NO772704L - Atoksisk, immunogent produkt av tetanus-toksin - Google Patents

Description

Atoksisk, immunogent produkt av tetanus-toksin.

Oppfinnelsen vedrører et atoksi.sk, immunogent produkt som kan fåes av tetanus-toksin ved hjelp av en proteinase. Den vedrører videre en tetanus-vaksine inneholdende det nye produkt.

Tetanus-toksin er som kjent, høy-toksisk overfor pattedyr og også mennesker og må for dets anvendelse som immu-niserende stoff avgiftes. Det er kjent at tetanus-toksin er å avgifte ved at det behandles med formaldehyd. Det er videre kjent at et atoksisk, immunogent produkt kan fåes ved behandling av tetanus-toksin med en proteinase. Dette atoksiske, immunogene produkt betegnes i den vitenskapelige litteratur som fragment C av tetanus-toksinet.

Det er nå overraskende funnet at ved behandling av tetanus-toksin med en proteinase, fortrinnsvis med papain, opp-står et ytterligere kjemisk entydig karakteriserbart stoff med spesielt fordelaktige egenskaper som kan isoleres.etter kjente biokjemiske fremgangsmåter.

Til de spesielt fordelaktige egenskaper av det som fragment Bo betegnede produkt hører dels manglende toksisitet og dets immunogenitet. Disse egenskaper gjør produktet egnet som bestanddel av vaksiner mot tetanus.

Oppfinnelsens gjenstand er følgelig et atoksisk, immunogent produkt oppnådd fra tetanus-toksin ved dets behandling med en proteinase, fortrinnsvis papain, idet produktet erkarakterisert vedfølgende parametre:

1. Sedimentasjonskonstant S°ow5,66-0,34

2. Immunologisk reaksjon med tetanus-antitoksin:

partielt identisk med det av tetanus-toksin.

3. Immunologisk reaksjon med fragment C: ikke identisk.

4. Molekylvekt, bestemt ved gel-elektroforese i natriumdodecylsulfat, 95.000 - 5000. 5. Ved reduksjon spaltbart i en underenhet med en molekylvekt på 45.000 - 2.500

og en med det kjente derivat av de lette kjeder av tetanus-toksin immunologisk identisk underenhet med

en molekylvekt på 48.000 2.500 (hver gang bestemt

i natrium-dodecylsulfat-elektroforese).

De i parametrene gjengitte svingningsbredder beror på feilgrenser innen bestemmelsesmetodene.

Sedimentasjonskonstantene ble bestemt i en vandig opp-løsning av 0,2M NaCl, 0,02M Na2H P04, 0,03M Na H2P04ved en pH

på 6,8 ifølge T. Svendberg og K.O. Pedersen "The Ultra-centrifuge", The Clarendon Press, Oxford, 1940, i en oversiktningscelle av en analyttisk ultrasentrifuge i tilknytning til Vinograd, Proc.Acad. Sei. USA, 49, 902 (1963). Oversiktningen av den prøveoppløsning

som inneholder produktet ifølge oppfinnelsen foregikk på 1 M Nacl-oppløsning av pH-verdi 7,0.

Den immunologiske reaktivitet ble undersøkt under anvendelse av antisera, som ble dannet ved immunisering av kaniner med tetanus-toksid eller fragment C ifølge oppfinnelsen. Det ble anvendt den kjente dobbelt-diffusjonsteknikk. Ved hjelp av denne teknikk kan det vises at det tidligere omtalte fragment C at-skiller seg entydig fra fragment B ifølge oppfinnelsen. Som det videre kunne vises er fragment B å oppdele i to spaltstykker hvorav det ene viser det samme immunologiske forhold som deri-vatet av den lette kjede som er omtalt i tysk patent nr. (tysk søknad nr. P 25 57-047 /HOE 74/B 028).

Gel-elektroforesen i en 7%-ig polyakrylamidgel under anvendelse av natriumdodecylsulfat som bestanddel av elektroforese-pufferen ble gjennomført ifølge K. Weber og M. Osborn, J.Biol. Chem., Vol. 244, 4406 - 4412 (1969). Før gjennomføringen av gel-elektrof oresen ble prøvene som skulle analyseres i vandig oppløs-ning blandet med natriumdodecylsulfat inntil en konsentrasjon på

1% og holdt 1 minutt i kokende vann. Beregningen av molekylvekten foregikk ved sammenlikning med standardstoffer for molekylvekt-bestemmelser (aldolase og katalase, oppnådd gjennom firmaet Boehringer, Mannheim, Kat. Nr. 15 575 - "Eichproteine Grosse II"). Beregningsmetoden er angitt i ovennevnte arbeid av Weber og Osborn.

Det nye atoksiske, immunogene som fragment B av tetanus-toksin betegnede produkt er oppnåelig etter den i tysk søknad P 25 10 987 (HOE 73/B 018) omtalte fremgangsmåte ved behandling av tetanus-toksin med en proteinase.

I en foretrukket utførelsesform oppnås fragment B ved behandling av tetanus-toksin, som kan fremstilles fra kultur-filtrater av Clostrium-Tetani ved ioneutvekslingskromatografi med papain, fortrinnsvis i bærebundet form i nærvær av et redu-serende stoff.

Det har da vist seg nyttig å velge inkubasjonstempera-turen høyere enn vanlig, d.v.s. mellom 30 og 60°C, fortrinnsvis mellom 45 og 55°C. Ved denne forholdsregel kan utbyttet av produktet ifølge oppfinnelsen økes. Etter den proteolyttiske inn-virkning på tetanus-toksinet fjernes det bærebundne enzym fra reaksjonsblandingen hensiktsmessig ved sentrifugering, og den gjengivende oppløsning underkastes en molekylsiktfraksjonering. Fordelaktig hardet derved vist seg anvendelsen av med epiklorhy-(R)

drin-nettdannet dextran, eksempelvis "Sephadex G 100 fra firmaet Pharmacia, Uppsala eller"Ultrogel(R)" fra LKB, Bromma

(R)

eller "Bio-Gel p fra Bio-Rad Laboratories, Richmond, Calif.

I tilfellet at det anvendes et oppløselig enzymprepar-at skjer atskillelsen av enzymet ved gjennomføring av molekyl-siktf raksjoneringen.

Så snart fragment B en gang.er oppnådd på denne måten, lar det seg dermed fremstille et antiserum ved immunisering av forsøksdyr med fragment B, med hvis hjelp det på vanlig måte kan fremstilles en immunadsorbens. Denne er igjen egnet til å utvinne fragment B i spesielt ren form fra inkubasjonsblandingen av nevnte fermentasjonsoppløsning.

Også fjerning av fragment C eller tetanus-toksin fra en blanding med fragment B, lar seg oppnå immunadsorptivt. Dertil fremstilles i første rekke et antiserum mot det kjente fragment C. Med dette antiserum kan det på vanlig måte fremstilles et immunadsorbens. Dette er igjen egnet til å fjerne rester av fragment C og av tetanus-toksin fra fragment B, da såvel fragment C som også tetanus-toksin reagerer med anti-fragment C-serum, imidlertid„;.ikke fragment B. ■

Andre isoleringsf remgangsmåter som o står til disposi-sjon for fagfolk til atskillelse av protein av forskjellig .elek- trisk ladning fører likeledes til resultat. Det er spesielt elek-troforetisk og ioneutvekslings-kromatografi-fremgangsmåter.

Dette på denne måten oppnådde rene fragment B av tetanus-toksin viser seg sammenliknet med tetanus-toksin som ikke toksisk. Mens man ved tetanus-toksin pr. mg påviser 30 x 10g minimal dødelig dose, har fragment B 5 minimal dødelig dose pr.mg. Fragment B viser seg med hensyn til den toksiske foreteelse helt forskjellig til tetanus-toksin, den viser ikke de ved spastisk paralyse karakteriserte foreteelser. På tross av nedsettelse av toksisiteten til 1 : 6 x 10 er det hensiktsmessig som omtalt i det følgende å behandle fragment B med et aldehyd.

For denne behandling behandles det ved hjelp av proteinase fremstilte produkt etter dets isolering med en proteinkonsen-trasjon på ca. 1 mg protein pr. ml. eller mindre enn en puffer-oppløsning på pH-verdi 6,0 - 8,5, fortrinnsvis 7,8, og en molaritet av pufferoppløsningen på 0,01 - 0,2 M med 0,015 - 0,3 M av et alifatisk mono- eller dialdehyd med 1-6 karbonatomer, fortrinnsvis formaldehyd i 14 - 28 dager ved 20 - ^37°C. Produktet kan hvis ønsket underkastes en 10 - 20, fortrinnsvis 15 timers dialyse mot en fysiologisk tålbar oppløsning som 0,15 molar natriumklorid og/eller sterilfiltreres. For fremstilling av en vaksine blandes produktet hensiktsmessig dessuten med et adju-vans, f.eks. aluminiumhydroksyd. Ved fortynning med en fysiologisk tålbar oppløsning som 0,15 molar natriumkloridoppløsning inn-stilles konsentrasjonen på det ønskede antigeninnhold.

Denne vaksine kan anvendes alene, men også i kombina-sjon med andre vaksiner. Til kombinasjonen egner det seg spesielt difterietoksoid, pertussisimmunogen, poliomyelittvira eller meslinger-vira. Ved adsorpsjonsforsøk kan man vise at om-trent halvparten av alle mot tetanus-toksin rettede beskyttende antilegemer er rettet mot fragment B.

Oppfinnelsen skal forklares nærmere ved hjelp av noen eksempler.

Eksempel 1.

Clostrium-Tetani fermenteres i et latam-medium. Det derved dannede toksin absorberes på dietylaminoetylcellulose-ioneut-veksler og elueres ved hjelp av en gradientøkende molaritet av en

fosfatpuffer av pH-verdi 7 fra 0,01 mol til 0,4 mol. Fraksjonene

.som inneholder toksinet oppdeles igjen ved en kromatografi på en

søyle som er fylt med "Sephadex(R)" G 100 og fraksjoner som inneholder toksinet utvinnes og forenes.

2,5 g tetanus-toksin i en oppløsning med en sluttkonsen-trasjon på 15 mg tetanus-toksin/ml av en 0,1 mol fosfatpuffer pH 6,5 inneholdende 0,01 mol Na2EDTA og 0,001 mol cystein HC1 blandes med 40 mg papain. Papainet inneholder 30 enheter enzym-atrisk aktivitet/mg stoff. I første rekke holdes blandingen i en time ved 45°C, deretter ytterligere i 2 timer ved 55°C.

For spaltningen av tetanus-toksinet kan det fortrinnsvis også anvendes bærebundet papain.

Hertil sammenbringer en mot 0,1 mol Na^O^-puffer av pH-verdi 10,0 dialysert oppløsning av 500 ml papain med 50 mg/ml med en ved hjelp av cyanbromid-aktivert agarosegel og hensettes i 24 timer ved 4°C. Det flere ganger med en 4 mol urinstoff og 0,5 mol NaCl pr. liter holdige oppløsning vaskede reaksjonspro-dukt anvendes analogt til det oppløselige enzym for den proteolyttiske spaltning av tetanus-toksinet.

Etter blandingens avkjøling inndampes volumet ved hjelp av ultrafilter og deretter påføres på en 10 x 100 cm lang

(R)

søyle, fylt med "Sephadex " G 100. Elueringen foregår med 0,1 M trishydroksymetylaminometan-saltsyrepuffer av pH-verdi 8,0, inneholdende 1 mol NaCl.

Under elueringen foregår kontinuerlig måling av adsorp-sjonen i området til bølgelengdene på 280 nm. Fraksjonene som i dette området viser en adsorpsjon, oppfanges atskilt. Det opp-står 4 fraksjoner, idet den første danner en dobbelttopp.

Ved en gjentatt kromatografi under de samme betingelser trekkes dobbelttoppen fra hverandre og endelig isoleres 2. topp. Denne inneholder det ifølge oppfinnelsen atoksiske, immunogene produkt, fragment B av tetanus-toksin.

Spesielt enkelt lar fragment B ifølge oppfinnelsen seg utvinne når man binder antiserum rettet mot det kjente fragment C (10 ml med 1000 IU/ml) på vanlig måte til Br-CN-aktivert agarose og deretter sammenblander et ved gel-kromatografi partielt renset preparat av fragment B med et slikt immunadsorbens. Etter 60 minutters omrøring atskilles gelen de dertil bundne forurens-ninger og fragment B utvinnes ved hjelp av en gjentatt gel-kromatograf i .

Det er også mulig å nøytralisere forurensningene ved tilsetning av antifragment C-antiserum (IgG fraksjon) og å at-skille immunkomplekset ved gel-kromatografi fra fragment B.

Endelig lar fragment B ifølge oppfinnelsen seg også fremstille når det ved hjelp av et engang fremstillet fragment B over et antiserum fremstilles et immunadsorbens for fragment B. Man kan derved betjene seg av kjente fremgangsmåter. Ved hjelp av immunadsorbenset adsorberes fragment B selektivt fra blandingen med andre reaksjonsprodukter fra proteinasebehandlingen av tetanus-toksinet selektivt, hvoretter det kan elueres selektivt fra immunadsorbens.

Eksempel 2.

Fragment B fortynnes med 0,1 molar fosfatpufferoppløs-ning av pH-verdi 6,5 til 200 yug pr. ml og blandes med 0,06% formaldehyd og hensettes ved 37 oC i 21 dager. Deretter dialyseres mot et flere ganger volum 0,15 natriumkloridoppløsning i 16 timer og forarbeides på vanlig måte til en vaksine.

Claims (8)

1. Atoksisk, immunogent produkt av tetanus-toksin, karakterisert ved følgende parametre: a) sedimentasjonskonstanter S°qw 5,66 - 0,34 , b) immunologisk reaksjon med tetanus-antitoksin: partielt identisk med det fra tetanus-toksin, ci immunologisk reaksjon med fragment C: ikke identisk, d) molekylvekt bestemt ved gel-elektroforese i natrium-dodecylsulf at , 95.000 - 5.000, e) ved reduksjon spaltbart i en underenhet med en molekylvekt på 45.000 - 2.5000 og en med det kjente derivat av de lette kjeder av tetanus-toksin immunologisk identisk underenhet med molekylvekt på 48.000 - 2.500 (hver gang bestemt i natriumdodecylsulfat-elektroforese).

2. Fremgangsmåte til fremstilling av det atoksiske, immunogene produkt ifølge krav 1, karakterisert ved at det ved behandling av tetanus-toksin med en proteinase oppnådde produkt fremstilles ved molekylsikt-fraksjonering, immunadsorpsjon, elektroforese og/eller ioneutvekslings-kromatografi.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 2, karakterisert ved at produktet behandles med en pH-verdi på 0,6 - 8,5 med 0,015 - 0,3 M av et alifatisk mono- eller dialdehyd med 1-6 karbonatomer i 14 - 28 dager ved 20 - 37°C.

4. Produkt, karakterisert ved parametre av et produkt oppnådd ifølge krav 3.

5. Anvendelse av produktet ifølge krav 1 som vesentlig bestanddel i en vaksine mot tetanus.

6. Anvendelse av produktet ifølge krav 4 som vesentlig bestanddel i en vaksine mot tetanus.

7. Tetanusvaksine, inneholdende som virksom bestanddel et produkt ifølge krav 1.

8. Tetanusvaksine, inneholdende som virksom bestanddel et produkt ifølge krav 4.