DE2634584A1 - Atoxisches, immunogenes produkt aus tetanus-toxin - Google Patents
Atoxisches, immunogenes produkt aus tetanus-toxinInfo
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Description
XO-L-KRKE AKTIENGESELLSCHAFT, Harburg (i.ahn)
263458/· 3
Aktenzeichen: , HOE 76/B 016
Datum: 30.7.1976 Dr. LI
Atoxisches, immunogenes Produkt aus Tetanus-Toxin
Die Erfindung betrifft ein atoxisches, immunogenes Produkt, das aus Tetanus-Toxin mit Hilfe einer Proteinase erhalten
werden kann. Es betrifft ferner eine Tetanus-Vaccine enthaltend das neue Produkt.
Tetanus-Toxin ist bekanntermaßen gegenüber Säugetieren und aichdem Mensch hochtoxisch und muss zu seiner Verwendung als
immunisierendes Agens entgiftet werden. Es ist bekannt, das Tetanus-Toxin dadurch zu entgiften , dass es mit Formaldehyd
behandelt wird. Es ist ferner (aus Patentanm.Nr. P 25 1O 987 HOE
73/B 018) bekannt, dass ein atoxisches, immunogenes Produkt
durch Behandlung von Tetanus-Toxin mit einer Proteinase erhalten werden kann. Dieses atoxische, immunogene Produkt wird
in der wissenschaftlichen Literatur als Fragment C des Tetanus-Toxins
bezeichnet. Wie im Beispiel 1 der Patentanmeldung ausgeführt, ist bei der Behandlung von Tetanus-Toxin mit einer
Proteinase mit der Entstehung mehrerer Bruchstücke zu rechnen. Das Fragment C wird in dem betreffenden Beispiel aus der zweiten
der anfallenden Fraktionen gewonnen.
Es wurde nun überraschend gefunden, dass bei der Behandlung von Tetanus-Toxin mit einer Proteinase, vorzugsweise mit Papain,
eine weitere, chemisch eindeutig charakterisierbare Substanz mit besonders vorteilhaften Eigenschaften entsteht, die nach
bekannten biochemischen Verfahren isoliert werden kann.
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70988 5/OSOO
263458Α
Zu den besonders vorteilhaften Eigenschaften des als Fragment B bezeichneten Produktes zählt dessen fehlende Toxizität und
dessen Immunogenität. Diese Eigenschaften machen das Produkt als Bestandteil von Vaccinen gegen Tetanus geeignet.
Gegenstand der Erfindung ist demnach ein atoxisches, immunogenes Produkt, erhältlich aus Tetanus-Toxin durch dessen
Behandlung mit einer Proteinase, vorzugsweise mit Papain, gekennzeichnet durch folgende Parameter:
1. Sedimenttationskonstante S° 5,66 - 0,34
2oW
2. Immunologische Reaktion mit Tetanus-Antitoxin: partiell identisch mit der von Tetanus-Toxin.
3. Immunologische Reaktion mit Fragment C: nicht identisch.
4. Molekulargewicht, bestimmt durch Gel-Elektrophorese in Natriumdodecylsulfat, 95-000 - 5 000.
5. Durch Reduktion spaltbar in eine Untereinheit mit einem Molekulargewicht von 45 000 - 2 500
und ein mit dem bekannten Derivat der leichten Ketten des Tetanus-Toxins immunologisch identische
Untereinheit mit einem Molekulargewicht von 48 000 - 2 500 (jeweils bestinu
dodecylsulfat-Elektrophorese).
48 000 - 2 500 (jeweils bestimmt in der Natrium-
Die in den Parametern wiedergegebenen Schwankungsbreiten beruhen auf Fehlergrenzen innerhalb der Bestimmungsmethoden.
Die Sedimentationskonstante wurde bestimmt in einer wässrigen Lösung von 0,2M NaCl, 0,02M Na3H PO4, 0,03M Na H3PO4 bei
einem pH von 6,8 nachT. Svedberg und K.O. Pedersen "The Ultra-
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centrifuge", The Clarendon Press, Oxford, 1940, in einer Überschichtungszelle
einer analytischen Ultrazentrifuge in Anlehnung an Vinograd, Proc.Acad. Sei. USA, _4_9, 902 (1963).
Die Überschichtung der das erfindungsgemässe Produkt enthaltenden
Probelösung erfolgte auf 1M NaCl-Lösung vom pH-Wert
7,0.
Die immunologische Reaktivität wurde geprüft unter Verwendung von Antiseren, die durch Immunisierung von Kaninchen mit Tetanus-Toxoid
oder dem erfindungsgemässen Fragment C erhalten wurden.
Es wurde die bekannte Doppel-Diffusionstechnik verwendet. Mit
Hilfe dieser Technik kann gezeigt werden, dass das früher beschriebene Fragment C sich von dem erfindungsgemässen Fragment B
eindeutig unterscheidet. Wie weiter gezeigt werden konnte, ist das Fragment B in zwei Spaltstücke aufzutrennen, von denen das
eine das gleiche immunologische Verhalten zeigt, wie das in dem Patent (Pat.Anm.Nr. P 25 57 047 /HOE 74/B 028) beschriebene
Derivat der leichten Kette.
Die Gel-Elektrophorese in einem 7 %igen Polyacrylamidgel unter Verwendung von Natriumdodecylsulfat als Bestandteil des Elektrophorese-Puffers
wurde nach K. Weber und M. Osborn, J. Biol. Chem., Vol. 244, 4406 - 4412 (1969) durchgeführt. Vor der
Durchführung der Gel-Elektrophorese wurden die zu analysierenden Proben in wässriger Lösung mit Natriumdodecylsulfat bis zu
einer Konzentration von 1 % versetzt und 1 Minute in siedendem Wasser gehalten. Die Kalkulation des Molekulargewichts erfolgt
durch Vergleich mit Standardsubstanzen für Molekulargewichtsbestimmungen (Aldolase und Katalase, erhältlich durch die Firma
Boehringer, Mannheim, Kat.Nr. 15 575 - "Eichproteine Größe II"). Die Berechnungsmethode ist in der oben zitierten Arbeit von
Weber und Osborn angegeben.
Das neue atoxische, immunogene, als Fragment B des Tetanus-Toxins
bezeichnete Produkt ist erhältlich nach dem in der Patentanmeldung P 25 10 987 (HOE 73/B 018) beschriebenen Verfahren
durch Behandlung von Tetanus-Toxin mit einer Proteinase.
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In einer bevorzugten Ausführungsform wird das Fragment B durch
Behandlung von Tetanus-Toxin, das aus KuIturfiltraten des
Clostrium-Tetani durch Ionenaustauschchromatographie gewonnen
werden kann, mit Papain, bevorzugt in trägergebundener Form, in Gegenwart eines reduzierenden Agens erhalten.
Es hat sich dabei als nützlich erwiesen, die Inkubationstemperatur höher als üblich, d.h. zwischen 30 und 6O C,
vorzugsweise zwischen 45 und 55 C, zu wählen. Durch diese Massnahme kann die Ausbeute an dem erfindungsgemässen Produkt
erhöht werden. Nach der proteolytischen Einwirkung auf das
Tetanus-Toxin wird das trägergebundene Enzym aus dem Reaktionsansatz, zweckmässig durch Zentrifugation, entfernt und die
zurückbleibende Lösung einer Molekularsiebfraktionierung unterworfen. Vorteilhaft erweist sich hierbei die Verwendung von
mit Epichlorhydrin-vernetztem Dextran, beispielsweise Sepha-
(R) CR)
dex G 100 der Firma Pharmacia, Uppsala oder Ultrogel von
(R)
LKB, Bromma oder Bio-Gel ρ von Bio-Rad Laboratories T Richmond, Calif..
LKB, Bromma oder Bio-Gel ρ von Bio-Rad Laboratories T Richmond, Calif..
Im Falle, dass eine lösliche Enzympräparation verwendet wird, erfolgt die Abtrennung des Enzyms bei der Durchführung der
Molekularsiebfraktionierung.
Sobald das Fragment B auf diese Weise einmal erhalten wurde, lässt sich damit ein Antiserum durch Immunisierung von Versuchstieren
mit Fragment B herstellen, mit dessen Hilfe in üblicher Weise ein Immunadsorbens gewonnen werden kann. Dieses wiederum
ist geeignet, das Fragment B in besonders reiner Form aus dem Inkubationsansatz der besagten Fermentationslösung zu gewinnen.
Auch die Entfernung von Fragment C oder Tetanus-Toxin aus einem Gemisch mit Fragment B lässt sich immunadsorptiv erreichen.
Dazu wird zunächst ein Antiserum gegen das bekannte Fragment C hergestellt. Mit diesem Antiserum kann in üblicher Weise ein
Immunadsorbens gewonnen werden. Dieses wiederum ist geeignet, Reste von Fragment C und von Tetanus-Toxin von dem Fragment B
zu entfernen, da sowohl Fragment C als auch Tetanus-Toxin mit
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dem Anti-Fragment C-Serum reagiert, jedoch nicht das Fragment B.
Andere Isolierungaerfahren, wie sie dem Fachmann zur Trennung
von Proteinen unterschiedlicher elektrischer Ladun*"* zur Ver—
fügung stehen, führen ebenfalls zum Erfolg. Es sind dies insbesondere elektrophoretische und Ionenaustausch-Chroiuatografis-Verfahren.
Das auf diese Weise erhältliche reine Fragment B aus dem Tetanus-Toxin erweist sich als nicht—toxisch. Das bedeutet,
dass Mäuse, welche eine Lösung des erfindungsgemässen Produktes
injiziert erhalten, innerhalb von 4 Tagen nicht absterben. Das neue Fragment B ist somit als Bestandteil einer Vaccinfe
zur Immunisierung gegen Tetanus geeignet. Es lässt sich in bekannter Weise, ggf. unter Verwendung eines üblichen immunologischen
Adjuvans zu einer Vaccine aufarbeiten.
In einigen Fällen hat es sich als zweckmässig erwiesen, das Fragment B mit einem Aldehyd zu behandeln. Für diese Behandlung
wird das mit Hilfe von Proteinasen gewonnene Produkt nach dessen Isolierung mit einer Proteinkonzentration von etwa 1 mg Protein
pro ml oder weniger in einer Pufferlösung vom pH-Wert 6,0 - 8,5, vorzugsweise 7,8, und einer Molarität der Pufferlösung von
0,01 - 0,2 M mit 0,015 - 0,3 M eines aliphatischen Mono- oder Dialdehyds mit 1-6 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise Formaldehyd,
während 14-28 Tagen bei 20 - 37°C behandelt. Das Produkt kann gewüschtenfalls einer 10- bis'20-, vorzugsweise 15-stündigen
Dialyse gegen eine physiologisch verträgliche Lösung wie 0,15
molares Natriumchlorid unterzogen und/oder sterilfiltriert werden.
Zur Herstellung einer Vaccine wird das Produkt zweckmässig noch mit einem Adjuvans, z.B. Aluminiumhydroxid, gemischt. Durch
Verdünnung mit einer physiologisch verträglichen Lösung wie 0,15 molarer Natriumchloridlösung wird Konzentration auf den
gewünschten Antigengehalt eingestellt.
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Diese Vaccinen können für sich alleine, aber auch in Kombination mit anderen Vaccinen, angewandt werden. Zur
Kombination eignen sich insbesondere Diphtherietoxoid, Pertiissisimmunogen, Poliomyelitisviren oder Masernviren.
Durch Adsorptionsversuche kann man zeigen, dass etwa die Hälfte aller gegen Tetanus-Toxin gerichteten schützenden Antikörper
gegen Fragment B gerichtet sind.
Die Erfidnung soll an nachfolgenden Beispielen näher erläutert werden:
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Beispiel 1:
Clostrium-Tetani werden in einem Latham-Medium fermentiert.
Das dabei gebildete Toxin wird an Diäthyiaminoäthylcellulose-Ionenaustauscher
adsorbiert und durch eine gradient ansteigende Molarität eines Phosphatpuffers vom pH-Wert 7
von 0,01 Mol bis 0,4 Mol eluiert. Die das Toxin enthaltenden Fraktionen werden bei einer Chromatographie auf einer Säule,
(R)
die mit Sephadex G 100 gefüllt ist, nochmals aufgetrennt
und die das Toxin enthaltenden Fraktionen gewonnen und vereinigt.
2,5 g Tetanus-Toxin in einer Lösung mit einer Endkonzentration von 15 mg Tetanus-Toxin/ml eines 0,1 Mol Phosphatpuffers pH 6,5
enthaltend 0,01 Mol Na3EDTA und 0,001 Mol Cystein HCl werden
mit 40 mg Papairi vermischt- Das Papain enthält 30 Einheiten enzymatischer Aktivität/mg Substanz. Zunächst wird die Mischung
1 Stunde bei 45 C gehalten, danach weitere 2 Stunden bei 55 C.
Für die Spaltung des Tetanus-Toxins kann bevorzugt auch trägergebundenes
Papain eingesetzt werden.
Hierzu werden eine gegen 0,1 Mol Na2CO3-PUffer vom pH-Wert 10,0
dialysierte Lösung von 500 ml Papain mit 50 mg/ml mit einem mittels Cyanbromid-aktiviertem Agarosegel zusammengebracht
und 24 Stunden bei 4 C belassen. Das mehrfach mit einer 4 Mol Harnstoff und 0,5 Mol NaCl pro Liter enthaltenden Lösung gewaschene
Reaktionsprodukt wird analog dem löslichen Enzym für die proteolytische Spaltung des Tetanus-Toxins verwendet.
Nach Abkühlung des Gemisches wird das Volumen mit Hilfe eines Ultrafilters eingeengt und danach auf eine 10 χ 100 cm
lange Säule, gefüllt mit Sephadex G 100, aufgetragen.
Die Elution erfolgt mit 0,1 M Trishydroximethylaminomethan-Salzsäurepuffer
vom pH-Wert 8,0, enthaltend 1 Mol NaCl.
/8
709885/0500
Während der Elution erfolgt kontinuierlich die Messung der Adsorption im Bereich der Wellenlänge von 280 niu. Die
Fraktionen, die in diesem Bereich eine Adsorption zeigen, werden getrennt aufgefangen. Es entstehen 4 Fraktionen, wobei
die erste einen Doppelgipfel darstellt.
Bei einer wiederholten Chromatographie unter den gleichen Bedingungen wird der Doppelgipfel aussinandergezogen und
schliesslich der 2. Gipfel isoliert. Dieser enthält das erfindungsgemäße atoxische, immunogene Produkt, das Fragment B
aus Tetanus-Toxin.
Besonders einfach lässt sich das ex"findungsgemässe Fragment B
gewinnen, wenn man Antiserum, gerichtet gegen das bekannte
Fragment C (10 ml mit 1 000 IU/ml) in üblicher Weise an
BrCN-aktivierte Agarose bindet, und anschliessend eine durch Gel-Chromatographie partiell gereinigte Präparation des
Fragments B mit einem solchen Immunadsorbens vermischt. Nach 60 Minuten Rühren wird das Gel mit den daran gebundenen
Verunreinigungen abgetrennt und das Fragment B durch eine nochmalige Gel-Chromatographie gewonnen.
Es ist auch möglich, die Verunreinigungen durch Zusatz von Anti-Fragment C-Antiserum (IgG Fraktion) zu neutralisieren
und die Immunkomplexe durch Gel-Chromatographie von dem Fragment B zu" trennen.
Endlich lässt sich das erfindungsemässe Fragment B auch gewinnen,
wenn mit Hilfe eines einmal hergestellten Fragments B über ein Antiserum ein Immunadsorbens für das Fragment B hergestellt
wird. Man kann sich dabei bekannter Verfahren bedienen. Mit Hilfe des Immunadsorbens wird das Fragment B selektiv
aus der Mischung mit anderen Reaktionsprodukten aus der Proteinasebehandlung
des Tetanus-Toxins selektiv adsorbiert, wonach es selektiv vom Immunadsorbens eluiert werden kann.
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709885/0500
Beispiel 2:
Das Fragment B wird mit 0,1 M Phosphatpufferlösung vom pH-wert
6,5 auf 200 ng Protein pro mi verdünnt und mit 0,0b %
Formaldehyd versetzt und bei 37 C 21 Tage stehen gelassen. Danach wird gegen ein mehrfaches Volumen 0,15 M Natriumchloridlösung
16 Stunden dialysiert und in üblicher Weise zu einer Vaccine verarbeitet.
709885/OSOO
INSPECTED
Claims (6)
1. Atoxisches, immunogenes Produkt, erhältlich aus Tetanus-Toxin
durch dessen Behandlung mit einer Proteinase, vorzugsweise Papain,gekennzeichnet durch folgende Parameter:
a. Sedimentationskonstante S„ 5,66 - 0,34
b. Immunologische Reaktion mit Tetanus-Antitoxin: partiell identisch mit der von Tetanus-Toxin.
c. Immunologische Reaktion mit Fragment C: nicht identisch.
d. Molekulargewicht, bestimmt durch Gel-Elektrophorese in Natriumdodecylsulfat, 95 000 - 5 000
e. Durch Reduktion spaltbar in eine Untereinheit mit einem Molekulargewicht von 45 000 - 2 5000
und ein mit dem bekannten Derivat der leichten Ketten des Tetanus-Toxins immunologisch identische
Untereinheit mit einem Molekulargewicht von 48 000 - 2 500 (jeweils bestimi
dodecylaulfat-Elektrophorese).
dodecylaulfat-Elektrophorese).
48 000 - 2 500 (jeweils bestimmt in der Natrium-
2. Verfahren zur Herstellung des atoxischen, immunogenen Produktes nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass
das durch Behandlung von Tetanus-Toxin mit einer Proteinase erhältliche Produkt durch Molekularsieb-Fraktionierung,
Immunadsorption, Elektrophorese und/oder Ionenaustausch-Chromatografie
gewonnen wird.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass das
Produkt bei einem pH-Wert von 0,6 - 8,5 mit O,015 - 0,3 M
eines aliphatischen Mono- oder Dialdehyds mit 1 - 6 Kohlenstoffatomen 14-28 Tage bei 20 - 37°C behandelt wird.
709885/0500 /11
ORIGINAL
HOE 76/b O16
4. Produkt gekennzeichnet durch Parameter eines Produktes ich n3.oh An5nruch 3
5. Verwendung das Produktes nach Anspruch 1 als wesentlicher
Bestandteil in einer Vaccine gegen Tetanus.
6. Verwendung des Produktes nach Anspruch 4 als wesentlicher Bestandteil in einer Vaccine gegen Tetanus.
709885/0500
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