FI58500B - REFERENCE TO A FRAME RELEASE BETWEEN IMMUNOGENT FRAGMENT AND TETANUS TOXIN - Google Patents
REFERENCE TO A FRAME RELEASE BETWEEN IMMUNOGENT FRAGMENT AND TETANUS TOXIN Download PDFInfo
- Publication number
- FI58500B FI58500B FI772305A FI772305A FI58500B FI 58500 B FI58500 B FI 58500B FI 772305 A FI772305 A FI 772305A FI 772305 A FI772305 A FI 772305A FI 58500 B FI58500 B FI 58500B
- Authority
- FI
- Finland
- Prior art keywords
- fragment
- tetanus toxin
- molecular weight
- tetanus
- sodium dodecyl
- Prior art date
Links
- 239000012634 fragment Substances 0.000 title claims description 47
- 108010055044 Tetanus Toxin Proteins 0.000 title claims description 36
- 229940118376 tetanus toxin Drugs 0.000 title claims description 36
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 12
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 claims description 12
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 claims description 12
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 claims description 9
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 8
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 claims description 7
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 claims description 7
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 7
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 claims description 7
- 235000019833 protease Nutrition 0.000 claims description 7
- 235000019333 sodium laurylsulphate Nutrition 0.000 claims description 7
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 6
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 6
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 6
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 239000011734 sodium Substances 0.000 claims description 5
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 4
- 230000008105 immune reaction Effects 0.000 claims description 4
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 claims description 3
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 claims description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 claims description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims description 2
- 229960005367 tetanus antitoxin Drugs 0.000 claims description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 claims 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 claims 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 claims 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 9
- 108090000526 Papain Proteins 0.000 description 7
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 7
- 238000000034 method Methods 0.000 description 7
- 229940055729 papain Drugs 0.000 description 7
- 235000019834 papain Nutrition 0.000 description 7
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 5
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 4
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 4
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 4
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 4
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 4
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 3
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 3
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 2
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 2
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 2
- 206010043376 Tetanus Diseases 0.000 description 2
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 2
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 description 2
- ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N cyanogen bromide Chemical compound BrC#N ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 2
- 210000002196 fr. b Anatomy 0.000 description 2
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 2
- 238000005227 gel permeation chromatography Methods 0.000 description 2
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 2
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 2
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 231100000668 minimum lethal dose Toxicity 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 239000002808 molecular sieve Substances 0.000 description 2
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 2
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 2
- URGAHOPLAPQHLN-UHFFFAOYSA-N sodium aluminosilicate Chemical compound [Na+].[Al+3].[O-][Si]([O-])=O.[O-][Si]([O-])=O URGAHOPLAPQHLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 2
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 2
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 2
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 102000016938 Catalase Human genes 0.000 description 1
- 108010053835 Catalase Proteins 0.000 description 1
- 241000193403 Clostridium Species 0.000 description 1
- 241000193449 Clostridium tetani Species 0.000 description 1
- 229920001425 Diethylaminoethyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000001390 Fructose-Bisphosphate Aldolase Human genes 0.000 description 1
- 108010068561 Fructose-Bisphosphate Aldolase Proteins 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 206010041415 Spastic paralysis Diseases 0.000 description 1
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003463 adsorbent Substances 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 238000002306 biochemical method Methods 0.000 description 1
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 229960002433 cysteine Drugs 0.000 description 1
- 239000007857 degradation product Substances 0.000 description 1
- 230000008021 deposition Effects 0.000 description 1
- -1 diethylaminoethylcellulose ion Chemical class 0.000 description 1
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- 125000002485 formyl group Chemical class [H]C(*)=O 0.000 description 1
- 229940124452 immunizing agent Drugs 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 239000010421 standard material Substances 0.000 description 1
- 239000012085 test solution Substances 0.000 description 1
- 229960000814 tetanus toxoid Drugs 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 1
- 231100000925 very toxic Toxicity 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/02—Bacterial antigens
- A61K39/08—Clostridium, e.g. Clostridium tetani
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Description
n —.1 r_, „„ KUULUTUSJULKAISU Cftcnnn —.1 r_, „„ AD PUBLICATION Cftcnn
jfiFgj ^ <11) UTLÄGGNINGSSKMFT 5 8 5 UUjfiFgj ^ <11) UTLÄGGNINGSSKMFT 5 8 5 UU
c (45) ;λ ^ 10 ~ 'r'1 ^ ^ (51) ic».ik?/int.a.3 C 07 G 7/00, A 61 K 39/08 1 // C 12 H 1/145 SUOMI—FINLAND (21) Pwn«iw»mw-pe««i«ewBi 772305 (22) HakmnltpUvf—AiNeknlnfrftg 28.07.77 * * (23) AUaipUvi—Glltlghttadag 28.07.77c (45); λ ^ 10 ~ 'r'1 ^ ^ (51) ic ».ik? /int.a.3 C 07 G 7/00, A 61 K 39/08 1 // C 12 H 1 / 145 FINLAND — FINLAND (21) Pwn «iw» mw-pe «« i «ewBi 772305 (22) HakmnltpUvf — AiNeknlnfrftg 28.07.77 * * (23) AUaipUvi — Glltlghttadag 28.07.77
(41) Tutkit |ulkMoi — Bllvtc offwcNg q2 jQ(41) Investigate | external - Bllvtc offwcNg q2 jQ
Patentti· ja rekisterihallitus (44) Nihttvitolpanon |» kuuLlulkaium pvm. —National Board of Patents and Registration (44) Nihttvitolpanon | » month expiration date -
Patent» och registerstyrelsen 7 AnaMon utlagd oeh utl.»krlft*n pubiicarad 31.10.80 (32)(33)(31) Fppdattjr «tuoHcma—Baglrd priority 31 # 0γ # jgPatent »and register 7 AnaMon utlagd oeh utl.» Krlft * n pubiicarad 31.10.80 (32) (33) (31) Fppdattjr «TuoHcma — Baglrd priority 31 # 0γ # jg
Saksan Liittotasavalta-Förbundsrepubliken Tyskland(DE) P 2634584-6 (71) Behringwerke Aktiengesellschaft, D-3550 Marburg/Lahn, Saksan Liitto- tasavalta-Förbundsrepubliken Tyskland(DE) (72) Torsten Bertil Helting, Marburg/Lahn, Saksan Liittotasavalta-Förbunds-republiken Tyskland(DE) (7M Oy Kolster Ab (5^) Menetelmä tetanustoksiinista saadun myrkyttömän, immunogeenisen fragmentti B:n valmistamiseksi - Förfarande för framställning av ett gift-fritt, immunogent fragment B ur tetanustoxinFederal Republic of Germany-Förbundsrepubliken Tyskland (DE) P 2634584-6 (71) Behringwerke Aktiengesellschaft, D-3550 Marburg / Lahn, Federal Republic of Germany-Förbundsrepubliken Tyskland (DE) (72) Torsten Bertil Helting, Marburg / Lahn, German Liitt -Republiken Tyskland (DE) (7M Oy Kolster Ab (5 ^) Method for the preparation of a non-toxic, immunogenic fragment B derived from tetanus toxin - Förfarande för framställning av ett gift-fritt, immunogent fragment B ur tetanustoxin
Keksinnön kohteena on menetelmä tetanustoksiinista proteinaasin avulla saadun myrkyttömän, immunogeenisen tuotteen valmistamiseksi.The present invention relates to a process for the preparation of a non-toxic, immunogenic product obtained from tetanus toxin by means of a proteinase.
_ Tetanustoksiini on tunnetusti imettäväisille ja myös ihmiselle erittäin myrkyllinen ja se on ennen käyttöä immunoivana aineena tehtävä myrkyttömäksi._ Tetanustoxin is known to be very toxic to mammals and also to humans and must be rendered non-toxic before use as an immunizing agent.
On tunnettua, että tetanustoksiini voidaan tehdä myrkyttömäksi käsittelemällä formaldehydillä. Lisäksi on tunnettua, että voidaan saada myrkytön, immunogee-ninen tuote käsittelemällä tetanustoksiinia proteinaasilla. Tätä myrkytöntä, immunogeenista tuotetta nimitetään tieteellisessä kirjallisuudessa tetanus-toksiinin fragmentiksi C.It is known that tetanus toxin can be detoxified by treatment with formaldehyde. In addition, it is known that a non-toxic, immunogenic product can be obtained by treating tetanus toxin with a proteinase. This non-toxic, immunogenic product is referred to in the scientific literature as fragment C of tetanus toxin.
Julkaisussa Biochem. Biophys. Res. Commun. j>7 (1974), 1263-1279 on esitetty fraktio B:ksi nimitetyn tetanustoksiinifraktion eristäminen. Tämä fraktio B (jolla harhaanjohtavasti on sama kirjainsymboli kuin fragmentti B:llä) on yhtä myrkyllinen kuin itse tetanustoksiini. Keksinnön mukaisesti valmistettu fragmentti B, joka on ensimmäisen kerran kuvattu eristettynä tuotteena julkaisussa J. Biol. Chem. 252 (1977), s. 187-193, on sensijaan myrkytön kysymykseen tulevina käyttömäärinä.In Biochem. Biophys. Res. Commun. j> 7 (1974), 1263-1279 discloses the isolation of a tetanus toxin fraction called fraction B. This fraction B (which misleadingly has the same letter symbol as fragment B) is as toxic as the tetanus toxin itself. Fragment B prepared according to the invention, first described as an isolated product in J. Biol. Chem. 252 (1977), pp. 187-193, is instead non-toxic in questionable uses.
2 58500 Κκillä olevan keksinnön mukaisesti saadaan käsittelemällä tetanustoksiinia proteinaasilla, esimerkiksi papaiinilla, yksiselitteisesti karakterisoitavissa olevaa ainetta, joka voidaan eristää tunnetuilla biokemiallisilla menetelmillä ja jolla on erityisesti edulliset ominaisuudet; saatu fragmentiksi B nimitetty tuote on immunogeeninen ja myrkytön. Fragmentti B on siten erittäin sopiva käytettäväksi rokotteisiin jäykkäkouristusta (tetanus) vastaan.According to the invention, 2,585,500 saadaanκ is obtained by treating tetanus toxin with a proteinase, for example papain, a substance which can be unambiguously characterized, which can be isolated by known biochemical methods and which has particularly advantageous properties; the resulting product, designated fragment B, is immunogenic and non-toxic. Fragment B is thus very suitable for use in vaccines against tetanus.
Keksinnön kohteena on menetelmä tetanustoksiinista saadun myrkyttömän, im-munogeenisen tuotteen valmistamiseksi, jolla on seuraavat ominaisuudet: a) sedimentaatiovakio S°2ow 5»66 + 0,3**, b) immunologinen reaktio tetanus-antitoksiinin kanssa: osittain sama kuin tetanustoksiinin kanssa, c) immunologinen reaktio fragmentin C kanssa: ei identtinen d) geelielektroforeesilla natriumdodekyylisulfaatissa määritetty molekyyli-paino 95 ooo + 5000, e) se on didulfidisillan pelkistävillä reagensseilla jaettavissa alayksiköksi, jonka molekyylipaino on **5 000 + 2500, ja alayksiköksi, joka on immunologisesti samanlainen kuin tetanustoksiinin keveiden ketjujen tunnetut johdannaiset ja jonka molekyylipaino on U8 000 + 2500, jotka mole-kyylipainot on määritetty geelielektroforeesilla natriumdodekyylisulfaa-tissa.The invention relates to a process for the preparation of a non-toxic, immunogenic product derived from tetanus toxin having the following properties: a) sedimentation constant S ° 2ow 5 »66 + 0.3 **, b) immunological reaction with tetanus antitoxin: partly the same as with tetanus toxin, c) immunological reaction with fragment C: not identical d) molecular weight determined by gel electrophoresis in sodium dodecyl sulphate 95 ooo + 5000, e) it can be divided by reducing agents with didulfide bridge into a subunit with the same molecular weight ** 5,000 + 2500 and an immunologically similar subunit, than known derivatives of tetanus toxin light chains and having a molecular weight of U8,000 + 2500, which molecular weights have been determined by gel electrophoresis in sodium dodecyl sulfate.
Keksinnön mukaiselle menetelmälle on tunnusomaista, että tetanustoksiini-liuos hajotetaan proteinaasilla, liuos, jossa hajotuksessa syntyneet tuotteet ovat, geelisuodatetaan geelillä, joka sopii sellaisten proteiinien erottamiseen, joiden molekyylipaino on noin 100 000, jolloin eluointi suoritetaan 0,1 M tris/suolahappo-puskurilla (pH 8), jossa on 1 mol/1 natriumkloridia, ja fraktioista kerätään ne, joissa on proteiineja, joiden molekyylipaino geelielektroforeesilla natriumdode-kyylisulfaatissa mitattuna on noin 95 000 ja jotka eivät muodosta saostumaa fragmentti-C-vastaseerumin kanssa.The method according to the invention is characterized in that the tetanus toxin solution is digested with proteinase, the solution containing the degradation products is gel-filtered with a gel suitable for separating proteins with a molecular weight of about 100,000, eluting with 0.1 M Tris / hydrochloric acid buffer ( pH 8) with 1 mol / l sodium chloride, and those containing proteins with a molecular weight of about 95,000 as measured by gel electrophoresis in sodium dodecyl sulfate and which do not precipitate with fragment C anti-serum are collected.
Parametrien poikkeamarajat aiheutuvat määritysmenetelmien virherajöistä.The deviations of the parameters are due to the error limits of the analytical methods.
Sedimentaatiovakio määritettiin vesipitoisessa liuoksessa, joka oli 0,2M NaCl:n, 0,02M Na2H Ρ0^:η ja 0,03M Na HgPO^in suhteen ja jonka pH oli 6,8, T. Sved-bergin ja K.O. Pedersenin mukaan "The Ultracentrifuge", The Clarendon Press,The sedimentation constant was determined in an aqueous solution of 0.2 M NaCl, 0.02 M Na 2 H 2 O 2 and 0.03 M Na H 2 PO 4 at pH 6.8 by T. Sved-Berg and K.O. According to Pedersen, "The Ultracentrifuge", The Clarendon Press,
Oxford, 19*+0, analyyttisen ultrasentrifugin kerrostuskennossa Vinogradin mukaan,Oxford, 19 * + 0, in an analytical ultracentrifuge deposition cell according to Vinograd,
Proc.Acad.Sei. USA, 1*9, 902 (1963). Fragmenttia C sisältävän koeliuoksen kerrostaminen tapahtui IM NaCl-liuokseLla, jonka pH-arvo oli 7,0.Proc.Acad.Sei. USA, 1 * 9, 902 (1963). The test solution containing fragment C was layered with 1M NaCl solution having a pH of 7.0.
Immunologinen reaktiivisuus testattiin käyttäen vastaseerumeita, joita saatiin immunoimalla kaniineja tetanus-toksoidilla tai keksinnön mukaisella fragmentti C :11a. Käytettiin tunnettua kaksoisdiffuusiomenetelmää. Tämän menetelmän avulla voidaan osoittaa, että aikaisemmin kuvattu fragmentti C poikkeaa yksiselitteisesti keksinnön mukaisesti valmistetusta fragmentista B. Voitiin myös osoittaa, että fragmentti B voidaan jakaa kahteen osaan,joista toisella on samanlainen immunologinen käyttäytyminen kuin DE-hakemusjulkaisussa 2 *+57 0*+7 kuvatulla kevyen ketjun johdan- 3 58500 naisella.Immunological reactivity was tested using antisera obtained by immunizing rabbits with tetanus toxoid or fragment C of the invention. A known double diffusion method was used. By this method it can be shown that the previously described fragment C differs unambiguously from the fragment B prepared according to the invention. It could also be shown that the fragment B can be divided into two parts, one of which has similar immunological behavior to that described in DE 2 * + 57 0 * + 7. light chain management- 3,500,500 women.
Geelielektroforeesi 7~#:sessa polyakryyliamidigeelissä suoritettiin K.Gel electrophoresis on a 7 ~ polyacrylamide gel was performed on K.
Weberin ja M. Osbornen mukaisesti, J. Biol. Chem., nide 2HU, UU06-UU12 (1969)·According to Weber and M. Osborne, J. Biol. Chem., Volume 2HU, UU06-UU12 (1969) ·
Ennen geelielektroforeesin suorittamista laimennettiin analysoitavat näytteet natriumdodekyylisulfaatin vesiliuoksella 1 %:n pitoisuuteen ja pidettiin minuutin ajan kiehuvassa vedessä. Molekyylipainon laskeminen tapahtui vertaamalla mole-kyylipainomäärityksiin tarkoitettuihin standardiaineisiin (aldolaasiin ja kata-laasiin, joita toimittaa firma Boehringer, Mannheim, Kat.Nr. 15 575 -"Eichproteine Grösse II"). Laskentamenetelmä on esitetty edellä mainitussa Weberin ja Osbornen julkaisussa.Prior to performing gel electrophoresis, the samples to be analyzed were diluted with 1% aqueous sodium dodecyl sulfate to a concentration of 1% and kept in boiling water for one minute. Molecular weight was calculated by comparison with standard materials for Mole weight assays (aldolase and catalase, supplied by Boehringer, Mannheim, Cat. No. 15,575 - "Eichproteine Grösse II"). The calculation method is presented in Weber and Osborne, cited above.
Uusi myrkytön, immunogeeninen, tetanustoksiinin fragmentti B:ksi nimitetty tuote voidaan saada DE-hakemusjulkaisussa 25 10 987 kuvatulla menetelmällä käsittelemällä tetanustoksiinia proteinaasilla. Eräässä edullisessa suoritusmuodossa saadaan fragmenttia B käsittelemällä tetanustoksiinia, jota voidaan saada Clostridium " tetanin viljelysuodoksista ioninvaihtokromatografiaa käyttäen, papaiinilla, edul lisesti kantajaan sidottuna, pelkistävän aineen läsnäollessa.A new non-toxic, immunogenic, tetanustoxin fragment B product can be obtained by the method described in DE-A-25 10 987 by treating tetanus toxin with a proteinase. In a preferred embodiment, fragment B is obtained by treating a tetanus toxin obtainable from culture filtrates of Clostridium tetanus using ion exchange chromatography, with papain, preferably bound to a support, in the presence of a reducing agent.
Tällöin on osoittautunut hyödylliseksi valita inkuboimislämpötila tavallista korkeammaksi, ts. väliltä 30-60°C, edullisesti väliltä ^5-55°C. Tällä toimenpiteellä voidaan keksinnön mukaisesti valmistetun tuotteen saantoa lisätä. Tetanustoksiinin proteolyyttisen käsittelyn jälkeenpoistetaan kantajaan sidottu entsyymi reaktioseoksesta, edullisesti linkoamalla, ja jäljelle jäänyt liuos fraktioidaan mo-lekyyliseulalla. Edullisesti käytetään tällöin epikloorihydriinillä ristisidottua dekstraania, esimerkiksi Sephadexv G 100, jota tuottaa firma Pharmacia, Uppsala, (R) (p) tai Ultragel' , tuottaa LKB, Bromma, tai Bio-gel p , tuottaa Bio-Rad Laboratories, Richmond, Calif..In this case, it has proved useful to select an incubation temperature higher than usual, i.e. between 30-60 ° C, preferably between ^ 5-55 ° C. By this measure, the yield of the product prepared according to the invention can be increased. After proteolytic treatment of the tetanus toxin, the enzyme bound to the support is removed from the reaction mixture, preferably by centrifugation, and the remaining solution is fractionated through a molecular sieve. Preferably, epichlorohydrin-crosslinked dextran is used, for example Sephadexv G 100, manufactured by Pharmacia, Uppsala, (R) (p) or Ultragel ', produced by LKB, Bromma, or Bio-gel p, produced by Bio-Rad Laboratories, Richmond, Calif. .
Mikäli käytetään liukoista entsyymivalmistetta, tapahtuu entsyymin erottaminen molekyyliseulafraktiointia suoritettaessa.If a soluble enzyme preparation is used, the enzyme is separated during molecular sieve fractionation.
Heti kun fragmenttia B tällä tavalla kerran on saatu, voidaan valmistaa sen vastaseerumi immunoimalla koe-eläimiä fragmentilla B, jonka vastaseerumin avulla tavalliseen tapaan voidaan saada immunoadsorbentti. Tätä puolestaan voidaan käyttää fragmentin B erityisen puhtaan muodon valmistamiseen edellä mainitun käymisliuoksen inkuboimispanoksesta.Once fragment B has been obtained in this way, its antiserum can be prepared by immunizing experimental animals with fragment B, which antiserum can be used to obtain an immunoadsorbent in the usual manner. This in turn can be used to prepare a particularly pure form of fragment B from the incubation batch of the above fermentation broth.
Myös fragmentin C tai tetanustoksiinin poistaminen seoksesta, jossa on fragmenttia B, voidaan suorittaa immunoadsorptiivisesti. Tätä varten valmistetaan ensin vastaseerumi tunnettua fragmenttia C vastaan. Tällä vastaseerumilla voidaan tavallisella tavalla saada immunoadsorbentti. Tällä puolestaan voidaan poistaa fragmentin C ja tetanustoksiinin jäännökset fragmentista B, koska sekä fragmentti C että myös tetanustoksiini reagoivat fragmentti C-vastaseerumin kanssa, mutta eivät fragmentin B kanssa.Removal of fragment C or tetanus toxin from the mixture containing fragment B can also be performed immunoadsorbently. To this end, an antiserum against a known fragment C is first prepared. An immunoadsorbent can be obtained with this antiserum in the usual manner. This, in turn, can remove residues of fragment C and tetanus toxin from fragment B, since both fragment C and tetanustoxin react with fragment C antiserum, but not with fragment B.
ι> 5 8500ι> 5 8500
Tetanustoksiinista saatava fragmentti B osoittautui vertailtaessa tetanus-toksiiniin myrkyttömäksi. Tetanustoksiini sisältää. 30 x 10^ ja fragmentti B 5 kuolettavaa vähimmäisannosta (MLD) mg:aa proteiinia kohti. Fragmentti B osoittautui myrkyllisyysoireiden suhteen tetanustoksiinista täysin poikkeavaksi: se ei aiheuta spastiselle halvautumiselle ominaisia oireita. Huolimatta myrkyllisyyden alentu- g misesta 1 : 6 x 10 -osaan, on tarkoituksenmukaista käsitellä fragmenttia B aldehy-dillä, kuten seuraavassa kuvataan.Fragment B from tetanus toxin proved to be non-toxic when compared to tetanus toxin. Tetanust toxin contains. 30 x 10 4 and fragment B 5 of the minimum lethal dose (MLD) per mg of protein. Fragment B proved to be completely different from tetanus toxin in terms of toxicity symptoms: it does not cause the symptoms characteristic of spastic paralysis. Despite the reduction in toxicity to 1: 6 x 10, it is appropriate to treat fragment B with an aldehyde as described below.
Adsorptiokokeilla voidaan osoittaa, että noin puolet kaikista tetanustoksiinin vasta-aineista ovat fragmentin B vasta-aineita.Adsorption experiments can show that about half of all tetanus toxin antibodies are antibodies to fragment B.
Keksintöä valaistaan nyt lähemmin seuraavan esimerkin avulla.The invention will now be further illustrated by the following example.
EsimerkkiExample
Clostridium tetani-viljelmässä muodostunut toksiini adsorboidaan dietyyli-aminoetyyliselluloosa-ioninvaihtimella ja eluoidaan fosfaattipuskurin (pH-arvo 7) nousevalla moolisuus-gradientilla 0,01-molaarisesta 0,U-molaariseen. Toksiinia sisältävät jakeet jaetaan vielä kromatografisesti pylväässä, joka on täytetty Sephadex^ G 100:11a (epikloorihydriini-verkkoutettu dekstraani, valmistaja Pharmacia, Uppsala, Ruotsi), ja toksiinia sisältävät jakeet otetaan talteen ja yhdistetään.The toxin formed in the Clostridium tetani culture is adsorbed on a diethylaminoethylcellulose ion exchanger and eluted with an increasing molarity gradient of phosphate buffer (pH 7) from 0.01 molar to 0.1 U molar. The toxin-containing fractions are further chromatographed on a column packed with Sephadex® G 100 (epichlorohydrin-crosslinked dextran, manufactured by Pharmacia, Uppsala, Sweden), and the toxin-containing fractions are collected and combined.
2,5 g tetanustoksiinia liuoksessa, jonka loppuväkevyys on 15 mg tetanus-toksiinia/ml 0,1-m fosfaattipuskuria, jonka pH on 6,5 ja joka sisältää 0,01-m Na^EDTA ja 0,001-m kysteiini-HCl, sekoitetaan 1*0 mg:n kanssa papaiinia. Papaiini sisältää 30 yksikköä entsymaattista aktiivisuutta/mg ainetta. Ensin seosta pidetään tunnin ajan U50C:ssa ja sen jälkeen vielä 2 tuntia 55°C:ssa.2.5 g of tetanus toxin in a solution with a final concentration of 15 mg tetanus toxin / ml in 0.1 M phosphate buffer, pH 6.5, containing 0.01 M Na 2 EDTA and 0.001 M cysteine HCl are mixed With 1 * 0 mg of papain. Papain contains 30 units of enzymatic activity / mg of substance. The mixture is first kept for one hour at 50 ° C and then for a further 2 hours at 55 ° C.
Tetanustoksiinin erottamista varten voidaan edullisesti käyttää myös kantajaan immobilisoitua papaiinia.Papain immobilized on a carrier can also be advantageously used for the separation of tetanus toxin.
Tämän valmistamiseksi saatetaan 0,1-m Na^CO^-puskuriaipH-arvo 10,0) vastaan dialysoitua liuosta yhteen 500 ml:n kanssa papaiinia, jossa on 50 mg/ml syaanibromidilla aktivoitua agaroosigeeliä ja annetaan olla 2k tuntia U°C:ssa. Useampaan kertaan k moolia virtsa-ainetta ja 0,5 moolia NaCl/l sisältävällä liuoksella pestyä reaktiotuotetta käytetään samalla tavalla kuin liukoista entsyymiä tetanustoksiinin proteolyyttisessä fraktioinnissa.To prepare this, a solution dialyzed against 0.1 M Na 2 CO 2 buffer (10.0) is combined with 500 ml of papain on a 50 mg / ml cyanogen bromide-activated agarose gel and allowed to stand for 2 hours at U ° C. . The reaction product, which has been washed several times with a solution containing k moles of urea and 0.5 moles of NaCl / l, is used in the same way as the soluble enzyme in the proteolytic fractionation of tetanus toxin.
Papaiinikäsittelyn jälkeen seos saa jäähtyä, sitä väkevöidään ultrasuodat-timen avulla ja se pannaan 10 x 100 cm pylvääseen, joka on täytetty Sephadex' ‘ G 100:11a. Eluoiminen tapahtuu 0,1-m trishydroksimetyyliaminometaani-kloorivety-happopuskurilla, jonka pH-arvo on 8,0 ja joka sisältää 1 moolin NaCl/l.After the papain treatment, the mixture is allowed to cool, concentrated by means of an ultrafilter and applied to a 10 x 100 cm column packed with Sephadex '' G 100. Elution is carried out with a 0.1 M trishydroxymethylaminomethane-hydrochloric acid buffer having a pH of 8.0 and containing 1 mol of NaCl / l.
Eluoinnin aikana mitataan jatkuvati adsorptio aaltopituudella 280 nm.During elution, the adsorption is continuously measured at 280 nm.
Jakeet, jotka tällä alueella osoittavat adsorptiota, otetaan erikseen talteen. Saadaan neljä jaetta, joista ensimmäinen antaa kaksoishuipun.Fractions showing adsorption in this range are collected separately. Four fractions are obtained, the first of which gives a double peak.
5 585005,585,500
Toistamalla kromatografointi samoissa olosuhteissa erotetaan kaksoishuiput toisistaan ja lopuksi eristetään 2. huippu. Tämä sisältää keksinnön mukaisen myrkyttömän, immunogeenisen tuotteen, tetanustoksiinin fragmentin B.By repeating the chromatography under the same conditions, the double peaks are separated and finally the 2nd peak is isolated. This includes fragment B of the non-toxic, immunogenic product of the invention, tetanus toxin.
Erityisen yksinkertaisesti saadaan keksinnön mukainen fragmentti B talteen, kun vastaseerumia, joka kohdistuu tunnettua fragmenttia C vastaan (10 ml, jossa 1 000 IU/ml), tavalliseen tapaan sidotaan BrCN-aktivoituun agaroosiin, ja senjäl-keen sekoitetaan geelikromatografisesti osittain puhdistettu fragmentin B preparaatti tällaisen immunoadsorbentin kanssa, βθ-minuuttisen sekoittamisen jälkeen erotetaan geeli siihen sitoutuneiden epäpuhtauksien kanssa ja fragmentti B saadaan talteen toistetulla geelikromatografoinnilla.Particularly simply, fragment B of the invention is recovered by binding anti-serum against a known fragment C (10 ml with 1000 IU / ml) to BrCN-activated agarose in the usual manner, and then mixing the gel-chromatographed partially purified preparation of fragment B with such with an immunoadsorbent, after βθ-minute mixing, the gel is separated with the impurities bound to it and fragment B is recovered by repeated gel chromatography.
„ On myös mahdollista neutraloida epäpuhtaudet lisäämällä vastafragmentti C- vastaseerumia (igG-jae) ja erottaa immuunikompleksi geelikromatografisesti fragmentista B.“It is also possible to neutralize the impurities by adding the anti-fragment C anti-serum (IgG fraction) and separating the immune complex by gel chromatography from fragment B.
Keksinnön mukainen fragmentti B voidaan saada talteen myös valmistamalla aikaisemmin valmistetun fragmentin B avulla vastaseerumi, ja sitä käyttäen immuno-adsorbentti fragmentille B. Tällöin voidaan käyttää hyväksi tunnettuja menetelmiä. Immunoadsorbentin avulla fragmentti B adsorboidaan selektiivisesti tetanustoksiinin proteinaasikäsittelyssä muodostuneiden reaktiotuotteiden seoksesta, minkä jälkeen se voidaan selektiivisesti eluoida immunoadsorbentista.Fragment B according to the invention can also be recovered by preparing an antiserum with the previously prepared fragment B, and using it as an immuno-adsorbent for fragment B. In this case, well-known methods can be used. Using an immunoadsorbent, fragment B is selectively adsorbed from a mixture of reaction products formed in the proteinase treatment of tetanus toxin, after which it can be selectively eluted from the immunoadsorbent.
Claims (1)
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE2634584 | 1976-07-31 | ||
| DE2634584A DE2634584C3 (en) | 1976-07-31 | 1976-07-31 | Atoxic, immunogenic product from tetanus toxin |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| FI772305A FI772305A (en) | 1978-02-01 |
| FI58500B true FI58500B (en) | 1980-10-31 |
| FI58500C FI58500C (en) | 1981-02-10 |
Family
ID=5984461
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FI772305A FI58500C (en) | 1976-07-31 | 1977-07-28 | REFERENCE TO A FRAME RELEASE BETWEEN IMMUNOGENT FRAGMENT AND TETANUS TOXIN |
Country Status (18)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS5326319A (en) |
| AT (1) | AT362498B (en) |
| AU (1) | AU516191B2 (en) |
| BE (1) | BE857373A (en) |
| CA (1) | CA1099635A (en) |
| DE (1) | DE2634584C3 (en) |
| DK (1) | DK342577A (en) |
| EG (1) | EG12732A (en) |
| FI (1) | FI58500C (en) |
| FR (1) | FR2360315A1 (en) |
| GB (1) | GB1570958A (en) |
| IE (1) | IE45539B1 (en) |
| IL (1) | IL52617A (en) |
| IT (1) | IT1085660B (en) |
| LU (1) | LU77874A1 (en) |
| NL (1) | NL7708279A (en) |
| NO (1) | NO772704L (en) |
| SE (1) | SE7708693L (en) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB8516442D0 (en) * | 1985-06-28 | 1985-07-31 | Wellcome Found | Cloned antigen |
-
1976
- 1976-07-31 DE DE2634584A patent/DE2634584C3/en not_active Expired
-
1977
- 1977-07-26 NL NL7708279A patent/NL7708279A/en not_active Application Discontinuation
- 1977-07-27 EG EG446/77A patent/EG12732A/en active
- 1977-07-27 AU AU27380/77A patent/AU516191B2/en not_active Expired
- 1977-07-28 FI FI772305A patent/FI58500C/en not_active IP Right Cessation
- 1977-07-28 SE SE7708693A patent/SE7708693L/en not_active Application Discontinuation
- 1977-07-29 AT AT563477A patent/AT362498B/en not_active IP Right Cessation
- 1977-07-29 NO NO772704A patent/NO772704L/en unknown
- 1977-07-29 IL IL52617A patent/IL52617A/en unknown
- 1977-07-29 LU LU77874A patent/LU77874A1/xx unknown
- 1977-07-29 IT IT26354/77A patent/IT1085660B/en active
- 1977-07-29 CA CA283,802A patent/CA1099635A/en not_active Expired
- 1977-07-29 IE IE1590/77A patent/IE45539B1/en unknown
- 1977-07-29 JP JP9213677A patent/JPS5326319A/en active Pending
- 1977-07-29 GB GB31968/77A patent/GB1570958A/en not_active Expired
- 1977-07-29 DK DK342577A patent/DK342577A/en not_active Application Discontinuation
- 1977-08-01 FR FR7723600A patent/FR2360315A1/en active Granted
- 1977-08-01 BE BE179821A patent/BE857373A/en unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| FI772305A (en) | 1978-02-01 |
| JPS5326319A (en) | 1978-03-11 |
| FR2360315A1 (en) | 1978-03-03 |
| AT362498B (en) | 1981-05-25 |
| EG12732A (en) | 1979-09-30 |
| AU516191B2 (en) | 1981-05-21 |
| DE2634584B2 (en) | 1979-03-22 |
| AU2738077A (en) | 1979-02-01 |
| NO772704L (en) | 1978-02-01 |
| DE2634584C3 (en) | 1979-11-08 |
| LU77874A1 (en) | 1978-02-02 |
| IT1085660B (en) | 1985-05-28 |
| DK342577A (en) | 1978-02-01 |
| DE2634584A1 (en) | 1978-02-02 |
| NL7708279A (en) | 1978-02-02 |
| IE45539L (en) | 1978-01-31 |
| FR2360315B1 (en) | 1980-04-11 |
| CA1099635A (en) | 1981-04-21 |
| BE857373A (en) | 1978-02-01 |
| IL52617A (en) | 1980-12-31 |
| FI58500C (en) | 1981-02-10 |
| IE45539B1 (en) | 1982-09-22 |
| GB1570958A (en) | 1980-07-09 |
| ATA563477A (en) | 1980-10-15 |
| IL52617A0 (en) | 1977-10-31 |
| SE7708693L (en) | 1978-02-01 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Rush et al. | The interaction of dopamine-β-hydroxylase with concanavalin A and its use in enzyme purification | |
| Olins et al. | Reconstitution of 7S molecules from L and H polypeptide chains of antibodies and γ-globulins | |
| Willis et al. | Preparation of the periplasmic binding proteins from Salmonella typhimurium and Escherichia coli | |
| Goldberg | Immunochemical specificity of lactate dehydrogenase-X | |
| Elovson | Biogenesis of plasma membrane glycoproteins. Purification and properties of two rat liver plasma membrane glycoproteins. | |
| Yan et al. | Multiple forms of pyrophosphate: D-fructose-6-phosphate 1-phosphotransferase from wheat seedlings. Regulation by fructose 2, 6-bisphosphate. | |
| Buchanan et al. | Activation of the cell wall degrading protease, lysin, during sexual signalling in Chlamydomonas: the enzyme is stored as an inactive, higher relative molecular mass precursor in the periplasm. | |
| Hoffschulte et al. | Identification of a soluble SecA/SecB complex by means of a subfractionated cell-free export system. | |
| Kawashima et al. | Studies on fraction I protein: II. Comparison of physical, chemical, immunological and enzymatic properties between spinach and tobacco fraction I proteins | |
| JPH03191789A (en) | Purification of antigenic protein of 69000 dalton from pertussis bacteria | |
| Crofton | Site of alkaline phosphatase attachment in alkaline phosphatase-immunoglobulin G complexes | |
| Heumann et al. | Purification and immunological characterization of the human hexokinase isoenzymes I and III (ATP-D-hexose 6-phosphotransferase EC 2.7. 1.1) | |
| Jenkins et al. | Extracellular antigens from Listeria monocytogenes I. purification and resolution of hemolytic and lipolytic antigens from culture filtrates of Listeria monocytogenes | |
| JPH07502896A (en) | Multifunctional surface proteins of streptococci | |
| FI58500B (en) | REFERENCE TO A FRAME RELEASE BETWEEN IMMUNOGENT FRAGMENT AND TETANUS TOXIN | |
| Mocali et al. | Transketolase from human leukocytes: Isolation, properties and induction of polyclonal antibodies | |
| KR910002957B1 (en) | Process and reagent for the specificic determination of pancreatic alpha-amylase | |
| Phillips et al. | Immunological characterization of human liver α-d-mannosidase | |
| EP0298991B1 (en) | Novel lectins derived from bacterial pili | |
| Lerman | Characterization of the insoluble protein fraction in the ocular lens | |
| Suzuki et al. | Isolation and some properties of glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase from vegetative cells of Bacillus cereus | |
| Wallace et al. | Hapten-sandwich labeling. IV. Improved procedures and non-cross-reacting hapten reagents for double-labeling cell surface antigens | |
| JPS60146154A (en) | Osteocarcin related derivative | |
| Curry et al. | Purification and crystallization of three isoenzymes of malate dehydrogenase from Zea mays seed | |
| RU2230325C2 (en) | Method for preparing purified preparation of botulinic toxin type a |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM | Patent lapsed |
Owner name: BEHRINGWERKE AKTIENGESELLSCHAFT |