DE2634584C3 - Atoxisches, immunogenes Produkt aus Tetanus-Toxin - Google Patents
Atoxisches, immunogenes Produkt aus Tetanus-ToxinInfo
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Description
25
Die Erfindung betrifft ein atoxisches, immunogenes Produkt, das aus Tetanus-Toxin mit Hilfe einer
Proteinase erhalten werden kann. Es betrifft ferner die Verwendung des neuen Produkts in einem Tetanus- -W
Impfstoff.
Tetanus-Toxin ist bekanntermaßen gegenüber Säugetieren und auch dem Menschen hochtoxisch und muß zu
seiner Verwendung als immunisierendes Agens entgiftet werden. Es ist bekannt, das Tetanus-Toxin dadurch zu sr>
entgiften, daß es mit Formaldehyd behandelt wird. Es ist ferner aus DE-OS 25 10 987 bekannt, daß ein atoxisches,
immunogenes Produkt durch Behandlung von Tetanus-Toxin mit einer Proteinase erhalten werden kann.
Dieses atoxische, immunogene Produkt wird in der to
wissenschaftlichen Literatur als Fragment C des Tetanus-Toxins bezeichnet. Wie im Beispiel 1 der
zitierten DE-OS 25 10 987 ausgeführt, ist bei der Behandlung von Tetanus-Toxin mit einer Proteinase mit
der Entstehung mehrerer Bruchstücke zu rechnen. Das Fragment C wird in dem betreffenden Beispiel aus der
zweiten der anfallenden Fraktionen gewonnen.
Das Fragment C hat ein verhältnismäßig kleines Molekulargewicht und ist deshalb auch weniger
immunologisch aktiv. Es bestand daher das Bedürfnis, ™ einen immunologisch wirksamen Stoff zur Verfügung zu
haben, dessen Molekulargewicht kleiner als das des Tetanus-Toxins, aber größer als das des Fragments C
dieses Toxin ist.
Es wurde nun überraschend gefunden, daß bei der Behandlung von Tetanus-Toxin mit einer Proteinase,
vorzugsweise mit Papain, neben dem Fragment C eine weitere, bisher nicht bekannte chemisch eindeutig
charakterisierbare Substanz mit dem gewünschten, und weiteren besonders vorteilhaften Eigenschaften ent- b0
steht, die nach bekannten biochemischen Verfahren isoliert werden kann.
Zu den besonders vorteilhaften Eigenschaften des als Fragment B bezeichneten Produktes zählt dessen
fehlende Toxizität und dessen Immunogenität. Diese hl>
Eigenschaften machen das Produkt als Bestandteil von Vaccinen gegen Tetanus geeignet.
Gegenstand der Erfindung ist demnach ein atoxisches, immunogenes Produkt, mit einer Sedimentationskonstante S"»»^^ ± 034 einem Molekulargewicht,
bestimmt durch Gel-Elektrophorese in Natriumdodecylsulfat, 95 000 ± 5000, welches mit Tetanus-Antitoxin
immunologisch partiell identisch wie Tetanus-Toxin, und mit Fragment C immunologisch nicht identisch
reagiert erhältlich aus Tetanus-Toxin durch dessen Behandlung mit einer Proteinase, vorzugsweise mit
Papain.
Das Produkt ist durch Reduktion spaltbar in eine Untereinheit mit einem Molekulargewicht von
45 000 ± 2500 und ein mit dem bekannten Derivat der leichten Ketten des Tetanus-Toxins immunologisch
identische Untereinheit mit einem Molekulargewicht von 48 000 ± 2500 (jeweils bestimmt in der Natriumdodecylsulfat-Elektrophorese).
Die in den Parametern wiedergegebenen Schwankungsbreiten beruhen auf Fehlergrenzen innerhalb der
Bestimmungsmethoden.
Die Sedimentationskonstante wurde bestimmt in einer wäßrigen Lösung von 0,2 M NaCl,
0,02 M Na2H PO4, 0,03 M Na H2PO4 bei einem pH von
6,8 nach T. Svedberg und K. O. Pedersen »The Ultracentrifuge«, The Clarendon Press, Oxford, 1940, in
einer Überschichtungszelle einer analytischen Ultrazentrifuge in Anlehnung an Vinograd, Proc. Acad. Sei. USA,
49, 902 (1963). Die Überschichtung der das erfindungsgemäße Produkt enthaltenden Probelösung erfolgte auf
1 M NaCI-Lösung vom pH-Wert 7,0.
Die immunologische Reaktivität wurde geprüft unter Verwendung von Antiseren, die durch Immunisierung
von Kaninchen mit Tetanus-Toxid oder dem erfindungsgemäßen Fragment B erhalten wurden. Es wurde die
bekannte Doppel-Diffusionstechnik verwendet. Mit Hilfe dieser Technik kann gezeigt werden, daß das
früher beschriebene Fragment C sich von dem erfindungsgemäßen Fragment B eindeutig unterscheidet.
Wie weiter gezeigt werden konnte, ist das Fragment B in zwei Spaltstücke aufzutrennen, von denen das eine
das gleiche immunologische Verhalten zeigt, wie das in der DE-OS 25 57 047 beschriebene Derivat der leichten
Kette.
Die Gel-Elektrophorese in einem 7%igen Polyacrylamidgel unter Verwendung von Natriumdodecylsulfat
als Bestandteil des Elektrophorese-Puffers wurde nach K. W e b e r und M. O s b ο r η, J. Biol. Chem., Vol. 244,
4406-4412 (1969) durchgeführt. Vor der Durchführung der Gel-Elektrophorese wurden die zu analysierenden
Proben in wäßriger Lösung mit Natriumdodecylsulfat bis zu einer Konzentration von 1% versetzt und
1 Minute in siedendem Wasser gehalten. Die Kalkulation des Molekulargewichts erfolgt durch Vergleich mit
Standardsubstanzen für Molekulargewichtsbestimmungen (Aldolase und Katalase, erhältlich durch die Firma
Boehringer, Mannheim, Kat. Nr. 15 575 — »Eichproteine Größe II«). Die Berechnungsmethode ist in der oben
zitierten Arbeit von Weber und O s b ο r η angegeben.
Das neue atoxische, immunogene, als Fragment θ des
Tetanus-Toxins bezeichnete Produkt ist erhältlich nach dem in der DE-OS 25 10 987 beschriebenen Verfahren
durch Behandlung von Tetanus-Toxin mit einer Proteinase.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird das Fragment B durch Behandlung von Tetanus-Toxin, das
aus Kulturfiltraten des Clostrium-Tetani durch lonenaustauschchromatographie
gewonnen werden kann, mit Papain, bevorzugt in trägergebundener Form, in Gegenwart eines reduzierenden Agens erhalten. Es hat
sich dabei als nützlich erwiesen, die Inkubationstemperatur
höher als üblich, d.h. zwischen 30 und 60°C,
vorzugsweise zwischen 45 und 55° C, zu wählen. Durch diese Maßnahme kann die Ausbeute an dem ernndungsgemäßen
Produkt erhöht werden. Nach der proteolytischen Einwirkung auf das Tetanus-Toxin wird das
trägergebundene Enzym aus dem Reaktionsansatz, zweckmäßig durch Zentrifugation, entfernt und die
zurückbleibende Lösung einer Molekularsiebiraktionierung unterworfen. Vorteilhaft erweist sich hierbei die
Verwendung von mit Epchlorhydrin-vernetztem Dextran, beispielsweise Sephadex®G 100 der Firma Pharmacia,
Uppsala oder Ultrogel® von LKB, Bromma oder Bio-Gel p® von Bio-Rad Laboratories, Richmond, Calif.
Im Falle, daß eine lösliche Enzympräparation verwendet wird, erfolgt die Abtrennung des Enzyms bei
der Durchführung der Molekularsiebfraktionierung.
Sobald das Fragment B auf diese Weise einmal erhalten wurde, läßt sich damit ein Antiserum durch
Immunisierung von Versuchstieren mit Fragment B herstellen, mit dessen Hilfe in üblicher Weise ein
Immunadsorbens gewonnen werden kann. Dieses wiederum ist geeignet, das Fragment B in besonders
reiner Form aus dem Inkubationsansatz der besagten Fermentationslösung zu gewinnen.
Auch die Entfernung von Fragment C oder Tetanus-Toxin aus einem Gemisch mit Fragment B läßt
sich immunadsorptiv erreichen. Dazu wird zunächst ein Antiserum gegen das bekannte Fragment C hergestellt.
Mit diesem Antiserum kann in üblicher Weise ein Immunadsorbens gewonnen werden. Dieses wiederum
ist geeignet, Reste von Fragment C und von Tetanus-Toxin von dem Fragment B zu entfernen, da
sowohl Fragment C als auch Tetanus-Toxin mit dem Anti-Fragment C-Serum reagiert, jedoch nicht das
Fragment B.
Andere Isolierungsverfahren, wie sie dem Fachmann zur Trennung von Proteinen unterschiedlicher elektrischer
Ladung zur Verfügung stehen, führen ebenfalls zum Erfolg. Es sind dies insbesondere elekCrophoretische
und Ionenaustausch-Chromatografie- Verfahren.
Das auf diese Weise erhältliche reine Fragment ßaus
dem Tetanus-Toxin erweist sich als nicht-toxisch. Das bedeutet, daß Mäuse, welche eine Lösung des
erfindungsgemäßen Produktes injiziert erhalten, innerhalb von 4 Tagen nicht absterben. Das neue Fragment B
ist somit als Bestandteil einer Vaccine zur Immunisierung gegen Tetanus geeignet. Es läßt sich in bekannter
Weise, ggf. unter Verwendung eines üblichen immunologischen Adjuvans zu einer Vaccine aufarbeiten.
In einigen Fällen hat es sich als zweckmäßig erwiesen, das Fragment B mit einem Aldehyd zu behandeln. Für
diese Behandlung wird das mit Hilfe von Proteinasen gewonnene Produkt nach dessen Isolierung mit einer
Proteinkonzentration von etwa 1 mg Protein pro ml oder weniger in einer Pufferlösung vom pH-Wert
6,0—8,5, vorzugsweise 7,8 und einer Molarität der Pufferlösung von 0,01 -0,2 M mit 0,015-0,3 M eines
aliphatischen Mono- oder Dialdehyds mit 1 —6 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise Formaldehyd während
14-28 Tagen bei 20-37°C behandelt. Das Produkt kann gewünschtenfalls einer 10- bis 20-, vorzugsweise
15-stündigen Dialyse gegen eine physiologisch verträgliche
Lösung wie 0,15 molares Natriumchlorid unterzogen und/oder sterilfiltriert werden. Zur Herstellung
eines Impfstoffes wird das Produkt zweckmäßig noch mit einem Adjuvans, z. B. Aluminiumhydroxid, gemischt.
Durch Verdünnung mit einer physiologisch verträglichen Lösung wie 0,15 molarer Natriumchloridlösung
wird Konzentration auf den gewünschten Antigengehalt eingestellt
Diese Impfstoffe können für sich alleine, aber auch in Kombination mit anderen Impfstoffen angewandt
werden. Zur Kombination eignen sich insbesondere Diphtherietoxoid, Pertussisimmunogen, Poliomyelitisviren
oder Masernviren. Durci; Adsorptionsversuche kann man zeigen, daß etwa die Hälfte aller gegen
ίο Tetanus-Toxin gerichteten schützenden Antikörper
gegen Fragment B gerichtet sind.
Die Erfindung soll an nachfolgenden Beispielen näher erläutert werden:
CIostrium-Tetani werden in einem Latham-Medium fermentiert Das dabei gebildete Toxin wird an
Diäthylaminoäthylcellulose-Ionenaustauscher adsorbiert
und durch eine gradient ansteigende Molarität eines Phosphatpuffers vom pH-Wert 7 von 0,01 Mol bis
0,4 Mol eluiert Die das Toxin enthaltenden Fraktionen werden bei einer Chromatographie auf einer Säule, die
mit Sephadex®G 100 gefüllt ist, nochmals aufgetrennt und die das Toxin enthaltenden Fraktionen gewonnen
und vereinigt.
2,5 g Tetanus-Toxin in einer Lösung mit einer Endkonzentration von 15 mg Tetanus-Toxin/ml eines
0,1 MoI Phosphatpuffers pH 6,5 enthaltend 0,01 Mol Na2EDTA und 0,001 Mol Cystein HCl werden mit 40 mg
Papain vermischt. Das Papain enthält 30 Einheiten enzymatischer Aktivität/mg Substanz. Zunächst wird
die Mischung 1 Stunde bei 45°C gehalten, danach weitere 2 Stunden bei 55° C.
Für die Spaltung des Tetanus-Toxins kann bevorzugt auch trägergebundenes Papain eingesetzt werden.
Hierzu werden eine gegen 0,1 Mol Na2CO3-Puffer
vom pH-Wert 10,0 dialysierte Lösung von 500 ml Papain mit 50 mg/ml mit einem mittels Cyanbromid-aktiviertem
Agarosegel zusammengebracht und 24 Stunden bei 4° C belassen. Das mehrfach mit einer 4 Mol
Harnstoff und 0,5 Mol NaCl pro Liter enthaltenden Lösung gewaschene Reaktionsprodukt wird analog dem
löslichen Enzym für die proteolytische Spaltung des Tetanus-Toxins verwendet.
Nach Abkühlung des Gemisches wird das Volumen mit Hilfe eines Ultrafilters eingeengt und danach auf
eine 10 χ 100 cm lange Säule, gefüllt mit Sephadex* G 100 aufgetragen. Die Elulion erfolgt mit 0,1 Mol
Trishydroximethylaminomethan-Salzsäurepuffer vom pH-Wert 8,0, enthaltend 1 Mol NaCl.
Während der Elution erfolgt kontinuierlich die Messung der Adsorption im Bereich der Wellenlänge
von 280 nm. Die Fraktionen, die in diesem Bereich eine Adsorption zeigen, werden getrennt aufgefangen. Es
entstehen 4 Fraktionen, wobei die erste einen Doppelgipfel darstellt.
Bei einer wiederholten Chromatographie unter den gleichen Bedingungen wird der Doppelgipfel auseinandergezogen
und schließlich der 2. Gipfel isoliert. Dieser
bo enthält das erfindungsgemäße atoxische, immunogene
Produkt, das Fragment flaus Tetanus-Toxin.
Besonders einfach läßt sich das erfindungsgemäße Fragment B gewinnen, wenn man Antiserum, gerichtet
gegen das bekannte Fragment C(IO ml mit 1000 IU/ml)
br> in üblicher Weise an BrCN-aktivierte Agarose bindet,
id anschließend eine durch Gel-Chromatographie
partiell gereinigte Präparation des Fragments B mit einem solchen Immunadsorbens vermischt. Nach
Λ t
60 Minuten Rühren wird das Gel mit den daran gebundenen Verunreinigungen abgetrennt und das
Fragment B durch eine nochmalige Gel-Chromatographie gewonnen.
Es ist auch möglich die Verunreinigungen durch Zusatz von Anti-Fragment C-Antiserum (IgG Fraktion)
zu neutralisieren und die Immunkomplexe durch Gel-Chromatographie von dem Fragment B zn trennen.
Endlich läßt sich das erfindungsgemäße Fragment B auch gewinnen, wenn mit Hilfe eines einmal hergestellten
Fragments B Ober ein Antiserum ein Immunadsorbens für das Fragment B hergestellt wird Man kann sich
dabei bekannter Verfahren bedienen. Mit Hilfe des Immunadsorbens wird das Fragment 3 selektiv aus der
Mischung mit anderen Reaktionsprodukten aus der Proteinasebehandlung des Tetanus-Toxons selektiv
adsorbiert, wonach es selektiv vom Immunadsorbens eluiert werden kann.
Das Fragment B wird mit 0,1 M Phosphatpufferlösung vom pH-Wert 6,5 auf 200 \ig Protein pro ml
verdünnt und mit 0,06% Formaldehyd versetzt und bei 37°C 21 Tage stehen gelassen. Danach wird gegen ein
mehrfaches Volumen 0,15 M Natriumchloridlösung 16 Stunden dialysiert und in üblicher Weise zu einem
Impfstoff verarbeitet
Claims (2)
1. Atoxisches immunogenes Produkt mit einer Sedimentationskonstante von S0MW 5,66 ± 0,34 und
einem Molekulargewicht, bestimmt durch Gel-Elektrophorese in Natriumdodecylsulfat, von
95 000 ± 5000, welches mit Tetanus-Antitoxin immunologisch partiell identisch wie Tetanustoxin und
mit Fragment C immunologisch nicht identisch reagiert, erhalten aus Tetanus-Toxin bei dessen
Behandlung mit einer Proteinase, vorzugsweise Papain, durch Isolierung des immunogenen Produktes
mittels Molekularsieb-Fraktionierung, Immunadsorption, Elektrophorese und/oder Ionenaustausch-Chromatographie
und gegebenenfalls Behandeln des isolierten Produktes bei einem pH-Wert von 6,0—8,5 mit 0,015—03 M eines aliphatischen Mono-
oder Dialdehyds mit 1 —6 Kohlenstoffatomen für die Dauer von 14—28 Tagen bei 20—37°C.
2. Verwendung des atoxischen immunogenen Produktes nach Anspruch 1 in Form eines
Impfstoffes zur Tetanusprophylaxe.
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