <SEP> (rein) <SEP> 1/1 <SEP> (rein) <SEP> 1/1
<tb> 10, <SEP> 0 <SEP> (konz. <SEP> X <SEP> 5) <SEP> 1/3 <SEP> (rein) <SEP> 1/4 <SEP> (rein) <SEP> 1/2 <SEP> (rein) <SEP> 1/2 <SEP>
<tb> 6,5 <SEP> 1,0 <SEP> (konz.x <SEP> 17) <SEP> 1/4 <SEP> (rein) <SEP> 1/6 <SEP> (rein) <SEP> 1/1 <SEP> (rein) <SEP> 1/1 <SEP>
<tb> 0, <SEP> 4 <SEP> (konz. <SEP> x <SEP> 25) <SEP> 1/6 <SEP> (rein) <SEP> 1/5 <SEP> (rein) <SEP> 1/1 <SEP> (rein) <SEP> 1/1
<tb> 0, <SEP> 1 <SEP> (konz.
<SEP> x <SEP> 5) <SEP> 1/1 <SEP> (rein) <SEP> 1/5 <SEP> (rein) <SEP> 1/1 <SEP> (rein) <SEP> 1/1
<tb> Ausgangsmaterial <SEP> (100 <SEP> ml) <SEP> konz.x <SEP> 5, <SEP> Polio <SEP> 1/1. <SEP> 7, <SEP> M. <SEP> K. <SEP> (rein) <SEP> 1/3
<tb>
Diese Ergebnisse zeigen, dass bei einem pH von 4,5 und 5,0 kein Poliomyelitis-Antigen in den überstehenden Flüssigkeiten gefunden werden konnte und dass das Antigen in den Eluaten praktisch quantitativ wiedergewonnen wurde. Ebenso wurde eine sehr beträchtliche Reinigung von Affennieren-Protein erreicht,
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angewendet wurden.
Beispiel 2 : Konzentrierung und Reinigung eines desaktivierten Maitlandzuchtvirus vom Typ III.
Die experimentellen Bedingungen waren ähnlich wie die von Beispiel 1. Es wurden 0, 4 mg/ml A1PO bei einem pH von 0,5 und 6,0 angewendet, und die Eluierung erfolgte mit 5 ml 0, Zögern NaHCOs.
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<tb>
<tb>
PH <SEP> der <SEP> Vaccine <SEP> mg/ml <SEP> Überstehende <SEP> Flüssigkeit <SEP> Eluate
<tb> AIPO4-Suspen- <SEP> AIPO4 <SEP> (100 <SEP> ml) <SEP> (5 <SEP> ml)
<tb> sion <SEP> in <SEP> der <SEP> Mischung <SEP> Polio <SEP> M. <SEP> K. <SEP> Polio <SEP> M. <SEP> K. <SEP>
<tb>
6,0 <SEP> 0,4 <SEP> (konz.x <SEP> 10) <SEP> 1/1,5 <SEP> (rein) <SEP> 1/2 <SEP> (rein) <SEP> 1/2 <SEP> (rein) <SEP> 1/4
<tb> 5, <SEP> 0 <SEP> 0, <SEP> 4 <SEP> (konz. <SEP> x <SEP> 20) <SEP> 1/1 <SEP> (rein) <SEP> 1/1 <SEP> (rein) <SEP> 1/16 <SEP> (rein) <SEP> 1/16
<tb> Ausgangsflüssigkeit <SEP> (100 <SEP> ml) <SEP> Polio <SEP> 1/6,(konz.x <SEP> 12), <SEP> M.K. <SEP> (rein) <SEP> 1/4
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<tb>
<tb> 3 <SEP> :
<SEP> Konzentrierungund <SEP> Reinigung <SEP> von <SEP> lebendem <SEP> MaitlandzuchtvirusPH <SEP> der <SEP> Vaccine <SEP> mg/ml <SEP> Überstehende <SEP> Flüssigkeit <SEP> Eluate
<tb> AIPO4-Suspen- <SEP> AIPO4 <SEP> (100 <SEP> ml) <SEP> (5 <SEP> ml) <SEP>
<tb> sion <SEP> in <SEP> der <SEP> Mischung <SEP> Polio <SEP> M. <SEP> K. <SEP> Polio <SEP> M. <SEP> K. <SEP>
<tb> 5, <SEP> 0 <SEP> 1, <SEP> 0 <SEP> (konz.) <SEP> 1/1 <SEP> (rein) <SEP> 1/2 <SEP> (rein) <SEP> 1/32 <SEP> 1/64
<tb> 0,4 <SEP> (konz. <SEP> x <SEP> 25) <SEP> 1/1 <SEP> (rein) <SEP> 1/1, <SEP> 5 <SEP> (rein) <SEP> 1/24 <SEP> 1/56
<tb> 0, <SEP> 1 <SEP> (konz. <SEP> x <SEP> 50) <SEP> 1/6 <SEP> (rein) <SEP> 1/4 <SEP> (rein) <SEP> 1/24 <SEP> 1/40
<tb> Ausgangsmaterial <SEP> (100 <SEP> ml) <SEP> Polio <SEP> 1/32 <SEP> (konz. <SEP> x <SEP> 25), <SEP> M. <SEP> K. <SEP> (rein) <SEP> 1/6 <SEP>
<tb>
Beispiel 4 :
Konzentrierung und Reinigung von lebendem Maitlandzuchtvirus vom Typ H.
Die experimentellen Bedingungen waren wie oben, die Eluierungen wurden mit 0, 2% NaHC03 durchgeführt.
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<tb>
<tb>
PH <SEP> der <SEP> Vaccine <SEP> mg/ml <SEP> Überstehende <SEP> Flüssigkeit <SEP> Eluate
<tb> AIPO4 <SEP> -Suspen- <SEP> AIPO4 <SEP> (100 <SEP> ml) <SEP> (5 <SEP> ml)
<tb> sion <SEP> in <SEP> der <SEP> Mischung <SEP> Polio <SEP> M. <SEP> K. <SEP> Polio <SEP> M. <SEP> K. <SEP>
<tb>
6, <SEP> 0 <SEP> 0, <SEP> 4 <SEP> (konz. <SEP> x <SEP> 7) <SEP> 1/1 <SEP> (rein) <SEP> 1/2 <SEP> (rein) <SEP> 1/4 <SEP> (rein) <SEP> 1/8
<tb> 0,1 <SEP> (konz.x <SEP> 12) <SEP> 1/1 <SEP> (rein) <SEP> 1/2 <SEP> (rein) <SEP> 1/4 <SEP> (rein) <SEP> 1/4
<tb> 5, <SEP> 0 <SEP> 0, <SEP> 4 <SEP> (konz. <SEP> x <SEP> 12) <SEP> 1/1 <SEP> (rein) <SEP> 1/1 <SEP> (rein) <SEP> 1/5 <SEP> (rein) <SEP> 1/8
<tb> 0, <SEP> 1 <SEP> (konz. <SEP> x <SEP> 13) <SEP> 1/1 <SEP> (rein) <SEP> 1/1 <SEP> (rein) <SEP> 1/3 <SEP> (rein) <SEP> 1/4
<tb> Ausgangsmaterial <SEP> Polio <SEP> 1/1 <SEP> (konz. <SEP> x <SEP> 4), <SEP> M. <SEP> K. <SEP> 1/3 <SEP> (rein)
<tb>
Beispiel 5 :
Konzentrierung eines lebenden Virus vom Typ I. das auf mit Trypsin behandelten Affenzellen gezüchtet wurde.
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Bei diesem Experiment wurde die Konzentration des Virus durch die Infektionsfähigkeit (infectivity) geprüft und nicht durch Komplementär-Fixierungs-Titrationen. Es wird gezeigt, dass auch die Infektionsfähigkeit völlig in dem Eluat wiedergefunden wurde.
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<tb> pH <SEP> bei <SEP> der <SEP> mg/ml <SEP> Überstehende <SEP> Flüssigkeit <SEP> Eluate
<tb> Adsorption <SEP> AlPO4 <SEP> (100ml) <SEP> (5ml) <SEP>
<tb> in <SEP> der <SEP> Mischung <SEP> Infektionsfähigkeits-Titer <SEP> Infektionsfähigkeits-Titer
<tb> 5, <SEP> 0 <SEP> O, <SEP> 1 <SEP> 10-4,8 <SEP> 10-7,6
<tb> Ausgangsmaterial <SEP> (100 <SEP> ml) <SEP> Infektionsfähigkeits-Titer <SEP> 10-'. <SEP> 2 <SEP>
<tb>
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Der PH der Mischung wurde mit Essigsäure auf 4,7 eingestellt. Die Mischung wurde dann 2 h mit einem magnetischen Rührer gerührt. Nach dem Absitzen wurde der grösste Teil der überstehenden Flüssigkeit abgehebert und der Rest durch Schleudern (spinning) entfernt. Das Virus wurde durch Suspendieren des Niederschlages in 125 ml Medium 199 (zu dem Iglo Natriumbicarbonat gegeben wurde) eluiert und 1/2 h geschüttelt, und anschliessend wurde der Niederschlag durch Zentrifugieren entfernt.
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<tb>
Volumen <SEP> Infektionsfähigkeits-Titer <SEP> Gesamtprotein <SEP>
<tb> Ausgangsflüssigkeit <SEP> 12, <SEP> 51 <SEP> 10-5, <SEP> 55 <SEP> 687mg <SEP>
<tb> Überstehende <SEP> Flüssigkeit <SEP> 12, <SEP> 51 <SEP> 10-3,85 <SEP> 337 <SEP> mg
<tb> Eluat <SEP> 125ml <SEP> 10' <SEP> 65 <SEP> 49 <SEP> mg <SEP>
<tb>
PATENTANSPRÜCHE :
1.
Verfahren zur Reinigung und Konzentrierung von lebendem Poliomyelitisvirus oder dem entsprechenden Antigen-Material unter Verwendung von Aluminiumphosphatgel als Adsorbens, dadurch gekennzeichnet, dass das lebende Virus oder das Antigen-Material auf Aluminiumphosphat bei einem pH-Wert unter 7 aus einem wässerigen Medium adsorbiert wird und dass anschliessend das lebende Virus oder das Antigen-Material mittels eines wässerigen, vorzugsweise gepufferten Mediums bei einem pH über 7, vorzugsweise zwischen 8 und 11 eluiert und durch Verwendung eines kleineren Volumens an Eluierungsmittel als jenes des wässerigen Mediums, aus welchem die Adsorption erfolgte, gleichzeitig konzentriert wird.