FI58500B - Foerfarande foer framstaellning av ett giftfritt immunogent fragment b ur tetanustoxin - Google Patents
Foerfarande foer framstaellning av ett giftfritt immunogent fragment b ur tetanustoxin Download PDFInfo
- Publication number
- FI58500B FI58500B FI772305A FI772305A FI58500B FI 58500 B FI58500 B FI 58500B FI 772305 A FI772305 A FI 772305A FI 772305 A FI772305 A FI 772305A FI 58500 B FI58500 B FI 58500B
- Authority
- FI
- Finland
- Prior art keywords
- fragment
- tetanus toxin
- molecular weight
- tetanus
- sodium dodecyl
- Prior art date
Links
- 239000012634 fragment Substances 0.000 title claims description 47
- 108010055044 Tetanus Toxin Proteins 0.000 title claims description 36
- 229940118376 tetanus toxin Drugs 0.000 title claims description 36
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 12
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 claims description 12
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 claims description 12
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 claims description 9
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 8
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 claims description 7
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 claims description 7
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 7
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 claims description 7
- 235000019833 protease Nutrition 0.000 claims description 7
- 235000019333 sodium laurylsulphate Nutrition 0.000 claims description 7
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 6
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 6
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 6
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 239000011734 sodium Substances 0.000 claims description 5
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 4
- 230000008105 immune reaction Effects 0.000 claims description 4
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 claims description 3
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 claims description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 claims description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims description 2
- 229960005367 tetanus antitoxin Drugs 0.000 claims description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 claims 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 claims 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 claims 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 9
- 108090000526 Papain Proteins 0.000 description 7
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 7
- 238000000034 method Methods 0.000 description 7
- 229940055729 papain Drugs 0.000 description 7
- 235000019834 papain Nutrition 0.000 description 7
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 5
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 4
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 4
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 4
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 4
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 4
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 3
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 3
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 2
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 2
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 2
- 206010043376 Tetanus Diseases 0.000 description 2
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 2
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 description 2
- ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N cyanogen bromide Chemical compound BrC#N ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 2
- 210000002196 fr. b Anatomy 0.000 description 2
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 2
- 238000005227 gel permeation chromatography Methods 0.000 description 2
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 2
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 2
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 231100000668 minimum lethal dose Toxicity 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 239000002808 molecular sieve Substances 0.000 description 2
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 2
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 2
- URGAHOPLAPQHLN-UHFFFAOYSA-N sodium aluminosilicate Chemical compound [Na+].[Al+3].[O-][Si]([O-])=O.[O-][Si]([O-])=O URGAHOPLAPQHLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 2
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 2
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 2
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 102000016938 Catalase Human genes 0.000 description 1
- 108010053835 Catalase Proteins 0.000 description 1
- 241000193403 Clostridium Species 0.000 description 1
- 241000193449 Clostridium tetani Species 0.000 description 1
- 229920001425 Diethylaminoethyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000001390 Fructose-Bisphosphate Aldolase Human genes 0.000 description 1
- 108010068561 Fructose-Bisphosphate Aldolase Proteins 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 206010041415 Spastic paralysis Diseases 0.000 description 1
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003463 adsorbent Substances 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 238000002306 biochemical method Methods 0.000 description 1
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 229960002433 cysteine Drugs 0.000 description 1
- 239000007857 degradation product Substances 0.000 description 1
- 230000008021 deposition Effects 0.000 description 1
- -1 diethylaminoethylcellulose ion Chemical class 0.000 description 1
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- 125000002485 formyl group Chemical class [H]C(*)=O 0.000 description 1
- 229940124452 immunizing agent Drugs 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 239000010421 standard material Substances 0.000 description 1
- 239000012085 test solution Substances 0.000 description 1
- 229960000814 tetanus toxoid Drugs 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 1
- 231100000925 very toxic Toxicity 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/02—Bacterial antigens
- A61K39/08—Clostridium, e.g. Clostridium tetani
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
n —.1 r_, „„ KUULUTUSJULKAISU Cftcnn
jfiFgj ^ <11) UTLÄGGNINGSSKMFT 5 8 5 UU
c (45) ;λ ^ 10 ~ 'r'1 ^ ^ (51) ic».ik?/int.a.3 C 07 G 7/00, A 61 K 39/08 1 // C 12 H 1/145 SUOMI—FINLAND (21) Pwn«iw»mw-pe««i«ewBi 772305 (22) HakmnltpUvf—AiNeknlnfrftg 28.07.77 * * (23) AUaipUvi—Glltlghttadag 28.07.77
(41) Tutkit |ulkMoi — Bllvtc offwcNg q2 jQ
Patentti· ja rekisterihallitus (44) Nihttvitolpanon |» kuuLlulkaium pvm. —
Patent» och registerstyrelsen 7 AnaMon utlagd oeh utl.»krlft*n pubiicarad 31.10.80 (32)(33)(31) Fppdattjr «tuoHcma—Baglrd priority 31 # 0γ # jg
Saksan Liittotasavalta-Förbundsrepubliken Tyskland(DE) P 2634584-6 (71) Behringwerke Aktiengesellschaft, D-3550 Marburg/Lahn, Saksan Liitto- tasavalta-Förbundsrepubliken Tyskland(DE) (72) Torsten Bertil Helting, Marburg/Lahn, Saksan Liittotasavalta-Förbunds-republiken Tyskland(DE) (7M Oy Kolster Ab (5^) Menetelmä tetanustoksiinista saadun myrkyttömän, immunogeenisen fragmentti B:n valmistamiseksi - Förfarande för framställning av ett gift-fritt, immunogent fragment B ur tetanustoxin
Keksinnön kohteena on menetelmä tetanustoksiinista proteinaasin avulla saadun myrkyttömän, immunogeenisen tuotteen valmistamiseksi.
_ Tetanustoksiini on tunnetusti imettäväisille ja myös ihmiselle erittäin myrkyllinen ja se on ennen käyttöä immunoivana aineena tehtävä myrkyttömäksi.
On tunnettua, että tetanustoksiini voidaan tehdä myrkyttömäksi käsittelemällä formaldehydillä. Lisäksi on tunnettua, että voidaan saada myrkytön, immunogee-ninen tuote käsittelemällä tetanustoksiinia proteinaasilla. Tätä myrkytöntä, immunogeenista tuotetta nimitetään tieteellisessä kirjallisuudessa tetanus-toksiinin fragmentiksi C.
Julkaisussa Biochem. Biophys. Res. Commun. j>7 (1974), 1263-1279 on esitetty fraktio B:ksi nimitetyn tetanustoksiinifraktion eristäminen. Tämä fraktio B (jolla harhaanjohtavasti on sama kirjainsymboli kuin fragmentti B:llä) on yhtä myrkyllinen kuin itse tetanustoksiini. Keksinnön mukaisesti valmistettu fragmentti B, joka on ensimmäisen kerran kuvattu eristettynä tuotteena julkaisussa J. Biol. Chem. 252 (1977), s. 187-193, on sensijaan myrkytön kysymykseen tulevina käyttömäärinä.
2 58500 Κκillä olevan keksinnön mukaisesti saadaan käsittelemällä tetanustoksiinia proteinaasilla, esimerkiksi papaiinilla, yksiselitteisesti karakterisoitavissa olevaa ainetta, joka voidaan eristää tunnetuilla biokemiallisilla menetelmillä ja jolla on erityisesti edulliset ominaisuudet; saatu fragmentiksi B nimitetty tuote on immunogeeninen ja myrkytön. Fragmentti B on siten erittäin sopiva käytettäväksi rokotteisiin jäykkäkouristusta (tetanus) vastaan.
Keksinnön kohteena on menetelmä tetanustoksiinista saadun myrkyttömän, im-munogeenisen tuotteen valmistamiseksi, jolla on seuraavat ominaisuudet: a) sedimentaatiovakio S°2ow 5»66 + 0,3**, b) immunologinen reaktio tetanus-antitoksiinin kanssa: osittain sama kuin tetanustoksiinin kanssa, c) immunologinen reaktio fragmentin C kanssa: ei identtinen d) geelielektroforeesilla natriumdodekyylisulfaatissa määritetty molekyyli-paino 95 ooo + 5000, e) se on didulfidisillan pelkistävillä reagensseilla jaettavissa alayksiköksi, jonka molekyylipaino on **5 000 + 2500, ja alayksiköksi, joka on immunologisesti samanlainen kuin tetanustoksiinin keveiden ketjujen tunnetut johdannaiset ja jonka molekyylipaino on U8 000 + 2500, jotka mole-kyylipainot on määritetty geelielektroforeesilla natriumdodekyylisulfaa-tissa.
Keksinnön mukaiselle menetelmälle on tunnusomaista, että tetanustoksiini-liuos hajotetaan proteinaasilla, liuos, jossa hajotuksessa syntyneet tuotteet ovat, geelisuodatetaan geelillä, joka sopii sellaisten proteiinien erottamiseen, joiden molekyylipaino on noin 100 000, jolloin eluointi suoritetaan 0,1 M tris/suolahappo-puskurilla (pH 8), jossa on 1 mol/1 natriumkloridia, ja fraktioista kerätään ne, joissa on proteiineja, joiden molekyylipaino geelielektroforeesilla natriumdode-kyylisulfaatissa mitattuna on noin 95 000 ja jotka eivät muodosta saostumaa fragmentti-C-vastaseerumin kanssa.
Parametrien poikkeamarajat aiheutuvat määritysmenetelmien virherajöistä.
Sedimentaatiovakio määritettiin vesipitoisessa liuoksessa, joka oli 0,2M NaCl:n, 0,02M Na2H Ρ0^:η ja 0,03M Na HgPO^in suhteen ja jonka pH oli 6,8, T. Sved-bergin ja K.O. Pedersenin mukaan "The Ultracentrifuge", The Clarendon Press,
Oxford, 19*+0, analyyttisen ultrasentrifugin kerrostuskennossa Vinogradin mukaan,
Proc.Acad.Sei. USA, 1*9, 902 (1963). Fragmenttia C sisältävän koeliuoksen kerrostaminen tapahtui IM NaCl-liuokseLla, jonka pH-arvo oli 7,0.
Immunologinen reaktiivisuus testattiin käyttäen vastaseerumeita, joita saatiin immunoimalla kaniineja tetanus-toksoidilla tai keksinnön mukaisella fragmentti C :11a. Käytettiin tunnettua kaksoisdiffuusiomenetelmää. Tämän menetelmän avulla voidaan osoittaa, että aikaisemmin kuvattu fragmentti C poikkeaa yksiselitteisesti keksinnön mukaisesti valmistetusta fragmentista B. Voitiin myös osoittaa, että fragmentti B voidaan jakaa kahteen osaan,joista toisella on samanlainen immunologinen käyttäytyminen kuin DE-hakemusjulkaisussa 2 *+57 0*+7 kuvatulla kevyen ketjun johdan- 3 58500 naisella.
Geelielektroforeesi 7~#:sessa polyakryyliamidigeelissä suoritettiin K.
Weberin ja M. Osbornen mukaisesti, J. Biol. Chem., nide 2HU, UU06-UU12 (1969)·
Ennen geelielektroforeesin suorittamista laimennettiin analysoitavat näytteet natriumdodekyylisulfaatin vesiliuoksella 1 %:n pitoisuuteen ja pidettiin minuutin ajan kiehuvassa vedessä. Molekyylipainon laskeminen tapahtui vertaamalla mole-kyylipainomäärityksiin tarkoitettuihin standardiaineisiin (aldolaasiin ja kata-laasiin, joita toimittaa firma Boehringer, Mannheim, Kat.Nr. 15 575 -"Eichproteine Grösse II"). Laskentamenetelmä on esitetty edellä mainitussa Weberin ja Osbornen julkaisussa.
Uusi myrkytön, immunogeeninen, tetanustoksiinin fragmentti B:ksi nimitetty tuote voidaan saada DE-hakemusjulkaisussa 25 10 987 kuvatulla menetelmällä käsittelemällä tetanustoksiinia proteinaasilla. Eräässä edullisessa suoritusmuodossa saadaan fragmenttia B käsittelemällä tetanustoksiinia, jota voidaan saada Clostridium " tetanin viljelysuodoksista ioninvaihtokromatografiaa käyttäen, papaiinilla, edul lisesti kantajaan sidottuna, pelkistävän aineen läsnäollessa.
Tällöin on osoittautunut hyödylliseksi valita inkuboimislämpötila tavallista korkeammaksi, ts. väliltä 30-60°C, edullisesti väliltä ^5-55°C. Tällä toimenpiteellä voidaan keksinnön mukaisesti valmistetun tuotteen saantoa lisätä. Tetanustoksiinin proteolyyttisen käsittelyn jälkeenpoistetaan kantajaan sidottu entsyymi reaktioseoksesta, edullisesti linkoamalla, ja jäljelle jäänyt liuos fraktioidaan mo-lekyyliseulalla. Edullisesti käytetään tällöin epikloorihydriinillä ristisidottua dekstraania, esimerkiksi Sephadexv G 100, jota tuottaa firma Pharmacia, Uppsala, (R) (p) tai Ultragel' , tuottaa LKB, Bromma, tai Bio-gel p , tuottaa Bio-Rad Laboratories, Richmond, Calif..
Mikäli käytetään liukoista entsyymivalmistetta, tapahtuu entsyymin erottaminen molekyyliseulafraktiointia suoritettaessa.
Heti kun fragmenttia B tällä tavalla kerran on saatu, voidaan valmistaa sen vastaseerumi immunoimalla koe-eläimiä fragmentilla B, jonka vastaseerumin avulla tavalliseen tapaan voidaan saada immunoadsorbentti. Tätä puolestaan voidaan käyttää fragmentin B erityisen puhtaan muodon valmistamiseen edellä mainitun käymisliuoksen inkuboimispanoksesta.
Myös fragmentin C tai tetanustoksiinin poistaminen seoksesta, jossa on fragmenttia B, voidaan suorittaa immunoadsorptiivisesti. Tätä varten valmistetaan ensin vastaseerumi tunnettua fragmenttia C vastaan. Tällä vastaseerumilla voidaan tavallisella tavalla saada immunoadsorbentti. Tällä puolestaan voidaan poistaa fragmentin C ja tetanustoksiinin jäännökset fragmentista B, koska sekä fragmentti C että myös tetanustoksiini reagoivat fragmentti C-vastaseerumin kanssa, mutta eivät fragmentin B kanssa.
ι> 5 8500
Tetanustoksiinista saatava fragmentti B osoittautui vertailtaessa tetanus-toksiiniin myrkyttömäksi. Tetanustoksiini sisältää. 30 x 10^ ja fragmentti B 5 kuolettavaa vähimmäisannosta (MLD) mg:aa proteiinia kohti. Fragmentti B osoittautui myrkyllisyysoireiden suhteen tetanustoksiinista täysin poikkeavaksi: se ei aiheuta spastiselle halvautumiselle ominaisia oireita. Huolimatta myrkyllisyyden alentu- g misesta 1 : 6 x 10 -osaan, on tarkoituksenmukaista käsitellä fragmenttia B aldehy-dillä, kuten seuraavassa kuvataan.
Adsorptiokokeilla voidaan osoittaa, että noin puolet kaikista tetanustoksiinin vasta-aineista ovat fragmentin B vasta-aineita.
Keksintöä valaistaan nyt lähemmin seuraavan esimerkin avulla.
Esimerkki
Clostridium tetani-viljelmässä muodostunut toksiini adsorboidaan dietyyli-aminoetyyliselluloosa-ioninvaihtimella ja eluoidaan fosfaattipuskurin (pH-arvo 7) nousevalla moolisuus-gradientilla 0,01-molaarisesta 0,U-molaariseen. Toksiinia sisältävät jakeet jaetaan vielä kromatografisesti pylväässä, joka on täytetty Sephadex^ G 100:11a (epikloorihydriini-verkkoutettu dekstraani, valmistaja Pharmacia, Uppsala, Ruotsi), ja toksiinia sisältävät jakeet otetaan talteen ja yhdistetään.
2,5 g tetanustoksiinia liuoksessa, jonka loppuväkevyys on 15 mg tetanus-toksiinia/ml 0,1-m fosfaattipuskuria, jonka pH on 6,5 ja joka sisältää 0,01-m Na^EDTA ja 0,001-m kysteiini-HCl, sekoitetaan 1*0 mg:n kanssa papaiinia. Papaiini sisältää 30 yksikköä entsymaattista aktiivisuutta/mg ainetta. Ensin seosta pidetään tunnin ajan U50C:ssa ja sen jälkeen vielä 2 tuntia 55°C:ssa.
Tetanustoksiinin erottamista varten voidaan edullisesti käyttää myös kantajaan immobilisoitua papaiinia.
Tämän valmistamiseksi saatetaan 0,1-m Na^CO^-puskuriaipH-arvo 10,0) vastaan dialysoitua liuosta yhteen 500 ml:n kanssa papaiinia, jossa on 50 mg/ml syaanibromidilla aktivoitua agaroosigeeliä ja annetaan olla 2k tuntia U°C:ssa. Useampaan kertaan k moolia virtsa-ainetta ja 0,5 moolia NaCl/l sisältävällä liuoksella pestyä reaktiotuotetta käytetään samalla tavalla kuin liukoista entsyymiä tetanustoksiinin proteolyyttisessä fraktioinnissa.
Papaiinikäsittelyn jälkeen seos saa jäähtyä, sitä väkevöidään ultrasuodat-timen avulla ja se pannaan 10 x 100 cm pylvääseen, joka on täytetty Sephadex' ‘ G 100:11a. Eluoiminen tapahtuu 0,1-m trishydroksimetyyliaminometaani-kloorivety-happopuskurilla, jonka pH-arvo on 8,0 ja joka sisältää 1 moolin NaCl/l.
Eluoinnin aikana mitataan jatkuvati adsorptio aaltopituudella 280 nm.
Jakeet, jotka tällä alueella osoittavat adsorptiota, otetaan erikseen talteen. Saadaan neljä jaetta, joista ensimmäinen antaa kaksoishuipun.
5 58500
Toistamalla kromatografointi samoissa olosuhteissa erotetaan kaksoishuiput toisistaan ja lopuksi eristetään 2. huippu. Tämä sisältää keksinnön mukaisen myrkyttömän, immunogeenisen tuotteen, tetanustoksiinin fragmentin B.
Erityisen yksinkertaisesti saadaan keksinnön mukainen fragmentti B talteen, kun vastaseerumia, joka kohdistuu tunnettua fragmenttia C vastaan (10 ml, jossa 1 000 IU/ml), tavalliseen tapaan sidotaan BrCN-aktivoituun agaroosiin, ja senjäl-keen sekoitetaan geelikromatografisesti osittain puhdistettu fragmentin B preparaatti tällaisen immunoadsorbentin kanssa, βθ-minuuttisen sekoittamisen jälkeen erotetaan geeli siihen sitoutuneiden epäpuhtauksien kanssa ja fragmentti B saadaan talteen toistetulla geelikromatografoinnilla.
„ On myös mahdollista neutraloida epäpuhtaudet lisäämällä vastafragmentti C- vastaseerumia (igG-jae) ja erottaa immuunikompleksi geelikromatografisesti fragmentista B.
Keksinnön mukainen fragmentti B voidaan saada talteen myös valmistamalla aikaisemmin valmistetun fragmentin B avulla vastaseerumi, ja sitä käyttäen immuno-adsorbentti fragmentille B. Tällöin voidaan käyttää hyväksi tunnettuja menetelmiä. Immunoadsorbentin avulla fragmentti B adsorboidaan selektiivisesti tetanustoksiinin proteinaasikäsittelyssä muodostuneiden reaktiotuotteiden seoksesta, minkä jälkeen se voidaan selektiivisesti eluoida immunoadsorbentista.
Claims (1)
- 6 58500 Patenttivaatimus: Menetelmä tetanustoksiinista saadun myrkyttömän, immunogeenisen fragmentti B:n valmistamiseksi, jolla on seuraavat ominaisuudet: a) sedimentaatiovakio S°2o\} 5,66^3,3*+, b) immunologinen reaktio tetanus-antitoksiinin kanssa: osittain sama kuin tetanus-toksiinin kanssa, c) immunologinen reaktio fragmentin C kanssa: ei identtinen d) geelielektroforeesilla natriumdodekyylisulfaatissa määritetty molekyyli-paino 95 000 + 5000, e) se on disulfidisillan pelkistävillä reagensseilla jaettavissa alayksiköksi, jonka molekyylipaino on 1*5 000 - 2500, ja alayksiköksi, joka on immunologisesti samanlainen kuin tetanustoksiinin keveiden ketjujen tunnetut johdannaiset ja jonka molekyylipaino on U8 000 - 2500, jotka molekyylipainot on määritetty geelielektroforeesilla natriumdodekyylisulfaatissa, tunnettu siitä, että tetanustoksiiniliuos hajotetaan proteinaasilla, liuos, jossa hajotuksessa syntyneet tuotteet ovat, geelisuodatetaan geelillä, joka sopii sellaisten proteiinien erottamiseen, joiden molekyylipaino on noin 100 000, jolloin eluointi suoritetaan 0,1 M tris/suolahappopuskurilla (pH 8), jossa on 1 mol/1 natriumkloridia, ja fraktioista kerätään ne, joissa on proteiineja, joiden molekyylipaino geelielektroforeesilla natriumdodekyylisulfaatissa mitattuna on noin 95 000 ja jotka eivät muodosta saostumaa fragmentti-C-vastaseerumin kanssa.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE2634584A DE2634584C3 (de) | 1976-07-31 | 1976-07-31 | Atoxisches, immunogenes Produkt aus Tetanus-Toxin |
| DE2634584 | 1976-07-31 |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| FI772305A FI772305A (fi) | 1978-02-01 |
| FI58500B true FI58500B (fi) | 1980-10-31 |
| FI58500C FI58500C (fi) | 1981-02-10 |
Family
ID=5984461
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FI772305A FI58500C (fi) | 1976-07-31 | 1977-07-28 | Foerfarande foer framstaellning av ett giftfritt immunogent fragment b ur tetanustoxin |
Country Status (18)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS5326319A (fi) |
| AT (1) | AT362498B (fi) |
| AU (1) | AU516191B2 (fi) |
| BE (1) | BE857373A (fi) |
| CA (1) | CA1099635A (fi) |
| DE (1) | DE2634584C3 (fi) |
| DK (1) | DK342577A (fi) |
| EG (1) | EG12732A (fi) |
| FI (1) | FI58500C (fi) |
| FR (1) | FR2360315A1 (fi) |
| GB (1) | GB1570958A (fi) |
| IE (1) | IE45539B1 (fi) |
| IL (1) | IL52617A (fi) |
| IT (1) | IT1085660B (fi) |
| LU (1) | LU77874A1 (fi) |
| NL (1) | NL7708279A (fi) |
| NO (1) | NO772704L (fi) |
| SE (1) | SE7708693L (fi) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB8516442D0 (en) * | 1985-06-28 | 1985-07-31 | Wellcome Found | Cloned antigen |
-
1976
- 1976-07-31 DE DE2634584A patent/DE2634584C3/de not_active Expired
-
1977
- 1977-07-26 NL NL7708279A patent/NL7708279A/xx not_active Application Discontinuation
- 1977-07-27 EG EG446/77A patent/EG12732A/xx active
- 1977-07-27 AU AU27380/77A patent/AU516191B2/en not_active Expired
- 1977-07-28 FI FI772305A patent/FI58500C/fi not_active IP Right Cessation
- 1977-07-28 SE SE7708693A patent/SE7708693L/ not_active Application Discontinuation
- 1977-07-29 GB GB31968/77A patent/GB1570958A/en not_active Expired
- 1977-07-29 IE IE1590/77A patent/IE45539B1/en unknown
- 1977-07-29 DK DK342577A patent/DK342577A/da not_active Application Discontinuation
- 1977-07-29 JP JP9213677A patent/JPS5326319A/ja active Pending
- 1977-07-29 IL IL52617A patent/IL52617A/xx unknown
- 1977-07-29 NO NO772704A patent/NO772704L/no unknown
- 1977-07-29 LU LU77874A patent/LU77874A1/xx unknown
- 1977-07-29 CA CA283,802A patent/CA1099635A/en not_active Expired
- 1977-07-29 AT AT563477A patent/AT362498B/de not_active IP Right Cessation
- 1977-07-29 IT IT26354/77A patent/IT1085660B/it active
- 1977-08-01 FR FR7723600A patent/FR2360315A1/fr active Granted
- 1977-08-01 BE BE179821A patent/BE857373A/xx unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| FI58500C (fi) | 1981-02-10 |
| FR2360315B1 (fi) | 1980-04-11 |
| IE45539B1 (en) | 1982-09-22 |
| DE2634584B2 (de) | 1979-03-22 |
| DK342577A (da) | 1978-02-01 |
| DE2634584C3 (de) | 1979-11-08 |
| GB1570958A (en) | 1980-07-09 |
| JPS5326319A (en) | 1978-03-11 |
| AU516191B2 (en) | 1981-05-21 |
| IL52617A0 (en) | 1977-10-31 |
| EG12732A (en) | 1979-09-30 |
| IE45539L (en) | 1978-01-31 |
| NL7708279A (nl) | 1978-02-02 |
| FI772305A (fi) | 1978-02-01 |
| SE7708693L (sv) | 1978-02-01 |
| DE2634584A1 (de) | 1978-02-02 |
| BE857373A (fr) | 1978-02-01 |
| IT1085660B (it) | 1985-05-28 |
| NO772704L (no) | 1978-02-01 |
| CA1099635A (en) | 1981-04-21 |
| LU77874A1 (fi) | 1978-02-02 |
| AU2738077A (en) | 1979-02-01 |
| IL52617A (en) | 1980-12-31 |
| ATA563477A (de) | 1980-10-15 |
| AT362498B (de) | 1981-05-25 |
| FR2360315A1 (fr) | 1978-03-03 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Rush et al. | The interaction of dopamine-β-hydroxylase with concanavalin A and its use in enzyme purification | |
| Olins et al. | Reconstitution of 7S molecules from L and H polypeptide chains of antibodies and γ-globulins | |
| Willis et al. | Preparation of the periplasmic binding proteins from Salmonella typhimurium and Escherichia coli | |
| Goldberg | Immunochemical specificity of lactate dehydrogenase-X | |
| Mekalanos et al. | Purification of cholera toxin and its subunits: new methods of preparation and the use of hypertoxinogenic mutants | |
| Yan et al. | Multiple forms of pyrophosphate: D-fructose-6-phosphate 1-phosphotransferase from wheat seedlings. Regulation by fructose 2, 6-bisphosphate. | |
| Buchanan et al. | Activation of the cell wall degrading protease, lysin, during sexual signalling in Chlamydomonas: the enzyme is stored as an inactive, higher relative molecular mass precursor in the periplasm. | |
| Hoffschulte et al. | Identification of a soluble SecA/SecB complex by means of a subfractionated cell-free export system. | |
| Lin et al. | Isolation and characterization of a cuticular polyester (cutin) hydrolyzing enzyme from phytopathogenic fungi | |
| Kawashima et al. | Studies on fraction I protein: II. Comparison of physical, chemical, immunological and enzymatic properties between spinach and tobacco fraction I proteins | |
| JPH03191789A (ja) | 百日咳菌からの６９０００ダルトンの抗原性タンパク質の精製方法 | |
| Heumann et al. | Purification and immunological characterization of the human hexokinase isoenzymes I and III (ATP-D-hexose 6-phosphotransferase EC 2.7. 1.1) | |
| Amos et al. | Synthesis of ‘bacterial’protein by cultured chick cells | |
| Crofton | Site of alkaline phosphatase attachment in alkaline phosphatase-immunoglobulin G complexes | |
| Jenkins et al. | Extracellular antigens from Listeria monocytogenes I. purification and resolution of hemolytic and lipolytic antigens from culture filtrates of Listeria monocytogenes | |
| Anderson et al. | Borohydride reduction of L-glutamate decarboxylase | |
| JPH07502896A (ja) | 連鎖球菌の多官能性表面タンパク | |
| FI58500B (fi) | Foerfarande foer framstaellning av ett giftfritt immunogent fragment b ur tetanustoxin | |
| Phillips et al. | Immunological characterization of human liver α-d-mannosidase | |
| Lerman | Characterization of the insoluble protein fraction in the ocular lens | |
| EP0298991B1 (en) | Novel lectins derived from bacterial pili | |
| Suzuki et al. | Isolation and some properties of glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase from vegetative cells of Bacillus cereus | |
| JPS60146154A (ja) | オステオカルシン関連誘導体 | |
| RU2230325C2 (ru) | Способ приготовления очищенного препарата ботулинического токсина типа а | |
| Hannestad et al. | Multiple M-components in a single individual-iI studies on urinary Fab μ like fragments in macroglobulinema |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM | Patent lapsed |
Owner name: BEHRINGWERKE AKTIENGESELLSCHAFT |